Enzimas de Restrição
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS PROFESSORES: Gonçalo A. Pereira [email protected] MONITORES: Alessandra Lanza Rego [email protected] Gustavo Henrique Zapparoli [email protected] AUTORES: Paola Fernanda Guidi Sulamida de Freitas Franco Vitor Hugo de Almeida e Silva [email protected] [email protected] [email protected] INTRODUÇÃO Durante o decorrer da disciplina serão desenvolvidas práticas laboratoriais simulando um mini projeto genoma, sendo o organismo alvo, um basidiomiceto de caráter fitopatogênico (Crinipellis perniciosa). 1. PLANTAS E PATÓGENOS E A IMPORTÂNCIA DOS PROJETOS GENOMA. Na famosa história infantil de Lewis Caroll, "Alice no país das maravilhas", há uma curiosa passagem em que a personagem corre, corre, corre, mas tudo ao seu redor corre também. Ou seja, é uma corrida para não se sair do lugar. Essa passagem tem sido largamente utilizada em uma perspectiva evolutiva para se comparar o que ocorre entre hospedeiros e patógenos. Ou seja, por mais que os hospedeiros "corram" para buscar novas estratégias para escapar dos seus algozes, os patógenos sempre acabam encontrando formas de superar a resistência conseguida pelos primeiros. É uma corrida sem fim, mas que tem que ser disputada, e o papel da ciência nesta corrida é o de prover uma "dianteira" para os hospedeiros. Com esse objetivo a ciência necessita de duas coisas. Primeiro, entender os competidores, e aí se encaixa a ciência básica na qual se incluem os projetos genoma. A segunda é a geração de estratégias capazes de interferir com os competidores, ou para prejudicá-los, como com o uso de fungicidas, herbicidas e pesticidas, ou para auxiliá-los, como com a aplicação de adubos ou o melhoramento genético. Neste último caso temos o método convencional e os controversos transgênicos, aos quais os projetos genoma são muitas vezes erroneamente associados. Em relação aos genomas, nos últimos anos houve uma verdadeira explosão desses projetos. O objetivo é conhecer a informação contida no DNA das células, que é o que determina as suas possibilidades. As razões que possibilitaram o avanço dos projetos genoma foram de natureza técnica, especificamente o aumento na velocidade do seqüenciamento e o desenvolvimento da bioinformática. Uma vez feito o seqüenciamento, outra etapa essencial para um projeto genoma é a anotação dessas seqüências. Por anotação entende-se provir a seqüência de informações biológicas como a localização de genes e tipo de proteína que aquele possível gene codifica. Para essa última missão a maior parte das vezes a anotação inicial é feita via a comparação das seqüências obtidas com os bancos de dados públicos, onde já existem seqüências anotadas, muitas delas fruto de extenso trabalho de bioquímicos que antecederam a biologia molecular. Existem atualmente muitos desses bancos de seqüências "on line", por exemplo o GenBank, que podem ser consultados via programas de comparação específicos do tipo "Blast". O número de seqüências depositadas anualmente nesses bancos é enorme, estimando-se que eles dobram de tamanho a cada 14 meses. Para a maior parte dos projetos genoma a anotação inicial de seqüências é feita automaticamente usando esses programas de comparação, sem que experimentos de bancada (wet lab) sejam realizados. São os chamados experimentos "in silica". 2. GENOMAS DE FUNGOS Há notícia da conclusão de dezenas de genomas de bactérias (www.tigr.org/tdb/mdb/mdbcomplete.html) e até mesmo de organismos com grandes conteúdos de DNA, como a Drosophila melanogaster (www.flybase.bio.indiana.edu) e o verme Caenorhabditis elegans (www.moulon.inra.fr/acedb/acedb.html), isso sem se falar no ser humano (Venter et al., 2001; Lander et al., 2001). Entretanto, no campo dos fungos, apesar da sua enorme importância econômica principalmente como fitopatógenos, pouco foi feito. Estima-se a existência de pelo menos 10.000 doenças de plantas causadas por fungos (Pennisi, 2001). De dados tornados públicos foi realizado o genoma completo apenas da levedura Saccharomyces cerevisiae (Goffeau et al., 1996), e o fungo Neurospora crassa está aparentemente em uma etapa final. Ambos são organismos experimentais. A principal razão para essa situação parece estar no tamanho e na complexidade de projetos genoma de fungos, o que reflete no custo e esforço para a sua realização. A maior parte dos fungos tem um conteúdo de DNA aproximadamente 10 vezes superior ao de bactérias e o seu DNA é organizado em cromossomos com muitas estruturas complexas. Assim sendo, são organismos difíceis de terem o seu genoma completado, pois exigem grande quantidade de seqüenciamento e os recursos de bionformática necessários para a sua montagem e análise já são consideravelmente mais complexos que os necessários para bactérias. 3. CRINIPELLIS PERNICIOSA (VASSOURA DE BRUXA) Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer é uma das 63 espécies conhecidas do gênero Crinipellis, da família Tricholomataceae, que corresponde a maior família em número de espécies da ordem Agaricales do filo Basidiomycota. A sua espécie é ainda subdividida em biótipos de acordo com o hospedeiro que ataca. O biotipo-C ataca especificamente o cacaueiro e apresenta um ciclo de vida hemibiotrófico, ou seja, se hospeda durante uma fase em tecido vivo e durante outra em tecido morto. Em condições naturais, a disseminação da doença resulta da dispersão abiótica de basidiósporos uninucleados liberados dos basidiomas presentes formados na superfície externa dos órgãos do hospedeiro. Ao atingir a superfície dos órgãos de plantas sadias, os esporos germinam, produzindo tubos de germinação monocarióticos que penetram no hospedeiro e atingem os tecidos meristemáticos. Os esporos penetram no tecido em crescimento do cacaueiro (ramos novos, almofadas e bilros), produzindo os sintomas que são observados tanto na copa como no tronco. Nos lançamentos verifica-se a formação lateral de outros brotos, dando o aspecto característico de uma vassoura. Esses brotos apresentam-se mais grossos que os normais, com entrenós curtos e folhas geralmente grandes, curavadas ou retorcidas. Com dois a quatro meses, esas vassouras secam. Nas almofadas florais formam-se cacho de flores anormais, com hastes grandes e inchadas, as quais daram origem a frutos com formato de morango que morrem prematuramente. Nessas almofadas também podem desenvolverse vassouras vegetativas. 4. PROJETO GENOMA DE CRINIPELLIS PERNICIOSA Em vista da complexidade do problema da vassoura de bruxa é que se propôs a realização do projeto Genoma de Crinipellis perniciosa (veja a página do projeto: www.lge.ibi.unicamp.br/vassoura). Optou-se por utilizar uma estratégia híbrida na qual fragmentos de DNA genômico gerados a partir de bibliotecas de shotgun são seqüenciados, comparando entretanto cada read, à medida que eles vão sendo gerados, com os bancos de dados. Esse é um procedimento semelhante ao realizado por projetos genoma que seqüenciam cDNA, com a vantagem que as seqüências são naturalmente normalizadas, ou seja sua ocorrência não depende da expressão dos genes, pois trata-se de DNA genômico A montagem do genoma completo, embora desejável a médio prazo, não é imprescindível para a identificação e análise de genes, o que pode ser feito durante o seqüenciamento, economizando vultosa quantidade de tempo e recurso. Ou seja, optou-se por uma abordagem pragmática de obter o máximo de informação com a menor quantidade de esforço e tempo possível. 1. Extração de DNA fúngico 2. Eletroforese em gel de agarose 3. Isolamento e purificação de banda 4. 1. PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DE DNA FÚNGICO Esta prática não será realizada diante do tempo despendido e da complexidade envolvida, entretanto segue o protocolo utilizado normalmente pelos pesquisadores do Projeto Genoma da vassoura de Bruxa. SOLUÇÕES UTILIZADAS: - Tampão de extração: CTAB (brometo de N-cetil-N, N, N-trimetil amônio) 100mM Tris HCL pH8, 1,4M NaCl, 2% CTAB, 20mM EDTA, 2% PVP Clorofórmio álcool isoamílico Isopropanol Etanol (70%) Água destilada, deionizada, esterilizada PROCEDIMENTO (deve ser realizado usando luvas) Etapa 1: Preparo das amostras 1. Pesar 65g de cada amostra e, posteriormante cobrir a amostra com papel laminado 2. Encher a garrafa térmica com nitrogênio líquido 3. Verter o nitrogênio líquido em um cadinho (com pistilo dentro) até preencher aprox. 1/3 do mesmo. 4. Colocar a amostra pesada no cadinho 5. Macerar o material, inicialmente com movimentos rotacionais suaves que vão tornando-se cada vez mais enérgicos à medida que o nitrogênio evapora. 6. Raspar com uma espátula todo o material pulverizado, introduzindo-o no tubo correspondente retirado do banho maria 7. Agitar o tubo por inversão (3x) suavemente e recolocá-lo em banho-maria 8. Incubar por 1hora a 65°C 9. Centrifugar a 10000rpm por 10 minutos e recuperar o sobrenadante Etapa 2: Extração, precipitação, lavagem e armazenamento do DNA 1. Adicionar 650 microlitros de Clorofómio- álcool isoamílico mais 100 microlitros de fenol 2. Vortexizar brevemente ou agitar por inversão por 10 min para uma melhor homogeneização e extração 3. Centrifugar a temperatura ambiente (25°C) , 13000rpm por 5 a 10 min ou até obter uma fração aquosa superior clara 4. Remover 450 microlitros da fase aquosa superior contendo DNA para um novo tubo 5. Adicionar, em seguida, o mesmo volume de isopropanol 6. Inverter suavemente os tubos (3x). Deixar o tubo a –20 (por 30 min) ou –70 (por 10 min). 7. Centrifugar a temperatura ambiente (25°C), 13000rpm por 5 min ou até obter uma fase aquosa superior clara 8. Despejar cuidadosamente o sobrenadante no sentido oposto ao precipitado de DNA em um recipiente qualquer 9. Dar um spin para fazer baixar toda a solução restante 10. Pipetar o restante do líquido cuidadosamente 11. Adicionar 1 ml de etanol 70% 12. Agitar vigorosamente o tubo por inversões, fazendo com que o precipitado solte-se da parede para lavá-lo completamente 13. Centrifugar a 13000 rpm por 1 min para forçar a aderência do precipitado 14. Repetir os passos 9, 10 e 11 e lavar uma segunda vez . Pode-se lavar até 5x com etanol se necessário.’ 15. Deixar os tubos em posição horizontal sobre papel toalha até secarem completamente 16. Ressuspender o precipitado em 30 microlitros de água 17. Deixar por 1-2 min em banho-maria a 37 °C para solubilização completa 18. Após solubilização aplicar 100microgramas/ml de RNAse (i microlitro de RNAse da Pharmacia para 30 microlitros de sol. de DNA e incubar em banho-maria a 37°C por 30 min 19. Quantificar o espectrofotômetro e ver a qualidade do amterial extraído em eletroforeze 20. Estocar a –20°C Bibliografia - ROGERS, S. O.; BENDICH, A.J. Extraction of total cellular DNA from plantes and fungi: GELVIN, S.B.; SCHILPEROORT, R.A (eds). Plant Molecular Biologi Manual. Dordrecht: Kluwer Academic Publisher, 1994 2. ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE - Concentração de agarose A eletroforese em gel de agarose permite a separação de moléculas de DNA em função de seu tamanho. Dependendo da faixa de separação requerida, utilizam-se diferentes concentrações de agarose, variando em geral de 0,5 a 3%. Assim, para uma boa separação de fragmentos variando de 0,5 a 10 kb, emprega-se uma concentração de 0,8 - 1,0%. Para fragmentos maiores pode-se utilizar uma concentração menor, de até 0,5%. Nessa concentração o gel já adquire uma consistência muito mole, dificultando sua manipulação. Para a separação de fragmentos pequenos, de 50 a 500 pb, recomenda-se uma malha mais fina através do uso de uma concentração alta, de 2 a 3 % de agarose. - Tampão Para manter o pH pouco alterado ao longo da corrida eletroforética e garantir a formação de um campo elétrico, utiliza-se uma solução de TBE (Tris/Borato/EDTA) ou de TAE (Tris/Acetato/EDTA) em pH alcalino. - Condições de corrida Normalmente emprega-se tensão (medida em Volts) constante, num valor que varia em função do comprimento do gel e distância entre os eletrodos da cuba. De modo geral os fabricantes da cuba sugerem os valores ideais, que variam na faixa de 50 a 150 V, dependendo do tamanho da cuba (8-10 V por cm). ATENÇÃO Brometo de etídeo é altamente tóxico, mutagênico e carcinogênico!! Sempre vestir luvas e não permitir nenhum contato físico com o reagente. Em caso de contato, lavar abundantemente com água. 3. OBTENÇÃO DE FRAGMENTOS - SONICAÇÃO E ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Na eletroforese a ser realizada (ver roteiro anterior) serão corridos DNA íntegro e fragmentos de DNA digerido, sendo os últimos obtidos através de processo de sonicação (técnica que consiste na submissão de uma solução contendo DNA a um equipamento de ultra-som, por tempo e potência determinados, gerando fragmentos de tamanhos variados). O tamanho dos fragmentos gerados por sonicação são selecionados através de uma corrida em gel de agarose utilizando-se um marcador de peso molecular conhecido. Tais fragmentos também poderiam ser obtidos através de uma digestão por enzimas de restrição. Enzimas de Restrição Em 1953 foi descrito um estranho fenômeno no qual a eficiência da replicação de um bacteriófago (vírus de bactérias) dependia da célula hospedeira na qual ele estava inserido. Algum tempo depois percebeu-se que a inabilidade de certos fagos crescerem em determinadas linhagens bacterianas era devido a presença de nucleases altamente específicas que clivavam o seu DNA. Isto pode ser encarado como um sistema de defesa bacteriano que degrada DNA que lhe é estranho (restrição). A bactéria protege seu próprio DNA desta degradação "camuflando-o" através da metilação de algumas bases específicas (modificação). Como conseqüência, este sistema é frequentemente descrito como fenômeno da restrição/modificação e existe em um grande número de bactérias. As enzimas de restrição ou endonucleases de restrição são divididas em várias classes, dependendo da estrutura, da atividade e dos sítios de reconhecimento e clivagem. As enzimas do Tipo II são proteínas monoméricas ou diméricas e clivam o DNA no mesmo sítio do seu reconhecimento. O sítio de reconhecimento deste tipo de enzima é normalmente uma seqüência palindrômica, isto é, ela tem um eixo de simetria e a seqüência de bases de uma fita é a mesma da fita complementar, quando lida na direção oposta (Figura 1). Figura 1. Dois tipos de clivagem feitas por enzimas de restrição. As setas indicam os sítios de clivagem. As linhas pontilhadas representam o centro de simetria da sequência. Estas enzimas reconhecem seqüências específicas de 4 a 8 pares de base (bp) na molécula de DNA e fazem dois cortes, um em cada fita. Há 2 tipos distintos de clivagens: a) os dois cortes ocorrem no eixo de simetria da seqüência específica, gerando extremidades abruptas, ou b) os cortes são feitos simetricamente, porém, fora do eixo de simetria, gerando extremidades coesivas. Estes dois tipos de clivagens e suas conseqüências estão mostrados na Figura 1. Atualmente, mais de 1000 enzimas de restrição já foram identificadas. A nomenclatura desenvolvida foi baseada na abreviação do nome do microrganismo do qual a enzima foi isolada. A primeira letra representa o gênero e as outras duas a espécie, seguido de um algarismo romano (ou outra letra) que indica a ordem da descoberta ou a linhagem da qual ela foi isolada. Por exemplo, a enzima de restrição denominada de EcoRI é purificada de uma Escherichia coli que carrega um fator de transferência de resistência RI, enquanto que a Hind III é isolada da Haemophilus influenzae, linhagem d III. A Tabela a seguir mostra a seqüência palindrômica e o local de clivagem de algumas enzimas de restrição. Note que algumas enzimas deixam terminações coesivas enquanto que outras fazem cortes abruptos ou não coesivos. Tabela: Algumas endonuclease de restrição: origem e sítios de clivagem. A seta indica o local de clivagem. Pu e Pi referem-se, respectivamente, a qualquer purina e pirimidina. O interesse por estas enzimas de restrição aumentou em 1973 quando se percebeu que elas poderiam ser usadas para fragmentar o DNA deixando extremidades de fitas simples de DNA que permitiam a ligação dos fragmentos. Isto significava que a recombinação poderia ser efetuada em tubos de ensaio. Além disto, DNA bacteriano poderia recombinar com DNA humano ou de qualquer outra espécie, abrindo a possibilidade de clonar genes humanos ou isolar proteínas de culturas bacterianas. Uma importante conseqüência da especificidade destas enzimas de restrição é que o número de clivagens feito por cada uma delas no DNA de qualquer organismo é definido e permite o isolamento de fragmentos deste DNA. Portanto, cada enzima de restrição gera uma família única de fragmentos quando cliva uma molécula de DNA específica. Enzimas que reconhecem sítios de restrição compostos por 4 pares de bases clivam o DNA em média a cada 256 nucleotídeos (44=256). Aquelas que reconhecem sítios com 6 e 8 bp clivam o DNA em média a cada 4096 e 65536 bp, respectivamente. No entanto, esta média pode sofrer variações significativas, dependendo principalmente da composição de bases do DNA analisado. Por exemplo, a enzima NotI reconhece um sítio de restrição contendo 8 bp, incluindo nucleotídeos CpG, que raramente ocorre no DNA de mamíferos. A família de fragmentos gerados por digestão com enzima de restrição é geralmente detectada pela separação destes fragmentos por eletroforese em gel de agarose. Os fragmentos migram em função de seus pesos moleculares sendo que os menores migram mais rapidamente (Figura 2). Figura 2. Moléculas de DNA de tamanhos diferentes podem ser separadas por eletroforese. Moléculas menores movem-se mais rapidamente que moléculas maiores, tornando-se portanto separadas em bandas. O DNA é corado com brometo de etídeo uma molécula que fluoresce quando iluminada com luz Ultra Violeta. 4. PURIFICAÇÃO DE BANDA DE DNA CORTADA DE GEL DE AGAROSE (KIT CONCERT) OBS: antes de começar a purificação da banda prepare um alíquota de TE a 65C . Equilibrar o banho a 50 e também adicionar etanol ao L2. - Cortar a área do gel que contem o fragmento desejado descartando o excesso de gel e transferir para um eppendorf Colocar 200l de L1 ( tampão de solubilização) no eppendorf Incubar por 15min a 50C misturando a cada 3min. Prepara a coluna e adicionar o gel solubilizado. Centrifugar por 1min a 14000rpm. Descartar o filtrado Colocar novamente na coluna 500l de L1 e incubar à temperatura ambiente por 1min Centrifugar novamente por 1min a 14000rpm e descartar o filtrado Adicionar 700l de L2 com etanol e incubar por 5 min a temperatura ambiente Centrifugar por 1min a 14000rpm, descartar o filtrado , tornar a centrifugar por 1min e descartar o residual. Para eluir o DNA, coloca-se a coluna no tubo eppendorf. Adicionar 50l de TE (65C) diretamente no centro da coluna. Incubar por 1min e então centrifugar a 14000rpm por 2min. Guardar o eluído. 5. VETORES DE CLONAGEM Após o isolamento de uma informação genética, por exemplo um fragmento de DNA obtido pela clivagem com enzimas de restrição, este fragmento deverá ser inserido numa outra molécula de DNA diferente, capaz de amplificar aquela informação genética em centenas de cópias. Este processo de amplificação é obtido através do uso de moléculas de DNA que são os chamados vetores de clonagem molecular. Atualmente, os tipos básicos de vetores usados na metodologia do DNA recombinante apresentam características especiais que os tornam excelentes veículos de clonagem em diferentes situações. A seguir, vamos apresentar o tipo de vetor que será utilizado em nossas aulas práticas. PLASMÍDEO São pequenas moléculas de DNA dupla fita, contendo os elementos necessários para a sua replicação e pelo menos um gene que confere resistência a antibiótico. Estes elementos genéticos extra cromossomais variam de 5 a 400 kilobases e comumente estão presentes em duas ou mais cópias por célula. Os plasmídeos presentes num grande número de cópias são usados como veículos de clonagem desde que capacitem a amplificação do segmento do DNA neles clonado. Um plasmídeo para ser um bom vetor de clonagem deve conter as seguintes propriedades: a) possuir uma origem de replicação (O), ou seja, uma seqüência de DNA que permita que o vetor seja replicado na célula hospedeira, b) apresentar dois ou mais sítios únicos de clivagem para endonucleases de restrição. O conjunto destes sítios é denominado de Múltiplo Sítios de Clonagem (MSC) é o local onde o inserto é incorporado ao vetor de clonagem, c) possuir um gene que codifica um produto que distingue a célula transformada da célula não transformada. Por exemplo, muitos vetores de clonagem carregam o gene que confere resistência à ampicilina (AmpR). As células transformadas com tais vetores são capazes de crescer num meio contendo o antibiótico, enquanto que as células não tranformadas acabam morrendo. Um dos passos fundamentais no processo de clonagem molecular é o uso de enzima de restrição que produz extremidades compatíveis durante a clivagem do DNA a ser clonado (inserto) e a do DNA receptor (vetor). Uma vez que o DNA foi ligado ao vetor, esta molécula híbrida deverá ser introduzida numa célula hospedeira geralmente bactérias, por um processo chamado de transformação, para que o vetor possa sofrer replicações e consequentemente amplificar o número de cópias do inserto. A bactéria transformada será facilmente reconhecida pela aquisição de um novo fenótipo dado pelo plasmídeo, ou seja, capacidade de crescer em meios contendo antibiótico. 6. CLONAGEM MOLECULAR A origem do termo clonagem vem da Genética Bacteriana que considera uma colônia de bactérias como um clone porque todos os indivíduos são geneticamente idênticos à bactéria inicial. A técnica central da metodologia do DNA recombinante é a clonagem molecular, a qual consiste no isolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas. A clonagem molecular compreende pelo menos dois estágios importantes: primeiro o fragmento do DNA de interesse chamado de inserto é ligado a uma outra molécula de DNA chamada de vetor para formar o que se chama de DNA recombinante. Segundo, a molécula do DNA recombinante é introduzida numa célula hospedeira compatível, num processo chamado de transformação. A célula hospedeira que adquiriu a molécula do DNA recombinante é agora chamada de transformante ou célula transformada. Um único transformante, em condições ideais, sofre muitos ciclos de divisão celular, produzindo uma colônia que contém milhares de cópias do DNA recombinante. Construção do DNA Recombinante Uma enzima de restrição particular reconhece somente uma seqüência única de bases. DNAs de origem diferente sob a ação da mesma enzima de restrição produzem fragmentos com o mesmo conjunto de extremidades fitas simples. Portanto, fragmentos de dois diferentes organismos (por exemplo, bactéria e homem) podem ser ligados por renaturação das regiões de fita simples. Além disto, se a ligação for "selada" com a enzima DNA ligase, depois do pareamento de bases, os fragmentos serão ligados permanentemente. A técnica de DNA recombinante tem um interesse especial se uma das fontes de DNA clivado for um plasmídeo. Uma molécula de DNA de plasmídeo que tem somente um sítio de clivagem para uma determinada enzima de restrição. A mesma enzima é usada para clivar DNA humano. Se os fragmentos de DNA humano são misturados com o DNA plasmidial linearizado, permitindo a ligação entre eles, uma molécula de DNA plasmidial contendo DNA humano pode ser gerada. Este plasmídeo híbrido pode ser inserido numa bactéria por transformação e então o inserto será replicado como parte do plasmídeo. Geralmente antibióticos são acrescentados ao meio da cultura para selecionar somente as linhagens que portam os plasmídeos (o plasmídeo usado para esta finalidade porta resistência a pelo menos um antibiótico). Figura 3. Construção de uma molécula de DNA híbrida a partir de fragmentos de diferentes organismos obtidos com o uso de enzima de restrição. DNA ligase Conforme mencionado anteriormente esta enzima promove a ligação dos fragmentos de DNA em vetores previamente clivados por endonucleases de restrição. A DNA ligase requer um grupo OH livre na extremidade 3' de uma das cadeias de DNA e um grupo fosfato na extremidade 5' da outra cadeia (Figura 4). A E.coli e o fago T4 codificam uma DNA ligase capaz de selar fragmentos de DNA com dupla fita. DNA ligase isolada de E.coli e de outras bactérias requer NAD+, enquanto que a isolada do bacteriófago T4 requer ATP como cofator. 7. CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECAS A obtenção de uma molécula de DNA recombinante, através da ligação de um fragmento de DNA de interesse com o DNA de um vetor, é um processo direto e relativamente simples. Entretanto, problemas especiais surgem quando o fragmento de interesse constitui uma fração pequena do DNA total. Este é o caso encontrado comumente quando o objetivo é o isolamento de genes presentes em uma única cópia num genoma complexo, ou quando o objetivo é o isolamento de clones portadores do DNA complementar à RNA mensageiro raro. Deste modo, é claro que quando queremos clonar um determinado gene ou o DNA complementar da mensagem ou mensagens por ele codificada(s) é necessário a obtenção de coleções de clones recombinantes, portadores de moléculas representantes de todo o genoma, ou de coleções de clones de cDNAs derivados de toda a população de mensageiros da célula ou tecido de interesse. Essas coleções de clones de DNA recombinante são chamadas de bibliotecas: Biblioteca Genômica, no caso dos clones terem sido obtidos a partir do DNA genômico ou Biblioteca de cDNA, no caso dos clones terem sido construídos a partir de DNA complementar. O DNA de organismos superiores é bastante complexo: por exemplo, o genoma haplóide de mamífero é composto de aproximadamente 3x109 pares de bases (pb). Portanto, se o fragmento de interesse tiver 3000 pb, ele compreenderá somente 1 parte em 106 de uma preparação do DNA total. De modo similar, uma espécie de RNAm particularmente rara pode compreender somente 1 parte em 105 ou 106 da fração de RNA mensageiros de uma célula. Deste modo, para que seja garantida a presença na biblioteca de pelo menos uma versão de todas as seqüências da população alvo, um dos pontos principais na construção de bibliotecas úteis é a obtenção de grandes quantidades de clones. Embora a solução deste problema envolva estratégias específicas no preparo do DNA alvo e na escolha do vetor de clonagem, em linhas gerais a construção de bibliotecas genômicas e de cDNAs segue um procedimento básico bastante semelhante. Nos dois casos, o DNA genômico ou os cDNAs são preparados para a inserção no vetor escolhido. O vetor e o DNA alvo são ligados e introduzidos em E.coli através de infecção ou em alguns casos, por transformação direta. Figura 4. Passos envolvidos na construção de Bibliotecas de cDNA e Bibliotecas genômicas 8.TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA Conceito de transformação induzida O processo de transformação constitui um evento de alta importância na técnica de manipulação gênica. A transformação natural descrita por Griffith, em 1928, e por Avery e colaboradores, em 1944, é um evento raro. No entanto em 1970, Mandel e Higa encontraram que a E.coli tornou-se marcadamente competente para transformação com DNA exógeno, quando a bactéria foi suspensa em cloreto de cálcio gelado e submetida a um curto choque térmico à 42oC. Estes mesmos autores também verificaram que as bactérias crescidas até a fase log eram mais competentes do que aquelas isoladas de outros estágios do crescimento. O procedimento do cloreto de cálcio que é usado até hoje produz uma eficiência de transformação de 105 a 107 transformantes por micrograma de DNA (a eficiência de transformação é geralmente expressa como o número de células transformadas, obtido a partir de um micrograma de DNA plasmidial intacto). O tamanho e a conformação da molécula do DNA, afeta o processo de transformação. Plasmídeos pequenos são mais facilmente incorporados pela célula bacteriana competente, DNA linear é pobremente incorporado, talvez pelo fato de sofrer degradação pelas enxonucleases presentes no espaço periplasmático. Bactéria competente Bactérias aptas a serem transformadas são denominadas competentes. O estado de competência tem sido detectado em diferentes espécies bacterianas, tanto gram-positivas quanto gram-negativas. Em geral, as bactérias são induzidas ao estado fisiológico de competência, num período definido ao final do ciclo de crescimento, pouco antes da população atingir a fase estacionária, quando os nutrientes começam a escassear e a densidade populacional é alta (Figura 10.3). Este período coincide com um decréscimo ou bloqueio na duplicação do DNA. A transferência do DNA só é geneticamente visível se modificar pelo menos um dos caracteres da célula receptora. Mecanismos de captação do DNA O mecanismo de captação da molécula do DNA pela bactéria competente ainda é desconhecido. Uma hipótese é que as moléculas do DNA passam através de canais situados nas chamadas zonas de adesão, que são locais onde a membrana interna e externa da célula bacteriana se unem formando poros. Estes poros só estão presentes durante o crescimento bacteriano (fase de crescimento exponencial). Em condições naturais, a captação do DNA torna-se difícil, devido a repulsão eletrostática existente entre as cargas negativas da camada de fosfolipídeos da membrana bacteriana com a carga negativa do grupo fosfato da molécula do DNA. O papel do cálcio é explicado pela hipótese de que a 0oC a fluidez da membrana celular é cristalizada, estabilizando a distribuição dos fosfatos carregados. Os íons Ca+2 formam um complexo com este grupamento, cobrindo as cargas negativas, facilitando agora a atração eletrostática com as moléculas do DNA na zona de adesão. O choque térmico, complementa este processo de captação, provavelmente criando um desbalanço térmico entre o interior e o exterior da célula bacteriana, auxiliando o bombeamento do DNA através da zona de adesão. A figura a seguir ilustra este processo. . Figura 4. Mecanismo molecular proposto para explicar a transformação de E. coli com uma molécula de DNA exógeno Eletroporação Este método baseia-se em características físico-químicas comuns a todas as membranas biológicas. A eletroporação baseia-se na introdução de DNA exógeno em células expostas a um campo elétrico. Este, polariza as regiões hidrofílicas dos fosfolipídios presentes nas membranas celulares, causando repulsões e consequentemente, poros transitórios na membrana, por onde o DNA pode ser introduzido na célula-alvo. Outro mecanismo de introdução de DNA exógeno em bactérias competentes é o choque térmico, entretanto utilizaremos durante nossas aulas práticas somente a eletroporação. Protocolo de obtenção de bactérias eletrocompetentes Considerações Primárias - Deve-se ter uma placa marcada com a linhagem de bactéria a ser utilizada, da qual deve-se pegar uma única colônia isolada para ser feito o pré-inóculo - Todos os tubos e frascos devem permanecer em gelo. Procedimento 1. Fazer pré-inóculo da bactéria em 50 ml de meio LB e deixar crescer overnight , 250 RPM 37ºC. 2. Transferir os 50 ml de pré-inóculo para erlenmeyer com 500 ml com meio LB e crescer até OD600 – 0,6 (entre 0,5 e 0,7). 3. (Deve-se acompanhar o crescimento em espectrofotômetro, 4. medindo a OD600 a cada 20min.). 5. Deixar 20 min. em gelo para interromper o crescimento. 6. Transferir cultura para dois tubos de centrífuga de 250 ml. 7. Centrifugar a 6000 RPM, por 15 min. a 4ºC . 8. Descartar sobrenadante. 9. Adicionar 200 ml de glicerol 10% e ressuspender células com leve agitação das mãos. 10. Centrifugar a 6000 RPM, por 15 min. a 4ºC . 11. Descartar sobrenadante. 12. Adicionar 20 ml de glicerol 10% e ressuspender células com leve agitação das mãos. 13. Transferir células para tubo de centrífuga de 30 ml. 14. Centrifugar a 6000 RPM, por 15 min. a 4ºC. 15. Descartar sobrenadante. Protocolo de Transformação Considerações Primárias - Lavar muito bem cubetas de eletroporação com água e álcool 70%. Após secagem esterilizar em luz ultra violeta por vinte minutos. - Antes de utilizar as cubetas mantê-las em gelo. Procedimento 1. 2. 3. 4. Descongelar bactéria (E. coli, linhagem DH10b) em gelo. Preparar equipamento de eletroporação com voltagem a 2KV. Deixar separado 1ml de meio de cultura (LB sem ampicilina) já na pipeta. Misturar DNA e célula competente em cubeta de eletroporação (ceritifique-se de que todo material encontre-se no fundo da cubeta). 5. Submeter à eletroporação e rapidamente adicionar o meio de cultura. Feito isso manter de 40 a 60 minutos a 37ºC em banho maria. 6. Plaquear em meio sólido. 9. PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) A reação em cadeia da polimerase (PCR, Polymerase Chain Reaction), foi idealizada em meados de 1980 e totalmente descrita em 1987. A maior aplicação desta metodologia é a possibilidade de se amplificar uma determinada sequência do DNA sem a necessidade do uso das tradicionais técnicas de clonagem molecular. Uma simples cópia de um gene específico dentro de um genoma pode ser amplificado para alguns microgramas, partindose de quantidades mínimas como sub picogramas de DNA total. A condição básica para a aplicação da técnica, depende da construção de oligonucleotídeos (iniciadores) os quais são complementares as duas fitas opostas do DNA e que estejam flanqueando a sequência a ser amplificada. O processo inicia-se com a desnaturação da dupla fita do DNA que contém a sequência a ser amplificada. Geralmente, a desnaturação é realizada a uma temperatura de 94ºC durante 5 minutos, onde nesta temperatura as duas fitas do DNA separam-se. O passo seguinte, consiste em abaixar a temperatura para níveis ao redor de 35ºC, permitindo que os oligonucleotídeos iniciadores anelem-se especificamente nas extremidades flanqueadas da sequência alvo e nas fitas opostas. Finalmente, a temperatura é elevada para aproximadamente 72º C e com isto a polimerase copia a sequência alvo a partir dos oligonucleotídeos iniciadores é a fase de extensão. Inicialmente, usou-se a DNA polimerase da Escherichia coli, cuja temperatura ótima é de 37ºC. Ela era adicionada manualmente a cada ciclo porque o passo de desnaturação a 94º C inativava a enzima. Como podemos ver, o processo basicamente ocorre em 3 fases: desnaturação, anelamento e extensão, os quais, constituem um ciclo da reação de amplificação. Inicialmente, usou-se a DNA polimerase da Escherichia coli, cuja temperatura ótima é de 37ºC. Ela era adicionada manualmente a cada ciclo porque o passo de desnaturação a 94ºC inativava a enzima. Um importante avanço técnico no processo surgiu com a descoberta da Taq polimerase (Sarki et al, 1988) oriunda da bactéria Thermus aquaticus a qual vive em fontes de água à temperatura de 75° C. A enzima tem uma temperatura ótima de ação a 72° C, mas permanece razoavelmente estável mesmo a 94° C e com isto, a enzima é adicionada uma única vez. Devido a este fato, foi possível a automatização do processo nos chamados termocicladores. Além da molécula do DNA, também o RNA pode ser amplificado desde que ele seja primeiro convertido para cDNA através da transcrição reversa. Além do principal uso do PCR que é o processo de amplificação de sequências específicas, rapidamente surgiram novas aplicações para esta poderosa metodologia, tais como: sequenciamento de nucleotídeos, análise do polimorfismo, diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas e várias outras aplicações mais específicas durante o uso da metodologia do DNA recombinante. Protocolo para 1 reação de PCR MIX 1. 22,6l de H20 MiliQ 2. 5l de 10x buffer 3. 2l de MgCl2 (25mM) 4. 8l de dNTPs (1,25mM) 5. 5l de primer Forward (15mM) 6. 5l de primer Reverse (15mM) 7. 0,4l de Taq Polymerase Procedimento 1. Misturar todos os reagentes indicados na ordem acima. Deixar o tubo contendo o MIX no gelo. 2. Adicionar 2l de DNA no tubo contendo o MIX. 3. Colocar o tubo no termociclador. - 96ºC por 4 minutos - 94ºC por 30 segundos - 50ºC por 30 segundos 41 ciclos - 72ºC por 3 minutos - 72ºC por 7 minutos - 4ºC 10. MINI PREPARAÇÃO DO DNA PLASMIDIAL Soluções - Solução I – GTE (para 500 ml) Glicose 23 ml de solução 20% Tris – HCl 13 ml de solução 1,0 M pH 7,4 EDTA 10 ml de solução 0,5 M pH 8,0 Completar para 500 ml com H2O. Obs. A solução de glicose 20 % deve ser preparada no momento de preparo da Solução I , demais soluções podem ser estocadas. - Solução II – NaOH (0,2 M)/ SDS (10%) (para 500 ml) NaOH 10 ml de solução 10 M SDS 50 ml de solução 10 % Preparar a Solução II na sequência: 200 ml de H2O 10 ml de NaOH 50 ml de SDS, para então completar para 500 ml com água. Obs. Diluir os 10 ml de NaOH em 200 ml de H2O, em banho gelado. - Solução III – acetato de potássio 3 M (para 500 ml) KOAc 147,2 g ácido acético glacial 57,5 ml Completar para 500 ml com água. Obs. Além dos 57,5 ml, adicionar mais ácido acético até a Solução III atingir o pH de 5,2. Procedimento 1. Inocular a bactéria transformada em 3ml de meio de cultura (LB + ampicilina) por 18 horas a 37C 2. Transferir 1,5 ml da cultura para um tubo eppendorf e centrifugar por 30 a 60 segundos a 14000rpm e descartar o sobrenadante 3. Adicionar 100l de sol.I gelada 4. Ressuspender as células com ponteira e deixar por 15min a 37C 5. Adicionar 200l de sol II (preparada no dia) 6. Misturar o conteúdo do tubo invertendo-o delicadamente 7. Adicionar 150l de sol.III gelada 8. Misturar o conteúdo invertendo o tubo cuidadosamente e lentamente (notase a formação de grumo branco) 9. Manter em banho de gelo por 15 min ou mais. 10. Centrifugar a 14000rpm 4C por 15min. 11. Transferir o sobrenadante para outro tubo tomando o cuidado para pegar somente material líquido 12. Adicionar 1ml de ETOH absoluto gelado (-20C) 13. Misturar o conteúdo 14. Centrifugar a 14000rpm a 4C por 15min 15. Descartar sobrenadante 16. Adicionar ao tubo 1ml de ETOH 70% gelado e centrifugar por 5min (14000rpm, 4C) 17. Secar, invertendo o tubo sobre o papel toalha. Precipitação 11. SEQÜENCIAMENTO AUTOMÁTICO utilização de sequenciadores automáticos é essencial quando deseja-se realizar sequenciamneto em larga escala, como por exemplo em projetos genoma. O desenvolvimento e utilização de sequenciadores automáticos torna mais efeciente e rápido o sequenciamento de DNA na medida em que as etapas de leitura do gel e o processamento de sequências são realizadas através de computadores. A reação de sequenciamento é realizada através do método de Sanger (1979), do mesmo modo que no sequenciamento manual. Entretanto, no sequenciamento automático os nucleotídeos estão marcados com fluorocromos ao invés de isótopos radioativos. Quatro diferentes fluorocromos são empregados e uma vez excitados por um feixe de laser emitem luz em diferentes comprimentos de onda. É possível marcar com estes fluorocromos o "primer" universal M13 ou então cada um dos dideoxinucleotídeos (terminadores). Assim, uma vez que em cada uma das reações (A, T, C, G) foi empregado um fluorocromo diferente é possível juntar estes produtos e realizar a corrida em uma única raia do gel de sequenciamento. Os produtos da reação de sequenciamento, marcados com os fluorocromos, ao serem submetidos a eletroforese passam pelo feixe de laser, que promove a excitação dos fluorocromos. A luz emitida pelos fluorocromos é detectada por um fotomultiplicador e a informação é processada através de um computador (Figura 6). Figura 6. Sequenciamento automático de DNA. As reações com os diferentes dideoxinucleotídeos são realizadas em um plasmídeo M13, no qual encontra-se clonado o fragmento de DNA a ser sequenciado. Cada uma das misturas de reação contém o primer universal M13 marcado com um fluorocromo diferente. Os produtos de reação são agrupados e submetidos a eletroforese em uma única raia de gel de sequenciamento, no sequenciador automático. A medida que os fragmentos passam pelo feixe de laser, os fluorocromos são excitados e a luz emitida é detectada por um fotomultiplicador. Esta informação é traduzida na forma de sequência através de um computador.
