identificação do projeto - pibic

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
DEPARTAMENTO DE PESQUISA
PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC CNPq e PIBIC UFPA
RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO
Período : Outubro de 2014 a Junho de 2015
(
) PARCIAL
( X ) FINAL
IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO
Título do Projeto de Pesquisa: DIVERSIDADE GENÉTICA DE CEPAS DE VÍRUS INFLUENZA
CIRCULANTES NA REGIÃO AMAZÔNICA.
Nome do Orientador: RITA CATARINA MEDEIROS SOUSA.
Titulação do Orientador: DOUTORADO.
Departamento: NÚCLEO DE MEDICINA TROPICAL.
Unidade: NÚCLEO DE MEDICINA TROPICAL.
Laboratório: LABORATORIO DE VIRUS RESPIRATORIOS/IEC.
Título do Plano de Trabalho: DIVERSIDADE GENÉTICA DE CEPAS DE VÍRUS INFLUENZA
CIRCULANTES NA REGIÃO AMAZÔNICA.
Nome do Bolsista: CÁSSIO MELO SALES
Tipo de Bolsa :
(X) CNPq
( ) PIBIC/UFPA
AGOSTO DE 2015
1.
INTRODUÇÃO
A Influenza (gripe) é uma doença de alta transmissibilidade, que está entre as
principais causas de morbi-mortalidade em todo o mundo. Estima-se que, por ano, cerca de 5
a 15% da população mundial é infectada pelo vírus da gripe. No Brasil, a infecção pelo vírus
Influenza tem sido descrita como uma onda que começa em abril no norte equatorial e viaja
para o sul, por um período de aproximadamente três meses, atingindo as regiões temperadas
do país (BAHER, 2010; DE MELO FREITAS, 2013).
Os agentes etiológicos responsáveis pela gripe, são os vírus Influenza, que
pertencem à família Orthomyxoviridae, que compreende os seguintes gêneros: Influenzavirus
A, Influenzavirus B, Influenzavirus C, Thogotovirus, Isavirus e Quaranjavirus (ICTV, 2014).
Os gêneros de vírus Influenza tem o potencial de causar doença em humanos, porém, o
Influenza A se destaca por sua maior variabilidade genética, que possibilita que este vírus seja
responsável por grandes epidemias ou pandemias (WRIGHT; NEUMANN; KAWAOKA,
2013).
A variabilidade genética dos vírus Influenza principalmente se deve a dois fatores,
a configuração do seu genoma segmentado e a circulação destes vírus em animais
(reservatórios animais), especialmente aves aquáticas migratórias. Dentre as proteínas
codificadas pelo seu genoma, existem duas glicoproteínas de superfície, denominadas
Hemaglutinina (HA) e Neuraminidase (NA), que estão relacionadas a ligação do vírus à
célula e a segunda à liberação de novos vírions para subsequente infecção celular. As
mutações que afetam os vírus Influenza ocorrem principalmente nestas duas proteínas,
propiciando assim, aterações genéticas que permitem que o vírus escape das defesas do
hospedeiro (SHEN et al., 2009; TAO et al., 2014).
Considerando o grande impacto que as variantes do vírus Influenza podem causar
à saúde pública, o constante monitoramento de mutações associadas à variabilidade das cepas
de vírus Influenza desempenha importante papel na obtenção de dados que subsidiam
intervenções de prevenção e controle de infecções por este patógeno, como na apreciação
adequada da composição vacinal com as características genéticas e antigênicas das cepas
circulantes.
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL

Detecção e caracterização de cepas de vírus Influenza circulantes na região
Amazônica nos anos de 2014 a 2015.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Descrever o padrão de circulação das cepas de vírus Influenza circulantes na
população abordada.

Analisar a ocorrência de rearranjo genético entre as cepas circulantes no período
estudado.

Verificar a ocorrência de mutações nos genes da HA e NA associadas ao escape à
resposta imunológica do hospedeiro.

Verificar a ocorrência de mutações nos genes codificador da hemaglutinina
associadas a patogenicidade do vírus influenza

Definir a ocorrência de mutações no gene da NA implicadas na resistência aos
antivirais.

Comparar as cepas isoladas na Região Amazônica com aquelas isoladas em outras
partes do Brasil e do mundo.
3.
MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. POPULAÇÃO DE ESTUDO
Os espécimes clínicos (aspirado nasofaríngeo ou swab combinado) são obtidos de
indivíduos de ambos os sexos e diferentes faixas etárias, com queixas sugestivas de gripe
atendidos em unidades de saúde nos estados do Acre, Amapá, Amazonas, Pará e Roraima no
período de janeiro de 2014 a junho de 2015, triados pela Rede de Vigilância da Gripe.
3.2. DETECÇÃO DE VÍRUS INFLUENZA A e B
A detecção dos vírus Influenza A e B foi realizada através da técnica de qRT-PCR (Realtime polymerase chain reaction), de acordo com o protocolos fornecidos pelo Centers of for Disease
Control and Prevetion (CDC, Atlanta, EUA) (CDCB, 2007; CDCC, 2009). Foram utilizados pares de
oligonucleotídeos iniciadores específicos, Foward e Reverse, e sondas marcada com o fluoróforo
FAM. A reação foi realizada com o kit comercial SuperScriptTM One-step qRT-PCR with Platinum
TaqTM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), seguindo orientações do fabricante. Em resumo, cada
mistura de reação incluiu 12,5 µL de master mix 2X, 0,5 µL (40 μM) de cada iniciador, 0,5
µL (10 µM) de sonda, 0,5 µL (50 μM) de Rox, 0,5 µL (5U) de mix de enzima e 5 µL de RNA
(volume total 25 µL). As etapas de amplificação foram realizadas no sistema de detecção ABI
7500 PCR System (Applied Biosystems) nas seguintes condições: um ciclo a 50°C por 30
minutos, seguido de 95°C por 2 minutos, posteriormente 45 ciclos de 95°C por 15 segundos e
55°C por 30 segundos. Cada conjunto de amostras submetido à amplificação incluiu um
controle negativo, que contém todos os reagentes da mistura e água livre de DNAse e RNAse,
e um controle positivo.
3.3. AMPLIFICAÇÃO DO GENE CODIFICADOR DA HA DOS VÍRUS INFLUENZA A E
B
A amplificação do gene codificador da HA foi realizada por reação em cadeia da
polimerase precedida de transcrição reversa (RT-PCR) convencional. A RT-PCR foi feita
utilizando-se Kit comercial SuperScript III TM One-step RT-PCR with Platinum Taq®(Invitrogen Life Technologies) e oligonucleotídeos iniciadores específicos para o gene da
hemaglutinina dos vírus Influenza A e Influenza B, o produto obtido na reação foi submetido
a nested-PCR. Para cada conjunto de amostras submetido à amplificação, foram
acrescentados um controle negativo (água livre de DNAse e RNAse) e um positivo (cepas de
vírus Influenza isoladas em cultivo celular).
3.4. AMPLIFICAÇÃO DO GENE CODIFICADOR DA NA de Vírus Influenza A
A fim de proceder à amplificação do gene codificador da NA, foi realizada a RTPCR, utilizando o kit comercial SuperScriptTM One-step RT-PCR with Platinum TaqTM
(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), e oligonucleotídeos iniciadores específicos. Posteriormente,
foi realizada a etapa de Seminested-PCR. Cada conjunto de amostras submetido à
amplificação foi acompanhado de um controle negativo (água livre de DNAse e RNAse) e um
positivo (cepas de vírus Influenza isoladas em cultivo celular).
3.5. ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE
Ao término da amplificação, a fim de visualizar as bandas de interesse, os
produtos das reações de nested-PCR e Semi-nested PCR foram analisados por eletroforese em
gel de agarose a 1,5%, corado por GelRed™ Nucleic Acid Gel Stain (Biotium, Hayward, CA,
USA), com tampão 1x tris-acetato-EDTA (TAE). O marcador de peso molecular
SmartLadder® (Eurogentec, San Diego, CA, USA) foi aplicado em cada gel. A visualização
dos amplicons foi realizada em transiluminador com luz ultravioleta (UV) e fotografado com
auxílio do sistema de foto documentação Vilber Loumart.
3.6. PURIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DOS PRODUTOS DA PCR
Os produtos da PCR que apresentaram a banda de interesse no gel de agarose
foram purificados utilizando-se o kit comercial MEGAquick-spinTM PCR & Agarose Gel
DNA Extraction System (iNtRON Biotechnology), seguindo as instruções do fabricante. A
quantificação do DNA para a determinação da concentração do mesmo foi realizada seguindo
instruções do fabricante do marcador de peso molecular Low Mass Ladder® (Invitrogen,
Carlsbad, CA, USA).
3.7. REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO
Os produtos purificados foram submetidos à reação de sequenciamento pelo
método de terminação em cadeia (SANGER et al, 1977), utilizando o Kit comercial Big Dye
Terminator® (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA). Posteriormente as sequências foram
submetidas à precipitação com isopropanol e então, analisadas em sequenciador automático
ABI Prism 3130xl (Applied Biosystems).
3.8. EDIÇÃO E ALINHAMENTO DAS SEQUENCIAS
A análise e edição das sequências nucleotídicas obtidas para os genes da HA e da
NA foram realizadas utilizando o programa Geneous 6.1, e alinhadas com sequências de
outras
cepas
isoladas
e
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
disponíveis
no
banco
de
dados
do
Genbank
4.
RESULTADOS
No período de janeiro de 2014 a junho de 2015 deram entrada no Laboratório de
Vírus Respiratório de Instituto Evandro Chagas, 3909 amostras de pacientes com quadro
sugestivo de gripe. Destas, 377 foram positivas para o vírus Influenza, sendo 83 A
(H1N1)pdm09, 213 A (H3N2) e 81 Influenza B.
4.1
ANÁLISE DA HEMAGLUTININA (HA)
A análise das sequências parciais do gene codificador da HA dos vírus Influenza
A (H1N1) pdm09 e A (H3N2) evidenciou a similaridade genética das cepas de vírus Influenza
A circulantes em nossa região com as cepas vacinais (Figura 1 e 2).
Figura 1: Comparação filogenética baseada na sequência nucleotídica parcial do gene da HA
de Vírus A H1N1 pdm09, com as cepas vacinais e cepas de outras localidades do mundo.
Árvore gerada pelo Método de Máxima Parcimônia com 1000 réplicas de bootstrap.
Figura 2: Comparação filogenética baseada na sequência nucleotídica parcial do gene da HA,
com as cepas vacinais e cepas de outras localidades do mundo. Cepas de vírus Cepas de vírus
Influenza A (H3N2). Árvore gerada pelo Método de Máxima Parcimônia com 1000 réplicas
de bootstrap.
Já em relação aos vírus Influenza B, a maioria das cepas circulantes em nossa
região pertence a linhagem Victória, contudo a linhagem contemplada na vacina no ano de
2014 foi a Yamagata (B/Massachusetts/02/2012) (Figura 3).
Figura 3: Comparação filogenética baseada na sequência nucleotídica parcial do gene da HA
dos vírus Influenza B, com as cepas vacinais e cepas de outras localidades do mundo. Árvore
gerada pelo Método de Máxima Parcimônia com 1000 réplicas de bootstrap.
4.2
ANÁLISE DA NEURAMINIDASE (NA)
Na análise da NA, nas cepas A (H1N1) pdm09 foi encontrada a substituição I106V,
que está associada à diminuição de sensibilidade aos antivirais. Assim como nas amostras A
(H3N2) verificou-se a ocorrência da substituição I222V, que produz uma redução moderada
na sensibilidade ao oseltamivir.
5. DISCUSSÃO
As alterações aminoacídicas resultantes de mutações nucleotídicas da HA e NA,
podem alterar as propriedades associadas com a antigenicidade ou patogenicidade das cepas
de vírus Influenza, bem como na falha do tratamento com antivirais mediante o surgimento de
cepas resistentes aos medicamentos que são utilizados no manejo clínico do paciente com
gripe.
A análise do gene da HA evidenciou a similaridade genética das cepas de vírus
Influenza A circulantes em nossa região com as cepas vacinais. Segundo estudo conduzido
em Portugal nos anos de 2012 e 2013, as cepas do vírus Influenza A (H3N2) e A
(H1N1)pdm09, apresentaram elevada homologia com as estirpes incluídas na vacina
antigripal da época. Contudo, assim como visto em nossa investigação, as cepas do vírus
Influenza B, evidenciaram uma maior variabilidade antigênica (GUIOMAR et al., 2014).
Quanto ao monitoramento da resistência aos antivirais, as cepas do vírus Influenza A e
B estudadas na maioria apresentaram-se susceptíveis aos antivirais oseltamivir e zanamivir.
Contudo, ainda em pequeno número, evidencia-se a ocorrência de substituições aminoacídicas
associadas a resistência aos antivirais.
Desde 2009, quando o vírus Influenza A (H1N1) pdm surgiu, já havia descrição de
raras mutações de resistência aos antineuraminidases, especialmente ao oseltamivir. Todavia,
esse cenário vem mudando, com a notificação do aumento do número de casos de gripe
causada por cepas resistentes aos antineuraminidases. Nossas observações corroboram os
dados da literatura, onde mais de 95% das amostras testadas para a resistência aos INAs
permanecem sensíveis (VRIES, 2010; ESHAGUI, 2011).
Estudos acerca da resistência do vírus Influenza A (H3N2) realizados pelo CDC
demonstram padrões de resistência onde a maioria dos vírus testados é suscetível ao
oseltamivir. Nos estudos do CDC, no período 2011-2013, entre as amostras subtipadas como
H3N2, 2% eram resistentes aos oseltamivir e 1% ao zanamivir (CDC, 2012; CDC, 2013).
6. CONCLUSÃO
Nosso estudo evidencia a variabilidade das cepas de vírus Influenza circulantes em
nossa região, com vista em cepas analisadas em todo o mundo.
A ocorrência de substituições aminoacídicas relacionadas à resistência aos antivirais
observadas neste estudo, fortalece a importância do monitoramento dos vírus Influenza.
7. CRONOGRAMA DE ATIVIDADES
Meses
Atividades
2014
2015
Desenvolvidas
Ago
Levantamento
Bibliográfico
Set Out Nov Dez Jan
Fev
Mar
Abr Ma
Jun
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
Jul
x
Coleta dos
Espécimes
Clínicos
Extração do
RNAv
Realização dos
testes de
detecção viral
Realização dos
testes de
caracterização
genética
Análise dos
dados
Elaboração do
Relatório
x
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BAEHR, M., FRANZ et. al. . Clinical features of adults younger and older than 50 years hospitalized
with influenza A H1N1 2009 in a private hospital in Santiago, Chile. Rev. chil. infectol., Santiago, v.
27, n. 2, Abr. 2010
CDC.
Influenza
antiviral
drug
resistance.
Disponível
em:
http://www.cdc.gov/flu/about/qa/antiviralresistance.htm. Acesso em: 10/ 01/ 13
CDC. 2012-2013 Influenza Season Week 20 ending May 18, 2013. Disponível em:
http://www.cdc.gov/flu/weekly/. Acesso em 27/05/13
DE MELLO FREITAS, F. T. Sentinel surveillance of influenza and other respiratory viruses, Brazil,
2000-2010. Brazilian Journal of Infectious Diseases, v. 17, n. 1, p. 62–68, 2013.
ESHAGHI, A. et
al. Multidrug-Resistant Pandemic (H1N1)
2009
Infection in
Immunocompetent Child. Emerging Infectious Diseases. Vol. 17, No. 8, Agosto 2011
GUIOMAR, R. et al. Vigilância da Gripe em Portugal no inverno 2012/2013. Instituto
Nacional de Saúde. Observações - Boletim Epidemiológico. Breves Artigos n 8. 2013
INTERNATIONAL COMMITTEE ON TAXONOMY OF VIRUSES (ICTV). Virus
Taxonomy:
2014
Release.
Disponível
em
http://ictvonline.org/virusTaxonomy.asp?taxnode_id=20142706. Acessado em 20 de março
de 2015
SHEN, J., MA, J, WANG, Q.
Evolutionary Trends of A(H1N1) Influenza Virus
Hemagglutinin Since 1918. PLoS ONE. v. 4, n.11, p.e7789, 2009.
TAO, H.; STEEL, J.; LOWEN, A. C. Intrahost dynamics of influenza virus reassortment.
Journal of Virology, v. 88, n. 13, 7485–92, 2014.
TAUBENBERGER, J. K. & MORENS, D. M. The Pathology of Influenza Virus Infections.
Annu Rev Pathol, 3: 499–522, 2008.
WRIGHT, P. F; NEUMANN, G & KAWAOKA, Y. Orthomyxoviruses. In: Field’s Virology.
6th ed.,vol. 2. Knipe, D. M. & Howley, P. M. (eds). Lippincott Williams & Wilkins, p.16911740. 2013.
VRIES, E. V. D., STELMA, F. F., BOUCHER, C. A.B. Emergence of a Multidrug Resistant
Pandemic Influenza A (H1N1) Virus. The New England Journal of Medicine. 363;14
september, 2010.
PARECER DO ORIENTADOR: Manifestação do orientador sobre o desenvolvimento das
atividades do aluno e justificativa do pedido de renovação, se for o caso.
O aluno desenvolveu apenas parte do projeto, uma vez que por motivo de saúde se ausentou das
atividades por 4 meses
DATA : 07 / 08 /2015
_________________________________________
ASSINATURA DO ORIENTADOR
____________________________________________
ASSINATURA DO ALUNO
INFORMAÇÕES ADICIONAIS: Em caso de aluno concluinte, informar o destino do mesmo após a
graduação. Informar também em caso de alunos que seguem para pós-graduação, o nome do curso e
da instituição.