Bactérias Fitopatogênicas

Bactérias
Fitopatogênicas
Carlos Hidemi Uesugi
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Todos os direitos reservados.
Nenhuma parte desta publicação poderá ser
reproduzida sem a autorização da Editora.
Título: Bactérias Fitopatogênicas
Autor: Carlos Hidemi Uesugi
Editora: CopyMarket.com, 2000
Sumário
Carlos Hidemi Uesugi
BACTÉRIAS FITOPATOGÊNICAS
Introdução.................................................................................................................................................................
1.1. Classificação dos Seres Vivos.........................................................................................................................
1.2. Diferenças Entre Procariotos e Eucariotos .................................................................................................
2. Morfologia e Ultraestrutura de Células Bacteriana.........................................................................................
2.1. Estruturas da Célula Bacteriana......................................................................................................................
2.1.1 Estruturas Externas a Parede Celular..........................................................................................................
2.1.2. Estruturas Internas a Parede Celular..........................................................................................................
3. Cultivo de Bactérias ............................................................................................................................................
3.1. Tipos Nutritivos das Bactérias........................................................................................................................
3.2. Condições Físicas Necessärias ao Crescimento ..........................................................................................
4. Reprodução e Crescimento................................................................................................................................
5. Classificação das Bactérias Fitopatogênicas.....................................................................................................
5.1. Divisão I – Gracilicutes...................................................................................................................................
5.1.1. Classe Proteobacteria....................................................................................................................................
5.2. Divisão II– Firmicutes.....................................................................................................................................
5.2.1. Classe Firmibacteria......................................................................................................................................
5.2.2. Classe Thallobacteria ...................................................................................................................................
5.3. Divisão III – Tenericutes................................................................................................................................
5.3.1. Classe Molicuttes ..........................................................................................................................................
5.4. Outras Bactérias................................................................................................................................................
5.5. Bactérias Fastidiosas ........................................................................................................................................
6. Espécies de Bactérias Fitopatogênicas..............................................................................................................
7. Aulas Práticas ......................................................................................................................................................
7.1. Características Culturais das Bactérias ..........................................................................................................
7.2. Roteiro para Diagnose de Doenças Bacterianas .........................................................................................
7.3. Identificação das Bactérias .............................................................................................................................
7.3.1. Chave para Identificação de Bactérias Fitopatogênicas ao Nível De Gênero H.................................
7.4. Meios de Cultura ..............................................................................................................................................
7.5. Isolamento de Microrganismos......................................................................................................................
7.5.1. Postulado de Koc..........................................................................................................................................
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Autor: Carlos Hidemi Uesugi
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1. Introdução
Carlos Hidemi Uesuge
1.1.
CLASSIFICAÇÃO DOS SERES VIVOS
Classificação dos organismos vivos
Esquema de classificação
Reinos
Organismos Incluídos
Linnaeus (1753)
Plantae
Bactérias, fungos, algas, plantas.
Animalia
Protozoários e animais superiores
Plantae
Algas multicelulares e plantas
Animalia
Animais
Protista
Microrganismos,
incluindo
bactérias,
protozoários, algas, bolores e leveduras.
Plantae
Algas multicelulares e plantas
Animalia
Animais
Protista
Protozoários e algas unicelulares
Fungi
Bolores e leveduras
Monera
Todas as bactérias (Procariotos)
Archaebacteria
(Archaea)
Bactérias que produzem gás metano, requerem
altas concentrações de sal ou requerem altas
temperaturas.
Eubacteria
(Bactéria)
Todas as outras bactérias, incluindo aquelas mais
familiares aos microbiologistas, tais como
causadores de doenças, bactérias do solo e da
água e bactérias fotossintéticas.
Eucariotas
(Eucarya)
Protozoários, algas, fungos, plantas e animais.
Haeckel (1865)
Whittaker (1969)
Woese (1977)
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Conceito de Classificação dos Cinco Reinos
Robert H. Whittaker (1969)
Ampliou o sistema de classificação de Haeckel e sugeriu três níveis de organização celular para acomodar os três
modos principais de nutrição:
1) Fotossíntese, o processo pelo qual a luz fornece energia para converter o dióxido de carbono em água e
açúcar.
2) Absorção, a captação de nutrientes químicos dissolvidos em água.
3) Ingestão, entrada de partículas de alimentos não dissolvidas.
Neste esquema de classificação constituem,
Reino Monera que abriga os procariotos ou seja, organismos que normalmente obtém nutrientes somente por
absorção, e não podem ingerir alimentos ou realizar fotossíntese.
Reino Protista inclui os microrganismos eucarióticos unicelulares, que representam os três tipos nutricionais: as
algas são fotossintéticas, os protozoários podem ingerir alimentos e os fungos limosos (fungos inferiores)
somente absorvem os nutrientes.
Organismos eucarióticos superiores são acomodados nos;
Reino Plantae (plantas verdes fotossintéticas e as algas superiores).
Reino Animalia (animais que ingerem os alimentos).
Reino Fungi, organismos que tem parede celular, mas não o pigmento fotossintético clorofila encontrado em
outras plantas. Eles absorvem os nutrientes.
Desta maneira os microrganismos foram colocados em três dos cinco reinos: Monera (Bactéria), Protista
(protozoários e algas microscópicas) e Fungi (os fungos microscópicos; leveduras e bolores). O sistema de
Whittaker coloca todas as bactérias no reino Monera e sugere um ancestral comum para todos os membros
deste reino. Entretanto, resultados de intensas pesquisas durante décadas recentes sugerem um ancestral
diferente entre os microrganismos, como descrito a seguir.
As três categorias filogenética dos seres vivos (Woese, 1977) Arqueobactérias, Eubactérias e Eucariotos
{©Até 1977 os cientistas achavam que os procariotos eram os mais primitivos de todos os organismos, ficando
subentendido que esses organismos, por causa da simplicidade estrutral, eram os ancestrais de eucariotos mais
complexos. Carl Woese e seus colaboradores na Universidade de Illinois descobriram que nenhum grupo tinha
se desenvolvido do outro. Eles descobriram que os procariotos e eucariotos tinham evoluído por vias
completamente diferentes de uma forma ancestral comum. Evidências para sustentar esta idéia vieram de estudos
com ácido ribonucléico ribossômico, ou rRNA que é essencial para a síntese de proteínas e, portanto, para a
sobrevivência da célula.
RNA formado por seqüência de quatro tipos de ribonucleotídeos, arranjados em várias combinações para formar
uma única e longa cadeia de centenas de unidades.
- O rRNA de qualquer organismo particular tem um arranjo distinto de ribonucleotídeos, ou uma sequência
nucleotídica específica.
- Os genes que controlam a sequência nucleotídica de rRNA variam lentamente durante milhões de anos de
evolução. Portanto, o rRNA pode servir como indicador de como os organismos estão intimamente
relacionados. Algumas regiões da molécula de rRNA de todos os organismos vivos permanecem quase as
mesmas, a despeito dos 3,5 a 4,5 bilhões de anos de evolução. Esta constância sustenta a ideia de que todos os
organismos desenvolveram de formas ancestrais comuns.
- A quantidade de diferenças entre as outras regiões de rRNA pode ser usada para medir o grau de
relacionamento entre os organismos. Por ex, se as seqüência de ribonucleotídeos de dois tipos de organismos
diferem em grande extensão, a relação entre ambos é muito distante; isto é, os organismos divergiram há muito
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tempo de um ancestral comum. Porém se as sequências mostram mais similaridades, os organismos estão
intimamente relacionados e tem um ancestral comum relativamente recente.
- Usando essas técnicas, Woese descobriu que as moléculas de rRNA em grupos de organismos diferem no
arranjo ou sequência de seus nucleotídeos. Os eucariotos possuem um tipo geral de sequência e os procariotos
um segundo tipo. Mas ele descobriu que alguns procariotos tem um terceiro tipo de rRNA e o arranjo desses
rRNA difere dos outros procariotos e eucariotos. Em outras palavras, existem dois tipos principais de bactérias,
as designadas archaeobactéria e as eubactérias.
Classificação de Woese
EUCARYA
Reinos:
Plantae
Animalia
Fungi Eumicota (Basidiomicotina) Parede celular com quitina
Protozoa
Fungi Chromista (não tem quitina na parede celular).
ARCHAEA (Archaebacteria); Abriga bactérias Termoacidófilas,
Metanogênicas, Halofilicas
Crenarchaeota - Termofílico extremo
Euryarchaeota - Metanogênicas, Halofílicas extremas
Korarchaeota
Archaea não definido
A parede celular da archaeobacteria é variável, não contém ácido murâmico (peptídioglicana).
A membrana possui lipídios ramificados, com ligação éter.
BACTERIA (Eubacteria); abriga as bactérias verdadeiras.
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1.2. DIFERENÇAS ENTRE PROCARIOTOS E EUCARIOTOS
Alguns elementos diferenciais entre células procarióticas e eucarióticas
Elemento
Células procarióticas
Células eucarióticas
Bactérias, Algas verdes-azuis
Algas, fungos, protozoários,
vegetais e animais.
Dimensões do organismo
1-2/1-4 µm ou menor
Maior que 5 µm em largura ou
diâmetro.
Sistema genético: Localização
Nucleóide, corpo cromatínico
ou material genético.
Núcleo,
cloroplastos.
Não limitada por membrana
nuclear. Um cromossomo
circular
Limitada
por
membrana
nuclear.
Mais
de
um
cromossomo linear
Não
Sim
Unidirecional. Transferência de
DNA de forma diplóide parcial
Fusão de gametas forma
diplóides que segrega por
meiose
Mitocôndria
Ausente
Presente
Estrutura de Golgi
Ausente
Presente
Retículo endoplasmático
Ausente
Presente
Ausente
Presente
Grupos
nos
quais
encontrados como
são
unidade estrutural.
Estrutura do núcleo
Replicação de cromossoma por
mitose
Recombinação genética
Vacúolos
limitados
membranas verdadeiras
Parede celular
Ribossomo
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por
Peptidioglicana (Mureina ou
mucopeptídeo
como
componente)
Duas subunidades 30S e 50S Tipo 70S
mitocôndria,
Ausência de peptidioglicana
Duas subunidades 40S e 60S Tipo 80S
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2. Morfologia e Ultraestrutura de Células Bacteriana
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Dimensões, formas e arranjos das células bacterianas
- Tamanhos (largura)
Ex. Streptococcus, 0,5 µm
Bacillus, 0,8 µm
Pseudomonas, 0,8 µm
Comprimento 1,4 - 2,8 µm
- Formas
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2.1. ESTRUTURAS DA CÉLULA BACTERIANA
2.1.1 Estruturas externas a parede celular
Flagelos
Compostos de 3 partes
- Estrutura basal
- Estrutura semelhante a um gancho
- Um longo filamento externo a parede celular.
Comprimento do flagelo:
- Geralmente é várias vezes o da célula, mas o seu diâmetro é uma pequena fração do diâmetro da célula (Ex. 10
a 20 nm).
Flagelação:
- Muitas espécies de bacilos possuem flagelos, mas raramente os cocos possuem.
- Fixação dos flagelos e numero de flagelos
- Atríquica
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- Clavibacter
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- Polar - Monotríquica - Xanthomonas
- Lofotríquica - Pseudomonas fluorescens
- Peritríquica
- Erwinia
Função do flagelo:
Mobilidade, porém a mecânica exata ainda não é conhecida. Segundo algumas suposições, a cadeia protéica
contrai e relaxa alternadamente produzindo movimento ondulatório.
* Flagelos movimentam em velocidade elevada.
Ex: Spirillum serpens - flagelo gira a um ritmo de 2400 rpm e o corpo a 800 rpm. A velocidade calculada de
deslocamento da célula é de 50 m/s.
Vibrio comma polar 200 m/s.
Pelos (Fímbrias)
São estruturas que se assemelham aos flagelos, mas não estão envolvidos na mobilidade. São consideravelmente
mais curtos do que os flagelos e mais numerosos. São encontrados tanto em espécies moveis como imóveis.
Funções das fímbrias:
Possuem várias funções associadas com vários tipos de pelos. Um deles é o pelo F (pelo sexual), serve como
porta de entrada de material genético durante a conjugação bacteriana. Outros tipos funcionam como sítios de
adsorsão de bacteriófago (vírus bacteriano) e como mecanismo de aderência à superfície do hospedeiro.
Cápsulas
Cobertura viscosa de natureza polissacarídica (dextrano, dextrina, levano, celulose).
Funções da cápsula
* Proteção contra dessecamento
* Em algumas bactérias patogênicas aumenta seu poder infectante. A perda completa da cápsula pode resultar na
perda do poder invasor ou infectante da bactéria.
Membrana externa
Todos os envelopes celulares das bactérias Gram-negativas possuem a membrana externa externamente à parede
celular. Ela tem uma estrutura complexa consistindo de fosfolipídios, lipopolissacarídeos e vários tipos de
proteínas. A membrana externa é ligada covalentemente à camada de peptidioglicana pela lipoproteína. As
principais funções da membrana externa inclui 1) proporcionar canais para difusão passiva de nutrientes ou
solutos hidrofílicos, 2) estabelecer barreira à permeabilidade a antibióticos, detergentes e outras substâncias
tóxicas, 3) proporcionar sítios receptores para bacteriocinas e bacteriófagos, 4) facilitar a formação e a
manutenção de pareamento durante a conjugação, e 5) dotar de hidrofilicidade à superfície da célula. Estas
funções são realizadas pela proteína de membrana externa (Omp) bem como pelos lipopolissacarídeos.
- Porina
Porinas são poros relativamente não específicos, ou canais, que são organizados como trimeros de tres
subunidades da proteína porina. A proteína porina é OmpA em Escherichia coli e OmpF em Pseudomonas aeruginosa
e P. syringae. Os genes de OmpF são altamente conservados entre estas duas bactérias, com 72% de homologia de
DNA. Os genes de OmpF P. syringae tem 33% de homologia com genes OmpA de E. coli.
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As bactérias Gram-negativas levam cerca de 105 cópias de porinas por célula na sua membrana externa. As
porinas são grandes canais repletos de água que permite difusão passiva não específica de solutos hidrofílicos. A
permeabilidade para solutos hidrofóbicos é pequena. As mais específicas porinas são também inducíveis
dependendo das condições de crescimento. Eles incluem as proteínas responsáveis para permeação específica de
maltose e maltodextrina, anions, ferro-sideroforas, e vitaminas B12.
- Lipopolissacarídeos
{©Lipopolissacarídeos cobre cerca de 40% da superfície da célula de bactéria entérica. LPS são moléculas
anfipáticas com metade lipídios hidrofóbicos A e metade polissacarídeos hidrofílicos. O lipídio A que é comum
para todos os LPS é composto por uma espinha de D-glucosamyl-β-D-glucosamina e cinco e sete cadeias de
ácidos graxos saturados de 12 - 16 átomos de carbonos. O polissacarídeo é subdividido em estrutura central e
cadeias laterais de antígeno-O. A estrutura central consiste de séries não repetitivas de resíduos de açúcares. A
estrutura do antígeno-O exibe considerável variação entre espécies e isolados, e as diferenças são de importância
taxonômica. O LPS de algumas bactérias fitopatogênicas tem sido sugeridos como tendo importante papel no
reconhecimento da hospedeira. Em isolados de Ralstonia solanacearum avirulentos e reação de hipersensibilidade
positiva possuem LPS que perderam o antígeno-O consistindo de rhamnose, 2-amino-2-deoxyglucose e xylose
com proporção molar de 4: 1: 1.
Parede celular
* Formação rígida que da forma à célula
* Espessura em média de 10 a 25 nm (100 a 250 Å)
Gram negativas possui membrana externa e camada de peptídioglicana, porém, a peptídioglicana é delgada.
Gram positivas possui uma camada espessa de peptídioglicana.
Estrutura da peptídioglicana
Polímero insolúvel constituinte da parede celular da bactéria.
Composição química e estrutura variam de espécie para espécie, havendo, contudo semelhanças básicas.
São formadas por três tipos de unidades
1)Ácido acetilglucosamina (AGA)
2)Ácido acetilmuramico (AMA)
3)Peptídio constituído por 4 ou 5 aminoácidos de variedade limitada.
2.1.2. Estruturas internas à parede celular
Periplasma
Periplasma é a matriz de polipeptídeos e sacarídeos. Ela contém diversas enzimas incluindo enzimas
degradadoras de tecidos vegetais tais como celulases e pectinases. Algumas enzimas localizadas no periplasma
funcionam como conversora que processa a conversão de metabolitos não transportáveis em transportáveis. O
oligossacarídeo do periplasma tais como β-1,2-D-glucan, derivado de membrana externa é responsável pela
manutenção da pressão osmótica do periplasma equivalente ao do citoplasma. Os oligossacarídeos também
funcionam para gerar carga líquida negativa para a célula bacteriana através do equilíbrio de Donnan resultante
dos resíduos de anions deles.
Protoplasto, esferoplasto
- Célula sem parede celular
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Membrana citoplasmática
*Fica imediatamente abaixo da parede celular, conhecida também como membrana protoplasmática ou
simplesmente membrana plasmática e incorpora várias proteínas intrinsecas. A membrana celular consiste de
camada dupla de lipídio de 50 a 75% de proteína e 20 a 35% de lipídio base peso seco. O lipídio das bactérias,
com exceção da archaeobacteria, é do tipo ácido graxo-glicerol ester.
*A membrana celular contém várias enzimas para metebolismo produtor de energia tais como citocromos,
citocromo oxidase, desidrogenases, ATPases, sintetese de proteínas e permeases e tem importante papel na
respiração, transporte ativo, rotação flagelar ou segregação de material nuclear na divisão celular.
A energia para o transporte ativo e rotação flagelar é fornecido pela força motiva de proton., ou diferença de
potencial eletroquimica protonica através da membrana. A força motiva protonica é gerada pela translocação de
protons da matrix do periplasma em consonância com a cadeia respiratória e/ ou hidrólise de ATP pela ATPase.
*É semipermeável, seletiva, controla a passagem de nutrientes e de escórias para dentro e para fora da célula
respectivamente.
Invaginações membranosas e sistemas de membrana (mesossomo)
*Em algumas bactérias tais como Clavibacter, Streptomyces e Bacillus, uma parte da membrana invagina para dentro
do citoplasma para formar complexa dobra membranosa chamado mesossomo
*Mesossomo está associado com a atividade respiratória, divisão nuclear, formação de septo, formação de
esporos e secreção de enzimas hidrolíticas. Associa-se de modo complexo com o material nuclear e sua
replicação.
Citoplasma
O material celular contido dentro da membrana citoplasmática pode ser dividido em:
* Área citoplasmática rica em RNA
* Área nuclear rica em DNA
*Material nuclear; Células bacterianas não contém o núcleo típico das células animais e vegetais superiores.
Possui dentro de citoplasma corpúsculos que são encarados como estrutura nuclear confinando o DNA da célula
bacteriana nesta área (não é um núcleo definido). Proposto, Nucleóide, cromossomo bacteriano etc.
Endospóros
Corpo oval de parede espessa (um por célula) que é uma célula altamente resistente. Chamados também de
esporos.
Ex: Bacillus, Clostridium
Composição dos esporos: Ácido dipicolínico, substância não detectada nas células vegetativas. Esta substância
está restrita aos esporos bacterianos onde formam de 5 a 10% do peso seco total.
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3. Cultivo de Bactérias
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Para o cultivo de bactérias é necessário o conhecimento de suas exigências nutritivas e das condições físicas
requeridas.
Exigências nutritivas
-Todas as formas de vidas, dos microrganismos ao homem repartem certas exigências nutritivas em termos de
substâncias químicas indispensáveis ao seu crescimento e ao funcionamento normal.
-Todos os organismos vivos requerem uma fonte de energia. Alguns seres vivos, como as plantas verdes, podem
utilizar a energia radiante e são denominadas fototróficos. As formas de vida incapazes de utilizar a energia
radiante, como a vida animal, dependem da oxidação de compostos químicos para obtenção da energia. Por isso
recebem o nome de quimiotróficos. Esses dois tipos de comportamento existem entre as bactérias
(fototróficos e quimiotróficos).
-Todos os organismos vivos requerem alguma forma de carbono; todos exigem, ao menos, pequenas
quantidades de dióxido de carbono, mas a maior parte também requer certos compostos orgânicos de carbono
como os açúcares e outros carboidratos. As plantas usam o dióxido de carbono, convertendo-o pela fotossíntese,
em carboidratos. Muitas bactérias também exigem apenas o dióxido de carbono como sua fonte nutritiva e
falando sob o ponto de vista nutritivo, tais organismos são autotróficos. Caso possam obter sua energia da luz,
recebem o nome de fotoautotróficos; se a energia for obtida pela oxidação de compostos químicos são
chamados de quimioautotróficos. outras bactérias são semelhantes aos animais, no sentido de serem incapazes
de usar o CO2 como única fonte de carbono e de dependerem de organismos autotróficos para a produção de
carboidratos e outros compostos utilizados como alimentos. As formas de vidas que exigem uma fonte orgânica
de carbono são heterotróficas.
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3.1. TIPOS NUTRITIVOS DAS BACTÉRIAS
Principais tipos nutritivos das bactérias.
Tipo
Fonte de energia para Fonte de carbono Exemplo de gênero
crescimento
para crescimento
FOTOTRÓFICO
Fotolitotrófico (autotrófico) Luz
CO2
Chromatium
Fotorganotrófico
(heterotrófico)
Comp. orgânico
Rhodopseudomonas
Luz
QUIMIOTRÓFICO
Quimiolitotrófico
(autotrófico)
Oxidação
de CO2
composto inorgânico
Thiobacillus
Quimiorganotrófico
(heterotrófico)
Oxidação
de Comp. orgânico
composto orgânico
Escherichia
Adaptado de Pelczar/Reid/Chan Microbiologia vol 1.
Fototróficas
Algumas utilizam CO2 como fonte de carbono - fotolitotróficas
Outras necessitam de compostos orgânicos - fotorganotróficas
Quimiotróficas
Organismos do gênero Nitrobacter são capazes de oxidar nitrito a nitratos e fixar o CO2, preenchendo, assim, suas
necessidades de energia de carbono - quimiolitotróficos.
Muitos outros microrganismos quimiotróficos, contudo requerem compostos orgânicos de carbono, dos quais
obtém energia por oxidação - quimiorganotróficos. As bactérias fotolitotróficas e quimiolitotróficas são
conhecidas comumente, como autotróficas, ao passo que as espécies fotorganotróficas e
quimiorganotróficas recebem a designação de heterotróficas.
As bactérias patogênicas às plantas são todas quimioheterotróficas, as quais obtém suas energias do metabolismo
de carboidratos, aminoácidos ou outros componentes de carbono orgânico, a qual serve também como
principais fontes de carbono.
Eutróficas e oligotróficas
{©Eutróficas são grupos de bactérias que crescem bem em meio completo rico em nutrientes, enquanto as
oligotróficas podem crescer somente em meio altamente diluídos, por exemplo, 10-2 a 10-3 vezes. As oligotróficas
são muito sensíveis a vários compostos orgânicos do meio de cultura, mas o efeito inibitório da peptona é
particularmente pronunciado. Portanto o crescimento de oligotrófas é imensamente suprimido em meio
nutriente ágar não diluído. Oligotróficas são comuns em bactérias do solo, colônias contadas em meio rico, são
em menor número se comparados àquelas contadas em meio altamente diluído.
Todas as bactérias patogênicas às plantas são eutróficas. Porém Rhizobacter daucus e Rhizomonas suberifaciens,
patógenos descobertos recentemente de galhas da cenoura e raiz corticosa de alface, respectivamente, tem
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comportamento oligotrófico. A descoberta destas bactérias implica se meio altamente diluído for usado para
estudo, mais patógenos de planta oligotróficos pode ser isolado de raízes de plantas afetadas por causas não
conhecidas.
- Fontes de carbono:
Todos os organismos requerem alguma fonte de carbono.
*Fonte de dióxido de carbono, carboidratos.
*Plantas usam dióxido de carbono e converte pela fotossíntese em carboidratos.
*Muitas bactérias também exigem apenas dióxido de carbono como sua fonte nutritiva.
- Tais organismos são: autotróficos.
Quando recebe energia da luz: fotoautotróficos
Quando a energia for obtida pela oxidação de compostos químicos é chamados quimioautotróficos.
* Aqueles que dependem de organismos autotróficos para a produção de carboidratos e outros compostos
utilizados como alimentos são ditos heterotróficos.
- Fonte de nitrogênio
* Plantas utilizam nitrogênio na forma de sais inorgânicos como nitrato de potássio
* Animais exigem compostos orgânicos como proteínas e produtos da sua degradação (peptídeos, aminoácidos)
* Bactérias são versáteis - Algumas utilizam nitrogênio atmosférico, outros crescem na presença de compostos
nitrogenados inorgânicos ou ainda existem aqueles que retiram nitrogênio das proteínas ou praticamente
qualquer composto orgânico nitrogenado.
Nitrogênio Inorgânico - Sais de amônio e nitratos são comumente utilizados como fonte de nitrogênio. Alguns
isolados de Ralstonia solanacearum e B. caryophylli realiza denitrificação, isto é, produzem gás a partir de nitrato sob
condições anaeróbias.
Nitrogênio orgânico - nitrogênio orgânico é comumente fornecidos na forma de aminoácidos, peptona,
extrato de carne, extrato de levedura. Peptona é um excelente nutriente porque contem quase todos os
aminoácidos necessários para o crescimento das bactérias, e ainda proporciona um bom efeito tamponante ao
meio. Extrato de carne e extrato de levedura são fontes ricas em vitaminas e são usados em combinação com a
peptona para acelerar o crescimento bacteriano.
Fósforo e enxofre
* Alguns organismos exigem compostos orgânicos de enxofre, outros são capazes de utilizar compostos
inorgânicos, um terceiro grupo pode mesmo utilizar enxofre elementar.
* Fósforo é suprido usualmente na forma de fosfato.
- Elementos minerais
Bactérias exigem vários elementos minerais para o seu desenvolvimento normal. (sódio, potássio, cálcio
magnésio, manganês, ferro, zinco, cobre, fósforo e cobalto).
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- Vitaminas
Bactérias apresentam comportamento variável. Embora todas as bactérias exijam vitaminas para o seu processo
metabólico normal, alguns são capazes de sintetizar todas as vitaminas.
- Água Todos os nutrientes devem ser dissolvidos em água antes de poderem ser absorvidos pelas bactérias.
Os dez principais bio-elementos, suas fontes e funções no microrganismo.
Elemento
Fonte
C
Composto orgânico, CO2
O
O2, H2O, Composto orgânico.
H
H2, H2O, Composto orgânico.
N
NH4+, NO3-, N2, Composto orgânico.
S
Função no metabolismo
Principais constituintes do material celular
SO42-, HS-, S0, S2, S2O32-, Composto Constituinte da cisteína, metionina, fosfato
orgânico.
de tiamina, coenzima A, biotina e ácido αlipóico.
P
HPO4-2
Constituinte
do
ácido
fosfolipídeos, e nucleotídeos.
K
K+
Principal cátion inorgânico na célula,
cofator de algumas enzimas.
Mg
Ca
Fe
nucléico,
Cofator de diversas enzimas. Presente na
parede celular, membranas e éster fosfato.
Mg2+
Cofator de enzimas; presentes em
exoenzimas
(amilases
e
proteases);
dipicolinato de cálcio, o componente mais
importante dos endospóros.
Ca2+
Presente nos citocromos, ferrodoxinas, e
outras proteínas ferro-sulforosas; cofator de
enzimas (algumas desidratases)
Fe2+ , Fe3+
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Bio-elementos de menor importância, suas fontes e funções nos microrganismos.
Elemento
Fonte
Função no metabolismo
Zn
Zn2+
Presente em álcool dehydrogenase, fosfatase alcalina,
aldolase, RNA e DNA polimerase.
Presente no superóxido dismutase da bactéria, cofator de
algumas enzimas (PEP carcoxikinase, re-citrato sintase).
Mn
Mn2+
Na
Na+
Cl
Cl-
Mo
MoO42-
Presente em nitrato reductase, nitrogenase, e formato
desidrogenase.
Se
SeO32-
Presente em glycine reductase e formato dehydrogenase.
Co
Co2+
Presentes em enzimas contendo coenzima B12 (glutamate
mutase, methylmalonyl-CoA mutase).
Cu
Cu2+
Presente em citocromo oxidase e oxigenases.
W
WO42+
Presente em algumas desidrogenases de formato.
Ni
Ni2+
Presente em urease; requerido para crescimento autotrófico
de bactérias oxidadora de hidrogênio.
Requerido por bactérias halofílicas.
3.2. CONDIÇÕES FÍSICAS NECESSÄRIAS AO CRESCIMENTO
- Temperatura
Uma vez que todos os processos de crescimento dependem de reações químicas, e que essas reações são
influenciadas pela temperatura, o crescimento bacteriano pode ser profundamente afetado por estas condições.
* Temperatura determina em parte ritmo e quantidade total de crescimento.
* Variação térmica pode influenciar os processos metabólicos e a morfologia celular.
- Cada espécie de bactéria cresce sob temperaturas situadas em faixas características.
1) Bactérias psicrófilas: são aquelas capazes de crescerem a zero °C ou menos embora seu ótimo esteja
dependendo de temperaturas mais elevadas próximo de 15 ou 20 °C. Diversas espécies da Antártida podem
crescer a -7 °C, mas com o ótimo entre 20 e 30 °C.
2) Bactérias mesófilas: são aquelas que crescem melhor em temperaturas situadas entre 25 e 40 °C.
3) Bactérias termófilas: são aquelas que crescem melhor em temperaturas entre 45 e 60 °C.
- Exigências atmosféricas
Os principais gases que afetam o crescimento bacteriano são o oxigênio e o dióxido de carbono.
1) Bactérias aeróbias são aquelas que crescem na presença de oxigênio livre.
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2) Bactérias anaeróbias são aquelas que crescem na ausência de oxigênio livre.
3) Bactérias anaeróbias facultativas são aquelas que crescem tanto na presença como ausência de oxigênio
livre.
4) Bactérias microaerófilas são aquelas que crescem na presença de pequena quantidade de oxigênio livre 1015%
- Acidez e alcalinidade (pH)
Para a maioria das bactérias, o ótimo de pH para o crescimento se situa entre 6,5 e 7,5, mas alguns podem viver
nos limites extremos de pHs. Variações mínimas e máximas para a maioria das espécies estão entre 4 e 9.
* Alteração de pH é corrigido com tampões. Combinação de KH2PO4 e K2HPO4
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Título: Bactérias Fitopatogênicas
Autor: Carlos Hidemi Uesugi
Editora: CopyMarket.com, 2000
4. Reprodução e Crescimento
Carlos Hidemi Uesugi
Reprodução
No círculo de crescimento das bactérias o processo mais comum e sem dúvida o mais importante é a fissão
binária transversal na qual uma única célula se divide em duas após desenvolver uma parede celular transversal.
É um método de reprodução assexuada.
-A fissão binária não é o único método de reprodução entre bactérias.
Streptomyces: produzem muitos esporos reprodutivos (cada esporo da origem
a um novo indivíduo).
Nocardia: produz filamentos que se fragmentam e produzem células bacilar ou cocóides.
Crescimento
Velocidade de crescimento e tempo de geração
- Processo de reprodução: fissão binária, uma célula se divide formando 2 células.
20 → 21 → 22 → 23 → 24 → ......2n
* Tempo de geração: tempo necessário para que uma se divida ou para que a população se duplique.
* O tempo de geração não é o mesmo para todas as bactérias.
Ex. Para E. coli é de 17 min. já para outras pode ser de muitas horas.
Para fins de ilustração, imagine-se a situação hipotética seguinte. Uma bactéria é inoculada num meio de cultura
e, após ter decorrido o tempo de geração deste microrganismo, há duas células; depois de outra geração, quatro
células; após 3 gerações, oito células em cada uma das gerações sucessivas, admitindo-se a ausência de mortes, a
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população dobra em número de seus indivíduos. A relação entre os números de células e de gerações pode ser
expressa numa série de equações.
B = número de bactérias inoculadas no meio ou contagem bacteriana no tempo zero;
b = número de bactérias ao fim de um dado período de tempo;
t = período de tempo
G = tempo de geração;
n = número de gerações;
log = logaritmos decimais (logaritmos comuns).
Iniciando a experiência com uma única célula, a população total b, ao fim de um dado tempo, seria expressa
como:
b = 1 x 2n
onde, 2n é a população bacteriana após a n-ésima geração. Em termos práticos, contudo, o número de bactérias
B, introduzido no meio da cultura no tempo zero, não é igual a 1, mas vários milhares, de modo que a formula se
modifica:
b = B x 2n (2)
Resolvendo a equação (2) para n, obtém-se:
log b = log B + n log 2
log b - log B
n = —————
(3)
log 2
Substituindo o valor de log 2, que é 0,301, chega-se a:
b
n = 3,3 log — (4)
B
Assim, usando a equação (4), pode-se calcular o número de gerações ocorridas, desde que se conheça a
população inicial B e a população b, após o tempo t.
O tempo de geração G é igual ao tempo t (tempo decorrido entre b e B), dividido pelo número de gerações n,
ou:
tt
G = –– = –––––––––––
n 3,3 log (b/B)
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Tempos de geração de diversas espécies de bactérias.
Bactéria
Meio
Temp. ºC
Tempo de geração
(minutos)
Bacillus mycoides
caldo
37
28
B. thermophilus
caldo
55
18,3
Escherichia coli
caldo
37
17
leite
37
12,5
Lactobacillus acidophilus
leite
37
66-87
Mycobacterium tuberculosis
sintético
37
792-932
Rhizobium japonicum
sais minerais + extrato de 25
levedura + manitol
344-461
Staphilococcus aureus
caldo
37
27-30
Streptococcus lactis
caldo lactose
37
48
leite
37
26
teste em coelho
37
1980
Treponema pallidum
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Tempo de geração de bactérias fitopatogênicas
Bactéria
Tempo
(min)
Erwinia amylovora
78
Estacionária
E. carotovora subsp. carotovora
25-30
Agitação
E. chrysanthemi pv. zeae
25
Estacionária
E. herbicola
25-30
Estacionária
Pantoea aglomerans pv. milletiae
25-30
Estacionária
Ralstonia solanacearum
66
Estacionária
P. syringae pv. syringae
73
Estacionária
P. syringae pv. apii
80
Estacionária
Xanthomonas axonopodis pv. citri
90
Estacionária
X. a. pv. phaseoli
134
Estacionária
X. oryzae pv. oryzae
90
Agitação
X.arboricola pv. pruni
92
Agitação
Rhodococcus facians
88
Estacionária
pv. 80
Estacionária
Curtobacterium
Flaccumfaciens
Clavibacter
michiganensis
flaccumfaciens
michiganensis
de
duplicação Método de cultivo
subsp. 115
Estacionária
Agrobacterium tumefaciens
78
Estacionária
A. rhizogenes
121
Estacionária
Adaptado de Goto, M. Fundamentals of Bacterial Plant Pathology.
Ciclo normal de crescimento (curva de crescimento de cultura bacteriana).
* Fase lag: população bacteriana permanece inalterada temporariamente, mas não significa que as células
estejam em repouso ou dormente; ao contrário durante esta etapa as células aumentam de tamanho além de suas
dimensões normais. São fisiologicamente ativas e estão sintetizando um novo protoplasma, adaptando ao novo
ambiente.
- Ao final da fase lag cada célula se divide.
- Nem todos completa a sua etapa lag simultaneamente.
- Ocorre um aumento gradual da população até o término dessa fase.
* Fase logarítmica ou exponencial: durante este período as células se dividem firmemente, num ritmo
constante, e o logaritmo do número de células relacionado com o tempo resulta numa linha reta. Em condições
apropriadas, o ritmo de crescimento é máximo durante esta fase.
* Fase estacionária: A fase logarítmica do crescimento começa a diminuir depois de várias horas, outra vez de
forma gradual, representada por uma curva de transição entre uma linha reta (fase logarítmica) e outra, que é a
fase estacionária. Esta tendência para o fim do crescimento pode, ser atribuído a uma série de circunstâncias,
particularmente, á exaustão de alguns nutrientes e, com menos frequência, à produção de produtos tóxicos. A
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população permanece constante durante um certo tempo, talvez como resultado da completa cessação das
divisões ou do equilíbrio entre o ritmo de reprodução e o equivalente ritmo de morte.
* Fase de declínio ou de morte. Depois do período estacionário, as bactérias podem morrer mais rapidamente
do que a produção de novas células, se, de fato, algumas bactérias ainda estiverem reproduzindo-se.
{©Indubitavelmente várias condições contribuem para a morte da bacteriana, mas as mais importantes são a
depleção de nutrientes essenciais e o acúmulo de substâncias inibidoras tais como os ácidos. Durante a fase de
morte, o numero de células viáveis decresce geometricamente (exponencialmente), em essência, o inverso do
crescimento durante a fase log. As bactérias morrem em velocidades diferentes, tal como se comportam em
relação ao crescimento. Algumas espécies de cocos Gran-negativos muito rapidamente, de modo que podem
restar algumas poucas bactérias vivas após 72 horas ou menos de incubação. Outras, porém, morrem tão
lentamente que há células viáveis depois de meses e até anos.
Curva de crescimento típica de bactérias. (A) fase lag; (B) fase log (logarítmica); (C) fase estacionária; (D) fase de
morta ou de declínio.
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5. Classificação das Bactérias Fitopatogênicas
Carlos Hidemi Uesugi
REINO PROCARIOTAE
5.1. DIVISÃO I - Gracilicutes
Procariotos com parede celular fina, contendo o tipo de parede Gram-negativa, com células tipo esfera,
bastonete ou curvo e hélice. As bactérias fitopatogênicas são todas, do tipo bastonete com raras exceções. A
maioria das bactérias fitopatogênicas de importância econômica estão incluídas aqui.
5.1.1. CLASSE - Proteobacteria - maioria bactérias unicelulares.
Família Pseudomonadaceae (antiga clasificação)
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Espécies, biovares e patovares de pseudomonas organizadas de acordo com a homologia de rRNA e DNA.
Reclassificação do grupo de homologia de rRNA do gêneros Pseudomonas (antiga denominação)
(Fitopatogênicas).
Grupo
rRNA
de
homologia Gêneros
I
Pseudomonas (Fluorescentes)
II
Burkholderia, Ralstonia (Grupo Burkholderia)
III
Acidovorax (Comamonadaceae)
IV
V
Xanthomonas (Grupo Xanthomonas)
GRUPO Pseudomonas
{©Gênero Pseudomonas - (espécie tipo - Pseudomonas aeruginosa) (Grupo I rRNA). Bastonete reto,
raramente curvo, Móvel com, normalmente, mais de um flagelo polar (lofotríquio). Colônia, branca, cinza-claro
ou creme. São estritamente aeróbios. Este gênero, além de bactérias fitopatogênicas, contém espécies epífitas e
saprófitas, cujos habitats são a rizosfera, o solo, a superfície de plantas, os restos de cultura e água. Há também
patógenos de animais. Causa numerosas manchas foliares, queimas, murchas vasculares, podridões moles,
cancros e galhas.
Gênero Rhizobacter - (espécie tipo - Rhizobacter daucus). São bastonetes retos ou ligeiramente curvos e
Gram negativos. Móveis por flagelos polar ou lateral ou ambos ou imóveis. São aeróbios. Colônia branca ou
branca-amarela. Crescimento flocular consistindo de unidade globular em meio líquido. Causa a galha bacteriana
da cenoura.
Gênero Rhizomonas - (espécie tipo - Rhizomonas suberifaciens). Bastonetes retos ou ligeiramente curvos.
Móveis, por um flagelo lateral, subpolar ou polar, ou imóveis. Colônias brancas ou amareladas lisa ou vincada.
São aeróbias. Causa a raiz corticosa da alface
Grupo Burkholderia
Gênero Burkholderia - (espécie tipo - Burkholderia cepacia) (Grupo II rRNA). Bastonete reto, raramente
curvo, Móvel com, normalmente, mais de um flagelo polar (lofotríquio). Colônia, branca, cinza-claro ou creme.
São estritamente aeróbios Causa numerosas manchas foliares, queimas, murchas vasculares, podridões moles,
cancros e galhas.
Gênero Ralstonia - (espécie tipo - Ralstonia picketii) (Grupo II rRNA). Bastonete reto, raramente curvo,
Móvel com, normalmente, mais de um flagelo polar (lofotríquio). Colônia, branca, cinza-claro ou creme. São
estritamente aeróbios. Causa numerosas manchas foliares, queimas, murchas vasculares, podridões moles,
cancros e galhas. Ex. murcha bacteriana do tomateiro (Ralstonia solanacearum).
Grupo Xanthomonas
Gênero Xanthomonas - (Homologia DNA-rRNA Grupo V). Bastonete reto móvel por um único flagelo
polar (monotríquia). Colônia quase sempre amarela, havendo três espécies que apresentam colônia branca. São
estritamente aeróbios. Produção de pigmento amarelo (xanthomonadina). Causa manchas em folhas frutos,
queimas em plantas anuais, perenes. Murcha vascular e cancro em citrus.
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Gênero Xylella - (espécie tipo - Xylella fastidiosa). Bastonete reto (pode haver bastonete ligeiramente curvo).
Não móvel. Colônia de dois tipos: lisa e rugosa, ambas opalescentes e circulares. São estritamente aeróbios. Não
cresce em meios comuns usados em fitopatologia, pois é exigente em vários componentes químicos. Habitante
do xilema. Causa; a pierce disease da videira, phony disease do pessegueiro, a clorose variegada do citrus (CVC)
etc..
Família Comamonadaceae
Gênero Acidovorax - (espécie tipo - Acidovorax avenae) (Grupo III rRNA). Bastonetes retos ou
ligeiramente curvos, móveis por um único flagelo polar. Causa; mancha foliar em milho, orquídias e melâncias.
Gênero Xylophilus - (espécie tipo - Xylophilus ampelinus). São bastonetes retos ou ligeiramente curvos,
Gram negativos, moveis por um flagelo polar. São aeróbios estritos. Causa a necrose bacteriana e cancro da
videira.
Família Rhizobiaceae
Gênero Agrobacterium - Bastonete reto. Móvel por um a seis flagelos subpolares ou peritíquios. Colônia
branca. São estritamente aeróbios. O processo da doença é devido à presença de plasmídeo específico na célula
da bactéria, A. tumefaciens (galha) A. rhizogenes (raiz), A. radiobacter (avirulento).
Gênero Liberobacter - Causa o greening dos citros. Bactéria de floema.
Família Enterobacteriaceae
Gênero Enterobacter - E. cloacae tem sido reportado causando a descoloração marrom do fruto do mamão
atraves da infecção oportunistica. Erwinia herbicola, epífita comum, é muitas vezes referidos como sinônimo de
Enterobacter agglomerans.
Gênero Erwinia - (espécie tipo - Erwinia amylovora). Bastonete reto Gram-negativo anaeróbio facultativo.
Móvel por flagelos peritríquios, com uma exceção (E. stewartii). Colônia branca ou amarela. Algumas espécies
possuem enzimas pectinolíticas e, portanto, são capazes de provocar a podridão mole em tecido vegetal.
A classificação dos isolados em Pantoea spp. é baseado nas diferênças na hibridação de
Gênero Pantoea DNA-DNA. A investigação desta parte da Enterobacteriaceae é incompleta, e a aplicação da nomenclatura
necessita ser levada em conta espécies altamente relacionadas da Enterobacter e Erwinia.
Gênero Serratia - São membras das enterobacterias gram negativas com flagelos peritriquios. Geralmente
formam colônias roseas. S. proteomaculans e S. marcescens tem sido reportado como patogenicos a plantas. O
primeiro tem sido reportado causando mancha bacteriana em Protea cynaroides e o segundo causando a “podridão
da coroa” em alfafa.
5.2. DIVISÃO II - FIRMICUTES: procariotos com parede celular espessa e forte, indicando o tipo Grampositivo de parede celular.
5.2.1. CLASSE FIRMIBACTERIA
Gram positivas, bastonetes formadoras de espóros com ou sem flagelos peritríquios.
Gênero Bacillus - São aeróbios ou aeróbioas facultativos. Causa varias doenças tais como podridão da batata
em armazenamento (Bacillus sp.), podridão da folha do fumo em processo de secagem (Bacillus sp.), podridão da
muda de tomate (Bacillus sp.), podridão da soja (Bacillus sp.), estrias brancas do trigo (B. megaterium pv. cerealis).
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Gênero Clostridium - São estritamente anaeróbios. Causa a podridão da folha do fumo em processo de
secagem e Sindrome da madeira molhada do álamo e do olmo.
5.2.2. CLASSE THALLOBACTERIA
Bastonetes irregulares, sem esporos, Gram-positivas.
Gênero Arthrobacter - (espécie tipo - Arthrobacter globiformis). A única espécie fitopatogênica deste
gênero é Arthrobacter ilicis, que é a nova designação de Corynebacterium ilicis. Bastonete e coco. Móvel. Aeróbio
estrito. Colônia amarela. Causa a queima bacteriana do azevinho americano.
Gênero Clavibacter - (espécie tipo Clavibacter michiganensis). Bastonetes pleomórficos, ou seja, com
formas diversas. Não móvel. Aeróbio estrito. Colônia amarela. (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis). Causa
murcha bacteriana em tomate, alfafa, batata e cancro em tomateiro (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis).
Gênero Curtobacterium - (espécie tipo Curtobacterium citreum). Bastonete curto, irregular. Móvel por
flagelos laterais. Aeróbio estrito.Colônia amarela, alaranjada ou rósea. (Curtobacterium flacunfaciens pv. flacunfaciens).
Causa murcha em feijoeiro e outras plantas.
Gênero Rathayibacter - (espécie tipo Rathayibacter rathayi). R. iranicus, R. rathayi, R. tritici. Estas espécies
causam exudações amareladas (gomose) na inflorescência, nos grãos em formação e também nas folhas e
distorções foliares em trigo e em várias espécies de gramíneas anuais. São bactérias associadas com nematoides
do gênero Anguina, necessitando destes como vetores.
NOCARDIFORMES
Gênero Nocardia - Apenas uma espécie tem sido relatada como patógeno de planta (N. vaccinii).
Gênero Rhodococcus - (espécie tipo Rhodococcus rhodochrous). A única espécie fitopatogênica deste
gênero é Rhodococcus facians. Células de várias formas (pleomórficas), podendo haver formação de hifas, mas não
de esporos. Aeróbio estrito. Não móvel. Colônia alaranjada, cor-de-rosa ou vermelha. Causa a fasciação da
ervilha doce.
STREPTOMYCETOS
Gênero Streptomyces - (espécie tipo Streptomyces albus). Apresenta colônia de crescimento lento com
aspecto granular, pulverulento e aveludado. Há desenvolvimento aéreo de micélio, que é ramificado, não
fragmentado e com cadeia de três ou mais esporos redondos, ovais ou cilíndricos. Gram positiva. São aeróbios.
Causa a sarna da batatinha (S. scabies).
5.3. DIVISÃO III - TENERICUTES: procariotos desprovidos de parede celular, envolvido apenas pela
membrana plasmática. São denominados de micoplasmas, incluindo a Classe Mollicutes. Tem reação Gramnegativa. Alguns requerem meios complexos para crescimento e penetram a superfície do meio de cultura,
formando colônias do tipo “ovo-frito”.
5.3.1. CLASSE - MOLICUTTES
Família - Spiroplasmataceae
Gênero Spiroplasma - (espécie tipo - Spiroplasma citri). Não possui parede celular. Insensível à penicilina.
Sensível à tetraciclina. Forma variada (pleomorfismo), inclusive helicoidal. Não móvel alguma espécies tem
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movimento por deslizamento em superfície úmida e a forma helicoidal tem movimento rotatório e por flexão.
Requer esteróis (colesterol) para crescer. A principal espécie fitopatogênica é a Spiroplasma citri agente causal da
Stubborn disease (doença teimosa) do citrus.
Família (s) - ainda não conhecidas
Gênero não definido, MLO (Mycoplasma-Like-Organism). Organismos pleomorficos sem parede celular.
Morfologicamente se assemelha ao micoplasma. Atualmente mais conhecido como fitoplasmas. Causam
numerosas doenças conhecidas como, amarelo, superbrotamento e declínio em árvores e algumas plantas anuais.
5.4. OUTRAS BACTÉRIAS.
Vários outros gêneros incluem bactérias relatadas como patogênicas para as plantas.
Gênero Acetobacter e Gluconobacter - Causa a chamada “doença rosea” do abacaxi e a podridão marrom da
maçã e da pera. Estes patógenos são oportunistas e não tem capacidade de afetar outros orgãos além do fruto.
5.5. BACTÉRIAS FASTIDIOSAS
São aquelas que não crescem em meios de cultura utilizados rotineiramente em bacteriologia.
Grupo das Riquetsias: Bactérias baciliformes, de parede celular rígida; patógenos dos sistemas vasculares.
Grupo dos Micoplasmas: Bactérias sem parede celular e sem forma definida.
Grupo dos Espiroplasmas, sem parede celular rígida.
Bactérias do raquitismo da cana de açúcar e de outras gramíneas
Xylella fastidiosa - bactéria causadora da clorose variegada dos citros.
Clavibacter xyli subsp. cynodontis - causa o raquitismo da grama bermuda (Cynodon dactylon); Bermuda-grass stunting.
Clavibacter xyli subsp. xyli - raquitismo da soqueira da cana-de-açúcar; ratoon stunting disease.
Obs: A diagnose de doenças causadas por bactérias fastidiosas são, feitas através de exames de cortes ultra-finos
em microscópio eletrônico e pela reação ou reprodução de sintomas em plantas testes inoculadas mecanicamente
com o suco do tecido da planta doente, através de vetores ou por enxertia.
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Classificação das categorias superiores de Procariotos e afiliação das bactérias fitopatogênicas
Reino
Divisão
Classe
Atributo
Família
Gracilicutes
Proteobacteria
Não fotos- Enterobacteriaceae
sintético
Gênero
Enterobacter
Erwinia
Pantoea
Serratia
Pseudomonadaceae
Pseudomonas
Rhizobacter
Rhizomonas
Grupo Burkholderia
Burkholderia
Ralstonia
Grupo Xanthomonas
Xanthomonas
Xylella
Comamonadaceae
Acidovorax
Xylophilus
Rhizobiaceae
Procariotae
Agrobacterium
Liberobacter
Firmicutes
Firmibacteria
Simples
(G+)
Bacillus Clostridium
Tallobacteria
Ramifi-cado
(G+)
Arthrobacter
Clavibacter
Curtobacterium
Nocardia
Rathayibacter
Rhodococcus
Streptomyces
Tenericutes
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Mollicu-tes
ProcariotoSe Spiroplasmataceae
m parede
Spiroplasma
Afiliação incerta
Fitoplasma
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Título: Bactérias Fitopatogênicas
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6. Espécies de Bactérias Fitopatogênicas
Carlos Hidemi Uesugi
Classificação atualizada, segundo Sub-Comité de Taxonomia de Bactérias Fitopatogênicas - ISPP. Names of
plant pathogenic bacteria 1864-1995. Review of Plant Pathology 75(9): 721-763, 1996.)
Grupo Pseudomonas
Fluorescentes:
Gênero Pseudomonas
P. agarici
P. amygdali
P. asplenii
P. betle
P. caricapapayae*
P. cichorii*
P. cissicola
P. corrugata*
P. ficuserectae
P. flectens
P. fuscovaginae
P. hibiscicola
P. marginalis*
pv. alfalfae
pv. marginalis*
pv. pastinacae
P. meliae
P. rubrisubalbicans
P. savastanoi
pv. glycinea*
pv. phaseolicola
pv. savastanoi
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28
P. syringae* (51 patovares)
pv. apii*
pv. coronafaciens
pv. garcae*
pv. helianthi
pv. hibisci
pv. lachrymans*
pv. passiflorae
pv. pisi
pv. sesami
pv. striafaciens
pv. syringae*
pv. tabaci*
pv. tomato*
P. syzygii
P. tolaasii
P. viridiflava*
Comamonadaceae
Não fluorescentes
Gênero Acidovorax
A. avenae (Pseudomonas avenae)
subsp. avenae (P. rubrilineans; P. alboprecipitans) *
subsp. cattleyae (P. cattleyae)
subsp. citrulli (P. pseudoalcaligenes subsp. citrulli)
A. konjaci (P. pseudoalcaligenes subsp konjaci)
Grupo Burkholderia
Não Fluorescentes
Gênero Burkholderia
B. andropogonis (Pseudomonas andropogonis; P. woodsii)
B. caryophylli (P. caryophylli)*
B. cepacia (P. cepacia)*
B. gladioli (P. gladioli)
pv. agaricicola
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29
pv. alliicola*
pv. gladioli*
B. glumae (P. glumae)
B. plantarii (P. plantarii)
Gênero Ralstonia
R. solanacearum*
R. pickettii
R. syzigii
(P. rubrisubalbicans)
Grupo Xanthomonas
GÊNERO, Xanthomonas spp.
Xanthomonas albilineans*
X. Cucurbitae
X. fragariae*
X. hortorum
X. oryzae*
X. hyacinthi
X. populi*
X. melonis
X. campestris*
X. pisi
X. axonopodis
X. sacchari
X. arboricola
X. theicola
X. bromi
X. translucens
X. cassavae
X. vasicola
X. codiaei
X. vesicatoria
* Espécies existentes antes da reclassificação
Reclassificação de Xanthomonas
Em Julho de 1995, foi proposta a reclassificação de Xanthomonas baseado no estudo da hibridação DNA-DNA
(Valterim et al.).
Nomes validados pela revisão de 1996 (Young, J. M. et al. Names of plant pathogenic bactéria 1864-1995. Review
of Plant Pathology 75: 721- 763. 1996).
Patovares de Xanthomonas arboricola
pv. celebensis
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pv. corylina
pv. juglandis
pv. populi
pv. pruni
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30
Patovares de Xanthomonas axonopodis
axonopodis
alfafae
bauhiniae
begoniae
beticola
biophyti
cajani
cassiae
citri
clitoriae
coracanae
cyamopsidis
desmondii
desmondiigangentici
desmondiilaxiflori
desmondiirotundifolii
dieffenbachiae
erythrinae
fascicularis
glycines
khayae
lespedezae
maculifoliigardeniae
malvacearum
manihotis*
martyniicola
mehlusii
nakataecorchori
patelii
pedalii
phaseoli
phillanthi
physalidicola
poinsettiicola
punicae
rhynchosiae
ricini*
Sesbaniae
tamarindi
vasculorum
vignaradiatae
Vignicola
vitians
* Apigmentada
Patovares de Xanthomonas campestris
pv. aberrans
pv. armoraciae
pv. barbareae
pv. campestris
pv. incanae
pv. plantaginis
pv. raphani
pv.alangii
pv. amaranthicola
pv. amorphophalli
pv. aracearum
pv. arecae
pv. argemones
pv. arracaciae
pv. asclepiadis
pv. azadirachtae
pv. badrii
pv. betae
pv. bilvae
pv. blepharidis
pv. boerrhaaviae
pv. brunneivaginae
pv. cannabis
pv. cannae
pv. carissae
pv. centellae
pv. clerodendri
pv. convovuli
pv. coriandri
pv. daturae
pv. durantae
pv. esculenti
pv. eucalypti
pv. euphorbiae
pv. fici
pv. guizotiae
pv. gummisudans
pv. heliotropii
pv. ionidii
pv. lantanae
pv. laureliae
pv. lawsoniae
pv. leeana
pv. leersiae
pv. malloti
pv. mangiferaeindicae*
pv. merremiae
pv. mirabilis
pv. musacearum
pv. nigromaculans
pv. obscurae
pv. olitorii
pv. papavericola
pv. parthenii
pv. passiflorae
pv. paulliniae
pv. pennamericanum
pv. phormiicola
pv. physalidis
pv. sesami
pv. spermacoces
pv. syngonii
pv. tardicrescens
pv. thespesiae
pv. thirumalscharii
pv. tribuli
pv. trichodesmae
pv. uppalii
pv. vernoniae
pv. viegasii
pv. viticola*
pv. vitiscarnosae
pv. vitistrifoliae
pv. vitiswoodrowii*
pv. zantedeschiae
pv. zingibericola
pv. zinniae
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*Apigmentada
Patovares de Xanthomonas hortorum
pv. carotae
pv. hederae
pv. pelargonii
pv. taraxaci
Patovares de Xanthomonas oryzae
pv. oryzae
pv. oryzicola
Patovares de Xanthomonas translucens
pv. arrhenatheri
pv. cerealis
pv. graminis
pv. phlei
pv. pheipratensis
pv. poae
pv. secalis
pv. translucens
pv. undulosa
ESPÉCIES ATUALMENTE VÁLIDAS DE CORINEBACTÉRIAS FITOPATOGÊNICAS E AS
DOENÇAS CAUSADAS.
Arthrobacter
Arthrobacter ilicis
Clavibacter spp.
Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis
Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus
Clavibacter michiganensis subsp. tesselarius.
Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis
Clavibacter tritici
Clavibacter xili subsp. xili
Clavibacter xili subsp. cynodontis
Curtobacterium spp.
Curtobacterium flaccumfaciens pv. betae
Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens
Curtobacterium flaccumfaciens pv. oortii
Curtobacterium flaccumfaciens pv. poinsetiae
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Rathayibacter spp.
R. iranicus,
R. rathayi,
R. tritici.
Rhodococcus sp.
Rhodococcus facians
MEMBROS DA FAMÍLIA ENTEROBACTERIACEAE
GÊNEROS (Erwinia, Enterobacter, Pantoea e Serratia)
ESPÉCIES de Erwinia
{©As diferentes espécies do gênero Erwinia podem ser divididas em três principais grupos: amylovora, ou não
causadora de podridão mole; herbicola ou erwinias amarelas; e carotovora ou causadora de podridão mole. Esta
divisão, no entanto, é mais uma forma didática que permite ter uma melhor visualização dos diferentes tipos que
compõe o gênero Erwinia. Na realidade é impossível colocar uma linha divisória entre estes grupos devido à
existencia de muitas formas intermediárias.
Grupo amylovora
As espécies deste grupo são:
E. amylovora.
E. tracheiphila.
E. mallotivora.
E. rubrifaciens.
E. quercina.
E. salicis.
E. psidii. Agente causal do crestamento foliar e das brotações da goiabeira. Ocorre apenas no Brasil e é aqui a
única representante do grupo amylovora.
Grupo herbicola
Constituida praticamente pelas variantes de E. herbicola que são predominantemente epífitas, tanto da parte
aérea como das raizes
E. herbicola,
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Espécie deste grupo:
E. herbicola pv. gypsophilae
Grupo carotovora
Agrupa as erwinias causadoras de podridão mole. As mais importantes são a Erwinia carotovora e a E.
chrysanthemi.
E. carotovora é distinguida em cinco subespécies
subsp. atroseptica,
subsp. betavasculorum,
subsp. carotovora,
subsp. odorifera
subsp. wasabiae
E. chrysanthemi possui seis patovares.
pv. chrysanthemi
pv. zeae
pv. dianthicola
pv. dieffenbachiae
pv. paradisiaca
pv. partheni
As outras erwinias colocadas neste grupo são:
E. cypripedii
E. rhapontici
GÊNERO Enterobacter
Enterobacter cancerogenus
Enterobacter dissolvens
Enterobacter minipressuralis
Enterobacter pyrinus
GÊNERO Pantoea
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A classificação dos isolados em Pantoea spp. é baseado nas diferênças na hibridação de DNA-DNA. A
investigação desta parte da Enterobacteriaceae é incompleta, e a aplicação da nomenclatura necessita ser levada
em conta espécies altamente relacionadas da Enterobacter e Erwinia.
As espécies deste gênero são:
Pantoea aglomerans
P. aglomerans pv millettiae (E. herbicola pv. millettiaea) encontrada no Brasil.
Pantoea ananas
P. ananas pv. ananas (E. ananas = E. herbicola pv. ananas).
P. ananas pv. uredovora
Pantoea stewartii (E. stewartii) e estava incluida no grupo herbicola por ser uma bactéria que forma colônia amarela.
Considerada Enterobacteriaceae por ser fermentativa (anaeróbia facultativa), mas não possui flagelos.
P. stewartii subsp. indologenes
P. stewartii subsp. stewartii
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reproduzida sem a autorização da Editora.
Título: Bactérias Fitopatogênicas
Autor: Carlos Hidemi Uesugi
Editora: CopyMarket.com, 2000
7. Aulas Práticas
Carlos Hidemi Uesugi
7.1. CARACTERÍSTICAS CULTURAIS DAS BACTÉRIAS
Para descrever as características culturais das colônias bacterianas é necessário considerar quanto aos diferentes
aspectos que estas colônias apresentam. Os mais relevantes são:
1) Quanto ao crescimento.
É avaliado em função do tempo necessário para que uma colônia, desenvolvida a partir de uma célula, se torne
claramente visível e definida sobre o meio de cultura. Para a identificação de bactérias fitopatogênicas o
crescimento das colônias podem ser classificadas em:
Muito rápido: Menos de um dia.
Rápido: Entre 1 e 2 dias.
Médio: Entre 2 e 3 dias.
Lento: Entre 3 e 4 dias.
Muito lento: Mais de 4 dias.
2) Quanto à forma:
Puntiforme Circular Irregular
3) Quanto à elevação:
Convexa Elevada Achatada Umbonada Irregular
4) Quanto à margem:
Lisa Serrilhada Ondulada Lobada Filamentosa
5) Quanto à consistência:
Mucosa, fluida, micelial.
6) Quanto à superfície:
Lisa, rugosa.
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7) Quanto ao brilho:
Brilhante, translúcido, opaco.
8) Quanto à cor:
Amarela, amarela creme, branca, branca acinzentada, etc..
9) Outras características.
- Estas características são definidas em função do meio de cultura e temperatura de incubação utilizada e da idade
da cultura.
- Para as bactérias fitopatogênicas são utilizados normalmente os meios NDA (nutriente, dextrose, agar) e 523
(de Kado e Hesket) e a temperatura de 25 a 30 °C.
- A idade da cultura para a observação das características culturais varia com o seu crescimento. Nas bactérias de
crescimento rápido é feita até 2 dias; nas de crescimento médio pode ser de 3 a 4 dias; nas lentas, de 4 a 6 dias e
nas muito lentas, de 5 a 10 dias ou mais.
7.2. ROTEIRO PARA DIAGNOSE DE DOENÇAS BACTERIANAS
I. Sintomas de doenças bacterianas
Os primeiros dados a serem considerados na diagnose de uma doença de planta são os sintomas causados na
hospedeira e as condições ambientais sob as quais esta doença foi constatada.
Os principais sintomas de doenças bacterianas estão listados abaixo:
01. Manchas foliares:
a) Manchas
b) Manchas angulares pequenas (geralmente numerosas) lesões do limbo foliar delimitada pelas nervuras
secundárias.
c) Manchas com halo - Causadas pelas bactérias produtoras de certas toxinas que, ao difundirem nos tecidos
adjacentes, causam degenerações da clorofila, formando um halo amarelo ao redor da lesão ou da mancha.
d) Crestamento - Grandes lesões necróticas. Podem ser também resultantes da coalescência de lesões menores.
e) Estrias - Lesões alongadas, geralmente observadas em folhas de gramíneas.
Obs: Uma das características peculiares das lesões bacterianas é o encharcamento dos tecidos afetados no
início do desenvolvimento das doenças. Exudação de pus é outra característica comum em lesões bacterianas.
02. Lesões nas hastes, pecíolos e frutos:
a) Manchas
b) Podridões
c) Cancros (Lesões abertas)
03. Murchas vasculares ou infecções vasculares:
a) Murcha
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b) Morte descendente
04. Podridões moles
a) Podridões moles (é comum em hortaliças tenras em períodos úmidos, tanto no campo, como em póscolheita).
b) Canela preta (Podridão mole da medula das hastes da batata)
c) Talo oco (Podridão mole da medula da haste do tomateiro)
Obs: A podridão mole, é causada pelas bactérias que produzem grande quantidade de enzimas pectolíticas. As
enzimas pectolíticas destroem rapidamente a lamela média e, ocorre ao mesmo tempo, a morte e a liberação
rápida do conteúdo celular.
05. Hipertrofia dos tecidos.
a) Galhas - Desenvolvimento anormal desordenado do tecido afetado.
b) fasciação - Estado achatado e muito ramificado da parte terminal da haste.
06. Sarna
Lesões resultantes do crescimento desordenado e posterior decomposição dos tecidos epidérmicos.
II. Exame de fluxo ou exsudação bacteriana
A exsudação ou fluxo bacteriano nos cortes dos tecidos afetados indica a presença de bactérias. Quando é
abundante nas lesões novas ou nos tecidos afetados recentemente, é uma indicação bastante segura de que a
bactéria é o agente causal da doença em questão.
A presença ou não do fluxo em lesões velhas não permite, no entanto, nenhuma conclusão.
Por outro lado, caso não for constatado fluxo bacteriano mesmo examinando-se várias lesões de diferentes
estágios de desenvolvimento da doença, pode-se concluir que a doença não é bacteriana.
O exame de fluxo permite ainda verificar em que parte do órgão ou do tecido afetado se encontra a maior
concentração bacteriana (tecido interno, vascular, parenquimatoso, etc.), possibilitando a escolha da parte mais
adequada para o isolamento da bactéria.
O conhecimento da localização da bactéria permite também definir se pode ou não efetuar a desinfecção
superficial do tecido com desinfetantes antes de se fazer o isolamento.
Como observar o fluxo bacteriano.
1. Manchas foliares - selecionar a lesão mais nova possível e, com uma lâmina bem afiada, retirar uma seção de
aproximadamente 5mm de largura, de maneira que o corte passe pelas partes necrosada de transição e sadia.
Colocar a seção sobre a lâmina de vidro com água destilada e cobrir com lamínula. Não deixar espaço vazio sem
água sob a lamínula. Examinar ao microscópio. A massa bacteriana quando presente, flui para a água como uma
nuvem. Quando muito abundante, pode ser vista até a olho nu.
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2. Tecidos internos - Remover a parte externa e cortar o tecido lesionado em sentido horizontal, de maneira
que possa obter uma lâmina de, no máximo, um mm de espessura. Cortar uma seção desta em sentido
transversal aos vasos e montar em lâmina de vidro com água e observar como no caso anterior.
3. Murchas vasculares - Nos casos de murchas vasculares, especialmente as causadas por Ralstonia solanacearum,
quando a haste é cortada, ela flui abundantemente como pus sobre o corte ou em fluxos densos, quando
mergulhados em água (copo ou tubo de ensaio), perfeitamente visíveis a olho nu, contra fundo claro.
III. Isolamento
Como as bactérias apresentam pouca variação morfológica é impossível identifica-las pelo exame direto dos
materiais afetados ao microscópio como normalmente se faz com fungos e nematóides.
Assim sendo, a bactéria deve ser isolada para ser posteriormente identificada através das suas características
culturais, morfológicas, fisiológicas, bioquímicas e reação aos tratamentos com corantes.
Nas lesões de plantas são encontradas, além, de bactérias fitopatogênicas, variável gama de bactérias saprófitas
que invadem rapidamente os tecidos mortos. A primeira etapa do trabalho de isolamento consiste, portanto em
separar esta mistura de bactérias encontradas na lesão através da diluição do extrato do tecido afetado sobre a
superfície do meio de cultura adequado, de maneira que as diferentes bactérias cresçam separadamente,
formando colônias puras, sem se misturarem entre si.
A identificação das bactérias fitopatogênicas entre as inúmeras bactérias saprófitas que cresceram separadamente
na placa de isolamento é feita através de exames e testes rápidos mais adequados para cada caso e todas as não
fitopatogênicas devem ser descartadas.
Este trabalho de isolamento está detalhado nos itens abaixo.
a) Escolher a lesão mais nova possível, preferivelmente a que apresenta um fluxo bacteriano abundante.
b) Efetuar uma lavagem ou desinfecção superficial adequada. Quando se trata de tecido espesso ou a parte
lesionada se situa na parte interna do órgão, ou ainda, a bactéria se localiza nos vasos do xilema, a desinfecção
externa pode ser efetuada mergulhando-se o material no álcool. Quando a localização do patógeno é superficial
ou no tecido parenquimatoso das folhas, a utilização de desinfetantes como álcool e hipoclorito é prejudicial,
pois pode matar também a bactéria que se pretende isolar. Neste caso, uma boa lavagem em água é o máximo
que se pode fazer.
c) Obtenção do extrato bacteriano do tecido afetado
c.1. Das manchas foliares e manchas superficiais das hastes, pecíolos e frutos. Após a desinfecção com álcool ou
lavagem com água, recortar em condições asséptica possível, uma pequena secção do tecido afetado (2 a 3 mm
de largura) da lesão nova ou da região de transição entre tecido necrosado e sadio. Transferir para uma lâmina de
vidro esterilizada e macerar com bastão de vidro, acrescentando-se uma ou mais gotas de água estéril.
c.2. Das lesões vasculares, podridões e lesões internas de tecidos volumosos.
Após a desinfecção externa com álcool, retirar o mais assepticamente possível, a casca, epiderme ou camada
superficial com o auxilio de uma lâmina fina (gilete) ou bisturi. Cortar e remover o tecido onde deve estar a
maior concentração bacteriana e transferir para tubo de ensaio com 2 a 3 ml de água estéril e deixar a bactéria
fluir para a água durante 5 a 10 min. Quando se tratar de tecido lenhoso (infecção vascular), a parte do tecido em
que se observa o escurecimento dos vasos deve ser cortada em fatias finas e transferidas para o tubo com água.
Para forçar a saída da bactéria, o tubo pode ser agitado, ou mais, o tecido macerado com um bastão de vidro. O
extrato bacteriano obtido neste caso é uma suspensão com uma leve turvação esbranquiçada.
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d) Diluição na placa em riscas sucessivas
Tomar uma pequena gota do extrato bacteriano com a alça previamente flambada e espalhar no canto da placa
sobre o meio da cultura, riscando-se varias vezes no mesmo lugar com um movimento alternado.
Este meio de cultura, preparado com 2 a 3 dias de antecedência deve absorver rapidamente o liquido(em
aproximadamente 30 segundos) sem deixar vestígios de águas na superfície.
Após esta operação, flambar a alça, esfriar e passar novamente 1 a 2 vezes sobre o mesmo local onde foi
espalhado a gota do extrato e, depois, riscar sucessivamente em linhas paralelas e bem próximas uma da outra,
toda a superfície da placa.
Estes detalhes são fundamentais e devem ser seguidos a risca para se obter um bom gradiente de diluição do
extrato bacteriano de maneira a obter colônias separadas sem se misturarem entre si.
e) Incubar a 25 - 30 °C durante 2 a 4 dias.
As colônias que aparecem inicialmente ou que tem crescimento muito rápido formando colônias grandes nos
primeiros dias são geralmente bactérias saprófitas, não fitopatogênicas.
Verificar se há colônias isoladas com as características da bactéria ou das bactérias consideradas na diagnose
preliminar.
Ao identificar o tipo da colônia da bactéria que se esta pretendendo isolar, transferir o mesmo para um tubo de
ensaio com meio inclinado.
Quando não se conhecem as características culturais da bactéria que se pretende isolar ou se elas são confusas ou
incertas, deve selecionar as colônias mais prováveis e transferi-las para os tubos. A bactéria que se pretende isolar
deve ser separada através de testes rápidos de identificação de bactérias fitopatogênicas para descartar quanto
antes possível as bactérias não fitopatogênicas ou saprófitas e possibilitar desta maneira, a execução dos demais
testes de identificação.
IV. Características culturais das bactérias fitopatogênicas mais freqüentes no Brasil
1. Agrobacterium - Bactérias de crescimento médio a rápido, colônia circular, lisa, convexa, esbranquiçada
brilhante ou levemente opaca e consistência mucosa.
2. Clavibacter michiganensis (Corynebacterium michiganense) - Bactérias de crescimento lento, colônia circular, lisa,
convexa, amarela creme clara e consistência semi fluida.
3. Erwinias do grupo carotovora (Erwinia carotovora subsp. carotovora, E. carotovora subsp. atroseptica e E.
chrysanthemi). Bactérias de crescimento rápido. Colônia opaca, esbranquiçada com tonalidade cinza ou levemente
esverdeada. Bordos irregulares.
4. Pseudomonas andropogonis, P. caryophylli e P. rubrilineans. Bactérias de crescimento médio, circular, lisa
esbranquiçada com tonalidade levemente amarelada, ou castanhas. P. caryophylli forma um pigmento castanho em
4 a 5 dias, que se difunde no meio de cultura.
5. P. cichorii, P. marginalis e P. viridiflava - Bactérias de crescimento rápido, colônia circular, bordo irregular,
esbranquiçada opaca, levemente esverdeada ou amarelada.
6. Burkholderia. gladioli e B. cepacia - Bactérias de crescimento médio a rápido, colônia circular com bordos lisos ou
irregulares esbranquiçados, com tonalidades levemente amareladas, castanhas ou acinzentadas.
7. Ralstonia solanacearum (Pseudomonas solanacearum) (compreende um grande numero de estirpes, variáveis em
patogenicidade, virulência e características culturais). Bactérias de crescimento médio. Colônias brancas, opacas
ou brilhantes. Quando desenvolvem isoladamente são circulares de crescimento lento. Normalmente formam-se
colônias irregulares. Consistência fluida. Várias estirpes produzem pigmentos castanhos que difundem no agar.
8. Pseudomonas syringae (compreende vários patovares). Bactérias de crescimento médio a rápido. Colônia circular,
esbranquiçada, levemente esverdeada ou amarelada, bordo liso ou irregular.
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9. Streptomyces - Bactérias de crescimento médio. Colônia micelial ou cotonosa. Torna-se pulverulenta depois de 4
a 5 dias. Branca com tonalidade cinza ou castanha. Pode produzir pigmento castanho que se difunde no meio de
cultura.
10. Xanthomonas albilineans - Bactérias de crescimento muito lento. Colônia circular, lisa, convexa, amarela
cremosa e consistência fluida.
11. Xanthomonas axonopodis - Compreende grande numero de patovares. Bactérias de crescimento médio. Colônia
amarela, circular, lisa, brilhante, convexa e consistência mucosa.
12. Xanthomonas campestris - Compreende a alguns patovares com origem em brássicas. Bactérias de crescimento
médio. Colônia amarela, circular, lisa, brilhante, convexa e consistência mucosa.
13. Xanthomonas fragariae - Bactérias de crescimento muito lento. Colônia amarela circular, lisa, brilhante, convexa
e consistência mucosa.
V. Testes rápidos para identificação de bactérias fitopatogênicas
1. Teste de hipersensibilidade em folha de fumo.
a) Preparar suspensão bacteriana em água estéril de cada uma das culturas a serem testadas (5 ml de cada em
tubo de ensaio). Utilizar somente culturas novas em desenvolvimento (Culturas de 2-3 dias a 28-30 °C).
A turbidez da suspensão deve ser aproximadamente equivalente a escala 7 de McFarland(*) (concentração MF-7),
avaliada por comparação, sob o fundo claro.
(*) Escala 7 de McFarland: Misturar em um tubo de ensaio, 9,6 ml de H2SO4 1% (v/v do ácido concentrado em
água destilada) e 0,4 ml de BaCl2 1%. Agitar bem antes de usar. Pode ser utilizada por tempo indeterminado,
desde que esteja selada hermeticamente.
b) Infiltrar a suspensão bacteriana sob a epiderme, no espaço internerval da face inferior da folha por meio de
uma seringa sem agulha. Para isso fazer um pequeno ponto no centro do espaço internerval com alfinete, ajustar
bem o ponto no centro do orifício da seringa, pressionando levemente com o dedo pelo lado oposto da folha e
infiltrar lentamente a suspensão ate formar uma área encharcada de aproximadamente 1 cm de lado.
É possível testar várias bactérias em folha, dependendo do seu tamanho. A área infiltrada toma uma coloração
verde escura, de aspecto encharcado, a qual desaparece dentro de 20 a 30 minutos. Deve preferir as folhas mais
desenvolvidas ou maduras para o teste, evitando-se, no entanto, aquelas que já está em fase de declínio.
c) Manter a planta em local iluminado, porém, ao abrigo da chuva.
d) Observar a reação no dia seguinte. A reação é positiva quando a parte infiltrada se necrosa dentro de 12 a 24
horas.
2. Teste de podridão mole em pimentão.
O método consiste em infestar a ponta do palito de dente com massa bacteriana (cultura nova de 1 a 2 dias em
meio solido) e fincar no pimentão verde previamente desinfetado com álcool. Em cada pimentão e possível
testar 4 a 5 bactérias. Incubar a 28 a 32 °C por 24 a 36 horas dentro de saco plástico para manter a condição de
câmara úmida. Em caso positivo, o palito fica solto devido à podridão dos tecidos ao redor. Em caso positivo, o
palito continua firme no lugar.
3. Teste de podridão mole em batata.
O método consiste em:
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a) Recortar ascepticamente a batata em rodelas finas de 3mm de espessura e colocar em placas de Petri. Sobre
um suporte de vara de vidro, retorcido em forma de U. Para manter uma condição de câmara úmida, colocar um
papel de filtro na tampa de placa e embeber com água estéril.
b) Inocular com alça a bactéria a ser testada no centro da rodela e incubar a 28 - 32 °C por 24 horas. Manter
sempre o papel bem umedecido.
Quando o resultado e positivo ha uma podridão aquosa a partir do ponto de inoculação, enquanto que em caso
negativo a rodela da batata se mantém intacta.
VI. Métodos de inoculação em plantas suceptiveis para testes rápido em patogenicidade.
1. Puntuação da folha.
Consiste em fazer inúmeras perfurações na folha com a ponta de uma agulha e depois passar a suspensão
bacteriana com pincel ou cotonete estéril.
2. Puntuação na haste.
Consiste em colocar a massa bacteriana ou suspensão bacteriana na haste e efetuar puntuações com uma agulha.
3. Corte da ponta das folhas com tesoura.
Consiste em "molhar" a tesoura com suspensão bacteriana e cortar a ponta das folhas. ë usado para bactérias que
invadem o sistema vascular das folhas.
4. Palito de dente.
Consiste em infestar o palito de dente com massa ou suspensão bacteriana e introduzir no tecido da planta
susceptível (haste tenra ou fruto). É usado para bactérias que causam cancros na haste, mortes descendentes,
murchas e podridões.
Em todos setes métodos (item 1 a 4) as plantas inoculadas devem ser mantidas em condições de câmara úmida,
sob o abrigo da luz solar para assegurar a infecção.
5. Infiltração na folha.
É o mesmo método utilizado para infiltração em fumo, porém, com suspensão muito menos concentrada (1/100
de MF-7). É o método mais rápido e seguro para teste de patogenicidade de Xanthomonas axonopodis pv. citri e X.
vesicatoria em folha de citrus e pimentão respectivamente.
6. Inoculação por aspersão.
Consiste em preparar uma suspensão bacteriana 1/100 de MF-7 e aspergir principalmente na parte inferior da
folha, onde se encontra o maior numero de estomatos. Aplicar ate ficar bem úmido. Após a infestação manter a
planta por no mínimo 24 horas em câmara úmida.
7.3. IDENTIFICAÇÃO DAS BACTÉRIAS
CHAVE PARA IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS FITOPATOGÊNICAS AO NÍVEL DE
GÊNERO.
A chave abaixo é valida somente para bactérias fitopatogênicas que crescem em meios de cultura, utilizados
normalmente em bacteriologia. Estas bactérias, excetuando-se as Streptomyces que possuem estrutura micelial, são
baciliformes que não formam endosporos. Variam no tamanho de 0,5 a 1,0 µm de diâmetro por 0,3 a 3,0 µm de
comprimento.
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1. Tipo de colônia: Micelial......................................Streptomyces
Mucosa ou fluida.......................(2)
2. Teste de Gram: Gram (+).....................................Clavibacter (Corynebacterium)
..................................................Arthrobacter
.................................................Curtobacterium
................................................. Rathayibacter
.................................................Rhodococcus
Gram (-).....................................(3)
3. Teste OF: Fermentativo.......................................Erwinia, Pantoea
Oxidativo...................................(4)
4. Colônias amarelas em NDA: (+). ........................Xanthomonas amarelas
(-).............................................(5)
5. Pigmento fluorescente em King-B:
(+).............................................Pseudomonas
(-)..............................................(6)
6.Crescimento em meio de asparagina:
(+)...........................................Acidovorax, Burkholderia e Ralstonia
(-)............................................Xanthomonas apigmentada
TESTE DE GRAM (Coloração)
-PROCEDIMENTO
1) Diluição
Sobre uma lâmina para microscópio limpa e desengordurada (mergulhar em álcool e enxugar com papel
higiênico de alta qualidade) colocar algumas gotas de água destilada estéril, transferir uma pequena quantidade de
massa bacteriana e diluir, produzindo uma suspensão ligeiramente turva.
2) Esfregaço
-Limpar e desengordurar uma lâmina, aquecer ligeiramente e transferir com auxilio de uma alça uma alçada da
suspensão preparada no item anterior, espalhando sobre a lâmina em círculo de diâmetro de aproximadamente 1
cm. Esperar secar e fazer a coloração.
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3) Coloração
-Sobre a lâmina com o esfregaço colocar algumas gotas do corante cristal violeta de Hucker. Esperar
aproximadamente 30 segundos e lavar com água.
-Colocar algumas gotas de solução iodo lugol e esperar aproximadamente 30 seg.
-Lavar com álcool etílico 95%.
-Observar a lâmina contra a luz. Bactérias Gram-positivas retém a coloração azul violeta, enquanto que as
bactérias Gram-negativas ficam completamente incolores.
As Gram-positivas podem ser observadas ao microscópio com a objetiva de 100X com óleo de imersão, e
apresenta uma coloração azul violeta.
As Gram-negativas, para serem visualizadas ao microscópio, devem ser coloridas novamente. Usa-se safranina
(vermelha) para diferenciar das Gram-positivas azuis.
ESTUDO DAS CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DAS BACTÉRIAS
-PROCEDIMENTO
1) Diluição
Sobre uma lâmina para microscópio limpa e desengordurada (mergulhar em álcool e enxugar com papel
higiênico de alta qualidade) colocar algumas gotas de água destilada estéril, transferir uma pequena quantidade de
massa bacteriana e diluir, produzindo uma suspensão ligeiramente turva.
2) Esfregaço
-Limpar e desengordurar uma lâmina, aquecer ligeiramente e transferir com auxilio de uma alça uma alçada da
suspensão preparada no item anterior, espalhando sobre a lâmina em círculo de diâmetro de aproximadamente 1
cm. Esperar secar e fazer a coloração.
3) Coloração
-
Colorir o esfregaço preparado no item anterior colocando algumas gotas de safranina.
-
Esperar por 2 a 3 minutos, lavar com água, secar e observar com objetiva de 100 x. Use óleo de imersão.
7.4. MEIOS DE CULTURA
Meio de cultura é o substrato utilizado para o desenvolvimento de microrganismos, de células, e de tecidos de
plantas e de animais, contendo para isso, os nutrientes necessários.
Elementos do meio de cultura
1. Elementos essenciais:
a) Água
b) Carbono
Orgânico: carboidratos. (Ex: dextrose, sacarose, maltose, amido etc..).
c) Nitrogênio
Orgânico: proteínas e aminoácidos.
Inorgânicos: nitratos e sais de amônio.
d) Elementos minerais: exigidos em maiores quantidades, P, K, Mg, S, Ca, Na.
Microelementos Mn, Fe, B, Zn, Co, Cu, Mo.
e) Fatores de crescimento: Vitaminas do complexo B, Aminoácidos e outros.
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2. Estimulantes: Ex. MgSO4·7H2O, CaCO3, etc..
3. Tamponante: (estabilizador de pH). Exs. K2HPO4, Na2HPO4, CaCO3
4. Solidificante: Ex. Ágar.
5. Inibidores: Ex. Antibióticos, ácidos orgânicos, etc.
6. Indicadores: Substâncias que conferem uma característica especial a colônia da bactéria que se pretende isolar.
Materiais de composição definida: Ex. Dextrose, KNO3, K2HPO4, Tiamina, ZnSO4.
Materiais de composição Indefinida: Muitos materiais de composição indefinidos são utilizados para o preparo
de meios de cultura. Exs:
Caldo de batata: Contém grande quantidade de amido (Carboidrato), contém ainda quantidade suficiente de
fonte de nitrogênio orgânico, elementos minerais (macro e micro) e alguns fatores de crescimento para permitir o
desenvolvimento de fungos e bactérias.
Caldo de verduras: Em comparação com o caldo de batata, é mais pobre em carboidratos e mais rico em sais
minerais, e muito rico em fatores de crescimento.
Extrato de malte: Malte é a semente de cevada germinada. Extrato de malte parte solúvel (desidratada) do malte
triturado e fervido, é rico em maltose, proteínas solúveis, aminoácidos, sais minerais e fatores de crescimento.
Extrato de carne: É a parte solúvel (desidratada) da carne moída fervida e desengordurada, rico em proteínas
solúveis, sais minerais e fatores de crescimento.
Extrato de Levedura: É a parte solúvel (desidratada) das células de leveduras autolisadas. É muito rico em
aminoácidos essenciais e vitaminas do complexo B, assim como em sais minerais.
Peptona: É um produto da digestão ácida ou enzimática de proteínas. Existem as mais variadas qualidades de
peptonas, dependendo dos materiais utilizados (carnes de diferentes animais, peixes, resíduos de matadouro, soja,
amendoim etc.) e do processo de digestão e também da enzima utilizada. As melhores peptonas são aquelas
obtidas de carne de boa qualidade. Nestes casos são ricos em proteínas solúveis, aminoácidos essenciais e sais
minerais.
Caseína hidrolisada: É uma peptona obtida da digestão ácida ou enzimática do leite, muito rico em proteínas
solúveis, aminoácidos essenciais e sais minerais.
Ágar: É uma substância utilizada como solidificante de meios de cultura. As principais qualidades do ágar como
solidificante do meio são: a) o seu ponto de liquefação é entre 90 e 100 ºC que permite cultivar os
microrganismos nas mais variadas temperaturas; b) o seu ponto de solidificação entre 40 e 50 ºC permite
incorporação de muitas substâncias termolábeis antes da solidificação; e c) não é digerido ou hidrolisado pelos
microrganismos. Ágar é um polímero de galactose extraídos de algas marinhas do grupo das agarófitas. A
qualidade do ágar varia em função do material original e do grau de purificação o qual foi submetido durante a
extração.
Meios para fungos: (fórmula para 1 litro)
a) BDA (Batata-Dextrose-Ágar): Caldo de 200 g de batata picada e fervida durante 10 a 15 minutos. Água para
completar 1 litro. 10 g de dextrose ou sacarose e 20g de ágar.
b) Meio de malte: Extrato de malte, 20g ; ágar 20g.
c) Meio de verduras: Caldo de 200 g de verduras. Água para completar 1 litro, 3g de CaCO3 e 20g de ágar.
Aos meios de cultura para fungos, quando são usadas para trabalhos de isolamentos, pode-se adicionar inibidores
de bactérias para evitar a contaminação. Os inibidores mais utilizados são o ácido lático e os antibióticos:
estreptomicina, penicilina, cloranfenicol. Estes inibidores são adicionados ao meio após a esterilização em
autoclave.
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Meios para bactérias.
a) NDA (Nutriente, dextrose, ágar): Extrato de carne, 5g; peptona, 10g; dextrose, 10g e ágar. 20g.
b) Meio 523 de Kado e Heskett: Dextrose ou sacarose, 10g; caseína hidrolisada, 8g; extrato de levedura, 4g;
fosfato de potássio dibásico (K2HPO4), 2g; Sulfato de magnésio (MgSO4·7H2O), 300 mg; ágar 20 g.
c) NDLA (Nutriente, dextrose, levedura, ágar): Extrato de carne, 5g; peptona, 10g; extrato de levedura, 4g;
dextrose, 5g, K2HPO4, 2g; KH2PO4, 0,5g e agra 10g.
d)YD (Extrato de levedura, dextrose e carbonato de cálcio): Extrato de levedura, 20g; dextrose, 10g e carbonato
de cálcio 20g.
e) BA (Batata, sacarose, agra) : caldo de 300g de batata picada e fervida; Na2HPO4, 2g; Ca(NO3)2, 0,5g; Peptona,
5g; sacarose, 15g e ágar, 20g.
Aos meios de cultura para bactérias, quando usado para trabalho de isolamento, pode-se adicionar o
cicloexamida, conhecido também como actidione ou outros fungicidas para impedir a contaminação com fungos.
Correção de pH. Os fungos não são exigentes quanto ao pH e, por isso, o meio de cultura pode apresentar
variações desde 5 a 8 sem afetar o seu desenvolvimento. Em meio muito ácido, no entanto, o ágar tende a se
hidrolisar durante a autoclavagem, devendo ser corrigido para, no mínimo pH 6. Quanto às bactérias a grande
maioria exige o pH próximo de 7 (neutro).
O pH é medido no potenciômetro ou através de fita de papel universal; em alíquotas de 50 a 100 ml. A correção
é feita adicionando-se gotas de soluções de base (KOH, NaOH, etc.) ou ácidos (HCl, H2PO4, etc),
tentativamente até obter o pH desejado. Através da regra de três simples, calcula-se a quantidade necessária para
corrigir o volume todo.
Preparo de meio de cultura em placas: Os ingredientes devem ser colocados em frascos com dobro do volume
do meio de cultura que está sendo preparado, tampado e autoclavado durante 15 a 20 minutos efetivos a 121 ºC
(pressão de vapor de 1 atm.). Depois de baixar naturalmente a pressão, deve ser esfriado a aproximadamente 50
ºC para depois verter em placas previamente esterilizadas. Este esfriamento é necessário para reduzir a
evaporação e a condensação da água na tampa da placa. Coloca-se aproximadamente 20 ml de meio por placa.
Depois de vertido o meio, as placas devem ser mantidas em uma estufa de 30 a 35 ºC por 12 a 24 horas ou a
temperatura ambiente por 2 dias em um local arejado e asséptico possível para eliminar a Água de condensação
da superfície da placa do meio de cultura.
Preparo de meios de culturas em tubos: Os ingredientes devem ser colocados em frascos e aquecidos até a
fervura para fundir o ágar. Depois de bem misturados, o meio é transferido para os tubos de ensaio (8 a 10 ml
por tubo) e os tubos tampados com algodão, acompanhados em um recipiente, coberto com uma folha
impermeável e autoclavados a 1 atm. de pressão de vapor durante 15 a 20 min. Depois de autoclavado, os tubos
são inclinados sobre um suporte de aproximadamente 1 cm de altura até completa solidificação.
Esterilização em autoclave: Autoclave é um equipamento para esterilização de materiais a 110-120 ºC sob
pressão de vapor de 0,5 a 1 atm. São utilizadas para esterilização de meios de cultura, líquidos e materiais que não
podem ser esterilizados no forno. O tempo de esterilização varia com o material e volume. 500 ml de meio de
cultura geralmente é autoclavado a 121 ºC (1 atm.) por 20 min.
Esterilização no forno: Vidrarias e materiais cirúrgicos são geralmente esterilizados a 160-200 ºC por tempo
efetivo de 2 a 3 horas.
Tindalização: é o processo utilizado para esterilizar meios que não podem ser aquecidos acima de 100 ºC.
Consiste em ferver durante 30 min. eliminando-se, desta maneira, todas as formas vegetativas. Deixa-se, depois,
em temperatura de 28 -32 ºC durante 1 dia para que as estruturas de resistência, como endospóros, germinem e
passem para a forma vegetava, para então ferver novamente durante 30 minutos. Para assegurar a esterilização,
repete-se esta operação mais uma vez, totalizando-se 3 fervuras de 30 min. por três dias consecutivos.
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Filtração: Soluções ou suspensões de substâncias que não podem ser aquecidas acima de 50 ºC são esterilizadas
através de filtração. a filtração é mais utilizada para esterilização de carboidratos termolábeis, aminoácidos e
vitaminas. Existem vários tipos de filtros, sendo o mais utilizado o de membrana de poros inferiores a 0,4 µ.
7.5. ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS
1) Isolamento de microrganismos do solo, ar, filoplano e rizoplano.
2) Isolamento de fungos fitopatogênicos.
3) Observação de fluxo bacteriano em lesões de plantas causadas por bactérias fitopatogênicas.
4) Isolamento de bactérias fitopatogênicas.
Primeira parte:
1. Isolamento de microrganismos do ar.
- Abrir as placas sobre a mesa durante 30 minutos.
- Incubar a 28 - 30 ºC por 2 a 3 dias e observar.
2. Isolamento de microrganismos do filoplano
- Lavar bem as folhas, eliminar o excesso de água e deixar secar.
- Pressionar levemente a superfície da folha sobre o meio de cultura da placa de Petri.
- Incubar a 28 - 30 ºC por 2 a 3 dias e observar.
3. Isolamento de microrganismos do solo.
- Coletar o solo, secar à sombra, peneirar e pesar 1g.
- Suspender em 100 ml de água esterilizada (diluição 10-2).
- Efetuar mais 3 diluições em série de 1/10 cada para se obter suspensões diluídas a 10-3, 10-4 e 10-5.
- Transferir 0, 05 ml de cada diluição para placas de BSA com 3 repetições e espalhar uniformemente com alça
de Drigalsky.
- Incubar a 28 - 30 °C por 2 a 3 dias e observar.
Esquema de diluição:
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4. Isolamento de microrganismos do rizoplano.
- Coletar raízes de uma planta.
- Lavar e deixar secar a sombra por 15 a 30 min.
- Pesar 1g e macerar em um cadinho com almofariz.
- Suspender o extrato em 100 ml de água esterilizada.
- efetuar diluição em série, de maneira a obter suspensões diluídas de 10-4, 10-5 e 10-6.
- Transferir 0,05 ml de cada diluição para placas de BSA com 3 repetições e espalhar uniformemente
com alça de Drigalsky.
- Incubar a 28 - 30 °C por 2 a 3 dias e observar.
Esquema de diluição:
Segunda parte: Isolamento de fungos fitopatogênicos.
1. De lesões foliares:
- Observar as frutificações do fungo sobre as lesões se for o caso.
- Recortar a parte da folha onde estão as lesões.
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- Imergir em solução de álcool 70% por 30 segundos.
- Transferir para solução de hipoclorito de sódio a 1% (água sanitária diluída a 1/2) e deixar por 2 a 3 minutos.
- Transferir para água esterilizada e deixar por 2 a 3 minutos
- Enxugar sobre papel toalha.
- Recortar assépticamente seções da lesão de 1 a 3 mm de lado, preferivelmente da região de transição entre o
tecido necrosado e o tecido sadio.
- Transferir as seções recortadas sobre o meio de BDA com antibiótico contra bactéria (estreptomicina). Colocar
5 a 6 seções por placa.
- Incubar a 28 - 30 °C por 5 a 7 dias e observar.
2. De lesões profundas (de frutos, hastes ou raízes):
- Observar frutificações do fungo sobre as lesões, se for o caso.
- eliminar a parte superficial externa da lesão com uma lâmina previamente esterilizada com álcool.
- Recortar assépticamente a parte interna da lesão da região de transição entre o tecido necrosado e sadio e
transferir diretamente sobre meio de BDA com antibiótico.
- Incubar a 28 - 30 °C por 5 a 7 dias e observar.
Terceira parte: Observação de fluxo bacteriano em lesões de plantas causadas por bactérias fitopatogênicas.
1. Em lesões foliares ou superfícies.
- Recortar uma secção de aproximadamente 3 mm de largura por 1 cm de comprimento, abrangendo uma área
necrosada, área de transição e área sadia. Se a lesão for pequena, corta-se ao meio de tal maneira que na secção
recortada fique localizada a metade da lesão. A espessura da lesão deve ser no máximo 0,5 mm para poder fechala com lamínula. Para isso, deve-se evitar nervuras espessas ou, se necessário, deve-se efetuar um corte horizontal
para eliminar a parte muito espessa.
-Transferir 2 a 3 seções recortadas sobre uma lâmina de vidro, cobrir com lamínula e encher o espaço com água.
Coloca-se 2 a 3 seções para que a lamínula não fique inclinada.
- Observar ao microscópio com objetiva de menor aumento. A massa bacteriana, quando presente, flui para a
água com um aspecto semelhante a uma nuvem que se dissipa lentamente no ar.
2. Em lesões profundas de hastes, raízes ou fruto.
- Eliminar a parte externa e tomar uma secção fina de no máximo 0,5 mm de espessura e 3 mm de largura
- Transferir sobre a lâmina e cobrir com lamínula, encher o espaço com água e observar ao microscópio como
no item anterior.
3. Em lesões vasculares causadas por Ralstonia solanacearum.
- Cortar uma secção de 2 a 3 cm da haste ou do tecido onde se observa o enegrecimento dos vasos e prender no
tubo de ensaio ou no copo de vidro, com água, de maneira que somente a parte inferior fique mergulhada na
água. O fluxo bacteriano desce em forma de filete branco dentro de 1 a 3 minutos, o qual é visível a olho nu,
quando se deixa incidir uma luz lateral contra um fundo escuro. Para que se possa observar o fluxo, não se deve
movimentar bruscamente o tubo ou o copo. O exame de fluxo é muito útil para diagnose de doenças
bacterianas, uma vez que, quando positivo, é uma indicação bastante segura de que a lesão é bacteriana.
Entretanto, quando é negativo, não se pode afirmar que não é bacteriana. Lesões velhas ou muito novas
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geralmente tem poucas bactérias e não podem ser visualizadas em fluxo. È necessário, portanto, observar várias
lesões das diferentes fases de desenvolvimento da doença e, se mesmo assim não se observar nenhum fluxo,
pode-se concluir que a doença não é bacteriana.
O exame de fluxo é útil também para se saber o tipo de lesão ou o local da lesão onde há maior concentração
bacteriana para se fazer o isolamento, ou ainda, para se saber se a bactéria esta localizada nos vasos ou no tecido
parenquimatoso. Quando a bactéria esta no tecido parenquimatoso, a desinfecção deve ser rápida para não matar
também a bactéria que se quer isolar. Se a localização for no vaso, é possível fazer uma boa desinfecção
superficial sem afetar as bactérias que estão no seu interior.
Quarta parte: Isolamento de bactérias fitopatogênicas.
1. De lesões foliares ou superficiais
- Lavar bem o material coletado (Planta com sintoma da doença) com água corrente (de torneira).
- Preparar ao mesmo tempo, a lâmina de vidro desinfetando-a inicialmente com álcool. Limpar a seguir com
papel (Guardanapo higiênico) e depois, passar rapidamente na chama.
- Recortar a parte da planta onde esta a lesão e imergir em solução de álcool 70% por 30 segundos.
- Transferir para a solução de hipoclorito de sódio a 1% por 1 a 3 min.
- Transferir para água esterilizada por 2 a 3 min.
- Enxugar sobre uma folha de papel toalha ou papel higiênico.
- Recortar assépticamente, pequenas seções de 1 a 3 mm de lado das lesões novas ou da região de transição entre
parte necrosada e sadia.
- Transferir as seções sobre a lâmina desinfetada, colocar 1 a 2 gotas de água e macerar com bastão de vidro
previamente flambado.
- Tomar uma alçada do extrato em riscas sucessivas. (seguir orientação do Professor).
2. De lesões ou podridões internas.
- Eliminar a parte superficial da lesão. Não é necessário fazer a desinfecção superficial como no item anterior.
- Retirar pequenas seções ou porções do tecido lesionado interno e transferir para a lâmina desinfetada, macerar
e plaquear, seguindo os mesmos procedimentos descritos no item anterior.
{©- As seções ou porções do tecido lesionado pode ser transferido para tubo de ensaio com 2 a 3 ml de água
esterilizada em vez de macerar em lâmina. Deixa-se algum mi nuto (1 a 15 min.) para que a bactéria saia
naturalmente do tecido para a água. Pode-se agitar o tubo para apressar o processo. Uma alçada deste extrato é
plaqueado sobre o meio de cultura, da mesma maneira descrita no item anterior. O método de extração de
bactéria em tubo de ensaio é melhor do que a maceração em lâmina quando a quantidade de bactéria presente no
tecido é grane, como nos casos de infecções vasculares (Ex. murcha bacteriana causada por Ralstonia solanacearum)
e podridões moles.
Postulado de Koch
- Isolar microrganismos associados à doença ou sintoma.
- Obter cultura pura.
- Inocular e reproduzir a mesma doença ou sintoma em hospedeira susceptível.
- Reisolar o mesmo microrganismo de hospedeira susceptível.
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