BACTÉRIAS DO SOLO E ASSOCIADAS A PLANTAS DE COUVE

BACTÉRIAS DO SOLO E ASSOCIADAS A
PLANTAS DE COUVE – FLOR: FIXAÇÃO DE
NITROGÊNIO E SOLUBILIZAÇÃO DE FOSFATO
Andreza Raquel Barbosa de Farias1, Júlia Kuklinsky-Sobral2, César Auguste Badji2, Fernando José Freire3,
Michelangelo de Oliveira Silva4, Pedro Avelino Maia de Andrade5, Luana Lira Cadete5, Luiz Aníbal da
Silva Filho5 & Maria das Dores da Silva6

Introdução
Com o avanço da tecnologia e o crescimento da
demanda populacional tem-se cada vez mais observado
o potencial de bactérias associadas às plantas para
controle de pragas e doenças, promovendo também o
crescimento vegetal, o que torna indispensável à
procura por conhecimento nesta área bem como as
possíveis interações que ocorrem entre estes
microrganismos e o vegetal, para que se possam utilizar
todos os benefícios destes microrganismos na
agricultura, na indústria e em processos que promovam
o avanço biotecnológico [1].
Uma destas propriedades é a fixação biológica de
nitrogênio, sendo este quantitativamente o elemento
mais importante para a agricultura, pelo fato de ser
limitante de crescimento vegetal. O nitrogênio
atmosférico (N2) está presente na atmosfera, compondo
cerca de 80%, entretanto sua absorção para os vegetais
só pode ser feita na forma de Amônia (NH3) e Nitrato
(NO3) sendo estes compostos solúveis [2].
Outra propriedade não menos importante é a
solubilização de fosfato inorgânico pelas bactérias
associadas às plantas, isto porque apesar de diversas
bactérias com esta característica estarem presentes no
solo, seu número não é suficiente para competir com
outras bactérias de diferentes funções estabelecidas, o
que limita o aumento substancial do crescimento
vegetal. O uso de bactérias solubilizadoras de fosfato
como inoculantes é, portanto, uma alternativa possível
para o aumento do desenvolvimento resultando uma
melhor produção vegetal [3, 4].
A couve-flor (Brassica oleracea) é uma planta de
cultivo bienal, mas que, entretanto, é cultivada como
anual [5]. Esta é uma espécie que apresenta um bom
desenvolvimento vegetativo quando cultivada em
temperaturas entre 150C e 180C, embora seus cultivares
de Inverno sejam resistentes ao frio [6]. Apresenta fácil
adaptação em solos com boa capacidade de retenção de
água, além de tratar-se de uma espécie razoavelmente
resistente à salinidade do solo. É muito exigente em
matéria orgânica e o pH do solo deve estar entre 6,5 e
7,5 [7]. Esta cultura, como tantas outras, precisa de
condições apropriadas de solo para se desenvolver.
Diante do exposto, o presente trabalho teve como
objetivos: isolar e selecionar bactérias associadas ao
solo e a rizosfera de área cultivado com plantas de
couve–flor com capacidade de fixar nitrogênio e
solubilizar fosfato inorgânico.
Material e métodos
A. Amostras de solo e rizosfera
Bactérias do solo e da rizosfera foram isoladas de
amostras de área cultivada com plantas de couve-flor,
na Propriedade Rural Açude Novo, localizada no
município de Garanhuns, PE. As amostras de solo,
coletadas na profundidade de 0-20cm, e de rizosfera,
coletadas próximas às raízes das plantas, foram levadas
ao Laboratório de Genética e Biotecnologia
Microbiana (LGBM) da Unidade Acadêmica de
Garanhuns (UAG/UFRPE) para processamento das
análises.
B. Isolamento das bactérias
Para o isolamento bacteriano, cerca de 5g de cada
amostra de solo e de rizosfera foram transferidos para
frascos Erlenmeyer (250ml) contendo 25g de pérolas
de vidro (0,1cm de diâmetro) e 50ml de tampão fosfato
salino (Phosphate Buffered Saline – PBS: 1,44g/l de
Na2HPO4; 0,24g/l de KH2PO4; 0,20g/l de KCl; 8,00g/l
de NaCl; pH 7,4). Estes frascos foram mantidos sob
agitação (90rpm) a 280C por 1h. Em seguida, foram
________________
1. Aluna de Graduação em Agronomia da Unidade Acadêmica de Garanhuns, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Av. Bom Pastor, s/n, Boa
Vista, Garanhuns, PE, CEP 55296-901. E-mail: [email protected]
2. Professores Adjuntos da Unidade Acadêmica de Garanhuns, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Av. Bom Pastor, s/n, Boa Vista,
Garanhuns, PE, CEP 55296-901.
3. Professor Adjunto do Departamento de Agronomia, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Rua Dom Manuel de Medeiros, Dois Irmãos,
Recife, PE, CEP 52171-900.
4. Doutorando do PPG em Ciência do Solo, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Rua Dom Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos, Recife,
PE, CEP 52171-900.
5. Alunos de Graduação em Agronomia da Unidade Acadêmica de Garanhuns, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Av. Bom Pastor, s/n,
Boa Vista, Garanhuns, PE, CEP 55296-901.
6. Aluna de Graduação em Zootecnia da Unidade Acadêmica de Garanhuns, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Av. Bom Pastor, s/n, Boa
Vista, Garanhuns, PE, CEP 55296-901.
Apoio financeiro: CNPq e FACEPE.
realizadas diluições seriadas em tampão PBS e 100µl
foram inoculados em meio de cultura King B [8],
incubados a 280C e avaliadas após 3, 8 e 14 dias.
A população bacteriana por grama de solo fresco
(UFC/g SF) foi estimada pela contagem de colônias
cultivadas em meio King B. Colônias características de
cada tipo morfológico foram repicadas das placas de
isolamento, purificadas pela técnica de esgotamento e
mantidas a -20oC, em meio TSA 10% (Tripcase Soy
Agar) líquido suplementado com 20% de glicerol.
C. Teste de fixação biológica de nitrogênio
Para identificação das bactérias fixadoras de
nitrogênio foi realizado um experimento segundo
Dobereiner et al. [9], no qual as bactérias foram
inoculadas em meio NFb semi-sólido [5g/l da ácido
málico; 0,5g/l de K2HPO4; 0,2g/l de MgSO4.7H2O;
0,1g/l de NaCl; 0,01g/l de CaCl2.2H2O; 4ml/l de
Fe.EDTA (solução 1,64%); 2ml/l de azul de
bromotimol (0,5 %); 2ml/l de solução de
micronutrientes (0,2g/l de Na2MoO4.2H2O; 0,235g/l de
MnSO4.H2O; 0,28g/l de H3BO3; 0,008g/l de
CuSO4.5H2O); 1,75g/l da agar; pH 6,8], e incubadas a
280C por 8 dias. Os experimentos foram realizados em
triplicatas e a identificação de bactérias fixadoras de
nitrogênio in vitro foi observada pela formação de um
halo horizontal de crescimento no interior do meio de
cultura, além da alteração da cor do.
D. Teste de solubilização de fosfato inorgânico
Para a seleção de bactérias solubilizadoras de
fosfato foi realizada segundo Verma et al. [10], com
algumas modificações. As bactérias foram inoculadas
em placas de Petri contendo meio sólido com fosfato
insolúvel (composição: 10g/l de glicose; 5g/l de
NH4Cl; 1g/l de NaCl; 1g/l de MgSO4.7H2O; 4g/l de
CaHPO4; 15g/l de agar; pH 7,2). As placas foram
incubadas a 28°C por 72h e, em seguida, foram
realizadas as leituras. Os experimentos foram
realizados em triplicatas e a presença de um halo claro
em torno da colônia indicou a solubilização do fosfato.
Resultados e discussão
A densidade total da comunidade bacteriana do solo
e da rizosfera não apresentaram diferenças
significativas, variando em torno de 109 a 1011 UFC/g
SF (Fig.1A). Este resultado não apresenta o efeito
risoférico, ou seja, maior densidade populacional
bacteriana na região da rizosfera devido à exsudação
radicular de compostos orgânicos [11]. Durante o
experimento de isolamento, 37 bactérias, 12 da
rizosfera e 24 do solo, foram selecionadas para
avaliação quanto à capacidade de fixar nitrogênio e
solubilizar fosfato.
Foram observados resultados satisfatórios para o
teste de fixação de nitrogênio, pois aquelas avaliadas
como positiva formaram um halo horizontal de
crescimento no interior da cultura, além de apresentar
alteração na cor do meio de cultura que era
inicialmente verde, mas que no decorrer do
experimento foi apresentando uma coloração azulada
(Fig.1B). Das bactérias da rizosfera, 50% foram
capazes de fixar nitrogênio, enquanto que apenas 24%
das linhagens isoladas do solo foram positivas (Fig.
1C).
Para o teste de solubilização de fosfato, foi possível
observar halos de solubilização bem claros e definidos
(Fig. 1D) e, mais uma vez, as bactérias oriundas da
rizosfera apresentaram maior freqüência de linhagens
solubilizadoras, 33% em comparação com apenas 12%
de bactérias positivas oriundas do solo. Logo, os
resultados obtidos revelam que pode haver maior
ocorrência de bactérias fixadoras de nitrogênio e
solubilizadoras de fosfato inorgânico em solo mais
próximo das plantas, como a rizosfera, ou que há uma
migração destas bactérias para a região mais próxima
da planta. Portanto, conclui-se que as bactérias
analisadas apresentam potencial aplicação para
promoção de crescimento vegetal. Contudo, é
importante ressaltar a importância e necessidade de
maior exploração destas linhagens.
Referências
[1] ROSENBLUETH, M.; MARTINEZ-ROMERO, E. 2006.
Bacterial endophytes and their interactions with hosts.
Molecular Plant and Microorganisms Interactions, 8: 827-837.
[2] BODDEY,
R.M.;
URQUIAGA,
S.;
ASSIS,
R.L.;
DOBEREINER, J. 1992. Fixação biológica de nitrogênio por
bactérias associadas à cana-de-açúcar. Comunicado Técnico, no.
6. EMBRAPA – CNPBS. 1-5p.
[3] RODRIGUEZ, H.; FRAGA, R. 1999. Phosphate solubilizing
bacteria and their role in plant growth promotion. Biotechnology
Advances, v.17, p. 319-339.
[4] GYANESWAR, P.; KUMAR, G.N.; PAREKH, L.J.; POOPLE,
P.S. 2002. Role of soil microorganisms in improving P nutrition
of plants. Plant and Soil, v245, p.83-93.
[5] CERMEÑO, Z. S. 1988. Prontuário do Horticultor.Litexa
Editora. Lisboa.
[6] MAROTO, J. V. 1986. Horticultura Herbacea Especial. 2ª
Edição. Ediciones Mundi-Prensa, Madrid.
[7] BIGGS, T. 1980. Culturas Hortícolas. 2ª edição. Colecção
EUROAGRO. Publicações Europa América, Lisboa.
[8] ARAÚJO, W.L.; LIMA, A.O.S.; AZEVEDO, J.L.; MARCON,
J.; KUKLINSKY-SOBRAL, J.; LACAVA, P.T. 2002. Manual:
Isolamento de microrganismos endofíticos. Piracicaba, SP:
CALQ, 86p.
[9] DOBEREINER, J.; BALDANI, V.L.D.; BALDANI, J.I. 1995.
Como isolar e identificar bactérias diazotróficas de plantas
não-leguminosas. – Brasília: EMBRAPA – SPI: Itaguaí, RJ:
EMBRAPA-CNPAB, 60p.
[10]VERMA, S.C.; LADHA, J.K.; TRIPATHI, A.K. 2001.
Evaluation of plant growth promoting and colonization ability of
endophytic diazotrophs from deep water rice. Journal of
Biotechnology, v.91, p.127-141.
[11]REIS, M.R.; SILVA, A.A.; GUIMARÃES, A.A.; COSTA,
M.D.; MASSENSSINI, A.M.; FERREIRA, E.A. 2008. Ação de
herbicidas sobre microrganismos solubilizadores de fosfato
inorgânico em solo rizosférico de cana-de-açúcar. Planta
Daninha, Viçosa-MG, v. 26, n. 2, p. 333-341.
Figura 1. A) Densidade populacional total da comunidade bacteriana da rizosfera e de solo cultivado com plantas de couve-flor. As
barras indicam o desvio padrão das médias resultantes da avaliação de 4 repetições; B) Reação positiva para o teste de fixação
biológica de nitrogênio; C) Freqüência relativa (%) de bactérias fixadoras de nitrogênio e solubilizadoras de fosfato inorgânico
isoladas da rizosfera e do solo cultivado com plantas de couve-flor; D) Avaliação do teste de solubilização de fosfato inorgânico, as
setas indicam os halos de solubilização.