Estabelecimento e validação de metodologias de detecção e
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Projeto Tecnologias Moleculares e de Biossegurança para o Desenvolvimento Agropecuário TMBBA Sub-projeto: Estabelecimento e validação de metodologias de detecção e análise de transgenes Equipe: –Vera Tavares de Campos Carneiro –Diva Maria de Alencar Dusi –Leila Maria Gomes Barros –Juliana de Almeida Dantas –Roberto Togawa –Daniele Scandiucci de Freitas –Ana Luiza Machado Lacerda –Filipe Pereira Fortes Atividades do projeto - Inventariar transgenes existentes assim como informações relacionadas - Determinar sequências identificadoras de transgenes em geral e desenhar pares de primers específicos para amplificação por PCR, via bioinformática – Implementar método de PCR qualitativa para detecção de transgene – Implementar método de Real Time PCR para deteção de transgene de modo quantitativo – Implementar método de PCR múltipla para análise de múltiplos eventos - Validar os resultados de PCR por hibridização em membrana, sequenciamento de DNA ou captura em suporte sólido e deteção em espectrofotômetro - Inventariar transgenes existentes assim como informações relacionadas Busca pela rede utilizando sítios de buscas e: http://www.agbios.com/dbase.php http://www.abc.org.br/ http://agenciact.mct.gov.br/index.php/content/view/44796.html http://www.bayercropscience.com.br/CP/novas_tecnologias/biotecnologia_1.asp http://www.ctnbio.gov.br/ http://www.cenargen.embrapa.br/ http://desearch.nal.usda.gov/ http://www.periodicos.capes.gov.br http://www.presidencia.gov.br/legislacao/ http://vm.cfsan.fda.gov/ http://www.rikilt.wur.nl/UK/ Legislação LEI Nº 11.105, DE 24 DE MARÇO DE 2005. Art. 1o Esta Lei estabelece normas de segurança e mecanismos de fiscalização sobre a construção, o cultivo, a produção, a manipulação, o transporte, a transferência, a importação, a exportação, o armazenamento, a pesquisa, a comercialização, o consumo, a liberação no meio ambiente e o descarte de organismos geneticamente modificados – OGM e seus derivados, tendo como diretrizes o estímulo ao avanço científico na área de biossegurança e biotecnologia, a proteção à vida e à saúde humana, animal e vegetal, e a observância do princípio da precaução para a proteção do meio ambiente. *Art. 27. Liberar ou descartar OGM no meio ambiente, em desacordo com as normas estabelecidas pela CTNBio e pelos órgãos e entidades de registro e fiscalização: Pena – reclusão, de 1 (um) a 4 (quatro) anos, e multa. *Art. 29. Produzir, armazenar, transportar, comercializar, importar ou exportar OGM ou seus derivados, sem autorização ou em desacordo com as normas estabelecidas pela CTNBio e pelos órgãos e entidades de registro e fiscalização: Pena – reclusão, de 1 (um) a 2 (dois) anos, e multa. Art. 40. Os alimentos e ingredientes alimentares destinados ao consumo humano ou animal que contenham ou sejam produzidos a partir de OGM ou derivados deverão conter informação nesse sentido em seus rótulos, conforme regulamento. Critérios para liberação planejada de plantas transgênicas Plantas liberadas para plantio e comercialização Planta Característica Gene Evento Promotor/ terminador Vetor Algodão Resistência pragas da Ordem Lepidóptera Resistência à canamicina e neomicina Cry1Ac algodão Bollgard evento 531 FMV e 35S pV-GHBK04 Algodão Resistência a glifosato cp4epsps *ST4793R Algodão Tolerante glifosato cp4epsps 1445 FMV e 35S/ES Monsanto do Brasil LTDA Algodão Resistência pragas da Ordem Lepidóptera e tolerância ao glifosato Cry1Ac e cp4epsps Mon15985 x Mon88913 Figwort mosaic virus and 35S Monsanto do Brasil LTDA 23/08/01 Eucalipto Baixa lignina Milho tolerância ao glufosinato de amônio NPTII Obs Monsanto do Brasil LTDA processo 01200.001471/2003-01 Parecer 05/06/03 Stoneville Pedigreed Seed Co (Bayer). 26/09/02 Informação confidencial Arborgen Tecnologia Florestal Ltda / International paper do Brasil pat T25 CaMV 35S/ CaMV 35S pUC/Ac Zea mays Liberação 21/06/07 Bayer CropScience Ltda. nº: 01200.005154/1998-36 Parecer 16/05/07 Revogação 29/06/07 Milho Zea mays tolerância ao glufosinato pat 676, 678, 680 CaMV 35S/ PHP6710 Pioneer Sementes LTDA (Du Pont) nº 01200.002052/2002-05 Milho Zea mays tolerância ao glifosato cp4-epsps NK603 CaMV/act-ar PV-ZMGT32 Dow Agrosciences Industrial Ltda N°: 01200.000667/2006-118/10/06 Monsanto do Brasil 26/09/02 Aventis Seeds Milho Zea mays Resistência a insetos e tolerante a herbicida glufosinato Cry1Ab/PAT Bt 11 CaMV35S / NOS pBSKSt Novartis Seeds LTDA (Syngenta) Milho Zea mays Resistente a insetos e tolerante a herbicida VIP3A / PAT ICP4 pNOV1325 Syngenta Milho Zea mays Resistência pragas da Ordem Lepidóptera e tolerância ao glifosato Cry1Ab MON810 35S e hsp70 maize / NOS PV-ZM BK07 Monsanto do Brasil Soja Resistência a glifosato p35S-CP4EPSPSNOSt CaMV35S/ NOSt PV-GMGT04 NCBI Monsanto do Brasil Tolerância a herbicidas do grupo imidazolinonas ahas ahas / ahas pBSKSt 40-3-2 Glycine max Soja Glycine max EMBRAPA Soja 26/09/02 Plantas com pedidos na CTNBio para comercialização Planta Característica Gene Evento Algodão tolerante ao glifosinato de amônio. pat LLCotton25 Algodão ST4793R Tolerante ao glifosato (Algodão Roundup Ready). CP4EPSPS Arroz LibertyLink Tolerante a glufosinato de amônia bar / Expressa pat LL Rice 62 Milho resistente a insetos da ordem Lepidoptera (Milho Guardian) Cry1Ab 88017 Promotor/ terminador Vetor Empresa Bayer CropScience Monsanto 35S 35S pB5 / 35Sbar Bayer CropScience Monsanto Plantas liberadas para comercialização Planta Característica Gene Milho Resistência a lagarta do cartucho Tolerância a glufosinato Cry1Ab, Cry1Ac, Cry9C Observação Sementes importadas e liberadas para consumo animal. pat e bar Plantas em pesquisa Planta Característica Gene Plasmídeo Empresa/ grupo de pesquisa Feijão Resistência ao mosaico dourado (BGMV) Replicase (ac1) pBGMVRNAiAHAS Embrapa (Francisco Aragão) Feijão Resistência ao mosaico dourado (BGMV) Beterraba Resistência a glifosato CP4EPSPS Monsanto Batata Resistência a vírus cp PYV Embrapa Embrapa (Francisco Aragão) Plantas liberadas para comercialização no Exterior Planta Característica Gene Evento Observação Abóbora Resistência a vírus Capa proteica de CMV, WMV2 e ZYMV ZW-20 Monsanto* (1995) Alfafa Tolerância a herbicida CP4 epsps J101, J163 Monsanto (2005) Algodão Resistência a lepdópteros Cry1Ac Cry1Ac, cry2Ab2 cry1Fa, cry1Ac, pat Algodão Tolerância a herbicida CP4 epsps bar Milho Cry1Ab/pat Mon531 Monsanto (1996) mon15986 Monsanto (2003) 281-24-236 x 3006-210-23 Dow Agrosciences (2005) Mon1445/1698 Monsanto (1996) LLcoton25 Bayer CropScience (2005) Bt11 Syngenta * (1996) resistência a lepdópteros Cry1Ab Mon810 Monsanto (1997) e Cry1F, pat TC1507 Dow Agrosciences /Pioneer(2003) tolerância a herbicida cry3Bb1 mon863 Monsanto (2003) Mon863 x mon810 Monsanto (2005) CP4 epsps GA21 Monsanto* (1998) CP4epsps epsps NK603 Monsanto (2001) T14, T25 Bayer CropScience* (1996) Cry3Bb1, cryAb pat Mamão Resistência a vírus Capa proteica PRSV 55-1, 65-1 Soja tolerância a herbicida CP4 epsps GTS 40-3-2 Universidade de Cornel e Universidade do Havai (1998) Monsanto (1996) Pesquisas Arroz enriquecido com vitamina A; alimentos com maior concentração de ferro e zinco; soja tolerante à seca. (Embrapa e Japão); tomate tolerante à seca; maracujá resistente a vírus; cana-de-açúcar resistente a vírus; frutas com longa vida de prateleira; produção comercial de uma variedade de arroz transgênico que produz proteínas do leite humano (Estados Unidos). - Determinar sequências identificadoras de transgenes em geral e desenhar pares de primers específicos para amplificação por PCR, via bioinformática. Busca de sequências no banco de dados (NCBI) Comparação (clustalw) >Glycinemaxtransgeniccp4epspsge TGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAA GATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCAC TGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACACGCT GACAAGCTGACTCTAGCAGATCTTTCAAGAATGGCACAAATTAACAACATGGCACAAGGGATACAAACCCTTAATCCCAATTCCAATTT CCATAAACCCCAAGTTCCTAAATCTTCAAGTTTTCTTGTTTTTGGATCTAAAAAACTGAAAAATTCAGCAAATTCTATGTTGGTTTTGA AAAAAGATTCAATTTTTATGCAAAAGTTTTGTTCCTTTAGGATTTCAGCATCAGTGGCTACAGCCTGCATGCTTCACGGTGCAAGCAGC CGGCCCGCAACCGCCCGCAAATCCTCTGGCCTTTCCGGAACCGTCCGCATTCCCGGCGACAAGTCGATCTCCCACCGGTCCTTCATGTT CGGCGGTCTCGCGAGCGGTGAAACGCGCATCACCGGCCTTCTGGAAGGCGAGGACGTCATCAATACGGGCAAGGCCATGCAGGCCATGG GCGCCAGGATCCGTAAGGAAGGCGACACCTGGATCATCGATGGCGTCGGCAATGGCGGCCTCCTGGCGCCTGAGGCGCCGCTCGATTTC GGCAATGCCGCCACGGGCTGCCGCCTGACCATGGGCCTCGTCGGGGTCTACGATTTCGACAGCACCTTCATCGGCGACGCCTCGCTCAC AAAGCGCCCGATGGGCCGCGTGTTGAACCCGCTGCGCGAAATGGGCGTGCAGGTGAAATCGGAAGACGGTGACCGTCTTCCCGTTACCT TGCGCGGGCCGAAGACGCCGACGCCGATCACCTACCGCGTGCCGATGGCCTCCGCACAGGTGAAGTCCGCCGTGCTGCTCGCCGGCCTC AACACGCCCGGCATCACGACGGTCATCGAGCCGATCATGACGTGCGATCATACGGAAAAGATGCTGCAGGGCTTTGGCGCCAACCTTAC CGTCGAGACGGATGCGGACGGCGTGCGCACCATCCGCCTGGAAGGCCGCGGCAAGCTCACCGGCCAAGTCATCGACGTGCCGGGCGACC CGTCCTCGACGGCCTTCCCGCTGGTTGCGGCCCTGCTTGTTCCGGGCTCCGACGTCACCATCCTCAACGTGCTGATGAACCCCACCCGC ACCGGCCTCATCCTGACGCTGCAGGAAATGGGCGCCGACATCGAAGTCATCAACCTGCGCCTTGCCGGCGGCGAAGACGTGGCGGACCT GCGCGTTCGCTCCTCCACGCTGAAGGGCGTCACGGTGCCGGAAGACCGCGCGCCTCCGATGATCGACGAATATCCGATTCTCGCTGTCG CCGCCGCCTTCGCGGAAGGGGCGACCGTGATGAACGGTCTGGAAGAACTCCGCGTCAAGGAAAGCGACCGCCTCTCGGCCGTCGCCAAT GGCCTCAAGCTCAATGGCGTGGATTGCGATGAGGGCGAGACGTCGCTCGTCGTGCGTGGCCGCCCTGACGGCAAGGGGCTCGGCAACGC CTCGGGCGCCGCCGTCGCCACCCATCTCGATCACCGCATCGCCATGAGCTTCCTCGTCATGGGCCTCGTGTCGGAAAACCCTGTCACGG TGGACGATGCCACGATGATCGCCACGAGCTTCCCGGAGTTCATGGACCTGATGGCCGGGCTGGGCGCGAAGATCGAACTCTCCGATACG AAGGCTGCCTGATGAGCTCGAATTCGAGCTCGGTACCGGATCCAATTCCCGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTG AATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTT ATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATA AATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGGATCGATCCCCCACCGGTCCTTCATGTTCGGCGGTCTCGCGAGCGGTGAA ACGCGCATCACCGGCCTTCTGGAAGGCGAGGACGTCATCAATACGGGCAAGGCCATGCAGGCCATGGGCGCCAGGATCCGTAAGGAAGG CGACACCTGGATCATCGATGGCGTCGGCAATGGCGGCCTCCTGGCGCCTGAGGCGCCGCTCG Desenho dos primers (ahas, cry1Ab, cry1Ac, CP4 epsps, pat, bar, promotor FMV, promotor 35S). gene Primer/sequência Temperatura de anelamento Produto de amplificação HAS Fpahas 5'ACTAGAGATTCCAGCGTCAC3' 55°C 685pb 59.1°C 168pb Rgahas 5'GTGGCTATACAGATACCTGG3' has Fahas168 5'GTCTGCCTGGGTACATTGC3’ Rahas168 5’CAGTCAGCTCCACAAAGCG 3’ 60.8°C has CP4 epsps CP4 epsps cry1Ac cry1Ac 35S 35S F104ahas 5’GTCTCTGCGCATGCTAGG 3’ 59.2°C R104ahas 5'GTCACACGATCATCAAACCG3’ 60.0°C Feps110 GGGTCTACGATTTCGACAGC 59.7°C Reps110 5’CTTCCGATTTCACCTGCAC3’ 59.2°C Feps93 5’GACGTCACCATCCTCAACG3’ 60.1°C Reps93 5’GGTTGATGACTTCGATGTCG3’ 59.1°C Fc1ac111 5’CTCAACTAGGTCAGGGCGTG3’ 60.8°C Rc1ac111 5'GCAAATTCTGTCCCGTCAAG3’ 60.6°C Fc1ac190 5’GTCTGTGATTCCGGGTGTC3’ 58.9°C Rc1ac190 5’ GAACAACAAGGACCGAACG 3’ 59.1°C F35S166 5’GGAAAGGCCATCGTTGAAG3’ 60.6°C R35S166 5’ GGATAGTGGGATTGTGCGTC 3’ 60.3°C F35S91 5’ CCAACCACGTCTTCAAAGC 3’ 59.3°C R35S91 5’GAAGGGTCTTGCGAAGGATAG 3’ 61.0°C 104pb 110pb 93 pb 111 pb 190pb 166pb 91pb Principais métodos de detecção 1. Imunológicos: Kits (Bt-Express) Elisa Western Blot 2. DNA PCR
