O que é o Notch? - Biologia do Desenvolvimento 2014

Recetor NOTCH
 É uma proteína transmembranar de passagem única, que consiste em apenas um peptídeo.
 É composto por:
→ uma componente extracelular que é responsável pela interação com os ligandos
→ um domínio transmembranar responsável pela ativação do recetor
→ um domínio de sinalização intracelular
Os ligandos de NOTCH interagem com o recetor de células adjacentes por um processo
designado inibição lateral.
Essa ligação entre recetor e o ligando, leva a ativação da via NOTCH na célula e a supressão da
atividade nas células adjacentes
Estrutura dos recetores NOTCH
 É composto por duas subunidades:
 Um fragmento N-terminal extracelular (NEC)
 Uma subunidade C-terminal transmembranar (NTM)
 As subunidades NEC e NTM permanecem associadas no recetor em repouso
através do domínio de heterodimerização (HD).
Estrutura do recetor NOTCH
 A subunidade EC é composta pelas porções EGF-Like, LNR e parte do HD.
 A subunidade TM esta caracterizada por parte de HD, e porções RAM, ANK, TAD e PEST.
ICN – intracellular domain of NOTCH1
Mecanismos de ativação do recetor NOTCH1
 O recetor NOTCH1 é ativado, pela interação de ligandos como
Delta-Like e Jagged.
 Ocorre uma mudança conformacional em LNR e dissociação das
duas subunidades do domínio HD.
 Seguindo a clivagem do recetor, primeiro pela metaloprotease
ADAM10 (clivagem S2) e subsequentemente pelo complexo de
gama-secretase (clivagem S3)
 Esses processos proteolíticos libertam o domínio intracelular
(ICN1) de NOTCH1 da membrana.
 O ICN1 interage com o DNA através da sua ligação com CSL e
recruta o coactivador MAML1 para ativar a expressão de genes
alvos.
HEMATOPOIETIC STEM CELL (HSC)
HSC
Dão origem a todas
as células
sanguíneas
AUTO-RENOVAÇÃO DAS STEM CELLS
Gene ld
Notch
Prolonga a
expessão do
GATA-2
Hes1
Proteínas de
diferenciação
E-proteínas
Linhagem
mieloide
E2A
EBF e PAX5
Linfócitos B
ESCOLHEM SER T
Notch
Linfócitos
T
HSC
na Medula
Óssea
HSC
no Timo
HSC
no Timo
Notch
Linfócitos
B
Linfócitos
T
HSC NO TIMO
HSC
DN
CD4⁻CD8⁻
pro-T cells
pre-T cells
CD34⁺CD33⁻CD1a⁻
CD34⁺CD33⁻CD1a⁺
Linfócitos T
0,018%
TLMP
CD34highCD33⁺
T e NK
DN – percursor mais
imaturo dos linfócitos T
THYMIC LYMPHOMYELOID PRECURSORS (TLMP)
Notch
Linhagem
Mieloide
GATA-2
TLMP
CD34highCD33⁺
IL-7, SCF, IL-1α, IL-6, GM-CSF
GATA-2
HEB, GABPα e GATA3, o
gene pTα
Notch
Linfócitos
T
Portanto a expressão de Notch1 é necessária e suficiente para impedir que as TLMPs se diferenciem em
células não-T mas não é suficiente para induzir o rearranjo do gene TCR que garante a progressão da
diferenciação dos linfócitos T em diferentes tipos de células T.
A sinalização intatimica de Notch é iniciada quando o receptor Notch1 recruta o seu ligando Dll4, que
leva a activação da transcrição dos genes alvo do Notch.
IL-7R
•Os resultados das experiências sustentam a possibilidade de que o Notch tem importância na regulação
do IL-7R.
•A via do IL-7R não influencia a diferenciação dos TLMPs mas proporciona sinais necessários para a sua
proliferação e sobrevivência.
T
IL-7Rα
TLMP
GM-CSFRα
Mieloide
NK
IL-2Rβ
TLMP
Linfócitos
T
OP9DL1
Células do
estroma
PI3K
PI3K importante para o desenvolvimento e é regulador crítico
da sobrevivência, crescimento e proliferação dos linfocitos.
Notch
Hes1
mTorc
Via
PI3K/Akt
Intreferir com as funções do Hes1 afeta o desenvolvimento
primordial e a expanção das células T e leva a um maior
aparecimento de células não-T.
CHECKPOINT BETA
DN1
CD44⁺CD117⁺CD25⁻
DN2
CD44⁺CD117⁺CD25⁺
DN3
multipotentes
especificamente T
CD44⁻CD117⁻CD25⁺
Checkpoint
Gene Rag1 e Rag2
com receptor TCRβ
da
β-selecção
DP
Apoptose
COMPLEXO PRE-TCR
As DN3 que expressam o receptor TCRβ rearranjado e produtivo, juntamente com o pTα e CD3 formam o
complexo pre-TCR que medeia a passagem pela β-selecção
Outras vias sinalizadoras mediadas por IL-7R e CXCR4 promovem a ativação da via PI3K/Akt demonstrados agirem
juntamente com pre-TCR durante β-selecção
Hes1, PTEN e c-Myc moleculas chave para a sobrevivência, diferenciação e poliferação no checkpoint da β-selecção
Expressão aumentada de PTEN resulta na diminuição da capacidade de diferenciar e proseguir na β-selecção.
Notch é necessário para um correto rearranjo do gene TCRβ e activação das moleculas chave
CXCR4
Expressão
descontinua ou
ausente do Notch
Notch
PI3K/Akt
sobrevivência
CXCR4
p38/MAPK
apoptose
A sinalização de CXCR4 assegura a
sobrevivência dos timocitos via PI3K/Akt ou
promove a sua apoptose pela via p38/MAPK.
C-MYC
No desenvolvimento das células T o c-Myc é descrito como mediador da proliferação.
A indução da expressão do c-Myc pelo Notch leva a proliferação das células que passaram a β-seleção e
atingem o estado DP, estado no qual a sinalização Notch cessa para evitar o aparecimento de leucemias.
DN
Notch
c-Myc
proliferação
DP
aumento
Leucemia linfoblástica aguda de células T (LLA-T)
 Carateriza-se por um grande defeito de maturação, induzindo a um acúmulo de células imaturas e a uma falha na
produção de células hematopoéticas diferenciadas.
 Sendo assim, estas células imaturas não são capazes de desempenhar suas funções normais.
 Apresentam mutações ativadoras no gene NOTCH1 em mais de 50% dos casos.
 Sabe-se que a sinalização constitutiva de NOTCH em progenitores linfóides promove o desenvolvimento de células
T imaturas.
 Caracteriza-se pela presença de mutações envolvendo os genes que codificam os recetores de células T (TCR) e
em vários genes de fatores de transcrição sendo o NOTCH1 o mais frequente.
Mutações do gene NOTCH1
 As mutações ativadoras de NOTCH1 normalmente interrompem os bloqueios moleculares responsáveis pela
prevenção da ativação espontânea do recetor na membrana ou mediando o final da sinalização de NOTCH1 no
núcleo.
 Uma das mutações ocorre no domínio HD, promovendo instabilidade no recetor NOTCH1, que resulta na
ativação independente do ligando, aumentando a libertação do ICN e sua consequente deslocação para o núcleo.
 Pode ocorrer uma mutação na extremidade 3’ do gene onde está codificado o domínio PEST, que são
responsáveis pela eliminação da sequência de reconhecimento para a degradação de ICN pelo complexo
FBXW7/SCF no núcleo, assim há um aumento de ICN e uma acentuação da atividade do NOTCH1.
 Em casos raros, NOTCH1 é ativado como resultado de inserções in-frame na parte distal do domínio HD,
resultando no deslocamento e consecutivo processamento no local de clivagem da protéase ADAM10.
Mutações do gene FBXW7
 Podem ocorrer:
 Mutações no gene FBXW7 , que normalmente envolvem resíduos de arginina, que
são responsáveis pelo reconhecimento dos locais de fosforilação do domínio PEST
do recetor NOTCH1.
 Mutações duplas no domínio HD e PEST ou em HD e FBXW7. A presença de
mutações nestes domínios induzem a ativação na membrana, independentemente do
ligando, prejudicando a degradação do recetor ativo do núcleo, resultando em altos
níveis de sinalização de NOTCH1.
Inibição do NOTCH através do péptido SAHM1
 No processo de ativação de NOTCH1, após a libertação do domínio intracelular
(ICN), este vai para o núcleo e liga-se ao fator de transcrição CSL, que por sua vez
vai recrutar o coativador MAML1 para que ocorra então a transcrição dos genes
alvo de NOTCH1.
 Recentemente foi desenvolvido um péptido que se liga ao complexo ICN-CSL, o
SAHM1, que diretamente contraria o recrutamento de MAML1, bloqueando a
transcrição dos genes alvo de NOTCH1 mesmo este estando ativo.
Mecanismo de inibição de SAHM1
 Parte A:
Processo de ativação de NOTCH1 no núcleo, mostrando a
ligação do fator de transcrição CSL e coactivador MAML1
ao ICN para ativação dos genes alvos.
 Parte B:
Inibição do processo pelo péptido SAHM1, que impede
que a MAML1 se ligue ao complexo ICN-CSL, bloqueando
a ativação dos genes alvos.
Inibidores gama-secretase (GSIs)
 A inibição a partir de GSIs bloqueia a atividade do
complexo gama-secretase, que é necessária para a
clivagem do domínio intracelular de NOTCH.
 A utilização de anticorpos que ligam no ligando
Delta-Like-4, previne a ligação e a ativação de
NOTCH a partir de ligandos.
 A inibição por anticorpos específicos ao recetor
NOTCH1, impede a clivagem proteolítica da região
reguladora negativa, mesmo após a ativação pelo
ligando.
Inibição por anticorpos específicos
 Foram desenvolvidos anticorpos específicos para o recetor NOTCH1 e NOTCH2
 Estes anticorpos estabilizam a região reguladora negativa de NOTCH1 e NOTCH2 que está localizada na parte
extracelular que por sua vez evita a clivagem do domínio intracelular mesmo na presença dos respetivos ligandos
 Os anticorpos mostram inibição, dependente de dose, na sinalização in vitro de ambos os NOTCH e alta
especificidade ao seu respetivo recetor
 Os resultados deste anticorpo específico de NOTCH1 em linhas celulares de LLA-T (que contêm mutações em
NOTCH1) demostram que existe inibição do crescimento celular em in vitro
Anticorpos específicos do ligando delta-like-4
 O ligando Delta-Like-4 (Dll4) contribui para a auto-renovação das stem cells e para o desenvolvimento vascular
 Haploinsuficiência de Dll4, resulta em letalidade embrionária devido a efeitos de desenvolvimento na vasculatura.
 O bloqueio de Dll4 resulta na formação de uma vasculatura não funcional, incapaz de suportar o crescimento
tumoral.
 Os anticorpos específicos ao ligando DII4, funcionam de modo a prevenir a ligação de ligandos e subsequente
ativação de NOTCH.
 O bloqueio de Dll4/NOTCH1 poderia aumentar a eficácia de anti-VEGF em tumores sensíveis, podendo assim ter
um potencial para aumentar os efeitos de quimioterapias.
REFERÊNCIA S BIBLIOGRÁFICAS
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FIM!