Apresentação do PowerPoint - Departamentos da Area Biologica
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Investigação de Marcadores Moleculares em Lesões Benignas e Neoplasias do Trato Digestório Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP NEOPLASIAS TRATO DIGESTÓRIO CÂNCER DE ESÔFAGO: 3º tipo (mundo) 6º tipo Brasil (10.590 casos) ~85% carcinomas CÂNCER GÁSTRICO: 2º tipo (mundo) 3º tipo Brasil (23.200 casos) ~95% adenocarcinomas CARCINOGÊNESE DO ESÔFAGO ÁLCOOL E FUMO FATORES DE RISCO Ambiental e genéticos História familial Agentes infecciosos (HPV) Megaesôfago chagásico Esôfago de Barrett Lesões cáusticas Aneuploidias Mutação genes supressores: TP53, P16, P17, FHIT Ativação de oncogenes: CCND1, HER-2/neu Doença de Chagas - Fase crônica Brasil: 50-60% chagásicos na fase crônica sem manifestações clínicas 2-4% fase crônica sintomática Intestino grosso (megacólon) Coração 80% Esôfago (megaesôfago) Risco de 3-8% Megaesôfago chagásico Carcinoma de células escamosas do esôfago Complicação tardia mais séria do megaesôfago 5% dos pacientes com MC em idade mais jovem em relação àqueles sem a doença Contato prolongado de agentes carcinógenos alimentares com a mucosa estase alimentar aumento do crescimento bacteriano e irritação química esofagite crônica C ARCINOMA DE ESÔFAGO Megaesôfago chagásico (MC) FISH: aneuploidias 7, 11, 17 deleção TP53 amplificação CCND1 MC: 60% aneuploidias (-7,+7, -17, +17) 54,5% deleção TP53 CE: 100% tri e tetrassomias 100% deleção TP53 70% CCND1 Chagásicos crônicos: com e sem megaesôfago Esofagites crônicas Molecular: Mutações TP53, MTS-1 e FHIT (PCR-SSCP, sequenciamento) T. cruzi: polimorfismos do kDNA (sangue e mucosa) CGH Imuno: Expressão proteínas: p53, p16 e fhit Apoptose: caspase-3 ativada Proliferação celular: antígeno Ki-67 CARCINOGÊNESE GÁSTRICA CÂNCER GÁSTRICO •Incidência elevada: Japão, China, Costa Rica, Chile e Portugal •Brasil: Estimativas para 2006 (INCA) •23.200 casos novos •Homens: 2x mais afetados TIPOS HISTOLÓGICOS DO ADENOCARCINOMA GÁSTRICO • ADENOCARCINOMA TIPO INTESTINAL OU BEM DIFERENCIADO: • Presença de lesões pré-neoplásicas • Predominante em homens e idosos • ADENOCARCINOMA TIPO DIFUSO OU POUCO DIFERENCIADO: • Prognóstico pior • Não associado a lesões pré-cancerosas • Mais frequente em mulheres e jovens Lesões précancerosas Helicobacter pylori Predisposição Genética Gastrectomia Anterior Tabaco Lesões do DNA Álcool Alimentos salgados , enlatados e defumados CARCINOGÊNESE GÁSTRICA Colonização da mucosa gástrica pela Helicobacter pylori (modificado Yoshiyama e Nakazawa, 2000) • Prevalência da Hp: 40 a 50% na população • 9 vezes risco de câncer gástrico • Geração de radicais livres (espécies de oxigênio e nitrogênio reativos) → danos no DNA • Alterações na secreção de fatores de crescimento e citocinas • Desregulação do ciclo celular do epitélio gástrico → proliferação celular ↑ x apoptose ↑ Estômago Normal Apoptose regulada Gastrite H.pylori Úlcera Gastrite atrófica Apoptose Apoptose + Proliferação regulada + Inflamação TNF CD95 NO Inflamação TNF CD95 NO Proliferação Proliferação Homeostase (renovação celular normal) Homeostase ( da proliferação celular) Desequilíbrio (perda de células) HOMEOSTASE E DESEQUILÍBRIO DA MUCOSA GÁSTRICA (modificado Wagner et al., 1997) CARCINOGÊNESE DO ESTÔMAGO • • • • • • • • Alterações genéticas e epigenéticas Oncogenes Genes supressores de tumor Reguladores do ciclo celular Moléculas de adesão celular (caderinas) Genes de reparo do DNA Instabilidade genética Ativação de telomerases PERDAS E GANHOS CROMOSSÔMICOS Cromossomos 1 2 3 4 5 7 8 9 12 13 14 15 16 17 18 19 20 22 Regiões Cromossômicas 1p (1p36) ; 1q22-q31 2pter-p23; 2q; 2q 3p14; 3q (3q12-qter) 4q32 5q21 7pq; 7q22; 7q31 Genes p73 FHIT APC ERBB; EGFR, HGF; c-MET c-MYC CDKN2A (p21) EPS8; DOC-1 receptor de serotonina 8pq; 8q (8q23-24) 9p (9p21) 12q (12q24) 13q (13q21-22) 14q (14q24) 15q (15q11-q15) 16pq, 16q22 17p (17p13); 17q; 17q (17q12-q21) 18q21; 18q 19p(19p13); 19q(19q13) 20pq; 20q11-q12 22q E-Caderina TP53, c-ERBB2, gastrina DCC CARCINOGÊNESE DO ESTÔMAGO (modificado Tahara, 2004) INTESTINAL TP53 APC D1S191 HIPERMETLAÇÃO MUCOSA NORMAL C-ERBB2 C-MET CICLINA E TP53 METAPLASIA INTESTINAL p27 ADENOMA CÂNCER AVANÇADO CÂNCER INICIAL DIFERENCIADO LOH 1p36 (p73) TELÔMEROS INSTABILIDADE GENÉTICA CD44 ALTERADO CICLINA E CD44 ALTERADO MUCOSA NORMAL LOH 17q21 DIFUSO LOH 7q p27 TELOMERASE hTERT H. pylori INVASÃO METÁSTASES MUTAÇÃO/LOH TP53 CÂNCER INICIAL CÂNCER AVANÇADO DIFERENCIADO INVASÃO METÁSTASES MUTAÇÃO/PERDA E CADERINA AMPLIFICAÇÃO K-SAM c-MET Escasses de estudos genéticos em lesões gástricas precursoras com potencial pré-neoplásico indicar marcadores cromossômicos associados com a carcinogênese gástrica FISH -aneuploidias (3, 7, 8, 9 e 17) -deleções no gene TP53, -amplificação CCND1 e Her-2/neu (c-erbb-2) lesões gástricas benignas e adenocarcinoma gástrico MOLECULAR IMUNO-HISTOQUÍMICA Avaliação da H. pylori Polimorfismos: CYP, expressão das proteínas: GST, XRCC1, XRCC3, COX2, NOS2 -p53 Expressão gênica: -ciclina D1 e p185 (HerPCR Real Time 2/neu) RaSH (hibridação subtrativa rápida) Metilação Comparar os resultados obtidos em lesões benignas com aqueles de adenocarcinomas gástricos ressaltar alterações genéticas que possam estar relacionadas com a progressão das lesões benignas, e maior risco de malignização utilizadas no diagnóstico precoce e prognóstico MATERIAL Controle: 10 biópsias mucosas gástricas histologicamente normais e H. pylori negativas Lesões gástricas: 113 (biópsias/frag. cirúrgico) • 38 gastrites crônicas • 13 gastrites atróficas crônicas • 21 úlceras gástricas • 21 metaplasias intestinais • 20 adenocarcinomas gástricos •Gastrite crônica e gastrite atrófica associada com H. pylori precede a formação do câncer gástrico •Úlcera péptica maior risco de câncer gástrico •Objetivos: avaliar a ocorrência de aneuploidias (3, 7, 8, 9 e 17); deleção e expressão do gene TP53. Amostras: 38 gastrite crônica 13 gastrite atrófica 21 úlcera gástrica Aneuploidias: frequência crescente de GC (21%) para GAC (31%) e para UG (62%) Gastrite crônica: 8/38 casos -7, +7 75% Hp+ Gastrite atrófica crônica: 4/13 casos +7, +8 100% Hp+ Deleção TP53: não observada Expressão aumentada da p53: Gastrite crônica: 5/11 (45%) Úlcera gástrica: 13/21 casos (62%) +7,+8; +17 69% Hp+ Expressão aumentada da p53: 2/17 (12%) GC: +7 GC: -7 UG: +8 ↑p53 em GC e UG: super expressão da proteína selvagem → resposta fisiológica ao processo inflamatório do epitélio gástrico (H. pylori) Metaplasia intestinal: (substituição do epitélio gástrico por células colunares intestinal) •Alguns estudos: mutação do TP53 e superexpressão da proteína p53 em metaplasia adjacente ao tumor. •Objetivo: •Investigar ocorrência de aneuploidias (3, 7, 8, 9 e 17), deleção e expressão do gene TP53, em metaplasia intestinal de pacientes sem câncer gástrico. •71% (15/21) casos MI: aneuploidias +7, +8, +9 •Associação: aneuploidias x H. pylori •60% (3/5) casos: deleção TP53 •12% (2/17) casos: expressão p53 •100% casos: aneuploidias (tri/tetra) •3/3 casos: deleção TP53 •30% (6/20 ): trissomias múltiplas •80% (12/15): expressão p53 Metaplasia: +7 Adenocarcinoma +9; +17 Mucosa normal: TP53 (vermelho) adenocarcinoma Deleção TP53 1 sinal vermelho 17 (verde) AUMENTO PROGRESSIVO NA FREQÜÊNCIA E COMPLEXIDADE DE CASOS COM ANEUPLOIDIAS 100 100 80 80 3 3 60 7 60 7 40 8 40 8 9 20 17 9 20 17 0 0 GC GAC UG MI CG monossomias GC GAC UG MI trissomias CG IMUNO-HISTOQUÍMICA – p53 Mucosa normal p53- Metaplasia Adenocarcinoma p53+ (fraca) p53+ (forte) •Cromossomos 7, 8, 9 e 17 carregam genes importantes que atuam no controle da proliferação celular •7q31: MET •8q24: MYC •9p21: CDKN2A •17p13: TP53 Dosagem anormal e expressão gênica vantagem proliferativa •17q21: ERBB-2 (HER-2/NEU) •Primeira evidência de alterações numéricas em MI de pacientes sem câncer gástrico alterações presentes em frequências adenocarcinoma conecção cronológica entre essas lesões expansão monoclonal •Ocorrência de instabilidade cromossômica em lesões benignas (GC e UG) que podem ter função importante na carcinogênese do estômago APOPTOSIS IN DIFFERENT GASTRIC LESIONS AND ASSOCIATION WITH H. pylori AND EXPRESSIONS OF p53 • Apoptose: homeostase do tecido equilíbrio entre proliferação e morte celular programada • Desequilibrio: taxa proliferativa excessiva potencializa o efeito de carcinógenos risco de câncer • Associação: H. pylori x Apoptose lesões gástricas ??? • H. pylori: risco de 2,7 a 12 vezes de câncer gástrico OBJETIVO: avaliar os IA em diferentes lesões gástricas e comparar com adenocarcinoma gástrico técnicas que detectam apoptose em fases diferentes: •Caspase-3 ativada (CPP32) mais precoce •TUNEL fragmentação do DNA •Associar com H. pylori, aneuploidias e expressão da p53 •AM0STRAS: 8 mucosa normal Hp34 gastrite crônica 11 gastrite atrófica 17 úlcera gástrica 12 adenocarcinomas Índice Apoptótico (IA) Técnica Amostra N x DP Mínimo Mediana Máximo Casos s TUNEL TUNEL positivos MN 08 1,820,47 0,0 2,0 3,6 0/8 GC 34 2,600,32 0,0 2,3 7,4 GAC 11 3,930,63* 0,0 4,4 7,0 UG 17 2,030,39 0,0 2,0 7,0 MI 15 2,360,41 0,0 2,4 5,2 AG 12 1,970,42 0,4 1,6 6,0 3/34 (26,5%) 6/11 (54,5%) 2/17 (11,8%) 2/15 (13,3%) 1/12 (8,3%) CPP32 positivos CPP32 MN 08 3,201,31 0,0 2,7 11,0 0/8 GC 34 13,822,58 0,0 8,4 52,0 15/34 (44,1%) 3/11 (27,3%) 4/17 (23,5%) 1/15 (6,7%) * GAC 11 6,201,57 0,0 5,0 13,4 UG 17 9,472,92 0,0 3,4 34,8 MI 15 6,721,47 0,8 6,8 24,4 AG 12 8,072,75 0,0 4,7 30,8 4/12 (33,3%) IA aumentados: TUNEL: GAC CPP32: GC Adenocarcinomas: IA baixos, sem diferença entre intestinal e difuso TUNEL CPP32 A-B:gastrite crônica A B C D E F G H C-D: úlcera gástrica E-F: metaplasia intestinal G-H: adenocarcinoma gástrico CONCLUSÕES • Não houve associação entre apoptose aumentada e infecção pela H. pylori, aneuploidias e super expressão da proteína p53 • não houve correlação entre os IA encontrados por ambas as técnicas, • aumento de apoptose em GC e GAC, não relacionado com infecção pela H. pylori reforçando a participação de lesões gástricas com potencial précanceroso na tumorigênese do estômago enfatiza a importância do emprego de métodos diferentes para detecção de apoptose. Double minutes (DM) aumento do número de cópias: dezenas a centenas de vezes (erros de replicação) Aumento da expressão gênica→proteína Regiões homogeneamente coradas (HSR) Carcinogênese: Genes Amplificados -CCND1 -c-MET -c-MYC -c-ERBB-2 (HER-2/NEU) -40 carcinoma esôfago -12 mucosa normal -40 adenocarcinoma gástrico Avaliar a relação entre -14 mucosa normal amplificação e polissomia de CCND1 e Her-2/neu com expressão aumentada das IMUNO FISH proteínas e aspectos clinicopatológicos→prognóstico Cyclin D1 (vermelho) Anticorpos: Her-2 (vermelho) ciclina D1(nuclear) Centrômeros (verde) Her-2 (membrana) AMPLIFICAÇÃO: CCND1: carcinoma esôfago 45% (18/40) câncer gástrico 10% (4/40) HER-2/NEU: carcinoma esôfago 7,5% (3/40) câncer gástrico 5% (2/40) IMUNO: Cyclin D1+: câncer esôfago 37,5% (15/40) câncer gástrico 35% (14/40) Her-2/neu+: câncer esôfago 12,5% (5/40) câncer gástrico 7,5% (3/40) FISH: (A-B) Amplificação CCND1( vermelho) – câncer de esôfago e gástrico (E-F) Polissomia 11 (verde) gene CCND1 (vermelho) FISH: (C-D) Amplificação Her-2 ( vermelho) – câncer de esôfago e gástrico (E-F) Polissomia 17 (verde) gene Her-2 (vermelho) IMUNO: (A-B) proteína Cyclin D1+ câncer esôfago e gástrico (C-D) proteína Her-2+ câncer esôfago e gástrico CONCLUSÕES: -CCND1: mais frequentemente amplificado e proteína super-expressada (ambas neoplasias) → função na progressão de infiltração e metástases → marcador molecular → prognóstico pior e comportamento mais agressivo → invasão, metástases, recorrência e sobrevida reduzida, -Baixa associação entre amplificação x super-expressão → outras vias de expressão alteração na síntese ou estabilidade da proteína alterações na regulação de transcrição gênica EQUIPE • • • • • • • • COORDENADORA: Profa. Dra Ana Elizabete Silva – UNESP COLABORADORES: Profa. Dra. Marileila Varella-Garcia – Cancer Center-USA Prof. Dr. Aldenis Albaneze Borim – FAMERP Profa. Dra. Patrícia Maluf Cury – FAMERP Dr. Alaor Caetano – FAMERP Profa. Dra. Kátia Ramos Lopes – Hospital Sírio Libânes - SP • • • • • • • • • • • • • PÓS-GRADUANDOS: Ana Cristina Gobbo César Lucimari Bizari Fernanda da Silva Manoel Caetano Marilanda Ferreira Bellini Márcia Cristina Duarte Juliana Garcia de Oliveira Aline Cristina Targa Aparecida Perpétuo Fedossi Héctor Matiolli INICIAÇÃO CIENTÍFICA: Isabella Katz Migliori Yvana Cristina Jorge • Auxílio e Bolsa: FAPESP, CAPES e CNPq
