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15º Conferência Internacional de Pesquisas em Cacau, São José, Costa Rica, 2006.
INDUÇÃO DE RESISTÊNCIA SISTÊMICA PARA O CONTROLE DA VASSOURADE-BRUXA Crinipellis perniciosa(Stahel) Singer EM CACAUEIROS (Theobroma cacao
L.) DOS CLONES ICS 1 E CCN 51.
Deraldo Ramos Vieira e Raúl René Valle
Palavras chave: elicitores químicos, resistência sistêmica adquirida, reação de
hipersensibilidade
Resumo
A indução de resistência sistêmica adquirida em plantas contra fitopatógenos, se constitui
numa alternativa tecnológica bastante promissora. Ela se caracteriza pela ativação dos
mecanismos de resistência de caráter multigênico que se encontram em estado latente nas
células vegetais, capazes de proteger a planta contra vírus, bactérias, fungos e nematóides,
durante um longo período, ou talvez, por toda a vida da mesma. Alguns produtos indutores
já estão disponibilizados no mercado. Com o objetivo de identificar algumas moléculas
com capacidade indutora, foram testadas algumas substâncias que são metabolizáveis pela
planta e de impacto ambiental praticamente nulo, no controle da vassoura-de-bruxa em
cacaueiros. No experimento 1, plantas adultas do clone de cacau (Theobroma cacao L.) ICS
1, susceptíveis à vassoura-de-bruxa, foram submetidas numa única vez, à injeção no tronco,
via xilema, de 20 mL dos diferentes indutores, caracterizados pelo controle (T0), glicose a
0,3 M (Molar) (T1), 0,6 M(T2), 0,9 M(T3) e 1,2 M (T4), o ácido salicílico 15 mM mais a
glicose 0,6 M (80% + 20% da mistura respectivamente) (T5), o ácido salicílico a 15 mM
(T6), cloreto de potássio 0,5 M (T7), a sacarose 0,3 M (T8) e 0,45 M (T9). Após 36 meses,
registrou-se a eficiência de vários indutores na diminuição estatisticamente significativa de
vassouras vegetativas, de almofadas, número de frutos infectados e aumento do número de
frutos sadios por planta, quando comparados ao controle (Tukey (p  0,05). No
experimento 2, plantas do clone de cacau (Theobroma cacao L.) CCN 51, susceptíveis à
vassoura-de-bruxa, com 4 anos de campo, foram submetidas a tratamentos idênticos via
injeção única no tronco, de10 mL por planta no ensaio 1 e via pulverização foliar de 100,
100 e 50 mL por planta no ensaio 2, caracterizados em seguida: controles (T0) água via
pulverização e via injeção, ácido salicílico 15 mM mais glicose 0,6 M (80% + 20% da
mistura respectivamente) (T1), ácido salicílico 15 mM mais glicose 0,6 M mais peróxido de
hidrogênio 5mM (80% + 10% + 10% da mistura respectivamente) (T2), ácido salicílico 15
mM mais peróxido de hidrogênio (80% + 20% da mistura respectivamente) (T3) quitosana
200 ppm (T4), cloreto de potássio 0,5 M (T5). Após 18 meses, registrou-se a eficiência de
alguns indutores na diminuição estatisticamente significativa de vassouras vegetativas, de
almofadas, número de frutos infectados e aumento do número de frutos sadios por planta,
quando comparados ao controle (Tukey p  0,05).
Introdução
A vassoura-de-bruxa atualmente se constitui na doença mais insidiosa e de maior
importância sócio-econômica para a cacauicultura brasileira. O agente etiológico é o
basidiomiceto hemibiotrófico denominado Crinipellis perniciosa. Atua Infectando tecidos
jovens com células em plena divisão e crescimento (meristemas), localizadas em ramos,
almofadas florais e frutos jovens do cacaueiro. Esse aspecto torna essa doença na mais
difícil de ser controlada, haja vista os altos custos dispensados atualmente no controle
químico, visando proteger as áreas da planta em pleno crescimento, portanto vulneráveis à
doença. O C. perniciosa apresenta no seu ciclo de vida, uma fase biotrófica (parasítica),
quando se estabelece no apoplasto, após a germinação dos esporos e formação das hifas
(Andebrhan, 1983; Rudgard & Butler, 1987). Acredita-se que nessa fase ocorra um
desbalanço hormonal, com a oxidação do AIA (auxina) pela ação de enzimas oxidativas do
fungo, sendo uma lacase (polifenoloxidase) e outra uma peroxidase (Krupasagar &
Siqueira, 1969). Verifica-se então, a quebra da dominância apical, estímulo das gemas
laterais, superbrotamento ocasionado por uma hipertrofia e hiperplasia celular, onde o
fungo estabelece uma relação parasítica com o hospedeiro, dando origem às vassouras
(Krupasagar & Siqueira, 1969). O período de incubação do fungo até o surgimento das
vassouras verdes, varia de 5 a 6 semanas (Lawrence & Campelo, 1991). Após 4 a 6
semanas, o fungo invade as células, matando-as, período no qual as vassouras começam a
secar (Lawrence & Campelo, 1991). Decorridos 5 a 6 meses, o patógeno inicia sua fase
saprofítica (reprodutiva), culminando com a liberação dos basidiósporos, estruturas
responsáveis por novas infecções (Lawrence & Campelo, 1991).
Atualmente a Ceplac recomenda o controle integrado da doença, através da poda
fitossanitária, resistência genética, controle biológico e controle químico, o que propicia
bons níveis de contenção da enfermidade. Porém, nos períodos de alta incidência, o
controle químico se torna bastante caro e pouco eficiente e os genótipos considerados
resistentes ainda apresentam níveis significativos de perda de frutos, da ordem de 20 a 40%,
embora bastante inferior aos materiais genéticos tradicionais altamente susceptíveis, que
apresentam uma perda de até 90 % da produção.
Apesar da eficiência dos agroquímicos no controle de doenças de plantas, o
surgimento de populações de patógenos resistentes a defensivos agrícolas, além de
dificultar o controle, propicia grandes prejuízos tanto à industria daquelas substâncias
quanto ao produtor. Outro aspecto referente à utilização desses defensivos em larga escala
no controle de enfermidades de plantas, é o desequilíbrio ecológico que provoca no meio
ambiente, afetando outros organismos não envolvidos nos patossistemas. Trabalhadores
rurais no Brasil envolvidos na aplicação de defensivos agrícolas, geralmente apresentam ao
longo de suas vidas, sérios problemas de saúde por conta da ocorrência de resíduos
químicos em seus organismos. Hoje a população mundial, principalmente a européia, está
bastante atenta para esse fato, exigindo de maneira crescente, produtos que tenham boa
qualidade, que não sejam produzidos com o uso de pesticidas e isentos de resíduos tóxicos.
Na natureza a ocorrência de doenças em plantas é uma exceção, ou seja, a grande
maioria das interações entre plantas e microrganismos são incompatíveis, nas quais não há
manifestação de doença (Agrios, 1997).
A resistência sistêmica adquirida (RSA), mecanismo natural de defesa de plantas
contra doenças, foi primeiramente observada por botânicos, no início do século XX
(Chester, 1933). Ross (1961) mostrou através de experimento em laboratório que, necrose
produzida por inoculação das folhas inferiores de plantas de fumo, com o vírus do mosaico
do fumo (TMV), desenvolvia resistência em toda a planta. Posteriormente descobriu-se que
esse tipo de resistência é de amplo espectro, ou seja, capaz de controlar doenças provocadas
por fungos, bactérias e vírus por um período de alguns dias, meses, ano ou por toda a vida
da planta (Pascholati, S. F. et al., 1995; Görlach et al., 1996; Hunt & Ryals, 1996; Ryals et
al.; 1996). Após a formação de lesões necróticas, seja como parte de um sintoma de doença
ou como parte da resposta hipersensitiva (HR), registra-se nesse momento, a resistência
localizada, na qual células vizinhas às lesões necróticas são induzidas no reforçamento das
paredes celulares via lignificação e produção de proteínas ricas em hidroxiprolina, como
também a síntese de fitoalexinas, ácido salicílico e proteínas relacionadas à patogênese,
para interrupção do processo infeccioso. (Ryals et al., 1996; Schneider et al., 1996; van
Loon et al., 1982).
Após esses eventos, um sinalizador móvel recentemente caracterizado em
Arabidopsis thaliana como sendo uma proteína transportadora de lipídio, induz o
estabelecimento da RSA em toda a planta, com a produção de ácido salicílico livre e
conjugado, aumento dos níveis de glucose e frutose, proteínas RP’s e lignificação da parede
celular, protegendo a planta contra futuros ataques de fitopatógenos (Maldonado et al.,
2002; Chandra et al.,1998).
Resultados de trabalhos científicos no estudo da RSA, tornaram real a possibilidade
de controlar doenças, aproveitando o arsenal de defesa latente existente nas plantas
susceptíveis. Essas descobertas despertaram a atenção da comunidade científica que
vislumbrou a possibilidade de modificar o paradigma referente ao controle de
fitopatógenos, optando por uma tecnologia limpa, eficiente e ecologicamente correta
(Percival, 2001; Lateur, 2002).
O experimento objetivou viabilizar para a cacauicultura, mais uma tecnologia no
controle do Crinipellis perniciosa, através da indução de resistência sistêmica em
cacaueiros adultos do clone de Theobroma cacao L. ICS 1 e CCN 51 susceptíveis à
vassoura-de-bruxa, através da utilização de elicitores químicos.
Materiais e Método
O experimento 1 foi conduzido no Centro de Pesquisas do Cacau, CEPECCEPLAC-Bahia-Brasil, km 22 da rodovia Ilhéus-Itabuna, Ilhéus-BA, utilizando cacaueiros
adultos do clone ICS-1 susceptíveis à vassoura-de-bruxa com aproximadamente 30 anos de
idade. Os tratamentos foram aplicados em dezembro de 2002 através da injeção única de 20
mL dos diferentes indutores no tronco dos cacaueiros via xilema, a 50 cm do solo, com
seringa de alta pressão. Os tratamentos foram: T0, controle injeção com água destilada; T1,
a glicose (G.) 0,30 M; T2, a glicose 0,60 M; T3, a glicose 0,90 M; T4, a glicose 1,20 M;
T5, o ácido salicílico (A.S.) 15 mM + a glicose 0,60 M (80% + 20% da mistura,
respectivamente); T6, o ácido salicílico 15 mM; T7, o cloreto de potássio (C.P.) 0,50 M;
T8, a sacarose (S.) 0,30 M e T9, a sacarose 0,45 M. O delineamento experimental foi de
blocos ao acaso com 4 repetições e 10 plantas por parcela, totalizando 40 plantas por
tratamento. As variáveis avaliadas por planta foram o número de vassouras vegetativas e de
almofadas e número de frutos infectados e sadios. As avaliações foram efetuadas
trimestralmente e os dados são referentes ao período de Janeiro de 2003 a dezembro de
2005 (3 anos). O experimento 2 foi instalado na Faz. Santo Antonio do Engenho, município
de Simões Filho-Bahia-Brasil, no qual plantas do clone de cacau (Theobroma cacao L.)
CCN 51, susceptíveis à vassoura-de-bruxa, com 4 anos de campo, foram submetidas aos
tratamentos aplicados em setembro de 2003 com indutores idênticos via injeção única no
tronco, de 10 mL por planta no ensaio 1 e 3 pulverizações foliares de 100, 100 e 50 mL por
planta no ensaio 2, caracterizados em seguida: T0, os controles água via pulverização e via
injeção, T1 o ácido salicílico 15 mM mais a glicose 0,6 M (80% + 20% da mistura
respectivamente), T2, o ácido salicílico 15 mM mais a glicose 0,6 M mais o peróxido de
hidrogênio 5mM (80% + 10% + 10% da mistura respectivamente), T3, o ácido salicílico 15
mM mais o peróxido de hidrogênio 5 mM (80% + 20% da mistura respectivamente), T4 a
quitosana (Q.) 200 ppm, T5, o cloreto de potássio 0,5 M. O delineamento experimental
utilizado nos 2 ensaios foi de blocos ao acaso, sendo constituído cada um deles, de 6
tratamentos 4 repetições, 5 plantas por parcela, 20 plantas por tratamento, 30 plantas por
bloco, totalizando 120 plantas em cada ensaio. As variáveis avaliadas foram as mesmas do
experimento 1, os dados foram coletados mensalmente e se referem ao período de outubro
de 2003 a março de 2005.
Resultados e Discussão
Experimento 1
Tabela 1.Efeito de diferentes elicitores químicos na indução de resistência sistêmica no
clone de cacau ICS1 para o controle da vassoura-de-bruxa. Janeiro/2003 a
dezembro/2005(3 anos).
Tratamentos
Doses
Vassouras Vassouras Frutos
Frutos
Futos
Vegetativas Almofada Infectados Sadios Sadios
--------------------- Número por planta ------ --- % -------------Controle
25 a
10 a
7a
6b
46
G.
0,3 M
8 b
5b
5a
12 ab
71
G.
0,6 M
6 b
6 ab
6a
16 a
73
G.
0,9 M
8 b
5b
5a
19 a
79
G.
1,2 M
7 b
5b
5a
17 a
77
Á. S. + G.
0,6 M + 15 mM
7 b
5b
5a
16 a
76
Á. S.
15 mM
9 b
7 ab
5a
14 a
74
C. P.
0,6 M
10 b
4b
4a
13 ab
76
S.
0,3 M
13 b
5b
5a
15 a
75
S.
0,45 M
7 b
3b
4a
13 ab
76
Médias seguidas pelas mesmas letras na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo
teste de Tukey (p  0,05)
Experimento 2 Ensaio 1
Tabela 1. Efeito de diferentes elicitores químicos na indução de resistência sistêmica no
clone de cacau CCN 51 para o controle da vassoura-de-bruxa via injeção no
tronco. outubro/2003 a março/2005. (1,5 ano).
Tratamentos
Doses
Vassouras Vassouras Frutos
Frutos
Futos
Vegetativa Almofada Infectados Sadios Sadios
s
--------------------- Número por planta ---- --- % --------------Controle
6a
8 bc
3 ab
4d
57
Á. S. + G.
0,6 M + 15 mM
7a
8 bc
2 bc
5c
71
A. S. + G. + P. H. 0,6 M + 15 mM+ 5mM
5a
6c
1c
6b
86
A. S. + P. H.
15 mM + 5mM
6a
7c
2 bc
3d
60
Q.
200 ppm
6a
10 ab
4a
6b
60
C. P.
0,5 M
5a
11 a
3 ab
8a
73
Médias seguidas pelas mesmas letras na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo
teste de Tukey (p  0,05)
Experimento 2 Ensaio 2
Tabela 1. Efeito de diferentes elicitores químicos na indução de resistência sistêmica no clone de
cacau CCN 51 para o controle da vassoura-de-bruxa via pulverização foliar.outubro/2003 a
março/2005. (1,5 ano).
Tratamentos
Doses
Vassouras Vassouras Frutos
Frutos
Futos
Vegetativa Almofada Infectados Sadios Sadios
s
--------------------- Número por planta ---- --- % --------------Controle
13 a
14 a
2a
1d
33
Á. S. + G.
0,6 M + 15 mM
3b
6c
2a
8a
80
A. S. + G. + P. H. 0,6 M + 15 mM+ 5mM
3b
6c
1a
6b
86
A. S. + P. H.
15 mM + 5mM
3b
11 ab
2a
6b
75
Q.
200 ppm
5b
6c
1a
6b
86
C. P.
0,5 M
5b
9 bc
2a
5c
71
Médias seguidas pelas mesmas letras na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo
teste de Tukey (p  0,05)
No experimento 1 todos os indutores foram estatisticamnte eficientes no controle de
vassoura vegetativa comparados ao controle, com destaque para a G. 0,6 M; no controle de
vassoura de almofada a S. 0,45 M e em seguida o C.P. foram estatisticamente os mais
eficientes comparados ao controle ao controle; não houve diferença estatística entre os
tratamentos no controle de vassoura em fruto; o número de frutos sadios foi
estatisticamnete superior em 6 indutores com relação ao controle, entre os quais se destacou
G. 0,9 M; o percentual de frutos sadios nas plantas induzidas foi bem maior do que o
controle. O peróxido de hidrogênio (H2O2), apresentou boa ação indutora quando aplicado
em combinação com o AS e uma ação ainda mais eficiente quando combinado com o AS e
a G 0,6 M. O longo período no qual a resistência sistêmica esteve presente nos cacaueiros
nesse experimento, pode ser justificado pela presumível “memória bioquímica”. que se
estabeleceu nas plantas após a injeção única em 2002. Assim o contato freqüente entre as
plantas e agentes estressores no ambiente como déficit hídrico, excesso de água no solo,
com destaque para o Crinipellis perniciosa, permitiram reativar os eventos metabólicos
inicialmente induzidos, de caráter multigênico e não específico, latentes, que se
estabeleceram após as injeções, o que transformou uma interação inicialmente compatível
para uma interação incompatível (Tuzun, 2001). Outro fator que certamente deve ter
influenciado na estabilização e manutenção da RSA por longo período, é o aumento da
recombinação somática provocada pelo estresse da indução que permite à planta uma
flexibilidade genética, como mostram os resultados de trabalho realizado por Lucht et al,
(2002), em Arabidopsis. A RSA também
No experimento 2, ensaio 1, com relação a vassoura vegetativa todos os tratamentos
foram estatisticamente iguais; com relação a vassoura de almofada nenhum tratamento foi
melhor que o controle e alguns deles como a quitosana e o cloreto de potássio foram até
inferiores; com referência ao controle de vassoura em frutos o único destaque foi para o
A.S.+ G.+ P.H; o número de frutos sadios foi estatisticamente maior nas plantas induzidas
com exceção do tratamento A.S.+ P.H.; o percentual de frutos sadios foi maior nas plantas
ativadas. O C.P. apresentou a maior quantidade de frutos produzidos por planta e
juntamente com os demais tratamentos com indutores superaram estatisticamente a
testemunha.
No experimento 2, ensaio 2, todos os indutores foram estatisticamnete superiores ao
controle com relação à incidência de vassoura vegetativa; com relação a vassoura de
almofada, somente o tratamento A.S.+ P.H. foi inferior ao controle; com relação ao número
de frutos infectados, todos os tratamentos foram iguais; o número de frutos sadios foi
estatisticamente maior em todos os tratamentos com indução, com relação ao controle, bem
como o percentual de frutos sadios.
É possível que a menor eficiência dos indutores no Experimento 2 ensaio 1,
principalmente com referência ao controle de vassoura vegetativa e de almofada, tenha sido
ocasionada pelo maior estresse provocado nos cacaueiros, pelo volume e/ou concentrações
utilizados na injeção das plantas, ou pelo fato de se tratar de cacaueiros ainda jovens. Em
experimentos com a utilização do indutor abiótico o BTH, desenvolvidos por Louws et al.,
2001 com o cultivo do tomateiro e Romero et al., 2001 com o cultivo da pimenta,
observou-se a diminuição da produção e tamanho das plantas.
As maiores produções verificadas na maioria dos tratamentos com indutores com
relação aos controles nos 3 ensaios, foram também verificadas em vários trabalhos sobre
indução de resistência, como o desenvolvido por Leskovar e Kolenda, 2002 , no qual o
indutor BTH além de controlar o ferrugem branca do espinafre, causado pelo fungo Albugo
occidentalis, aumentou a produção em 50% com relação ao controle.
Em todos os experimentos foi observado o aparecimento de uma clorose malhada quase
imperceptível, em forma de micro pontuações (stippling) em folhas velhas das plantas
induzidas, característica indicadora da presença da resistência sistêmica. Os indutores
aplicados provocam em nível local, perturbações metabólicas como estresses osmótico e
iônico (Agrios, 1997; Buchanan et al., 2000; McDowell et al.,2000; Vranová et al., 2002;
Kawano et al., 2000) além de induzir várias rotas metabólicas envolvidas em mecanismos
de defesa das plantas contra estresses biótico e abiótico. Provavelmente, houve ação direta
de genes RSA, peroxidação de lipídios da membrana plasmática, quebra da integridade da
membrana, abertura de canais de íons, com o influxo de Ca2+, H+ e efluxo de K+ e Cl-,
alteração do pH, explosão oxidativa, ação da enzima de membrana NADPH oxidase,
geração de espécies ativas de oxigênio (H2O2, O2-), de óxido nítrico (NO) ativação da rota
dos fenilpropanoides via ação da fenilalanina amônia-liase, síntese de ácido salicílico,
culminando com a reação de hipersensibilidade e morte celular (Agrios, 1997; Buchanan et
al., 2000; McDowell et al.,200; Vranová et al., 2002; Kawano et al., 2000). Estes processos
levam ao desenvolvimento da resistência localizada adquirida em células vizinhas `a região
de ocorrência da morte celular, através do reforço da parede celular via liginificação,
incorporação de glicoproteínas ricas em hidroxiprolina, peroxidase, proteínas relacionadas
com patogênese, síntese de fitoalexinas, compostos fenólicos (Agrios, 1997).
Concomitantemente, mensageiros, que podem ser lipídios transferidores de proteínas (ltp)
(Maldonado et al., 2002), e/ou peróxido de hidrogênio dentre outros, propiciam a
transmissão de um sinal para toda a planta, inclusive extremidade de ramos, almofadas
florais e frutos jovens, colocando a mesma em estado de “prontidão” ou “competência”
(priming), preparando-a para a reação de resistência contra sucessivos ataques pelo fungo.
As micro explosões oxidativas e micro hipersensibilidades provavelmente presentes nas
micro pontuações cloróticas acima citadas, a síntese de proteínas relacionadas com
patogênese, a lignificação da parede celular, a síntese de novo de ácido salicílico e
liberação das reservas previamente armazenadas nos vacúolos, na forma glicosídica,
desenvolveram, por fim, a resistência sistêmica adquirida (Alvarez et al., 1998; Maldonado
et al., 2002) nos tecidos distantes das áreas previamente induzidas. Todos esses eventos
metabólicos foram, possivelmente, capazes de diminuir significativamente infecções em
cacaueiros por Crinipellis perniciosa, nos 3 ensaios.
Inoculação de plantas de pepino com Pseudomonas lachrymans ou Colletotrichum
lagenarium, induziu após alguns dias, resistência sistêmica contra 13 diferentes doenças
por um período de 11 meses (Kuc et al., 1977). Pelo fato da RSA se constituir num
mecanismo de amplo espectro, certamente poderá controlar outras doenças que acometem o
cacaueiro, a exemplo da podridão-parda, murcha de verticilium, murcha de Ceratocistis
dentre outras.
Okey & Sreenivasan, 1996, constataram a eficiência do A.S. no controle da
podridão parda em cacaueiros; Vieira et al., 2000; Vieira et al., 2001 verificaram que
plântulas do clone Sca 6 resistente à vassoura-de-bruxa, submetidas ou não à infecção por
Crinipellis, apresentaram maiores teores de açúcares redutores e maior degradação de
amido que o clone UF 613, susceptível à doença. Os autores após submeterem plântulas do
clone UF 613 à solução de glicose 0,35 M, conseguiram igualar os teores de açúcares
redutores nesse clone aos níveis encontrados no Sca 6, indicando assim a possibilidade de
indução de resistência via aplicação de glicose.
Nesse trabalho ficou evidenciado também a eficiência do A.S. tanto aplicado
isoladamente, como também junto com a glicose 0,6 M, numa proporção de 4:1 da mistura,
e outra mistura associado à G. 0,6 M e o P. H. 5 mM. Trabalho desenvolvido com um
análogo do ácdio salicílico, o benzotiadiazol (BTH), resulltou na indução de resistência
sistêmica em mudas de cacaueiros da cultivar Catongo, susceptível à vassoura-de-bruxa,
quando aplicado 30 dias antes da inoculação, sem apresentar qualquer ação fungitóxica
direta sobre o fungo, apresentando um controle que variou de 33,51 a 84,49%, em função
de dosagens e épocas da indução (Resende et al., 2000). A eficiência desses tratamentos
combinados, provavelmente se deve a ação da enzima A.S. glucosiltransferase, na reação
que liga as duas substâncias para a forma glicosídica, denominada de glicosídeo do ácido
salicílico (GAS) modulando os níveis de A.S. no apoplasto, evitando fitotoxidez e ao
mesmo tempo, estocando a forma GAS em vacúolos. A forma livre do A.S. é a forma ativa,
que é responsável pelo sinal de transdução no acionamento de genes que codificam para o
aumento de proteínas RP (Klessig et al.,1994). A forma conjugada (GAS) é inativa e se
constitue fonte de reserva de AS para suprir futuras demandas nos mecanismos de
resistência contra novas infecções (Klessig et al.,1994; Chen, 1993). Os GAS’s são
estocados no interior da célula (Klessig et al.,1994). A enzima que libera a molécula de AS
da glucose é uma -glucosidase localizada no apoplasto (Klessig et al.,1994).
Pesquisa sobre a utilização de glicose ou sacarose, na indução de RSA em plantas
contra fitopatógenos é limitada. Porém, pesquisa desenvolvida por Salt et al. (1988),
quando injetaram o fungo Perenospora tabacina em plantas de fumo, constataram um
aumento sistêmico de glicose, bem como a acumulação de uma substância fungitóxica
denominada β-ionone. A injeção desse composto em caule de fumo, protegeu a planta
contra a doença blue mold e aumentou o seu crescimento. Maiores níveis de carboidratos
solúveis também foram verificados em folhas de fumo sistemicamente protegidas, quando
comparados aos níveis do controle (Pan et al.,1993). Estímulos acionados pelos estresses
biótico e abiótico como déficit hídrico, salinidade, danos mecânicos e infecções por vírus,
bactérias e fungos, podem modular a ação da invertase extracelular, enzima chave na
hidrólise da sacarose (Sturm, 1999) e reguladora central da partição de assimilados,
interagindo açúcares, estresses (biótico e abiótico) e hormônios (Roitsch, 2003). Açúcares
além de regularem a expressão de genes do metabolismo primário, também regulam a
expressão de genes específicos de ferimentos, como inibidores de proteinase e
lipoxigenase, proteínas relacionadas com patogênese (Sadka et al., 1994). Além de suas
funções essenciais como substratos de carbono, energia e biossíntese de polímeros dos
vegetais, a glicose e a sacarose têm características hormonais, na função de mensageiros
primários na transdução de sinais (Rolland et al., 2002) e modulam e coordenam os
mecanismos internos da planta, de acordo com as condições ambientais, governando o
crescimento e desenvolvimento (Koch, 1996; Sheen et al.,1999; Rolland et al., 2002).
Hexoquinases funcionam como sensores de glicose na modulação da expressão de genes e
múltiplas rotas na sinalização de hormônios (Rolland et al., 2002). Tem sido também
demonstrado que a glicose ou a sacarose induzem a ação das enzimas sacarose sintase,
amido sintase e uma invertase extracelular (Roitisch et al, 1995). Acumulação coordenada
de hexoses e proteínas relacionadas com patogênese (RP’s) de ação anti-fúngica, nas
formas de quitinases acídica e básica (PR-3) e uma osmotina (PR-5), constituem respostas
de defesa contra patógenos durante a maturação de frutos em videiras (Salzman et al,
1998). Através de testes in vitro, constataram que a ação anti-fúngica da forma básica da
PR-3 e PR-5, contra os fungos Guignardia bidwellii e Botrytis cinérea, foi aumentada em
70% quando adicionou-se ao meio nutritivo, solução de glicose a 1M. Estudos realizados
em frutos durante a maturação, confirmaram os resultados in vitro. À mediada que os frutos
iam amadurecendo, registrou-se um aumento nos níveis de glicose (0,4 a 1,6 M), associado
ao aumento nos níveis das proteínas PR-3 e PR-5 e a resistência dos frutos contra os fungos
testados in vitro (Salzman et al., 1998). Os autores acreditam que a ação da glicose,
possivelmente estaria relacionada à repressão de genes que codificam para expressão das
enzimas relacionadas a colonização de hospedeiros por patógenos, a exemplo da pectatoliase em Fusarium solani (Guo et al, 1995) e celulase em Trichoderma reesei (Ilmen et al.,
1996). A ação da glicose contra o fungo, seria facilitada pela ação da PR-5, na abertura de
poros na membrana fúngica (Salzman et al., 1998) . Em culturas de células de
Chenopodium rubrum, sob o efeito de glicose em concentrações de 20 a 100mM, verificouse a produção de altas concentrações das enzimas envolvidas em mecanismos de defesa
vegetal, como a fenilalanina amônia-liase (PAL), invertase da parede celular (CWIInvertase da Parede Celular) e reprimiu a Rubico (Ehness, 1997). Resultados semelhantes
foram encontrados por Roitsch et al. (2003), trabalhando com cultura de células de tomate,
quando verificaram que a glicose e a sacarose induziram o aumento da atividade das
enzimas invertase e PAL. Pesquisa realizada com folhas de soja submetida a solução de
sacarose 200mM, aumentou sobremaneira a produção de proteína vegetativa de reserva
(VSP) A e B, e de muitas enzimas envolvidas em mecanismos de defesa de plantas contra
fitopatógenos. Dentre elas destacam-se a chalcona sintase, que participa na síntese de
fitoalexinas, a patatina que é uma acil hidrolase, responsável pela síntese de oxilipinas,
substâncias com atividades em mecanismos de resistência de plantas contra patógenos
(Heitz et al., 2002), a lipoxigenase, enzima envolvida diretamente na síntese de ácido
jasmônico e o inibidor de proteinase I, indutor de resistência de plantas contra insetos
(Sadka et al, 1994). Folhas destacadas e discos retirados de tecidos de folhas, caules e
hipocótilos de plantas de girassol (Helianthus annus), após serem tratados com solução de
sacarose a 100 mM, induziu a formação da escopoletina e aiapina, duas cumarinas com
ação de fitoalexinas, as quais são induzidas quando o girassol é submetido aos estresses
provocados por injúria mecânica, ataque de insetos, ataque de fungos patogênicos e não
patogênicos (Gutierrez et al., 1995). A sacarose está envolvida também na indução de genes
relacionados com reparo de tecidos danificados por insetos e ferimentos (wound genes) a
exemplo de uma proteína ribossomal (rpL34 gene) numa rota independente do ácido
jasmônico (Yu et al., 2000). Altos níveis de açúcares na planta reprimem genes ligados a
assimilação de carbono e super expressa outros relacionados com proteínas de defesa da
planta contra estresses, a exemplo de inibidores de proteinase II (Johnson et al., 1990),
chalcona sintase (Tsukaya et al., 1991) PR 3 (Herbers et al., 1995), PR 1b e PR Q (Herbers
et al., 1996a). A glicose e a frutose em concentrações entre 100 a 500 mM induz genes de
defesa tanto em cultivo de fumo (Herbers et al, 1996b) como no cultivo de uva (Salzman et
al, 1998).
A utilização do KCl como indutor foi respaldada na possibilidade de provocar
estresses osmóico e iônico sub-letais nos cacaueiros, levando as plantas a desenvolverem
uma resposta multigênica, envolvendo mecanismos de defesa amplo, complexo,
multifuncional e posterior aclimatação através de uma plasticidade fenotípica (Karban et
al., 1999), tornando essas plantas resistentes a futuros estresses bióticos ou abióticos
(Sairam et al., 2004). Um número de cDNAs isolados como resultado de um screening
sobre genes expressados em plantas sob estresse salino, foram relacionados a genes
envolvidos em mecanismos de defesa de plantas contra fitopatógenos. Pesquisas mostraram
a expressão de proteínas relacionadas com patogênese sob estresse salino, a exemplo de
uma ß-glucanase em arroz, uma endoquitinase em tomate e vários trabalhos tem associado
também a osmotina (PR 5), uma proteína super expressada em plantas sob estresse salino
(Buchanan et al., 2000) e também envolvida em mecanismos de resistência de plantas
contra enfermidades (Salzman et al., 1998). Inibidores de proteinase envolvidos em
resistência de plantas contra insetos, bem como enzimas que participam no controle de
estresse oxidativo, a exemplo da ascorbato peroxidase e glutationa peroxidase, também são
induzidas pelo estresse salino (Sairam et al., 2004).
Cloreto de potássio em aplicação única 0,1 M em folhas inferiores de pepino,
induziu resistência sistêmica em folhas superiores contra o fungo Sphareoteca fuliginea,
por um período 25 dias (Reuveni et al., 1994). O KCl na mesma concentração, induziu
resistência sistêmica em plantas de milho reduzindo em aproximadamente 80% a incidência
de Puccinia sorghi, 10 dias após a inoculação (Reuveni et al,1996). Outros sais potássicos
também induzem resistência sistêmica em plantas no controle de doenças. Irving et al.
(1990), induziram resistência sistêmica em plantas de pepino contra Colletotrichum
lagenarium, através do aumento da atividade das enzimas quitinase e peroxidase,
(marcadores fisiológicos para RSA) através da aplicação de K2HPO4 a 50 mM. Gottstein et
al. (1989), quando utilizaram soluções de K3PO4 e K2HPO4 foram bem sucedidos no
propósito de induzir resistência sistêmica no cultivo do pepino contra a antracnose, por um
período de até 40 dias. Walters et al. (1992), após utilizarem o K3PO4 a 10 mM, também
lograram êxito na indução de resistência em Vicia faba contra Uromyces viciae-fabae,
conseguindo um controle de até 75%, quando o intervalo entre os tratamentos e a
inoculação foi de 12 dias. Todos esses autores são unânimes em afirmar que, a indução de
resistência sistêmica nesses diferentes trabalhos, ocorre possivelmente, através do seqüestro
do Ca2+ da membrana plasmática de células do hospedeiro, pela ação do fosfato,
provocando a descompartimentalização celular, liberando ou possibilitando a síntese de
enzimas hidrolíticas. Essas enzimas podem atuar na parede celular do hospedeiro,
especialmente sobre substâncias pécticas, mais sensíveis à ação dessas enzimas, pela ação
do Ca2+, liberando oligossacarídeos ou oligogalacturonatos, que poderão funcionar como
um sinal de alarme ou causador da sua liberação. O seqüestro do Ca2+, todavia, pode ser um
dos muitos caminhos para elicitar a produção do sinal de alarme. A ação do potássio
também induz a liberação de Ca2+ da membrana plasmática, aumentando sua concentração
no citosol, desencadeando em seguida reações em cascata para desenvolver mecanismos de
defesa e de estabilização da região submetida ao estresse, bem como sistemicamente em
toda a planta (Munnik et al, 2001).
A quitosana que é conhecida como um elicitor endógeno, por se originar da parede
celular de fungos, e produzida industrialmente via manipulação de e exoesqueleto de
crustáceos, teve boa ação indutora, pricipalmente no ensaio 2 do experimento 2,
possivelmente via rota do ácido octadecanoico. Trabalhos desenvolvidos por Kohle et, al,
(1985) em células de soja, Doares et al., (1995) em folhas de tomate e Vasconsuelo et al.,
(2004), propiciaram, formação de calose, pelo influxo de cálcio da membrana plasmática
para o citoplasma e síntese de ácido jasmônico e inibidor de proteinase I a indução dea
fitoalexina antraquinona respectivaamente.
O H2O2 gerado via exposão oxidativa desempenha um papel central nos eventos
envolvidos na morte de células do hospedeiro, durante o fenômeno da hipersensibilidade. A
produção de enzimas antioxidativas ou antioxidantes não enzimáticos, tem sido mostrado
suprimir o mecanismo de morte celular durante várias interações incompatíveis hospedeiropatógeno. Além disso, a inibição de mecanismos endógenos de antioxidação, utilizando
específicos e não específicos agentes farmacológicos, aumentando, desse modo, a
concentração de espécies ativas de oxigênio como o H2O2, resultou na elevação dos níveis
de morte de células do hospedeiro (Levine et al., 1994). A explosão oxidativa é uma
resposta comum das plantas, quando submetidas tanto ao estresse biótico como o abiótico
(Desikan et al., 2003). Esses estresses incluem fitopatógenos, elicitores, injúrias mecânicas,
altas e baixas temperaturas, luz ultra-violeta e ozônio dentre outros (Hung et al., 2005). O
H2O2 estimula a síntese dos ácidos benzóico e salicílico, através da enzima BA-2hidroxilase. O H2O2 aplicado na concentração de 5 mM em cultura de células BY-2 de
fumo, provocou a morte de aproximadamente 10% das células, enquanto que 60% delas
continuaram sadias (Hout et al, 2001).
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