Flexibilidade metabólica de bactérias isoladas de raiz de Sorghum

Flexibilidade metabólica de bactérias isoladas de raiz de Sorghum
bicolor L. Moench: capacidade no uso de diferentes fontes de carbono
Larissa B. da Silva*¹ (PG), Lucas L. da Silva¹ (PG), Enderson P. B. Ferreira 2 (PQ), Karina F. D. N.
Santos1 (PQ), Plínio L. F. Naves1 (PQ), Claudia C. G. Martin-Didonet1 (PQ).
¹Br 153, Nº3105 Fazenda Barreiro do Meio, Câmpus de Ciências Exatas e Tecnológicas – CCET,
Anápolis, GO. (PG) [email protected]
²Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Arroz e Feijão, Santo Antônio de Goiás, GO. (PQ)
Resumo: A diferenciação fenotípica está entre as principais ferramentas utilizadas para a
caracterização de bactérias endofíticas. A fim de elucidar a flexibilidade do uso de 9 diferentes fontes
de carbono, o presente trabalho avaliou, através de espectrofotometria, a capacidade de crescimento
de 25 amostras de bactérias endofíticas isoladas da raiz de sorgo. A partir desses dados foi gerada
uma matriz binária UPGMA e construído um dendograma pelo coeficiente de Jaccard. As análises
dos resultados mostraram a formação de 10 grupos, sendo que 15 isolados foram fisiologicamente
semelhantes às bactérias de referência: Azospirillum brasilense, Rhizobium tropici, Mesorhizobium
mediterraneum e Gluconacetobacter diazotrophicus. Os demais isolados apresentaram alta
diversidade metabólica.
Palavras-chave: Metabolismo bacteriano, Micro-organismos endofíticos e Fonte de carbono.
Introdução
Estudos tem evidenciado a ocorrência de interação mutualística entre
bactérias e plantas visando elucidar o papel biológico desses micro-organismos
(CASTRO, 2011). Esses micro-organismos desempenham importante papel nos
ciclos biogeoquímicos, funções biorremediadoras, capacidade de conversão de
energia e síntese de uma infinidade de produtos. Algumas bactérias associadas a
plantas são endofíticas e se destacam atualmente como uma fonte alternativa em
potencial para obtenção de produtos e processos biológicos (VIDEIRA, ARAÚJO e
BALDANI, 2007).
A busca por novos micro-organismos associativos a plantas, como fontes de
bioprodutos, requer a caracterização desses isolados. Assim, através da
fenotipagem é possível avaliar as particularidades e semelhanças morfológicas,
bioquímicas e fisiológicas dos isolados (PONTES et al., 2007; CHEN et al., 2008;
PENG et al., 2008).
Dentre os aspectos fisiológicos e bioquímicos comumente avaliados estão
inclusas informações de cultivo e adaptabilidade metabólica como o crescimento em
diferentes temperaturas, pH, concentrações de sal, atividades enzimáticas, e ainda a
capacidade no uso de diferentes fontes de carbono (VIDEIRA, ARAÚJO e BALDANI,
2007). Este último teste pode revelar o potencial do isolado bacteriano para utilizar
carbono presente em moléculas com diferenças em sua natureza química. Essa
flexibilidade metabólica caracteriza uma alta capacidade de adaptação, sendo esta
uma importante vantagem ecológica para os micro-organismos (LEITE, 2011).
O objetivo do presente trabalho foi verificar a capacidade de crescimento de
25 amostras de bactérias isoladas de sorgo (Sorghum bicolor L. Moench)
submetidas a meios de cultura contendo 9 diferentes fontes de carbono, utilizando
como referência as estirpes padrões FP2 (Azospirillum brasilense), Br322 e Br520
(Rhizobium
tropici),
Br522
(Mesorhizobium
mediterraneum)
e
Pal5
(Gluconacetobacter diazotrophicus),
Material e Métodos
Material biológico: Para avaliar a capacidade de metabolizar diferentes
fontes de carbono 25 bactérias endofíticas isoladas de sorgo da coleção de microorganismos do Laboratório de Bioquímica de Micro-organismos da CCET/UEG foram
submetidas ao cultivo, sendo utilizadas como referência as estirpes padrões FP2 (A.
brasilense), Br322 e Br520 (R. tropici), Br522 (M. mediterraneum) e Pal5 (G.
diazotrophicus), cedidas gentilmente pela Universidade Federal do Paraná.
Cultivo de micro-organismos: As bactérias foram crescidas em caldo
Batata sob agitação por 24h, e a partir daí utilizadas como pré-inóculo. Para o teste
de fontes de carbono (ácido maleico, ác. málico, ác. succínico, frutose, manitol,
manose, sacarose, sorbitol e trealose) 10 mM de cada fonte foi adicionada em caldo
mínimo (HUNGRIA et al., 1994). Os testes foram realizados em microplacas de 96
poços (deep well plate)) utilizando 1mL de meio em cada poço. Foi utilizado para o
teste 50μL de cada pré-inóculo seguido de incubação sob agitação (130 rpm) a 37°c
por 72h. Após esse período as amostras foram avaliadas por espectrofotometria
(Epoch®) no comprimento de onda de 600 nm a fim de verificar o crescimento
bacteriano. Todos os ensaios foram realizados em triplicatas.
Análise: Obtidas as médias de leitura (D.O. 600 nm), foram adotados limites
de leitura para elaboração de uma matriz binária para avalição de similaridade entre
as bactérias estudadas. Fazendo uso do software NTSYSpc (versão 2.02i) para
agrupamentos tipo UPGMA (Unweighted Pair Group with Arithmetic Means),
adotando o coeficiente Jaccard (J) foi gerado um dendrograma através do qual
foram determinadas as similaridades de utilização de fontes de carbono entre os
isolados e as estirpes de referência (RODRIGUES et al., 2006).
Resultados e Discussão
A maioria das bactérias isoladas foram capazes de crescer nas diferentes
fontes de carbono testadas. Assim, é possível constatar que as bactérias
apresentaram grande diversidade metabólica. A partir de 25 isolados bacterianos
de sorgo e de 5 bactérias de referência, 86,6% dessas bactérias (30 no total)
apresentaram 80% de similaridade fisiológica na utilização das fontes de carbono
(Figura 1).
No dendograma (Figura 1) é possível observar a formação de dez grupos,
sendo G2 o maior com 11 isolados que apresentaram similaridade de 100% com a
estirpe padrão Br522 (M. mediterraneum). O segundo maior grupo (G5), com 4
isolados, foram similares em 100% com três estirpes padrões: as bactérias FPp2 (A.
brasilense), Br322 (R. tropici), e Pal5 (G. diazotrophicus). A menor similaridade (66%)
observada neste estudo foi para o isolado NS23, indicando uma distância evolutiva
fisiológica com as demais bactérias estudadas (Figura 1).
Figura 1: Dendrograma gerado no software NTSYSpc (versão 2.02i) definido pelo método de
agrupamento UPGMA utilizando a coeficiente de Jaccard com base na utilização de diferentes fontes
de carbono (ácido maleico, ác. málico, ác. succínico, frutose, manitol, manose, sacarose, sorbitol e
trealose).
A fonte de carbono mais restritiva ao crescimento das bactérias testadas foi
o ácido maleico. Apenas as amostras NS23 (G10), NS32 e YMS54 (G3) foram
capazes de utilizar este como fonte de carbono para seu crescimento, indicando
baixa ocorrência nas bactérias estudadas da maquinaria metabólica necessária a
sua utilização. O mesmo comportamento foi observado por Lima (2013) na
caracterização de isolados endofíticos de milho.
Alguns estudos relatam uma restrição no crescimento de bactérias quando
submetidas a meios cujas fontes de carbono sejam de natureza química ácida
(SRIDHAR et al., 2005; FERNANDES JÚNIOR et al., 2009). Berges et al. (2009)
aponta que rizóbios normalmente apresentam baixa capacidade para metabolizar
compostos ácidos, diferentemente do observado para as bactérias do gênero Br322
e Br520 (R. tropici), Br522 (M. mediterraneum) utilizadas no presente trabalho. De
acordo com Ikeda (2010), a capacidade de crescimento intrínseco em diferentes
fontes de carbono sugere que a maioria dos isolados de sorgo apresentaram grande
plasticidade fisiológica no uso de fontes de carbono.
Conclusão
Pela caracterização fenotípica de isolados bacterianos de raiz de sorgo, foi
possível observar uma flexibilidade no metabolismo de carbono, indicando que
esses isolados apresentam uma alta capacidade de adaptação ambiental.
Agradecimentos
Ao fomento do Programa Institucional da Universidade Estadual de Goiás
(UEG), pela bolsa em Pesquisa de Pós-graduação nível mestrado Stricto Sensu do
Programa de Mestrado em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde. Ao Instituto
Nacional de Ciência e Tecnologia (INCT-CNPq) em Fixação Biológica de Nitrogênio,
pelo financiamento do projeto.
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