Slide 1 - IBA (FMRP)

HIV X Imunoterapia
Fernanda Rocha
Gustavo Garcia
Tiago Medina
HIV- Vírus da Imunodeficiência Humana
-HIV- (human imunodeficiency virus):
• Familia: Retroviridae
•Gênero: Lentivirus
•HIV-1 – (Subtipos de A-J)
•HIV-2
-Sintomas:
-Semelhante gripe comum
Partículas do HIV-1 na superfície de macrófagos infectados
População infectada com HIV
Western &
Central Europe
Eastern Europe
& Central Asia
820 000
1.4 million
[720 000 – 910 000][1.3 million – 1.6 million]
North America
1.5 million
East Asia
[1.2 million – 2.0 million]
770 000
Middle East & North Africa
Caribbean
240 000
[220 000 – 270 000]
Central &
South America
1.4 million
[1.2 million – 1.6 million]
[560 000 – 1.0 million]
460 000
[400 000 – 530 000]
South & South-East Asia
4.1 million
Sub-Saharan Africa
[3.7 million – 4.6 million]
[20.9 million – 24.2 million]
Oceania
22.5 million
57 000
[50 000 – 64 000]
Total: 33.3 million [31.4 million – 35.3 million]
Estimativa de novos casos de infecção pelo HIV
North America
70 000
Western &
Central Europe
Eastern Europe
& Central Asia
[23 000 – 40 000]
[110 000 – 160 000]
31 000
130 000
[44 000 – 130 000]
Middle East & North Africa
Caribbean
17 000
[13 000 – 21 000]
Central &
South America
92 000
[70 000 – 120 000]
East Asia
82 000
[48 000 – 140 000]
75 000
[61 000 – 92 000]
South & South-East Asia
270 000
Sub-Saharan Africa
1.8 million
[1.6 million – 2.0 million]
[240 000 – 320 000]
Oceania
4500
[3400 – 6000]
Total: 2.6 million [2.3 million – 2.8 million]
Cinética da infecção pelo HIV
Abaixo de 200 células/ml: Muito vulnerável, tratar imediatamente;
Entre 200 e 350 células/ml: Vulnerável, deve ser iniciado o tratamento
Entre 350 e 500 células/ml: Pouco vulnerável, pode começar a critério médico;
Acima de 500: Saudável, não precisa começar o tratamento.
Formas de terapias para o controle da
infecção viral
Nature Biotechnology 25, 1395 - 1402 (2007)/ Ann Intern Med. 1996 Apr 1;124(7):654-63.
Sistema Imune versus Infecção Viral
Nature Reviews Immunology 10, 11-23 (January 2010)
Propagação do HIV
Pontos de intervenção por drogas antivirais
Nature Biotechnology 25, 1395 - 1402 (2007)
Resposta imune durante infecção viral
-100µg/kg de IL7 por 9 dias
-ATR+ 100µg/kg de IL7 por 26 dias
8dpi – 10µg de IL7 ou PBS por 2 semanas
-3 ou 10 μg/kg de IL-7; 3x/semana por 16 dias
IL-7 administration drives T cell-cycle entry and expansion in HIVinfection
Objetivo: Verificar a atividade biológica da IL-7 recombinante
humana administrada em pacientes infectados com HIV.
A rhIL-7 é tóxica para pacientes infectados com HIV?
rhIL-7/
placebo
1 4
Teste para anticorpos
anti-IL-7
toxicidade
14
28
56
A concentração de 30 mg/kg de rhIL-7 é a máxima tolerada pelos pacientes.
Qual o perfil farmacocinético da rhIL-7 após seu único inóculo subcutâneo?
rhIL-7
Dose única
0.5, 1, 1.5, 2, 2.5,
4, 8, 12, 24, 48 e
72h
plasma
ELISA
Os níveis de IL-7 no plasma aumentaram de modo dependente da dose. O
perfil farmacocinético torna-se não linear com o aumento da dose.
Como os linfócitos circulantes se comportam após administração de rhIL-7?
rhIL-7
Dose única
0, 1, 2, 4,
14, 28 dias
PBMC
Citometria
de Fluxo
Placebo
IL-7 (3mg/Kg)
IL-7 (10mg/Kg)
IL-7 (30mg/Kg)
IL-7 (60mg/Kg)
Uma única dose de IL-7 induziu um aumento no número de
linfócitos T CD4+ e CD8+ circulantes.
A administração da IL-7 induziu o aumento linfocitário de alguma subpopulação específica?
rhIL-7
Dose única
0, 1, 2, 4,
14, 28 dias
PBMC
Citometria
de Fluxo
O aumento de linfócitos foi predominante entre os
linfócitos T de memória central.
A administração de rhIL-7 induz proliferação de linfócitos?
rhIL-7
Dose única
Ki67  proteína nuclear expressa
em todas as fases do ciclo celular,
exceto na fase de repouso
0, 1, 4,
14, 28 dias
Linfócitos
Proliferação
celular
Placebo
IL-7 (3mg/Kg)
IL-7 (10mg/Kg)
IL-7 (30mg/Kg)
IL-7 (60mg/Kg)
rhIL-7 induz proliferação e ativação de linfócitos?
Treg
A administração de rhIL-7 induziu os linfócitos T a entrarem em ciclo celular,
exceto a subpopulação de células T reguladoras.
A administração de rhIL-7 induz ativação de linfócitos?
rhIL-7
Dose única
0, 1, 4,
14, 28 dias
Linfócitos
Ativação
celular
Placebo
IL-7
A administração de rhIL-7 induziu ativação dos linfócitos T
no mesmo período que eles iniciaram ciclo celular.
Qual o efeito da rhIL-7 sobre as células T CD8+ específicas ao antígeno viral?
rhIL-7
Dose única
0, 4, 28 dias
Tetrâmero + Peptídeos
Citomegalovirus;
Epstein-Barr virus;
Influenza virus;
HIV
PBMC
Citometria
de Fluxo
Uma única dose de rhIL-7 aumentou o recrutamento não seletivo de células T
CD8+ de memória específicas ao antígeno em ciclo celular.
Qual o efeito da rhIL-7 sobre os linfócitos B?
CD21low
CD21high
Imatura
Transição
rhIL-7
Dose única
0, 4, 28 dias
PBMC
Citometria
de Fluxo
O número de
células B
circulantes não
foi alterado
A administração de rhIL-7 induziu a emergência de células B de imaturas para
uma fase de transição.
Memória
central
Imatura
Transição
A IL-7 possui um perfil favorável para o desenvolvimento terapêutico para
pacientes com HIV ou outras linfopenias.
Objetivo: Investigar o potencial terapêutico da IL-7 na
infecção crônica pelo LCMV, na tentativa de reverter a
exaustão celular.
O tratamento com IL-7 aumenta o número de
células no baço durante a infecção com LCMV?
Infecção com o
clone 13 - LCMV
C57BL/6
8° dia
Tratamento com
IL-7 ou PBS por 3
semanas
Quantificação do número
de células no baço em
diferentes dias
Houve aumento de linfócitos T CD4, T CD8 e linfócitos B
após tratamento com IL-7
O tratamento com IL-7 aumenta o número de células T CD8
específicas para o LCMV?
Infecção com o
clone 13 - LCMV
8° dia
Tratamento com
IL-7 ou PBS por 3
semanas
Remoção do baço
(Marcação com tetrâmero)
Citometria – células
TCD8 específicas para
TetGP33+, TetGP276+ e
TetNP396+
A IL-7 promoveu o aumento de células T CD8 específicas
para o LCMV
O aumento no número de células também é
observado em outros órgãos?
Infecção com o
clone 13 - LCMV
8° dia
Tratamento com IL7 ou PBS por 3
semanas
Fígado
29° dia
Histologia
do fígado
Citometria
para
TCD4 e TCD8 totais
e específicas para
os tetrâmeros
Após o tratamento com IL-7, houve aumento no infiltrado de células
totais e específicas para o vírus no fígado, cérebro, pulmões e rins
O aumento no número de células obtidas após o
tratamento com IL-7 se traduz em ganho funcional?
Infecção com o
clone 13 - LCMV
8° dia
Tratamento com
IL-7 ou PBS por 3
semanas
29° dia
Citometria – células
TCD4 e TCD8 específicas
para o vírus
As células T CD4 e TCD8 expandidas pela IL-7 são
funcionais.
... Células T de camundongos infectados com o clone 13 de LCMV possuem altos níveis de PD-1 (Barber et al., 2006).
Os níveis de PD-1 nas células T estão diminuídos após o
tratamento com IL-7?
Infecção com o
clone 13 - LCMV
8° dia
Tratamento com
IL-7 ou PBS por 3
semanas
29° dia
FACS - Expressão de PD-1
nas células TCD4 e TCD8
O tratamento com IL-7 diminuiu a expressão de PD-1 nas
células T CD4 e T CD8
Camundongos tratados com IL-7 eliminam
eficientemente o vírus?
Infecção com o
clone 13 - LCMV
8° dia
Tratamento com
IL-7 ou PBS por 3
semanas
Titulação viral
em vários dias
– Contagem de
placa viral
A IL-7 facilitou a eliminação viral dos reservatórios
crônicos (baço, fígado, rins e cérebro)
Quais citocinas estão elevadas durante o
tratamento com IL-7?
Infecção com o
clone 13 - LCMV
8° dia
Tratamento com
IL-7 ou PBS por 3
semanas
Dosagem de citocinas
séricas - ELISA
Citocinas do padrão Th1 e Th17 estão aumentadas durante o
tratamento com IL-7. IL-10 aumenta após a eliminação do vírus
O tratamento com IL-7 induz dano tecidual
decorrente da resposta imune inflamatória?
Infecção com o
clone 13 - LCMV
8° dia
Tratamento com
IL-7 ou PBS por 3
semanas
Dosagem de AST e ALT
no soro
O tratamento com IL-7 não aumenta os níveis séricos das
enzimas indicativas de dano hepático
A produção de IL-22 está aumentada durante o
tratamento com IL-7?
Infecção com o
clone 13 - LCMV
8° dia
Tratamento com
IL-7 ou PBS por 3
semanas
29° dia
Dosagem de IL-22 no
soro - ELISA
O tratamento com IL-7 também aumenta a produção
sérica de IL-22
O dano hepático limitado foi consequência do
efeito citoprotetor da IL-22?
A IL-22 produzida durante o tratamento com IL-7 impede
os danos celulares no fígado
O tratamento com IL-7 altera o número de células T
reguladoras?
Infecção com o
clone 13 - LCMV
8° dia
Tratamento com
IL-7 ou PBS por 3
semanas
FACS – Tregs no baço e
no fígado
O número absoluto de Tregs aumenta após o tratamento com IL-7, mas
a frequência está diminuída em relação ao número total de células T
A depleção de Tregs durante o tratamento com IL-7 altera
o número de células T totais e específicas para o LCMV?
A depleção de Tregs aumentou o número de células T CD4 e T CD8
totais e específicas para o vírus.
O aumento de células T em animais depletados de Tregs
está relacionado com aumento de IL-2?
Dosagem de
citocinas no soro
A maior produção de IL-2 induzida pelo tratamento com IL-7
promove o aumento no número de células T.
A depleção de Tregs durante o tratamento com IL-7
provocou danos hepáticos?
Dosagem de
AST no soro
A depleção de células T reguladoras não provocou
danos hepáticos
Socs3 é expresso durante a infecção crônica por
LCMV?
Infecção crônica
com o clone 13
- LCMV
OU
Infecção aguda cepa Armstrong
de LCMV
Sorting das
células T
Western Blotting –
Expressão de Socs3
Socs3 é altamente expresso na infecção crônica causada
por LCMV
O tratamento com IL-7 inibe a expressão de Socs3
durante a infecção crônica por LCMV?
Infecção com o
clone 13 - LCMV
8° dia
Tratamento com
IL-7 ou PBS por 5
dias
Sorting das
células T
Western Blotting –
Expressão de Socs3
A expressão de Socs3 nas células T foi inibida após tratamento
com IL-7
Socs3 é o principal inibidor da resposta imune
contra a infecção crônica por LCMV?
Infecção com o
clone 13 - LCMV
Infecção com o
clone 13 - LCMV
Socs3wt/wtLck-Cre-
Socs3fl/flLck-Cre+
Remoção do baço
FACS – Células TCD8
específicas para
NP396, GP276 e
GP33
Socs3 inibe a resposta imune específica contra o LCMV
As células T permanecem funcionais após a
deleção condicional de Socs3?
Infecção com o
clone 13 - LCMV
Infecção com o
clone 13 - LCMV
Socs3wt/wtLck-Cre-
Socs3fl/flLck-Cre+
Remoção do baço
FACS – Células TCD4 e
TCD8 produtoras de
citocinas
As células T CD4 e TCD8 continuam funcionais na ausência
de Socs3
O vírus é eliminado de órgãos reservatórios na
ausência de Socs3?
A deficiência de Socs3 propiciou a eliminação viral de
vários órgãos reservatórios
Conclusão