5_Microbiologia celular_1 parte

Microbiologia Celular
1ª parte
The phylogenetic tree of life
as defined by comparing rRNA gene sequencing
Procaryotes
Eukaryotes
Eukarya
Bacteria
Archaea
Universal ancestor
(adaptado de Prescott, Harley, Klein, “Microbiology”, 5th ed.)
Ribosomal RNA (rRNA) – evolutionary chronometer
Microrganismos estão distribuidos pelos três domínios:
Eukarya
- Microrganismos: protozoários, microalgas, fungos
- Organismos superiores: animais, plantas, algas multicelulares
- Maior parte são bactérias extremófilas, isto é vivem em ambientes
extremos; por exemplo:
- bactérias que necessitam de níveis elevados de sal – vivem em lagos
Lago salgado no Quenia
salgados, salinas, etc.;
Proliferação de
halobactérias vermelhas - outras que necessitam de temperaturas elevadas – vivem em fontes
Archaea
termais em regiões com actividade vulcânica, etc.)
- Bactérias produtoras de gás metano
(metanogénicas; vivem em habitats anóxicos como
rumen/animais, sedimentos de lagos, campos de arroz,
Regiões vulcânicas
etc.)
(Temperaturas altas
e/ou pH ácido)
(Aberturas hidrotermais fundos marinhos,
Açores, Yellowstone park, EUA, Islândia)
Bacteria
Todas as outras bactérias, incluindo maior parte das bactérias ambientais
(p.ex., do solo,da água, da microflora natural de animais e plantas),
bactérias patogénicas para o ser humano, animais e plantas, bactérias
fotossintéticas, etc.
“Extremozymes”
Microrganismos extremófilos
- Termófilos ou Hipertermófilos
- Acidófilos ou alcalófilos
- Halófilos
Enzimas que funcionam em
condições ambientais extremas
(p.ex., a Temperatura elevada,
a pH ácido ou alcalino, ou na
presença de concentrações elevadas de sal)
São activas e estáveis em condições ambientais extremas
Potencial uso na industria (ex. biocatálise em condições extremas);
Aplicações no processamento de alimentos, em materiais de limpeza, etc. ;
Investigação, etc.
Exemplos: - Proteases, amilases, celulases, xilanases, etc. termoestáveis
(para a industria alimentar, têxtil ou de detergentes, etc.)
- Taq DNA polimerase, Pfu DNA polimerases, etc.
aplicação na técnica da Reacção de Polimerização em Cadeia
do DNA (PCR- Polymerase Chain Reaction), com aplicações
em microbiologia ambiental, microbiologia clínica, engenharia genética, etc.
(Taq = Thermus aquaticus; Pfu = Pyrococcus furiosus)
Microrganismos procariotas
Estruturas e função nas células
de bactérias
Formas e tamanho das células de bactérias
(Cocos)
(Bacilos ou
bastonetes)
(Espiroquetas hélices flexíveis)
(Bactérias com caule ou apêndice)
(Espirilos hélices rígidas)
Prescott, Harley & Klein, Microbiology,
th edition,Mc GrawHill, 2002
Formas pleiomórficas – formas variáveis
(Micélio – rede de filamentos
multinucleados)
• The largest bacteria
known has
~ 750 µm dimeter
(Thiomargarita
namibiensis – isolated
from a oceanic sediment
in the Namíbia Coast,
1997;
Epulopiscium fishelsoni
– isolated from the gut of
the surgeonfish, Red
Sea)
• The smallest
bacteria known has
0.2 µm of diameter
(Mycoplasma
pneumoniae)
Prescott, Harley & Klein, Microbiology, 5th edition,Mc GrawHill, 2002
Alguns PROCARIOTAS FAMOSOS (domínio Bacteria)
Escherichia coli
(bactéria natural do intestino;
coliforme)
Bacillus anthracis
(ANTRAX – bioterrorismo)
Endósporo
Cianobactéria
(fotossíntese oxigénica;
Fitoplankton ambientes aquáticos)
Pseudomonas sp.
(biodegradação de compostos orgânicos
poluentes no Ambiente)
Staphylococcus aureus
(Patogéneo humano; infecções em feridas,
abcessos, choque tóxico)
Lactobacillus acidophilus
(fermento lácteo do Iogurte)
Some famous Archaea
Pyrococcus furiosus
Isolated from marine sediments
near volcanos; rapid growth
at 100ºC (duplicates in ~37 min);
also resistent to radiation;
contain enzymes with tungsten.
Pfu DNA Polymerase is
comercially availabe for use
in PCR (in vitro Polymerase
Chain Reaction)
Thermoplasma acidophilum
Grows optimally at 59ºC and
pH 1.8; lacks a cell wall
→ various shapes
Methanobrevibacter smithii
dominant archaeon in the human
gut ecosystem (large bowel);
influences the digestion of
polyssacharides by consuming
end-products of bacterial fermentation
Archaeal Lipids: Innovative Materials
for Biotechnological Applications
In European Journal of Organic Chemistry, 2008
Development of biomimetic materials, drug-delivery systems, etc.
Procaryotic cell organization
Ribossomes
Cytoplasm
Nucleoid
Plasmid
Flagellum
Plasma membrane
Cell wall
Inclusion bodies
A parede celular de procariotas
(“Cell Wall”)
• É uma estrutura rigida
situada externamente à
membrana plasmática
Funções da parede celular
•
Dá forma e integridade à célula
•
Protege a célula da lise osmótica (
)
•
Contribui para a patogenicidade de algumas bactérias
•
Protege a célula de substâncias tóxicas
A parede celular e a protecção osmótica
• osmose
– movimento de água através de uma
membrana selectivamente permeável, de
soluções mais diluídas para mais
concentradas
• As células estão frequentemente em
soluções hipotónicas
[soluto]fora da célula < [soluto]dentro da célula
A parede celular protege contra a lise osmótica
•
Lise osmótica
– Pode ocorrer quando as células estão em soluções hipotónicas
([solutos]fora da célula < [solutos]dentro da célula)
- O movimento de água para o interior das células causa aumento de
volume que culmina na lise da célula devido à diferença de pressão
osmótica.
A parede celular não protege contra a plasmólise
•
Plasmólise
– Ocorre quando as células estão em soluções hipertónicas
[solutos]exterior da célula > [solutos]interior da célula
– A água sai da célula causando o encolhimento do citoplasma, que
resulta em perda de viabilidade da célula.
– Importância prática da plasmólise - Útil na conservação de
alimentos (ex: alimentos secos e geleias)
Coloração de Gram (“Gram stain”)
Gram+
Ex. Clostridium
GramEx. Escherichia coli
Taxonomic importance
Prescott, Harley & Klein, Microbiology, Mc GrawHill, 2002
As bactérias dividem-se em dois grupos com base na estrutura e
composição da parede celular: bactérias Gram positivas e Gram negativas
As bactérias Gram positivas e Gram negativas distinguem-se com base
na resposta à coloração de Gram (observação microscópica).
Prescott, Harley & Klein, Microbiology, Mc GrawHill, 2002
Coloração de Gram
Prescott, Harley & Klein, Microbiology, Mc GrawHill, 2002
Peptidoglicano (mureína)
•
É um componente muito importante da parede de bactérias Grampositivas e Gram-negativas (do domínio Bacteria)
•
Polissacárido formado por unidades repetitivas; insolúvel na água
•
A unidade repetitiva é formada por
- N-acetilglucosamina (NAG)
– ácido N-acetilmurâmico (NAM)
que aparecem alternados.
•
O ácido N-acetilmurâmico possui no grupo hidroxilo do C3 um
substituinte tetrapéptido (normalmente, constituido por 4 aminoácidos;
participa no estabelecimento de pontes entre duas cadeias -NAG-NAMNAG-NAM-).
•
São conhecidos mais do que 100 tipos diferentes de peptidoglicano
em espécies bacterianas diferentes
(variam principalmente na composição das cadeias peptídicas que estabelecem
as pontes entre cadeias de NAG e NAM)
Peptidoglycan
(mureín)
(Polissacaride layer;
very similar in
Gram-positive and
Gram negative
Bacteria)
Diversity between
bacteria
observed mainly in the
composition of the
peptide chain and
interbridge.
Staphylococcus aureus
(Gram-positive)
Prescott, Harley & Klein, Microbiology, Mc GrawHill, 2002
(►)
Gram-negativas
(ligação peptídica
directa entre as duas
cadeias)
Gram-positivas
A ligação entre duas
cadeias é feita por um
pentapéptido –
cross linking.
(P. ex. cadeia pentaglicínica
em Staphylococcus aureus)
Prescott, Harley & Klein, Microbiology, Mc GrawHill, 2002
Ligação glicosídica
β (1, 4), entre NAM e
NAG. É sensível à
acção da lisozima
Alguns dos
aminoácidos não
são encontrados
em proteínas
Prescott, Harley & Klein, Microbiology, Mc GrawHill, 2002
Lisozyme
- Present in animal secretions (tears, saliva), in the egg white, etc.
(Line of defense against bacterial infection ?!)
- Action of lisozyme (breaks the
• Hipotonic extracelullar
medium
• Isotonic extracelullar
medium
(p.ex. saline solution 0.9% NaCl,
sucrose 10%)
β1-4 glycosidic bond in peptidoglycan)
- Acção do antibiótico penicilina e derivados, p.ex. cefalosporinas,
bacitracina .
(inibem a síntese de peptidoglicano - ao nível do estabelecimento da ponte entre
péptidos)
Prescott, Harley & Klein, Microbiology, Mc GrawHill, 2002
• protoplasto – célula sem parede celular
(p.ex. Células Gram positivas - suspensas em meio isotónico ou ligeiramente
hipertónic e tratadas com penicilina, não possuem parede celular)
• esferoplasto – células sem peptidoglicano mas com parte da parede celular
(p.ex. Células Gram negativas - suspensas em meio isotónico ou ligeiramente
hipertónico e tratadas com penicilina mantém uma parte da parede celular, i.e., a
membrana externa)
. Protoplastos e esferoplastos são sensíveis a modificações da pressão osmótica do meio
extracelular (quando suspensos em meios diluídos (hipotónicos) sofrem lise em resultado da entrada
descontrolada de água).
Parede celular de bactérias Gram positivas
Prescott, Harley & Klein, Microbiology, Mc GrawHill, 2002
Contém essencialmente peptidoglicano e ácidos teicóicos
Ácidos teicóicos
• são polímeros de glicerol
ou ribitol ligados por
grupos fosfato
(Polialcoóis)
- podem ter açúcares ou
D-alanina ligados
- conferem carga negativa
à superfície celular e
ligam catiões divalentes
(p.ex. Ca2+)
Prescott, Harley & Klein, Microbiology, Mc GrawHill, 2002
Parede celular de bactérias Gram negativas
Parede
celular
Prescott, Harley & Klein, Microbiology, Mc GrawHill, 2002
Consiste numa fina camada de peptidoglicano rodeada por uma membrana externa
A membrana externa é composta por lípidos, lipoproteínas, e lipopolissacáridos (LPS)
Lipopolissacárido (LPS) nas bactérias Gram negativas
•
Consiste em três partes:
– Lípido A (hidrófobo)
– Região central polissacarídica (hidrófila)
– Polissacarídeo lateral O
(composição varia entre espécie bacterianas)
Importância do LPS
•
•
•
•
Contribui para a especificidade
antigénica da espécie bacteriana
(cadeia lateral O);
Contribui para a carga negativa da
superfície da célula (região central
polissacarídica)
Ajuda a estabilizar a estrutura da
membrana externa (lípido A)
Pode ser uma endotoxina (lípido
A) (em algumas bactérias Gram negativas
que causam infecções, p.ex. Géneros
Salmonella, Escherichia, Shigella → sintomas
no hospedeiro)
Prescott, Harley & Klein, Microbiology, Mc GrawHill, 2002
Ligações entre estruturas (Bactérias Gram negativas)
• As lipoproteínas de Braun ligam a membrana externa ao
peptidoglicano (fortemente)
• Locais de adesão
– Locais de contacto directo entre a membrana plasmática e a
membrana externa
– Algumas substâncias podem entrar e sair directamente da
células nestes locais de adesão
Outras características da membrana externa
• É relativamente permeável a compostos químicos e péptidos
devido à presença de porinas
– As porinas formam canais através dos quais pequenas
moléculas (600-700 daltons) são capazes de passar
Estruture of Pseudopeptidoglycan
(Ex. em Methanobacterium species)
Em algumas bactérias do domínio
Archaea, o componente principal da
parede celular é o
pseudopeptidoglicano.
- os açúcares da unidade repetitiva
são a
N-acetilglucosamina e o ácido Nacetiltalosaminurónico (não possui ácido murâmico)
- as ligações glicosídicas são do tipo β-1,3 (não são
sensíveis à acção da lisozima)
- a ponte entre duas cadeias é feita por um
resíduo de glutamato
Prescott, Harley & Klein, Microbiology, Mc GrawHill, 2002
Em outras espécies Archaea,
a parede celular consiste em
camadas de polissacáridos,
glicoproteinas ou proteínas.
Tipo de parede celular mais
comum em Archaea - camada
superficial paracristalina (“Slayer”), composta por
subunidades de proteínas ou
glicoproteínas; tem simetria
cristalina (hexagonal,
tetragonal, etc.).
Também presente em algumas bactérias
do domínio Bacteria.
Espaço
Periplasmático
•
É o espaço entre a membrana plasmática e a parede celular (em bactérias grampositivas) ou entre a membrana plasmática e a membrana externa (em bactérias
gram-negativas)
•
Periplasma - substância que ocupa o espaço periplasmático
ENZIMAS PERIPLASMÁTICAS
- Encontradas no periplasma de bactérias gram-negativas
- Funções principais
- Aquisição de nutrientes
- Síntese de peptidoglicano
- Modificação de compostos tóxicos
O citoplasma
• Encontra-se entre a
membrana e o
nucleoide
• Contém ribossomas
e corpos de
inclusão
Corpos de inclusão
•
grânulos de materiais orgânicos ou inorgânicos produzidos
pela célula;
•
frequentemente usados como materiais de reserva
energética ou reserva de materiais estruturais.
•
quantidade depende do estado nutricional da célula.
Exemplos de corpos de inclusão orgânicos
Grânulos de Glicogénio (reserva de Carbono e energia)
- Polímero de glucose (ex: bactérias E. coli, Salmonella, Bacillus; também em
fungos)
Grânulos de Amido (reserva de Carbono e energia)
- Polímero de glucose (amilose, amilopectina) ex: géneros Clostridium,Acetobacter
Grânulações lipídicas de poli-β-hidroxibutirato
(PHB) (reserva de Carbono e energia)
– polímero de β-hidroxibutirato
(ex: géneros Alcaligenes, Bacillus)
Corpos de inclusão inorgânicos
• Grânulos
de polifosfato
– São polímeros lineares de ortofosfato também chamados grânulos de
volutina ( na espécie ex: Spirillum volutens)
– Constituem reserva de fósforo para a síntese de ácidos nucleicos e
fosfolípidos
• Grânulos de enxofre
- material de reserva energética em bactérias que
oxidam compostos de enxofre reduzidos (como o
H2S) e acumulam temporariamente S0
(no citoplasma e/ou no espaço periplasmático)
Deposição de grânulos de
enxofre no interior de células
de Chromatium
•Magnetossomas
(em algumas espécies de
bactérias aquáticas)
– contêm ferro sob a forma de magnetite
(Fe3O4)
– são usados para orientar as células no
campo magnético terrestre (magnetotaxia).
Migração de bacterias em onda, quando expostas a
campo magnético
Magnetossomas isolados
(morfologia depende da espécie)
magnetossomas
Prescott, Harley & Klein, Microbiology, Mc GrawHill, 2002
Aquaspirillum magnetotacticum
Vacúolos gasosos
Presentes em bactérias
aquáticas (ex: cianobactérias, bactérias
púrpura e verdes e algumas bactérias aquáticas não-fotossintéticas; em
lagos)
Permitem às células regular a profundidade a que vivem numa
coluna de água (conferem capacidade para flutuar consoante as necessidades de
luminosidade óptimas para fotossíntese)
Heterociste (site of N2 fixation)
P. ex. Anabena (cyanobacteria)
Gas vacuoles
(clusters of hollow
structures made of protein
and filled with gas)
Prescott, Harley & Klein, Microbiology, Mc GrawHill, 2002
Ribossomas
•
São estruturas complexas constituídas por proteínas e RNA
•
É o local onde se realiza a síntese de proteínas
•
São mais pequenos que os ribossomas de eucariotas
– Ribossomas de procariotas ⇒ 70S (sub-unidades 50S e 30S)
(Ribossomas de eucariotas ⇒ 80S)
• S = unidade Svedburg (sedimentação)
NUCLEÓIDE
É uma região com forma irregular
• É onde se localiza o cromossoma (molécula de DNA em cadeia
dupla, geralmente, em conformação circular fechada) - normalmente,
1 / célula
O cromossoma procariotico
•É uma molécula de DNA cadeia
dupla e geralmente circular
•Tamanho variável entre 0,5
e 10 Mpb (pb – pares de bases)
•Em muitos casos, uma só cópia
por célula
•90% do genoma de E. coli
codifica para proteínas
Plasmídeos
• São pequenas moléculas de DNA cadeia dupla
• Existem e replicam independentemente do cromossoma
• Não são necessários para o crescimento e reprodução
da célula
• Podem conter genes que conferem vantagem selectiva
às células que os albergam
(ex: resistência a drogas; transformação e/ou degradação
de compostos tóxicos)
Componentes exteriores à parede celular
“CAPSULE AND
SLIME LAYERS”
Cápsula
- Geralmente formada por polissacáridos; ou por proteínas, em alguns casos
- É dificilmente removida da célula;
- É observável no microscópio óptico, por coloração negativa.
FUNÇÕES:
- favorece a adesão a superfícies (ex. infecção de tecidos por
bactérias patogénicas; formação de biofilmes na Natureza);
- protege a bactéria de condições ambientais desfavoráveis
como a desidratação; protecção do stresse osmótico;
- protege a bactéria das defesas do organismo hospedeiro que
infecta (p.ex. da fagocitose)
- protege a bactéria de infecções por virus
“PILLI AND FIMBRIAE”
Virus-covered pillus
(microscopia electrónica de transmissão)
FIMBRIAS
- Apêndices pequenos e finos, constituidos
por proteínas (até 1000 / célula);
- Medeiam a adesão a superfícies (p.ex.
reconhecem receptores nas células dos
tecidos infectados; também, na
formação de biofilmes)
PILLI
- Semelhantes às fimbrias, mas mais grossos
e menos numerosos (1-10/célula);
- Necessários para a conjugação entre bactérias
(Transferência horizontal de plasmídeos e partes de
cromossomas entre bactérias)
Flagelo (“Flagellum”; plural Flagella)
• 3 partes: - filamento – cilindro rígido e oco, composto por sub-unidades proteicas - flagelina;
•
- gancho – liga o filamento ao corpo basal;
•
- corpo basal – série de anéis que provocam o movimento flagelar
(funciona como motor)
Em bactérias Gram negativas
Em bactérias Gram positivas
Prescott, Harley & Klein, Microbiology, Mc GrawHill, 2002
Possible mechanism for
Flagellar movement
In Gram negative bacteria
(“proton turbine” model)
Mot proteins function as the flagellar motor
Energy source: proton-motive force
~ 1000 protons / single rotation of flagellum (?)
Esquema da construção do filamento do flagelo numa bactéria
Gram negativa
Prescott, Harley & Klein, Microbiology, Mc GrawHill, 2002
FLAGELOS – permitem a locomoção das células
Monótriquico e polar
(1 flagelo numa extremidade da célula )
lofotríquico
Peritríquico
(Vários flagelos à volta de
toda a superfície da célula)
lofotríquico
(tufos de vários flagelos numa ou ambas as extremidades da célula)
Prescott, Harley & Klein, Microbiology, Mc GrawHill, 2002
Movimento
Flagelar
O flagelo roda como
uma ventoinha,
no sentido ou
contra o
movimento dos
ponteiros do relógio
Prescott, Harley & Klein, Microbiology, Mc GrawHill, 2002
Quimiotaxia (“Chemotaxis”)
•
Movimento das células na direção de um
composto químico atractivo ou para longe
de um repelente
•
A concentração destes compostos químicos é
detectada por quimioreceptores existentes na
superfície das células
•
É complexo mas rápido
– As respostas ocorrem em
menos de 20 milisegundos
Phototaxia (“Phototaxis”)
• Movimento das células na direção da luz
(em microrganismos fototróficos)
O ENDÓSPORO BACTERIANO
- É produzido por certas bactérias Gram positivas (p.ex. dos géneros Bacillus,
Clostridium, Sporosarcina, Sporolactobacillus, etc.) quando sujeitas a condições
ambientais extremas (p.ex. ausência de nutrientes, desidratação);
- É uma estrutura dormente
- É resistente a agressões ambientais (calor, radiação Ultra-Violeta,
desinfectantes químicos, desidratação); ajuda à sobrevivência da espécie
bacteriana em condições ambientais adversas. Não tem actividade metabólica.
Esporulação
(quando fonte de C ou N se esgota)
Libertação do esporo maduro
Geralmente, 10-15 horas após início
da esporulação
Formação de endósporo em Clostridium pascui
(microfotografia obtida por Microscopia de contraste de fase)
FORMA E LOCALIZAÇÃO NA CÉLULA - tem valor taxonómico
Terminal
Central
Prescott, Harley & Klein, Microbiology, Mc GrawHill, 2002
Sub-terminal
ESPORO MADURO
(Envólucro do endosporo - composto por várias camadas de
Exosporium
proteínas; impermeável e responsável
pela resistência do endosporo à entrada
de compostos químicos).
(camadas de peptidoglicano intercruzadas)
Núcleo do endosporo (“core or spore protoplast”)
contém algumas estruturas celulares da célula vegetativa
(p.ex. ribossomas e ácidos nucleicos.)
Constituinte principal – dipicolinato
de cálcio
Estrutura do ácido dipicolinico
Dipicolinato de cálcio
complexo formado entre o
ácido dipicolínico e iões Ca2+
(BrocK – biology of microorganisms,Prentice-Hall)
O que torna o endósporo tão resistente?
• Presença de cálcio complexado com ácido dipicolínico intercalado
nas bases do DNA, estabilizando-o;
• Desidratação do interior do endósporo (somente 10-15% H2O),
inactivando enzimas (ausência de actividade metabólica)
• Camada espessa a proteger o interior do endósporo
• Rico em enzimas de reparação de DNA
• Contém muitas proteínas de pequena dimensão (“small acidsoluble proteíns”, SASPs) que:
- protegem o DNA da radiação UV, secagem e calor
(DNA em forma mais compactada);
- podem funcionar como fonte de C e energia para a nova célula
vegetativa que virá a resultar da germinação do endosporo.
ESPOROGÉNESE
- Começa normalmente
quando o crescimento da
célula vegetativa pára
devido a falta de
nutrientes (normalmente,
falta de fonte de C ou de N);
- Processo complexo;
- demora entre 8 e15 h,
dependendo da
bactéria em causa
Produção de SASPs
e ácido dipicolinico
Incorporação de Ca2+
Prescott, Harley & Klein, Microbiology, Mc GrawHill, 2002
em Bacillus subtilis
GERMINAÇÃO DOS ENDOSPOROS
Germinação:
- endosporo absorve água e incha
- ácido dipicolínico é excretado
- inicia-se a síntese de macromoléculas
- inicia-se actividade enzimática e actividade metabólica
- protopasto do endósporo sintetiza componentes novos, emerge
do envólucro do endosporo e entra no ciclo de vida vegetativo.
Activação da germinação de endósporos
- indução da germinação;
normalmente, por acção do calor
(p.ex. 60ºC ou em água em ebulição
durante 5 min – dependendo da
espécie bacteriana)
Prescott, Harley & Klein, Microbiology, Mc GrawHill, 2002
Germinação é inibida em
ambientes ácidos
(aplicação na
conservação de alimentos)
Prescott, Harley & Klein, Microbiology, Mc GrawHill, 2002