Trabalho nº. 6 - Universidade Fernando Pessoa
Propaganda
UNIVERSIDADE FERNANDO PESSOA FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE TRABALHOS PRÁTICOS DE BIOQUÍMICA II LICENCIATURA EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Fernanda Leal, Carla Oliveira, Pedro Silva 2005/06 1 ÍNDICE Pág. Indicações gerais 3 Trabalho nº. 1: Oxidação da glucose: Experiência da garrafa azul 7 Trabalho nº. 2: Análise de ATP 9 Trabalho nº. 3: Respiração mitocondrial 13 Trabalho nº. 4: Determinação de triacilglicerois no soro 16 Trabalho nº. 5: Metabolismo de aminoácidos: Determinação da actividade da 18 transaminase glutâmico-pirúvica em músculo cardíaco Trabalho nº. 6: Digestão de hidratos de carbono, proteínas e gorduras 22 2 INDICAÇÕES GERAIS A. Manipulação de Reagentes É prática corrente no laboratório a manipulação de líquidos e sólidos, que deve obedecer necessariamente a certos cuidados, de modo a evitar-se a sua contaminação com substâncias indesejáveis e, no caso de substâncias tóxicas e corrosivas, de modo a haver segurança pessoal. Um cuidado geral a observar, para evitar a contaminação, consiste em nunca pousar a rolha dum frasco que se abriu directamente sobre a banca de trabalho. Num frasco de reagentes sólido, só se deve introduzir um instrumento limpo e seco, tal como uma espátula ou colher; num reagente líquido só se deve introduzir uma pipeta nas mesmas condições. Certos reagentes, como por exemplo NaOH, KOH, etc. alteram-se quando expostos ao ar, pelo que os seus frascos devem estar abertos durante um tempo mínimo. Outros, como HCl concentrado, emitem vapores tóxicos e corrosivos, pelo que só devem ser manipulados dentro da “hotte”. Depois duma amostra dum reagente ter sido removida dum frasco, nenhuma porção dele deve ser metida de novo no frasco; esse resto de reagente, pode ter-se contaminado durante a manipulação e iria introduzir impurezas que ficariam no frasco. Quando se retira uma porção de reagente, deve-se ter em conta dois pormenores importantes: a) O rótulo do frasco virado para cima, o que se deve observar sempre que se utiliza um frasco de reagente (em especial se ele é líquido), de modo a evitar-se a deterioração do rótulo. b) A rolha não é pousada directamente sobre a banca. Quando se acabou de tirar um reagente líquido de um frasco, deve-se remover por lavagem qualquer porção de líquido que tenha escorrido pelo lado de fora, secando em seguida com um pano. Este cuidado toma excepcional importância quando se trabalha com um reagente corrosivo ou venenoso. Antes de se trabalhar com qualquer reagente, deve-se inteirar de todas as informações sobre as suas características e propriedades, assim como de todos os cuidados a ter com a sua manipulação. Sempre que necessário deve-se trabalhar protegido quer por uso de luvas e máscaras, quer por utilização de uma hotte. Qualquer acidente deve ser imediatamente comunicado ao professor responsável pela aula, e se se tratar de um reagente tóxico deve-se procurar ajuda médica. B. Subdivisões de um Relatório Laboratorial 1. Título O título a dar a cada trabalho deve ser curto e informativo. Regra geral, os alunos devem usar o título que vem nas folhas. 2. Introdução Na introdução devem fazer breves referências ao problema que vão tratar e às linhas gerais em que ele se insere. Em seguida devem realçar a importância e o significado biológico do trabalho. 3 Finalmente deverão explicitar qual o objectivo do trabalho, indicando concreta e sucintamente o que investigaram. A introdução deve ser relativamente curta (10-15 linhas) e conter 2 a 3 parágrafos. Não devem subdividir esta secção em alíneas. No conjunto, a introdução deve formar um todo de tal modo que ao ler-se se tenha a impressão de um bloco informativo e não apenas de parágrafos desconexos. 3. Material e Métodos Nesta secção deverão descrever o material e os métodos utilizados. Quanto ao material, e no que se refere a reagentes químicos devem referir o nome dos fornecedores (ou fabricantes). No que se refere a equipamento (aparelhos) devem mencionar a marca e o modelo utilizado. Os métodos devem ser descritos pormenorizadamente de tal modo que qualquer pessoa seja capaz de repetir a experiência com base na descrição feita. As descrições dos métodos podem ser apresentadas em alíneas separadas. Cada alínea deverá ter um título descritivo do método. 4. Resultados Na secção de resultados deverão incluir os dados obtidos no laboratório, o mais possível sob a forma de gráficos, tabelas, registos. Os resultados devem ser apresentados em alíneas separadas a não ser que se tratem de resultados afins. Cada alínea deve ter um título descritivo. Os únicos comentários que devem fazer nesta secção são os necessários ao esclarecimento do significado das tabelas e gráficos. Cada tabela, gráfico ou figura deve ter um número e uma legenda. Uma legenda completa consta de um título destacado e de uma descrição muito breve dos pormenores da experiência. 5. Discussão A discussão deve compreender as conclusões das experiências realizadas. Se conveniente, deve ser referida a ocorrência de determinados erros que possam ter afectado os resultados obtidos. Esta secção deve ser escrita com clareza e objectividade, de modo a que o leitor possa distinguir entre as conclusões provenientes da execução do trabalho e as inferências resultantes da comparação dos dados experimentais obtidos com informações colhidas em leituras. 6. Bibliografia Nesta secção é feita a menção a artigos e livros consultados na realização do trabalho e relatório. A seguir indicam-se dois exemplos de referências bibliográficas: (1) Hughes, R.H. & Wimmer, E.J. 1935. “The Absorption of Soluble, Volatile Fatty Acids” J. Biol. Chem., 108: 273-375. (referência a um artigo publicado numa revista) (2) Fruton, J.S. & Simmonds, S. 1953. General Biochemistry, John Wiley & Sons, New York, p 239245. (referência a um assunto tratado num livro) 4 Se houver necessidade de no texto do trabalho incluir referências, podem fazê-lo utilizando um número, ex: (1), (2), (3)....... e depois numerar a bibliografia; alternativamente, podem referir o nome do autor e o ano, ex. Hughes (1935), e organizar a bibliografia por ordem alfabética. ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- INFORMAÇÕES IMPORTANTES: - Cada grupo de trabalho deverá entregar um relatório por cada trabalho laboratorial realizado. - O prazo de entrega é até uma semana após a realização do trabalho. - Não é permitida a entrega de relatórios iguais por diferentes grupos de trabalho. - Os relatórios devem ser assinados por todos os membros do grupo de trabalho. O grupo de trabalho deve ser o mesmo até ao fim do semestre. C. Traçado e utilização de Gráficos Muitas vezes os resultados experimentais são apresentados sob a forma de tabelas. Porém, um gráfico traçado a partir destes valores, apresenta grandes vantagens, como sejam: a) - Dar uma ideia da dependência funcional das quantidades ou propriedades medidas (variáveis). b) - Obter, por simples leitura do gráfico, os resultados de experiências em condições diferentes das usadas (ver interpolação e extrapolação). Preparação e traçado de um Gráfico Escolha do papel do gráfico O papel deve ser escolhido de modo a permitir leituras com o mesmo número de algarismos significativos que os resultados obtidos. Assim, para o caso de dois algarismos significativos, pode usar-se o papel quadriculado vulgar; para três ou quatro algarismos significativos, deve recorrer-se a papel milimétrico. Traçado dos eixos coordenados Os eixos coordenados são representados por duas linhas perpendiculares; a horizontal é o eixo das abcissas (ou dos xx) e a vertical é o eixo das ordenadas (ou dos yy). Normalmente quando se estuda um sistema com duas variáveis, atribuem-se valores a uma das variáveis (variável independente) e medem-se os valores correspondentes da Segunda variável (variável dependente). Por convenção a variável independente representa-se em abcissas, e a dependente em ordenadas. Escolha das escalas As escalas devem ser escolhidas de tal modo que os pontos do gráfico não fiquem afastados que não permitam o traçado duma curva válida ou significativa: se os pontos forem muito afastados, podem 5 traçar-se várias curvas diferentes para os mesmos pontos marcados, dificultando assim a determinação da forma da curva que representa a relação entre as variáveis consideradas. Identicamente devem escolher-se as escalas de modo a que os pontos traçados não fiquem tão próximos que se perca a precisão das determinações, isto é, para qualquer ponto da curva deve ser possível determinar o mesmo número de algarismos significativos que os usados nas coordenadas dos pontos que serviram de base ao traçado da curva. Marcação dos pontos Todos os pontos experimentais que se usam no gráfico devem aparecer explicitamente marcados. Traçado da curva Há a considerar dois casos: a) Sabe-se qual a forma da curva (recta, parábola,...). b) Não se tem qualquer ideia da forma da curva. No primeiro caso, e supondo que se trata de uma recta, esta deve ser traçada de modo a deixar o mesmo número de pontos de ambos os lados e a iguais distâncias. Tratando-se de uma curva, seguem-se princípios análogos, não se devendo distorcer uma curva simples, para englobar todos os pontos: Quando um ponto é conhecido com toda a certeza (acontece frequentemente com o ponto zero) a linha traçada deve incluir obrigatoriamente esse ponto. Se não se conhece a forma da curva, o seu traçado tem de ser feito a sentimento, a partir da maneira como estão dispostos os pontos experimentais, e procurando obter curvas de forma simples. Interpolação e extrapolação gráficas A interpolação gráfica consiste em determinar as coordenadas dos pontos da curva situados entre pontos que foram usados para o seu traçado. Na extrapolação obtem-se valores fora da gama de condições experimentais utilizadas; a curva é prolongada (usa-se normalmente linha tracejada) até atingir as coordenadas do ponto desejado. 6 TRABALHO Nº. 1 OXIDAÇÃO DA GLUCOSE: EXPERIÊNCIA DA GARRAFA AZUL Introdução Este exercício demonstra de uma forma elegante o papel das enzimas oxidantes tais como o NAD + e o FAD no metabolismo. A experiência da garrafa azul é uma das mais antigas demonstrações da “química mágica”. Em condições alcalinas, a glucose reduz lentamente o azul de metileno de azul para transparente. A forma azul é rapidamente regenerada pela introdução de ar na solução (agitação). Deste modo, o azul de metileno está alternadamente a oxidar a glucose e a reduzir o oxigénio. A introdução deste exercício mostra três reacções relevantes: oxidação de glucose a ácido glucónico, redução de oxigénio a água, e oxidação/redução reversível de azul de metileno. Procedimento Experimental Parte I – Oxidação da Glucose 1. Usar 2 frascos de reacção de 125 ml; 2. Misturar 20ml de KOH a 5% com 20ml de glucose a 7% em cada um dos frascos; 3. Adicionar 1 gota de azul de metileno a 0.2% apenas num dos frascos; 4. Avaliar a mudança de cor. Questão: A glucose também é oxidada na ausência de corante? Uma vez que não há alteração de cor para sinalizar, e a solução é alcalina demais para medir a produção de ácido, a resposta só pode ser respondida medindo o consumo de oxigénio. Parte II– Medição do consumo de oxigénio 1. Ligar a ponta de duas pipetas graduadas (5 e 10ml) com um tubo de borracha de aproximadamente 15 cm; 2. Encher as pipetas até meio com água; 3. Equilibrar o volume nas duas pipetas; 4. Colocar as 2 pipetas num suporte sem as afastar muito e não demasiado apertado, para se poder ajustar o nível da água. 5. Cada grupo (4 alunos) tem 2 frascos de 125 ml com as suas soluções (com e sem azul de metileno); 6. Tapar os frascos; 7. Ligar um tubo de borracha do primeiro frasco ao topo da pipeta de 5ml; 7 8. Ajustar o nível da água nas duas pipetas; 9. Marcar o limite da água em cada pipeta; 10. Segurar o frasco pela parte superior, de forma a reduzir o contacto com a mão; 11. Agitar o primeiro frasco (com azul de metileno) cerca de 20 vezes; 12. Esperar de cada vez que a cor azul desapareça; 13. Repetir o mesmo procedimento para o segundo frasco, mantendo os tempos, embora não haja mudança de cor; 14. Medir os volumes nas pipetas; 15. Calcular a variação do volume. Resultados 1. Existe diferença na variação de volume nas pipetas utilizadas para medir o consumo de oxigénio? Porquê? 2. Descrever para cada mudança de cor, o que está a acontecer ao corante azul de metileno. 3. Qual dos reagentes funciona como dador e qual funciona como receptor de electrões? Explicar. 4. Descrever o papel desempenhado pelo corante. 5. Represente sob a forma de uma equação as reacções de transferência de electrões na via ilustrada por esta experiência. 8 TRABALHO Nº. 2 ANÁLISE DE ATP Introdução Estrutura O ATP é obtido muito raramente no estado puro. A maior parte das amostras comerciais contêm na sua composição ADP e fosfato inorgânico (Pi). A análise de uma amostra, é assim muitas vezes necessária antes de ser utilizada, por exemplo, numa reacção enzimática. São vários os métodos que podem ser utilizados para essa análise, dando, cada um deles, diferentes informações sobre a amostra. 1- Determinação do conteúdo de adenina Pode ser feita por espectrofotometria ultravioleta e indica a quantidade total de nucleótidos presentes. As bases púricas absorvem fortemente luz ultravioleta ao comprimento de onda de 260 nm. Esta absorção não é afectada significativamente pela ligação da ribose ao grupo fosfato. 2- Determinação do conteúdo de ribose O conteúdo em ribose na amostra pode ser determinado por um método colorimétrico e pode ser utilizado para determinar a quantidade total de nucleótidos presente - nº de moles de ribose = nº de moles ATP + nº de moles de ADP. 3 - Determinação do conteúdo em fosfato a) O fosfato inorgânico pode ser facilmente determinado por um método colorimétrico. Quando se faz este tipo de teste numa amostra de ATP, pode-se avaliar a quantidade de Pi contaminante. b) As ligações fosfato lábeis são hidrolisadas por aquecimento em HCl 1M, a 100ºC durante 10 minutos. Assim, cada molécula de ATP origina 2 moléculas de fosfato inorgânico, ao passo que uma de ADP dá origem apenas a uma. A diferença entre o fosfato inorgânico antes e depois da hidrólise indica-nos assim, o número total de grupos fosfato lábeis na amostra. Neste trabalho, irá ser fornecida uma amostra de ATP para análise de concentração 1 mg/ml. Para a determinação da adenina e ribose a amostra deverá ser diluída 10 vezes. 9 Procedimento Experimental Reagentes Amostra de ATP - 1mg/ml Reagente de orcinol - 0,1% orcinol e 0,1% FeCl3 em HCl concentrado Soluções padrão de ribose - 0,5; 0,2; 0,1; 0,05 e 0,02 mM de ribose na forma nucleotídica (a ribose livre não reage bem com a solução de orcinol) Reagente de molibdato-ácido sulfúrico - 2 volumes de molibdato de sódio 5% (Na2MoO4.2H2O), 1 vol H2SO4 10M e volume H2O Solução "Metol" - 1 g de sulfato de metil-p-amino fenol (metol) em 100 ml de metabisulfito de sódio 3% (Na2S2O5) Solução padrão de fosfato inorgânico - KH2PO4 1.0 mM Material Banho Material de vidro: tubos de centrífuga e pipetas Pipetas automáticas Espectrofotómetro Método A- Determinação do conteúdo em adenina 1- Medir a D.O. a 260 nm das soluções padrão de adenina (utilizar água desionizada como branco). 2- Construir uma recta padrão. 3- Medir a D.O. a 260 nm da amostra diluída 10 vezes. B- Determinação do conteúdo em ribose 1- Preparar os tubos da recta padrão, pipetando 2,0 ml de cada solução padrão de ribose para cada tubo de ensaio e 1,0 ml de água desionizada. Utilizar como branco um tubo contendo 3,0 ml de água desionizada. 2- Preparar a amostra em duplicado, pipetando 2,0 ml da solução de ATP diluída e 1,0 ml de água desionizada. 3- Adicionar 3 ml de orcinol a cada tubo, agitar e colocar em banho de água fervente durante 30 minutos exactamente. Retirar os tubos ao fim desse tempo e colocá-los em água fria até ficarem à temperatura ambiente. 4- Ler o valor da D.O. a 620 nm. 10 C - Determinação do conteúdo em fosfato 1- Pipetar para dois tubos 1.0 ml da solução de ATP a testar e 1 ml de HCl 2M. Colocá-los em água fervente durante 10 minutos. Remover os tubos do banho e deixar arrefecer. Rolhar os tubos e invertê-los repetidamente. Estas soluções de ATP hidrolisadas irão ser utilizadas para a determinação em fosfato. 2- Preparar 7 tubos de acordo com a tabela: Tubo 1 2 3 4 5 6 7 Solução de ATP - 1,0 1,0 - - - - - - - 0,5 0,5 - - - - - - - 1,0 1,0 1,0 - - 0,5 0,5 - - original (ml) Solução de ATP hidrolisada (ml) Solução de fosfato padrão (ml) H2O (ml) 3- A cada tubo adicionar 1,3 ml do reagente molibdato-ácido sulfúrico e agitar. Adicionar 0,5 ml de "metol" e agitar novamente. Deixar repousar durante 30 minutos e adicionar 5,0 ml de água. Agitar por inversão, após rolhar os tubos. 4- Ler a D.O. a 620 nm, utilizando o tubo 1 como branco. Resultados 1. Determinar a concentração em adenina da amostra. 2. Calcular o valor da concentração da ribose na amostra de ATP não diluída. 3. Assumindo que as leituras de absorvância são proporcionais à quantidade de fósforo inorgânico nos tubos, calcular: a) A concentração de fosfato inorgânico na solução de ATP original. b) A concentração total de fosfato inorgânico na solução de ATP hidrolisada. c) Tendo em conta que 1 ml da solução de partida de ATP origina 2 ml de ATP hidrolisado, calcular a quantidade de ATP produzido por hidrólise, isto é, o conteúdo em fosfato lábil total. Apresentar o resultado em moles por ml da solução de ATP original. d) Por hidrólise, cada molécula de ATP origina duas moléculas de fosfato inorgânico, ao passo que cada molécula de ADP origina apenas uma. Assim, o primeiro grupo fosfato lábil encontra-se 11 presente em ambas as moléculas, ADP e ATP, e esse número é igual ao número de moléculas de ribose presente. Se o conteúdo em ribose presente na amostra, previamente determinado, for subtraído ao conteúdo em fosfato lábil total, encontra-se a quantidade correspondente ao segundo grupo fosfato lábil. Este número é igual ao número de moléculas de ATP. Portanto, para obter a quantidade de ATP, deve-se subtrair o conteúdo em ribose (em moles/ml) ao conteúdo em fosfato lábil total determinado. e) O conteúdo em fosfato lábil total consiste em dois grupos fosfato por cada molécula de ATP, e um grupo por cada molécula de ADP. Se se multiplicar o conteúdo em ATP (em moles/ml) por dois e se subtrair ao conteúdo em fosfato lábil total, obtém-se o conteúdo em ADP, em moles/ml. f) Calcular o peso de ATP, ADP e fosfato inorgânico existentes em 1 ml da solução de ATP original, sabendo que os respectivos pesos moleculares são os seguintes: ATP (sal dissódico): 551 g/mol ADP (sal monossódico): 449 g/mol Fosfato inorgânico (NaH2PO4): 120 g/mol Somar os valores encontrados e determinar o peso total de soluto encontrado para 1 ml da solução. O peso total da amostra dissolvida em 1 ml de solução é 1 mg. Determinar o peso total que NÃO é constituído por ATP, ADP ou fosfato inorgânico. Que percentagem é do total? g) Que fracção das moléculas de ATP são moléculas de ADP? Tendo em conta a concentração de fosfato inorgânico encontrado, pode-se concluir que todo o ADP provém da hidrólise de ATP puro? 12 TRABALHO Nº. 3 RESPIRAÇÃO MITOCONDRIAL Introdução Este exercício serve para examinar várias reacções da respiração mitocondrial. A preparação foi feita a partir de bife de coração de vaca. Preparou-se uma solução de citoplasma, uma de mitocôndrias e uma que é a mistura das duas. A transferência de electrões é evidenciada pela redução (descoloração) do DCIP (2,6-dicloroindofenol) que, tal como o azul de metileno, é azul escuro na sua forma oxidada e passa a transparente na sua forma reduzida. Procedimento Experimental Parte I – Preparação dos extractos celulares de coração de vaca 1. Retirar toda a gordura e fibras de cerca de 50 g de bife de coração de vaca; 2. Cortar o músculo aos pedaços pequenos; 3. Colocar num copo de vidro de 500 ml; 4. Adicionar 50 ml de fosfato de potássio, 0.1 M a pH=7.4 e liquefazer usando uma varinha mágica; 5. Transferir a mistura para um tubo de falcon de 50 ml; 6. Centrifugar esta solução espessa a 6000 rpm durante 10 minutos; 7. O sedimento forma uma fase compacta e rosada na parte inferior do tubo e uma fase superior menos compacta e cinzenta (que contem as mitocôndrias) com um fluído sobrenadante vermelho claro (citosol); 8. Transferir 20 ml do sobrenadante cuidadosamente para um tubo de falcon novo 9. Transferir o resto do sobrenadante para outro tubo de falcon que deve ser guardado no congelador para o trabalho prático seguinte. 10. Adicionar 5 ml de tampão fosfato à fase cinzenta contendo as mitocôndrias, ressuspender e transferir para um novo tubo; 11. Centrifugar o tubo das mitocôndrias e o tubo do citosol a 6000 rpm durante 10 minutos; 12. Depois da centrifugação, o citosol (citoplasma) é transferido para novo tubo, tentando evitar qualquer contaminação com material insolúvel presente no primeiro - esta solução será chamada CITOPLASMA; 13. Retirar o sobrenadante do tubo das mitocôndrias e descartar; 14. Ressuspender as mitocôndrias em 5 ml de tampão fosfato – esta solução será chamada MITOCÔNDRIAS; 15. Preparar dois tubos eppendorf com 750 l da solução de mitocôndrias e 750 l da solução de citoplasma e misturar - esta solução será chamada EXTRATO DE CORAÇÃO DE VACA. Nota: Normalmente, 2 eppendorf de cada uma destas soluções é suficiente para cada grupo. 13 Parte II – Que substratos são oxidados pelo extracto de coração de vaca? A oxidação é indicada pela redução (descoloração) do DCIP (solução stock: 0.5mM ou 0.145mg/ml). O tampão é 0.1M fosfato de potássio, pH=7.4. Protocolo experimental: 1. Preparar 5 tubos de reacção; 2. Colocar 4 gotas de tampão e 2 gotas de DCIP em cada tubo: I. Controlo sem substrato: 12 gotas de água; II. Citrato: 10 gotas de água, 2 gotas de 0.1M de citrato de sódio; III. -cetoglutarato: 10 gotas de água, 2 gotas de 0.1M de -cetoglutarato (sal de sódio); IV. Succinato: 10 gotas de água, 2 gotas de 0.1M de succinato de sódio; V. NADH: 10 gotas de água, 2 gotas de 10mM de NADH (7.09 mg/mL). 3. As reacções são iniciadas pela adição de 2 gotas de extracto de coração de vaca; 4. Misturar bem; 5. Deixar os tubos à temperatura ambiente durante 10 minutos; 6. Avaliar a mudança de cor nos vários tubos. Parte III – Identificação das fracções celulares activas que promovem as reacções de oxidação Protocolo experimental: 1. Preparar 3 tubos como o tubo IV da parte anterior: Colocar 4 gotas de tampão e 2 gotas de DCIP em cada tubo: IV. Succinato: 10 gotas de água, 2 gotas de 0.1M de succinato de sódio; 2. Preparar 3 tubos como o tubo V da parte anterior: Colocar 4 gotas de tampão e 2 gotas de DCIP em cada tubo: VI. NADH: 10 gotas de água, 2 gotas de 10mM de NADH (7.09 mg/mL). 3. Para cada grupo de 3 tubos adicionar: 2 gotas de extracto de coração de vaca no primeiro tubo; 2 gotas de solução de citoplasma no segundo tudo; 2 gotas de solução de mitocôndrias no terceiro tubo. 4. Avaliar a mudança de cor nos vários tubos. Parte IV– Identificação da especificidade de inibição pelo malonato Protocolo experimental 1. Preparar 4 tubos de reacção; 2. Colocar 4 gotas de tampão e 2 gotas de DCIP em cada tubo: I. Succinato: 10 gotas de água, 2 gotas de 0.1M de succinato de sódio; II. Succinato+malonato: 8 gotas de água, 2 gotas de succinato, 2 gotas de malonato; 14 III. NADH: 10 gotas de água, 2 gota de NADH; IV. NADH+malonato: 8 gotas de água, 2 gotas de NADH, 2 gotas de malonato; 3. As reacções são iniciadas pela adição de 2 gotas de solução de mitocôndrias; 4. Misturar bem; 5. Deixar os tubos à temperatura ambiente durante 10 minutos; 6. Avaliar a mudança de cor nos vários tubos. Resultados 1. Que substratos são usados pelo extracto de coração? 2. Em que compartimento(s) celular(es) decorrem as actividades oxidantes que foram observadas? 3. Que outros reagentes serão necessários para se ver oxidação do citrato e do -cetoglutarato? 4. Comparar as estruturas do succinato e do malonato e sugerir uma explicação para o comportamento do malonato. 5. Indicar num diagrama da cadeia de transporte de electrões, onde é que o DCIP está a aceitar electrões e qual é o complexo inibido pelo malonato. 6. Que inibidor se poderia utilizar para inibir o NADH? Como actuaria? 15 TRABALHO Nº. 4 DETERMINAÇÃO DE TRIACILGLICEROIS NO SORO (QCA KIT) Introdução Neste exercício pretende-se quantificar os triglicerídeos presentes no soro. Os triglicerídeos serão determinados após hidrólise enzimática com lipases. O indicador é a quinoneimina formada a partir de peróxido de hidrogénio, 4-aminofenazona e 4-clorofenol sob a influência catalítica da peroxidase. Triglicerídeos + H2O Glicerol + ATP lipases Glicerol cinase Glicerol-3-fosfato + O2 glicerol + ácidos gordos glicerol-3-fosfato + ADP G-3-P Oxidase 2H2O2 + fenol + 4-aminofenazona + clorofenol dihidroxiacetona fosfato + H2O2 POD quinoneimina + HCl + 4H 2O Procedimento Experimental Composição do reagente Conteúdo Tampão Concentração inicial de Solução Tampão pipes (pH 6,8) 50 mM 4-clorofenol 4.2 mM Aspartato Mg 40 mM 4-aminoantipirina 0.35 mM ATP 2.0 mM Glicerol cinase 800 U/L Glicerol-3-fosfato oxidase 2000 U/L Peroxidase 500 U/L Lipases 9000 U/L Procedimento Comprimento de onda 500 nm, Hg 546 nm Cuvete 1 cm de espessura Temperatura Medida 20-25ºC, 37ºC Contra o branco reactivo 16 1. Preparar as seguintes amostras em eppendorfs: Branco (µl) Padrão (µl) Cada amostra (µl) Padrão --- 10 --- Amostra --- --- 10 Reagente 1000 1000 1000 Densidade óptica (D.O.) 2. Misturar bem a preparação. 3. Incubar durante 10 minutos a 20ºC - 25ºC. 4. Transferir para a cuvete cada uma das preparações. 5. Medir a Densidade óptica (D.O.) da amostra contra o branco nos 60 minutos seguintes. Resultados D.O.amostra Concentração de triglicerídeos na amostra = x 200 = mg/dl D.O.padrão Concentração de triglicerídeos na amostra = (mg/dl) x 0.01143 = mmol/L Amostras D.O. Conc. Conc. triglicerídeos triglicerídeos mg/dl mmol/L Diagnóstico Padrão Amostra 1 Amostra 2 … Valores de referência Os seguintes limites superiores são recomendados para a determinação do factor de risco para a hipertrigliceridemia: Valor Interpretação 1.71 mmol/L (150 mg/dl) Valores suspeitos de triglicerídeos no sangue 2.29 mmol/L (200 mg/dl) Valores aumentados de triglicerídeos no sangue 17 TRABALHO Nº. 5 METABOLISMO DE AMINOÁCIDOS: DETERMINAÇÃO DA ACTIVIDADE DA TRANSAMINASE GLUTÂMICO-PIRÚVICA EM MÚSCULO CARDÍACO Introdução Numa reacção de transaminação, o grupo -amino de um aminoácido é transferido para um cetoácido, produzindo-se os respectivos -cetoácido e -aminoácido correspondentes. R1.CHNH3+.COO- R1.CO.COO- + + R2.CO.COO- R2.CHNH3+.COO- Muitas reacções de transaminação ocorrem nos tecidos, catalisadas por transaminases específicas para um determinado par aminoácido/cetoácido. As reacções são reversíveis, sendo o equilíbrio da reacção deslocado de acordo com os reagentes em excesso. As duas transaminases mais importantes, em termos de actividade quantitativa são: 1- Transaminase glutâmico-oxaloacética (GOT), também designada por aspartato transaminase, que catalisa a reacção: L-Aspartato + -cetoglutarato Oxaloacetato + L-glutamato 2 - Transaminase glutâmico-pirúvica (GPT), também designada por alanina transaminase, que catalisa a reacção: L-Alanina + -cetoglutarato Piruvato + L-glutamato Estas transaminases utilizam como grupo prostético o piridoxal-fosfato. A actividade das transaminases em tecido pode ser investigada, incubando um homogeneizado com o respectivo par aminoácido-cetoácido. A transaminação ocorrida pode ser observada por cromatografia pela formação do novo aminoácido. A reversibilidade da reacção pode ser demonstrada, utilizando o par aminoácido-cetoácido complementar, como reagentes iniciais. Procedimento Experimental Reagentes Piruvato 0,1 M L-glutamato 0,1 M 18 L-leucina 0,1 M D-glutamato 0,1 M L-alanina 0,1 M -cetoglutarato 0,1 M Tampão fosfato pH 7,4 Etanol a 96% Padrões: L-alanina e L-glutamato (0,02 M) Placas de T.L.C. (sílica gel) Reagente de ninidrina Solvente: propanol:NH4OH a 33% (70:30) Material Banho Material de vidro: tubos de centrífuga e pipetas Pipeta automática Cronómetros Método A - Preparação do extracto de coração de porco (preparado previamente) 1 - Cortar o coração em pequenas peças e homogeneizar com 6x o peso, com tampão gelado (tampão fosfato 0,05M, pH 7,4), durante 3 a 4 minutos. 2 - Centrifugar a 17000 rpm, por 20 minutos. 3 - Dialisar o sobrenadante contra o tampão gelado. B - Incubação do extracto com vários substratos 1 - Preparar 8 tubos de centrífuga: A, B, C, D, E, F, G e H. 2 - Pipetar os seguintes reagentes: A B C D E F G Piruvato Na (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 L-Glutamato (ml) 0,5 L-Alanina (ml) 0,5 0,5 -Cetoglutarato (ml) 0,5 L-Leucina (ml) H 0,5 D-Glutamato (ml) 0,5 Fosfato 0,05M (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 3 - Adicionar 0,5 ml de extracto a cada tubo. 4 - Incubar a 37ºC no banho, durante 30 minutos. 19 5 - Parar a reacção com a adição de 1,5 ml de etanol. 6 - Esperar um pouco e centrifugar os tubos durante 3 minutos a 5000rpm. 7- Guardar os tubos no frigorífico até usar. C - T.L.C. 1 –Marcar a placa de sílica com um lápis como representado na figura. 2- Aplicar 5 l do sobrenadante das amostras a testar e ao mesmo tempo padrões de L-alanina e Lglutamato de acordo com o esquema: 1,4cm 1,5 cm º º º º º º º º º º º º º º Ala A B C Glu D E Ala B C F Glu G H 1cm 3 – Colocar solvente propanol:hidróxido de amónio (70:30) até uma altura de cerca de 0,5 cm na tina de TLC na câmara. 4- Introduzir as placas de sílica após a colocação das amostras e deixar correr durante 3/4 hora a 1 hora. 5- Retirar as placas e marcar com um lápis o ponto atingido pelo solvente. 6- Secar as placas dentro da câmara com um secador durante 1 ou 2 minutos. 7- Pulverizar a placa na câmara com o reagente de ninidrina. 8- Secar as placas dentro da câmara com um secador durante 1 ou 2 minutos. 10- Fazer um esquema das placas de cromatografia. 11- Calcular os valores do factor de retenção (Rf): Rf = distância percorrida pela amostra / distância percorrida pelo solvente 20 Resultados 1 – Interprete o esquema das placas de cromatografia. 2 - Que conclusões pode tirar no que respeita à especificidade da enzima e reversibilidade da reacção? 3 - Indique se o extracto utilizado continha quantidades detectáveis de aminoácidos ou cetoácidos. 21 TRABALHO Nº 6 DIGESTÃO DE HIDRATOS DE CARBONO, PROTEÍNAS E GORDURAS A nutrição é definida como um conjunto de fenómenos físico-químicos e fisiológicos que ocorrem no interior do organismo e mediante os quais este recebe e utiliza os materiais fornecidos pelos alimentos, que lhe são necessários para a formação e manutenção da sua matéria viva e para a realização das actividades, próprias quer da vida vegetativa, quer da vida de relação e trabalho. No conceito anglo-saxónico, nutrição é o estudo dos nutrientes contidos nos alimentos, desde que são ingeridos até que os produtos finais do seu metabolismo são excretados. Assim, inclui os processos de digestão e absorção, as reacções catabólicas e anabólicas e o estudo das necessidades de nutrição para todos os segmentos do organismo da pessoa saudável. O conjunto de acções sofridas pelos alimentos no tubo digestivo, desde a boca, que levam ao “desdobramento” dos hidratos de carbono, das gorduras e das proteínas em partículas suficientemente pequenas para passarem a parede intestinal e entrarem na circulação, corresponde à digestão. Os sistemas complexos de que dispõem o aparelho digestivo do homem para separar os alimentos nos seus nutrientes que vão ser, posteriormente, absorvidos, assentam num processo básico, que consiste na actualização de enzimas desagregadoras das grandes moléculas dos constituintes alimentares, sendo os hidratos de carbono convertidos em glicose e outros açúcares simples (6 átomos de carbono), as gorduras em ácidos gordos e glicerol e as proteínas em aminoácidos. As enzimas estão contidas nos sucos digestivos da boca, estômago e intestino e são produzidas por glândulas específicas, controladas pelos sistemas nervoso e endócrino. As bactérias da parte terminal do intestino podem desempenhar algum papel na digestão de certos alimentos, em especial dos constituintes do tipo da celulose, ou fibra, que, resistindo às enzimas digestivas, podem sofrer modificações por acção das celulases bacterianas. Normalmente, mais de 90% dos hidratos de carbono, das gorduras e das proteínas que formam os alimentos são completamente digeridos e absorvidos, mas os ácidos gordos e os aminoácidos essenciais são absorvidos em mais de 98%. Em fisiologia, a absorção é a penetração de uma substância através das mucosas ou da pele ou da membrana celular para o meio interno do organismo ou para o protoplasma celular. Em nutrição, a absorção corresponde à passagem através da mucosa do tubo digestivo dos nutrientes que fazem parte da constituição dos alimentos e atingem a corrente sanguínea. A absorção faz-se, principalmente, ao nível do intestino delgado e do cólon, de forma selectiva para cada um dos nutrientes. Os processos fisiológicos da absorção são para certos nutrientes através de mecanismos simples, por osmose, mas na generalidade envolvem reacções complexas de passagem para o interior das células da mucosa e, posteriormente, do meio interno destas para os capilares sanguíneos ou linfáticos. Nestas reacções, muito delas ainda mal conhecidas, intervêm iões e moléculas ionizadas, enzimas e hormonas. 22 Objectivo Pretende-se evidenciar, com estes trabalhos experimentais, a função das enzimas amilase salivar, pepsina e lipase pancreática na digestão de alguns alimentos. A actividade ou capacidade digestiva destas enzimas pode ser verificada in vitro medindo o desaparecimento de substractos e/ou o aparecimento dos produtos resultantes. Os resultados obtidos podem correlacionar-se com patologias derivadas de perturbações genéticas específicas, que condicionam anomalias metabólicas. PARTE A: DIGESTÃO DO AMIDO PELA AMILASE SALIVAR Introdução A maior parte dos alimentos é ingerida sob formas que o organismo não pode utilizar directamente, por serem sólidos ou não serem absorvidos no tubo digestivo. Desta forma, os alimentos precisam de sofrer a mastigação para se produzir a ruptura de parte das suas estruturas e, posteriormente, serem decompostos em moléculas suficientemente pequenas para passarem a mucosa da parede intestinal e atingirem a corrente sanguínea. A desintegração dos alimentos ingeridos em formas assimiláveis é facilitada pelas operações prévias de cozedura, e constitui o processo inicial de digestão. Na boca, os alimentos vão libertando os seus hidratos de carbono simples e complexos, que começam a ser desintegrados pelos processos de trituração e da digestão enzimática, em resultado dos movimentos de mastigação, pela acção múltipla da saliva, que actua pela sua qualidade de líquido humidificante e lubrificante e veículo da enzima amilase e de elementos minerais. A saliva é produzida por três pares de glândulas salivares e é formada por cerca de 99,5% de água, pelo que favorece a dissolução de moléculas que a mastigação vai libertando dos alimentos sólidos, e inicia o ataque, pela amilase, dos polissacarídeos que são sensíveis à sua acção. A amilase actua sobre o amido e o glicogénio, em presença de cloro, que é indispensável, desdobrando-os em dextrinas e maltose, de que é corrente apercebermos o sabor adocicado. Mas este efeito não tem significado relevante em digestão porque é de curta duração, e cessa quando o bolo entra em contacto com o suco gástrico estomacal. Este é praticamente inactivo no desdobramento dos polissacarídeos. No intestino, o conteúdo do estômago (quimo) chegado intermitentemente, de consistência cremácea, vai sofrer desde o duodeno, e após se tornar alcalino, a acção de enzimas pancreáticas (amilase pancreática de efeito semelhante ao da amilase salivar) e intestinais segregadas pelas glândulas de Brunner do duodeno e de Lieberkuhn (dissacaridases: sacarase, lactase, maltase e isomaltase). Sabe-se que existem várias dissacaridases, dentro das designações genéricas indicadas, sendo quatro particularmente importantes: 23 - maltase Ia: hidrolisa 50% da maltose e toda a isomaltose. - maltase Ib (invertase ou sacarase): hidrolisa a totalidade da sacarose e 25% da maltose. Possui uma rápida actividade. - Maltases II e III: dissociam os restantes 25% de maltose. No intestino grosso há acção variável da flora intestinal, actuando pelas enzimas hidrolases sobre alguns polissacarídeos não decompostos na parte superior do intestino, como a hemicelulose e, em menor extensão, a celulose, que além de fermentações gasosas, podem produzir alguma glicose. Princípio A função aldeídica ou cetónica é susceptível de ser oxidada; as aldoses e cetoses vão, portanto, comportar-se como redutores e, em particular, vão poder reduzir os sais metálicos, em solução alcalina, até ao estado de metal ou até ao grau de oxidação inferior. Um dos reagentes mais utilizados para detectar a presença de açucares redutores e para os dosear consiste num sal cúprico (Cu2+). O processo de oxidação das oses ocorre com a redução do hidróxido cúprico, em meio alcalino, de cor azul e solúvel, em hidróxido cuproso, amarelo e insolúvel. Pelo aquecimento à fervura, este desidrata-se e converte-se em óxido cuproso, dando origem a um precipitado vermelho-tijolo: açucar reduzido + 2 Cu(OH)2 2 CuOH açucar oxidado + CuOH + H2O Cu2O + H2O Esta reacção ocorre com todas as moléculas de aldoses e cetoses que têm, senão um grupo aldeídico ou cetónico livre, pelo menos pseudoaldeídico ou pseudocetónico susceptível de fornecer um grupo livre à medida que o estado de equilíbrio da solução se desloca em função da própria reacção. A maltose, um di-holósido redutor (a função hemiacetálica de uma das oses está envolvida numa ligação osídica com um hidroxilo alcoólico da segunda ose), é um produto intermediário da hidrolise - ácida ou enzimática - de poli-holósidos, tais como o amido e o glicogénio. É formada pela união de duas moléculas de D-glucose através de uma ligação -1,4glicosídica. Figura 1. Estrutura química da maltose. 24 O amido é a forma de reserva glucídica nos vegetais. Encontra-se em geral na forma de grãos de amido cuja morfologia só varia de acordo com a espécie vegetal. Na maior parte dos casos é formado por dois constituintes: A amilose, um poli-holósido de cadeias lineares, formada de unidades de D-glucose ligadas entre si por ligações -1,4-glicosídicas. Admite--se hoje, graças ao estudo dos espectros de raios-X, que a cadeia está disposta em hélice com 6 anéis glucopiranósicos, de configuração em cadeira, em cada volta. Esta estrutura explica a cor azul obtida com o iodo: as moléculas de halogéneo dispor-se-ão ao longo do eixo da hélice sob a forma de um complexo iodo- -amilose devido a forças dipolares electrostáticas. Esta propriedade desaparece pela fragmentação da molécula de amilose, na hidrólise. Figura 2. Estrutura química da amilose. A amilopectina, um polissacarídeo cuja massa molecular pode atingir muitos milhões e é formado de cadeias principais idênticas às da amilose, mas sobre as quais vêm ligar-se, através de ligações -1,6-glicosídicas, as cadeias laterais que apresentam estrutura idêntica à das cadeias principais e cujo comprimento varia de 20 a 25 resíduos de glucose. Material . Estufa a 37ºC (incubação das amostras) . Placa de aquecimento com banho-maria (100 ºC) . Tubos de ensaio em vidro (10 ml) . Suporte e molas para tubos de ensaio . Pipetas volumétricas (3 ml, 4 ml, 5 ml) . Pipetas Pasteur . Vórtex . Pipetador . Cronómetro Soluções - (já preparadas) Solução de amido: dissolver 1 g de amido em 100 ml de H 2O destilada com aquecimento. Lugol: dissolver 1 g de iodo e 2 g de iodeto de potássio em 300 ml de água. Reagente de Benedict: Dissolver 5 g de carbonato de calcio; 8,5 g de citrato de sódio e 0,85 g de sulfato de cobre em 500 ml de H2O. Solução de -amilase (tipo VI-B) diluída de forma a ficar 300 unidades/ml (equivalente à saliva). 25 Procedimento experimental 1. Identificar 4 tubos de ensaio (A1; A2; A3 e A4). 2. Adicionar a 1 deles (A1) 3,0 ml de H2O destilada. 3. Colocar nos restantes 3,0 ml de solução de - amilase. 4. Ferver em banho de água o tubo A4 durante 3 min e deixar arrefecer. 5. Adicionar (na hotte) 3 gotas de HCl concentrado ao tubo A3 e agitar. 6. Adicionar a cada um dos 4 tubos 5,0 ml de solução de amido e agitar no vórtex. 7. Incubar na estufa a 37 C durante 45 min. 8. Identificar mais 4 tubos de ensaio como B1; B2; B3 e B4. 9. Transferir metade do volume existente no tubo A1 (ou seja 4 ml), para o tubo B1. Repetir o procedimento para os outros tubos. 10. Ao conjunto dos tubos A adicionar 3 gotas de solução de Lugol e observar o resultado. 11. À série de tubos B adicionar 5,0 ml de reagente de Benedict e colocar em banho de água a ferver durante 2 min. Retirar os tubos do banho e observar. Resultados 1. Apresente, sobre a forma de tabelas, a cor obtida em cada série de tubos de acordo com a seguinte escala (exemplo para o teste de Benedict): - Azul (teste de Benedict negativo) + Verde ++ Amarelo +++ Laranja ++++ Vermelho-tijolo (teste de Benedict positivo) 2. Identifique, explicando, os tubos que não reúnem as condições experimentais necessárias para uma eficaz actuação da amilase. 3. Que conclusões se podem tirar quando o teste de Benedict e o teste do Iodo são ambos positivos? Estes resultados seriam alterados se o tempo de incubação fosse prolongado? 4. Explique, recorrendo aos resultados obtidos, como é que a actividade da amilase é influenciada pelo pH e pela temperatura. 26 PARTE B: DIGESTÃO DA ALBUMINA DO OVO PELA PEPSINA Introdução As proteínas dos alimentos, quer de origem animal, quer de origem vegetal, só começam a ser digeridas no estômago, e a sua de composição, até que sejam libertados os aminoácidos que as constituem, prossegue no intestino, onde se passam as fases principais. No estômago, as substâncias quimicamente activas são o ácido clorídrico, o pepsinogénio e a quimosina (ou renina). As acções do ácido clorídrico consistem principalmente na acidificação do meio gástrico e no seu efeito hidrolítico. O HCl activa, igualmente, o pepsinogénio, transformando-o em pepsina, destrói os micróbios que possam estar presentes nos alimentos e, ao atingir o duodeno, desencadeia diversos mecanismos essenciais para a digestão das proteínas, nomeadamente as secreções pancreática e intestinal. A desnaturação das proteínas pelo HCl, em resultado da destruição das ligações de hidrogénio condicionadoras da estrutura terciária, que desaparece, facilita as acções das enzimas proteolíticas. A digestão das proteínas é iniciada no estômago pela pepsina, que tem origem nas células principais sob a forma de um precursor inactivo – o pepsinogénio. A activação da pepsina é desencadeada, no pH adequado, por moléculas de outro pepsinogénio que desdobram o pepsinogénio inactivo, seguindo-se a acção da pepsina activa que, por autocatálise, activa novas moléculas de pepsinogénio. A pepsina transforma as proteínas desnaturadas pelo ácido clorídrico em proteoses e estas em peptonas, que são ainda polipeptídeos de elevado peso molecular, mas solúveis em solução aquosa. Hidrolisa as ligações peptídicas, dentro da estrutura dos polipetídeos, pelo que se trata de uma endopeptidase, actuando, preferencialmente nas ligações formadas pelos aminoácidos dicarboxílicos e aromáticos. No intestino, as proteínas e peptídeos chegados do estômago são atacados pelas enzimas do suco pancreático, designadamente, a tripsina, quimotripsina e carboxipeptidase. As proteases pancreáticas libertam pequenos peptídeos com 2, 3 ou 4 aminoácidos e alguns aminoácidos, sobretudo tirosina e triptofano. O suco intestinal segrega várias enzimas, com acção sobre os derivados das proteínas libertadas anteriormente, incluindo a enteroquinase, activadora da tripsina. Na parte final do intestino, cólon esquerdo, alguns compostos azotados podem ser substracto de acções bacterianas de putrefacção, com libertação de aminas de cheiro característico, que são bases provenientes da descarboxilação de aminoácidos, como a alanina, a tirosina e a histidina. Material . Bisturi . Tubos de ensaio de vidro (15 ml) . Congelador 27 . Banho ou estufa a 37 ºC . Suporte para tubos de ensaio . Cronómetro . Vórtex . Pipetador . Pipetas volumétricas (5 ml) Reagentes – (já preparados) . Ovo cozido . HCl concentrado (2 M) . NaOH 10 M . Solução de pepsina (5 g em 100 ml) Procedimento experimental 1. Cortar 5 lâminas de clara de ovo cozido com o bisturi. 2. Colocar 1 lâmina em cada tubo de ensaio. 3. Identificar os tubos com P1, P2, P3, P4 e P5. 4. Adicionar 1 gota de H2O ao tubo P1. 5. Adicionar 1 gota de HCl 2 M aos tubos P2, P3, P4. 6. Adicionar 1 gota de NaOH 10 M ao tubo P5. 7. Adicionar 5,0 ml de solução de pepsina a cada um dos tubos e agitar. 8. Colocar o tubo P3 no congelador durante 30 min. 9. Colocar os restantes tubos na estufa a 37C durante 45 min. Resultados 1. Observe a aparência da clara do ovo após incubação em cada um dos tubos. Qual dos tubos reúne as condições experimentais necessárias para uma eficaz actuação da pepsina? Explique. 2. O que é que pode concluir acerca do valor de pH e temperatura óptimos para a pepsina? 3. Compare o efeito da adição do HCl na parte A com a parte B deste trabalho. Explique as diferenças em termos fisiológicos. 4. Explique a necessidade de duplicação das condições experimentais nos tubos 2 e 4. 28 PARTE C: DIGESTÃO DE LÍPIDOS PELA ACÇÃO DA PANCREATINA E DA BÍLE Introdução Na boca, as acções mecânicas e de ensalivação dos alimentos são predominantes, não havendo para as gorduras modificações de ordem digestiva. Julga-se que na criança seja segregada pequena quantidade de lípase, activada pelo leite materno. No estômago, tem sido verificada a existência de uma lípase gástrica muito fracamente activa, que na criança também seria activada pelo leite. Os lípidos são, desta forma, pouco modificados no estômago, apenas se iniciando a sua emulsão pelos movimentos de agitação do conteúdo gástrico que vai sendo evacuado para o intestino, com demora proporcional à natureza dos constituintes dos alimentos em digestão. Os lípidos desencadeiam a secreção das hormonas enterogastronas pela parede duodenal, as quais inibem a motilidade e a evacuação gástricas. No duodeno, a chegada do quimo ácido desencadeia as secreções pancreática, biliar e intestinal, pelo contacto directo com a mucosa, que têm a função de neutralizar o quimo. O desencadeamento da secreção pancreática é essencialmente hormonal e devido, em primeiro lugar, à secretina, que provoca a secreção de um volume abundante de suco pancreático rico em iões bicarbonato que neutraliza a acidez do quimo e, em segundo lugar, à colecistoquinina (CCK), a qual actua na secreção das enzimas pancreáticas. A secreção externa do pâncreas contem enzimas activas para todos os alimentos, aumentando a quantidade de cada um deles, proporcionalmente ao uso no regime alimentar de hidratos de carbono, gorduras e proteínas. A lípase pancreática hidrolisa as gorduras neutras (triglicerídeos) em ácidos gordos e glicerol, mas esta acção não leva sempre à separação completa, encontrando-se mono- e diglicerídeos. O desencadeamento da excreção biliar, para a secreção da bile da vesícula, é efectuado intermitentemente pelas gorduras chegadas ao duodeno, sendo a contracção da vesícula biliar estimulada pela hormona CCK. A bile é segregada de forma contínua pelo fígado, em volume de 500- -1000 ml por dia, sendo estimulada a sua secreção pelos coleréticos fisiológicos e medicamentos. É constituída fundamentalmente por três componentes: bilirrubina, colesterol e sais biliares. Os sais biliares (glicolato e taurocolato de sódio, conjugados, respectivamente, com glicina e taurina) têm grande capacidade de emulsão, dividindo as moléculas de gordura de forma a constituírem pequenas gotículas, o que faz aumentar enormemente a sua superfície de contacto com os fluídos biológicos, nos quais se encontram as enzimas hidrolíticas. Os sais biliares desempenham o papel de activadores, ao prepararem as gorduras pela emulsão e reforçarem a actividade das lípases pencreática e intestinal, indispensáveis para a digestão das gorduras. 29 Material . Estufa a 37 ºC . Tubos de ensaio em vidro (15 ml) . Micro-espátula . Caixa de Petri em vidro . Fita indicadora de pH . Pipetas Pasteur em vidro ou em plástico . Pipetador . Pipetas volumétricas (3 ml e 5 ml) . Cronómetro . Vórtex . Suporte para tubos Reagentes - (já preparados) . Azeite . Sais biliares . Solução de pancreatina Procedimento experimental 1. Identificar 3 tubos de ensaio com L1, L2, L3. 2. Pipetar 3,0 ml de azeite para cada um dos tubos. 3. Adicionar 1 microespátula de sais biliares aos tubos L1 e L3 e agitar no vórtex. 4. Pipetar 5,0 ml de solução de pancreatina para os tubos L2 e L3 e agitar no vórtex. 5. Adicionar 5,0 ml de H2O destilada ao tubo L1 e agitar. 6. Incubar os tubos a 37C durante 45 min. Retirar 2 gotas da solução do tubo L1 e aplicar sobre a fita indicadora de pH. Repetir o processo de 10 em 10 min e para cada um dos tubos de modo a obter 2-3 medidas de pH por tubo. Resultados 1. Construa uma tabela com os valores de pH obtidos e relacione com as reacções verificadas. Em que tubo a digestão das gorduras ocorreu mais rápida e completamente? 2. Explique, referindo o papel dos sais biliares e da pancreatina, os resultados obtidos. 30
