Cell

Métodos Celulares
Prof.Doutor José Cabeda
Imunologia
Células Sanguíneas
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Imunologia
CD4
Células do S.I.
T
Linfócitos
CD8
B
NK
Macrofagos
Monócitos
Neutrófilos
PMN
Outras células do Sangue
plaquetas
Eosinófilos
Basófilos
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eritrócitos
Imunologia
Purificação de células
do sistema Imunológico
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Imunologia
Cell Separation Technologies





Centrifugation : Density
Filtration : Size
Flow Cytometry (FACS)
 Size
 Granularity
 Fluorescence
Batch affinity systems : antibody, avidin-biotin
Batch magnetic systems
 Paramagnetic difference
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Separação em gradiente de
densidade



Numa centrifugação sedimentam primeiro as
partículas mais densas, que por sua vez impedem
as menos densas de sedimentar
Ficol: polisacarideo
 Agrega eritrócitos tornando-os mais densos
Metrizamida (composto denso contendo iodo)
 Densidade ajustável em função da concentração
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Separação em Gradiente
descontínuo de densidade
Soro
plaquetas
PBMC
Ficoll-hypaque
density
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Separação em gradiente contínuo
de densidade (II)
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Separação Imunomagnética
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Immunomagnetic Labeling of Cells
Target antigen
Antibody (IgG)
PBL
FITC
Magnetic bead
HER-2/neu
One-Step
Labeling
Two-Step
Labeling
Cell
Cell
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Paramagnetic particles

Large size
 1 to 5 um in diameter

Magnetic susceptibility
of a cell: High

Small number of beads
per cell
 1- 10 beads/cell

Commercially available
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Paramagnetic colloidal beads

Colloidal size
 50 to 200 nm
 Spread in solution
(Brownian Motion)

Magnetic susceptibility of a
cell: Low

Large number of beads per cell
 100 - 100,000 beads/cell
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Molecular Magnetic Labeling

Erbium ion (Er3+)
 Paramagnetic ion
 High atomic magnetic dipole moment
 Ionic binding to the cell surface

Ferritin
 Paramagnetic protein
 Hollow protein shell (13 nm)
 Deposition of Fe2O3 in the cavity (7 nm)
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Magnetic Labeling
Paramagnetic
particle
Size
Cell's magnetic
susceptibility
Labeling
method
Number per cell
Commercially
available
Paramagnetic
Molecular
colloidal beads magnetic labels
1 – 5 µm
50-200 nm
< 15 nm
High
Medium
Low
Ionic
Immunological
Immunological
1 - 10
100 - 100,000
> 100,000 ?
Yes
Yes
No
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Immunological
Imunologia
Fraction (-)
Fraction (-)
Cell Separation Based on
Antigen Expression Level
Antigen Expression Level
Antigen Expression Level
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MACS® Cell separation system
Plunger
Magnet
Separation
column
Remove the magnet
magnetic cell
non-magnetic cell
Unlabeled
cells
Immunomagnetically
labeled cells
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®
HG4100
Incubation
Cell Separation system
Aspiration
Resuspension
magnetic cell
non-magnetic cell
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Quadrupole Magnetic Flow Sorter
(QMS)
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High Gradient Magnetic Separator
(HGMS)
Separator
Operation
MACS
Semi-flowthrough
Holding
Iron spheres
material
or wires
Cell
accumulation
Yes
Applicable
Narrow
cell size
(small cells)
Flow control
No
HG4100
QMS
Batch
Flow-through
Test tube wall
N/A
Yes
No
Middle
Wide
N/A
Yes
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a'
+
-
-
b'
Fm
a
- Prof. Doutor José Cabeda
b
+
+
+
-
MAGNET
-
-
Axial Symmetry
-
-
+
+
Cell Separation by the QMS
+
Imunologia
Lymphocyte cell separation by
the QMS
CD8+ cells
CD4+ cells
Feed
26%
38%
38%
a
b
6%
Feed
a
96%
b
6%
12%
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99%
Imunologia
CD34 cell isolation by the QMS
Feed
a
0.02%
0.67%
b
88.5%
Total cell load = 2 x108 cells;
CD34 cell recovery = 81%;
Throughput = 1.75 x 105 cells/s
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Imunologia
Colony Formation from CD34+
Cells
CD34+ cells
CFU-GM
BFU-E
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CFU-Mix
(immature)
Imunologia
PANNING

Aderência celular a uma superfície sólida
 Monócitos e macrófagos são naturalmente
aderentes
 Outras células podem aderir se a superfície
estiver conjugada com anticorpos
apropriados
 Panning directo
 Panning indirecto
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Purificação positiva e negativa


Purificação Positiva
 Panning
 Imuno-separação magnética
 Centrifugação gradiente densidade
 Centrifugal elutriation
 Formação de rosetas
 Citometria de Fluxo
Purificação Negativa
 Todos os anteriores
 Citotoxicidade mediada por Anticorpo/complemento
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Rosetas

Nos anos 70
 Linfócitos T formam rosetas com SRBC
 Melhor rendimento se:
• SRBC tratados c/ neuraminidase
• SRBC tratados c/ AET

(2-aminoethylisothiouronium bromide)
Método barato mas pouco prático e de baixo
rendimento
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Método de lise mediada pelo
complemento
Selecção negativa de células
 Passos:

Marcação das células a eliminar c/ anticorpos
 Indução da lise celular c/ complemento de
coelho

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Selecção negativa c/ L-LME



L-Leucine methyl Ester (L-LME) é metabolizado
nos lisosomas originando um metabolito tóxico
Colocando as células em contacto c/ L-LME, os
monócitos e NK são destruídos
Separar as células mortas com lymphoprep
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Isolamento de linfócitos de
orgãos linfóides secundários
As células estão fracamente agregadas
 São separáveis por acção mecânica
 Forçar o tecido a passar repetidamente
por uma malha de aço fino
 Utilizar a suspensão celular obtida,
depois de purificada por lymphoprep
 Descartar os restos de tecido

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Análise de Células
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Estudo de populações celulares
por Citometria de fluxo

Utilização de CD14/CD45 para definir a
população de linfócitos
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Efeito de um “gating” correcto
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Estudo de activação linfocitária (I)

Método de Activação
 Antigénio especifico
pouco útil para culturas de linfócitos humanos
 Requer activação in vitro para enriquecimento prévio
Mitogénio
 Concanavalina A (ConA)
 Phytohemaglutinina (PHA)
 Proteina A de staphylococcus
 Pokweed mitogen
Anticorpos / Interleuquinas



Células T
• aCD3
• aCD2
• aCD28
• aTCR
Células B
• aIgM
• aCD20
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T+B
•Ionoforo A23187
•Ionomicina
•Ester de forbol
•IL-2
•IL-4
Imunologia
Estudo de activação linfocitária (II)
Radioactividade
3
 H-dTTP (Incorpora-se no DNA em cada divisão)
 Bromo desoxi-uridina (BrdU)




Incorpora-se no DNA em cada divisão
É Fluorescente  Detectável por Citometria de fluxo
Medida da [Ca2+] intracelular

O Ca é um dos primeiros mensageiros secundários da
activação celular
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Imunologia
Medida da actividade citotoxica




Incubação das células alvo (linhas tumorais) com
51Cr
Se o estudo for de ADCC (antibody dependent cell
mediated citotoxicity) as células alvo devem estar
sensitizadas com anticorpo
Incubação das células alvo com as NK/LAK
Medida da radioactividade libertada no
sobrenadante da cultura
a b
%lise 
x100%
c b
a=lise experimental cpm (efector + alvo)
b=lise espontânea cpm (meio+alvo)
c=lise máxima (SDS+alvo)
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