Southern, Northern e Western Blot Teorias e Aplicações Gerhard Wunderlich e Carsten Wrenger BMP-5777 Western Blot: Proteínas • Bloqueio: reduz as interações não específicas entre membrana e o anticorpo • 1ª anticorpo: (monoclonal ou policlonal) é específico para a proteína de interesse • 2ª anticorpo: (anti IgG espécie-espécifico) conjugado com uma enzima que permite a identificação visual • Detecção: colorimétrica quimioluminescente fluorescente radioativa Western Blot: - Proporciona um método para comparações de proteínas a nível de expressão - Diagnósticos médicos (ex. Teste confirmatório para HIV, além de outras doenças infecciosas, auto-imunes, alergias, e outros) Southern Blot: DNA • Denaturação: digestão da dupla fita do DNA com enzimas de restrição e o tratamento do gel com solução alcalina (NaOH) • Transferência do ssDNA para uma membrana: A membrana é aquecida (no caso da nitrocelulose) ou exposta a radiação ultravioleta (no caso do nylon) para ligar permanentemente o DNA à membrana. • Sonda Hibridizadora: é uma molécula de DNA ou RNA cuja seqüência é conhecida (idêntica ou complementar a seqüência de interesse). A sonda de DNA é marcada normalmente incorporando-se átomos radioativos ou ligando-se corantes quimioluminescentes • Revelação: por uma auto-radiografia em um filme de raio-x, ou pelo aparecimento de uma cor caso a marcação cromogênica tenha sido usada. Southern Blot: - Análises de sequências genomicas, para verificar se uma determinada seqüência de DNA está ou não presente em uma amostra de DNA analisada - Alterações em um único nucleotídeo; detecção de inserções, deleções e rearranjos; ordenamento de fragmentos do DNA; fragmentos de cromossomo. Northern Blot: mRNA • Denaturação: adição de formaldeído, que funciona como um desnaturante. • Transferência do RNA para uma membrana: aquecimento (no caso da nitrocelulose) ou exposição a radiação UV (no caso do nylon) • Altamente sensível a RNAses • Sonda Hibridizadora: é uma molécula de DNA ou RNA cuja seqüência é conhecida e complementar a seqüência de interesse, marcada normalmente com átomos radioativos ou corantes quimioluminescentes • Revelação: exposição a filme de raio-x, ou pela detecção de fluorescência. Northern Blot: • Úteis em estudo de expressão gênica (verificar se um determinado gene de um genoma é ou não transcrito em RNA) • Estudo de diferentes tecidos • Estudo do padrão temporal de expressão de genes durante o crescimento do indivíduo Professor Sir Edwin M. Southern Southern, E. M. (1975). "Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis". Journal of molecular biology 98 (3): 503–517 H. Towbin, T. Staehelin, J. Gordon. 1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. PNAS