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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
RESISTÊNCIA DA SOJA À FERRUGEM ASIÁTICA E AO OÍDIO:
HERANÇA DE CARACTERES QUALI-QUANTITATIVOS E
MAPEAMENTO GENÉTICO
Lizandra Lucy Catelli
Orientador: Prof. Dr. Antônio Orlando Di Mauro
Co-orientadores: Dr. Carlos Alberto Arrabal Arias
Dr. Ricardo Vilela Abdelnoor
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e
Veterinárias - Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das
exigências para a obtenção do título de Doutor em Agronomia
(Genética e Melhoramento de Plantas).
JABOTICABAL – SÃO PAULO - BRASIL
Fevereiro de 2009
Livros Grátis
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DADOS CURRICULARES DO AUTOR
LIZANDRA LUCY CATELLI - nascida em Alvorada do Sul-PR, em 23 de abril de
1978. Possui graduação em Ciências Biológicas pela Universidade Filadélfia de Londrina,
em Londrina-PR (conclusão em 2003) e mestrado em Genética e Melhoramento de
Plantas pela Universidade Estadual de Londrina - UEL (conclusão em 2005). Atualmente
é integrante do projeto de pesquisa em melhoramento e diversidade genética de soja para
resistência a ferrugem asiática, na Estação Experimental Boliche, em Guayaquil no
Equador.
iii
Dedico
Vó Germana,
exemplo de vida e amor incondicional
iv
AGRADECIMENTOS
A Deus, essência da minha vida pelo talento e direção a mim concedido para realização
deste trabalho.
Aos Drs. Antonio Orlando Di Mauro, Carlos Alberto Arrabal Arias e Ricardo Vilela
Abdelnoor, pela orientação e oportunidade de realizar o trabalho.
Aos pesquisadores Francismar C. Marcelino, Naoki Yamanaka, Elizeu Binneck, Álvaro
Manoel de Almeida, Janete Apparecida D. Senna e Ivan Schuster, pelas valiosas
sugestões no desenvolvimento do trabalho.
Aos membros da banca examinadora Drs. Franscismar Correa Marcelino, Eduardo
Antônio Gavioli, Rinaldo Cesar de Paula, Maria Aparecida Pessôa da Cruz Centurion,
pelas valiosas correções e sugestões para aperfeiçoamento do trabalho.
A Paula Camargo por toda a ajuda e dedicação durante o trabalho mostrando-se a cada
dia uma grande profissional.
A Michelle Rincão, Amanda Rusiska, Luana Gonçalves de Souza, Barbara Panoff,
Adriana Polizel, por todo apoio nas avaliações e no decorrer dos experimentos.
A Renata Fuganti, Danielle Cristina Gregório, Maria Aparecida dos Santos, Noélle
Giacomini Torres pelas correções da tese e as excelentes sugestões no trabalho.
A Renata Stolf pela amizade e pelas experiências vividas durante o percurso do
doutorado.
v
A Selma Pereira, Amanda Paiva, João Victor, André Passionoto, Maria Cecília, Rodrigo
Pereira, Gustavo, Salvador, Guto, Joyce, Glória, Cibelle, Larissa e Fabiana pela
convivência e incentivo no decorrer do doutorado.
Aos funcionários do laboratório de Biotecnologia Vegetal e Bioinformática, Silvana Marin,
César Silveira, Márcia e Vera Pierotti, pelos ensinamentos, conselhos e valiosa amizade.
A todos amigos do Laboratório de Biotecnologia, que de alguma maneira contribuíram
para a realização do trabalho.
Aos amigos de Jaboticabal, em especial, Daniela Sarti, Dani Gaucha, Marcelo Marchi pela
excelente convivência.
Aos amigos Maria Claudia, Érica Perna, Leandro, José, Márcia, Higo, Claudio, Viviane,
Rodrigo, Angélica, Magda, Luciana e Érica Brito, por entenderem minha ausência e
apoiarem em todos os passos da minha vida.
A Alexander Davalos, sempre me apoiando e ajudando com muito amor e paciência.
A minha família, presente em todos os momentos da minha vida com amor, apoio e
incentivo.
A UNESP-FCAV, FINEP, CAPES e a Embrapa Soja pelo apoio financeiro, concessão da
bolsa e disponibilização de estrutura física para a realização deste trabalho.
E também, a todos aqueles que de alguma forma contribuíram para o desenvolvimento
deste trabalho.
vi
SUMÁRIO
Página
LISTA DE ABREVIATURAS .............................................................................................. viii
RESUMO............................................................................................................................. x
SUMMARY ..........................................................................................................................xi
CAPITULO 1 - CONSIDERAÇÔES GERAIS ...................................................................... 1
1 INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 1
2 REVISÃO DE LITERATURA ......................................................................................... 3
2.1 Soja ......................................................................................................................... 3
2.2 Doenças que ocorrem na soja ................................................................................. 4
2.2.1 Ferrugem asiática da soja (Phakopsora pachyrhizi) ............................................. 5
2.2.1.1 Agente causador ............................................................................................... 5
2.2.1.2 Histórico da doença ........................................................................................... 5
2.2.1.3 Epidemiologia .................................................................................................... 6
2.2.1.4 Sintomatologia ................................................................................................... 7
2.2.1.5 Perdas ............................................................................................................... 8
2.2.1.6 Controle da doença ........................................................................................... 9
2.2.1.7 Genótipos resistentes ...................................................................................... 10
2.2.2 Oídio da soja (Erysiphe diffusa sin. Microsphaera diffusa) ................................. 12
2.2.2.1 Agente causador ............................................................................................. 12
2.2.2.2 Morfologia ........................................................................................................ 12
2.2.2.3 Histórico........................................................................................................... 13
2.2.2.4 Epidemiologia .................................................................................................. 13
2.2.2.5 Sintomas e desenvolvimento da doença ......................................................... 14
2.2.2.6 Perdas ............................................................................................................. 15
2.2.2.7 Controle da doença ......................................................................................... 16
2.2.2.8 Genótipos resistentes ...................................................................................... 16
2.3 Mecanismos de agressão e defesa nas interações planta-patógeno .................... 18
2.4 Marcadores moleculares ....................................................................................... 20
2.5 Mapas genéticos ................................................................................................... 22
3 OBJETIVOS ................................................................................................................... 27
3.1 Objetivos Específicos ............................................................................................... 28
4 REFERÊNCIAS BIBIOGRÁFICAS ................................................................................. 29
CAPÍTULO 2 - RESISTÊNCIA À FERRUGEM ASIÁTICA DA SOJA: HERANÇA DE
CARACTERES QUALITATIVOS E QUANTITATIVOS E MAPEAMENTO GENÉTICO .... 46
RESUMO........................................................................................................................ 46
Introdução ...................................................................................................................... 47
vii
Material e Métodos ......................................................................................................... 48
Material Genético ........................................................................................................ 48
Instalação e delineamento do experimento ................................................................. 49
Inoculação e Avaliação................................................................................................ 49
Extração de DNA e Estratégia de Mapeamento .......................................................... 50
Análise dos Dados....................................................................................................... 52
Resultados ..................................................................................................................... 54
Dados quantitativos ..................................................................................................... 54
Dados qualitativos ....................................................................................................... 57
Discussão....................................................................................................................... 60
Herança dos genes maiores ........................................................................................ 60
Herança dos caracteres quantitativos ......................................................................... 61
Mapeamento molecular ............................................................................................... 62
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................. 67
CAPITULO 3 - MAPEAMENTO MOLECULAR DE UM NOVO GENE DE RESISTÊNCIA
AO OÍDIO DA SOJA .......................................................................................................... 75
RESUMO........................................................................................................................ 75
Introdução ...................................................................................................................... 76
Material e Métodos ......................................................................................................... 77
Resultados e Discussão ................................................................................................. 80
REFERÊNCIAS BIBIOGRÁFICAS ................................................................................. 87
CAPÍTULO 4 - CONCLUSÕES ......................................................................................... 94
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
AFLP - “Amplified Fragment Length Polymorphism” ou Polimorfismo de Comprimento de
Fragmento Amplificado
Avr - avirulência
BAC - “Bacterial Artificial Chromosome” ou Cromossomo Artificial Bacteriano
BSA - “Bulked Segregant Analysis” ou Análise de Agrupamentos Segregantes
CID – “Carbon isotope discrimination” ou discriminação isotópica do carbono
cM - centiMorgan
DNA – “Deoxyribonucleic acid” ou Ácido desoxirribonucléico
EMBRAPA - Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
EST - “Expressed Sequence Tags” ou Etiquetas de Sequências Expressas
Fflr – “First flower” ou Início do florescimento
GQMol - Genética Quantitativa e Molecular
GL – “Linkage Group” ou Grupo de Ligação
HR - “Hipersensitive Response” ou Resposta de Hipersensibilidade
ITS - “Internal Transcribed Sequences” ou Seqüências Internas Transcritas
Lf – “Leaf area” ou Área foliar
Lflt shape - “Leaflet Shape” ou Formato da folha
Lf wdth - “Leaf width” ou Largura da folha
LOD – “Logarithm of ODds” Logaritmo dos nós
MAS - “Marker Assisted Selection” ou Seleção Assistida por Marcadores
PCR - “Polymerase Chain Reaction” ou Reação em Cadeia da Polimerase
PI – “Plant Introduction” ou Introdução de Plantas
PR - “Pathogenesis Related” ou Relacionada à Patogênese
QTL - “Quantitative Trait Locus” ou Loco de Característica Quantitativa
R - “Resistance” ou Resistência
RAPD - “Random Amplified Polymorphic DNA” ou DNA Polimórfico Amplificado ao Acaso
RB - “Reddish-Brown” ou Marrom-Avermelhado
ix
RFLP - “Restriction Fragment Length Polymorphism” ou Polimorfismo de Comprimento de
Fragmento de Restrição
RGAs - “Resistance Gene Analogs” ou Análogos de Genes de Resistência
RILs - “Recombinant Imbred Lines” ou Linhagens Endogâmicas Recombinantes
SCAR - “Sequence Characterized Amplified Regions” ou Regiões Amplificadas
Caracterizadas por Seqüências
SCN - “Soybean Cist Nematode” ou Nematóide do Cisto da Soja
SDS – “Sudden death syndrome” ou Síndrome da morte súbita
Sd fill – “Seed filling” ou Enchimento de grãos
SGQ - Sistema de Genética e Quantitativa
SNPs- “Single Nucleotide Polymorphism” ou Sequências Únicas de Nucleotídeo
SSR - “Simple Sequence Repeat” ou Sequência Simples Repetida
VNTR – “Variable Number of Tandem Repeats” ou Seqüências Adjacentes que se
Repetem em Número Variável
x
RESISTÊNCIA DA SOJA À FERRUGEM ASIÁTICA E AO OÍDIO: HERANÇA DE
CARACTERES QUALI- QUANTITATIVOS E MAPEAMENTO GENÉTICO
RESUMO - Os fungos patogênicos Phakopsora pachyrhizi e Erysiphe diffusa causam a
ferrugem asiática e oídio, respectivamente, em soja, e são responsáveis por grandes
perdas nas áreas sojícolas de muitos países. O objetivo deste trabalho foi estudar a
herança de caracteres qualitativos e quantitativos e mapear genes de resistência dessas
doenças, utilizando populações de plantas F2 e F2:3 derivados dos cruzamentos entre os
genótipos resistentes à ferrugem asiática PI 200487 e PI 200526 com o genótipo
suscetível BRI98-641. Ambos os genótipos apresentaram um gene dominante para a
resistência, os quais foram mapeados no mesmo grupo de ligação da soja (GL-N).
Adicionalmente, as análises quantitativas demonstraram que o modelo aditivo-dominante
foi suficiente para explicar a herança dos dois caracteres, número de urédias e
severidade, mostrando que alguns genes adicionais de efeito menores podem contribuir
para a resposta da severidade da ferrugem asiática nas duas populações. No entanto, o
número de urédias demonstrou ser menos influenciado pelas condições ambientais,
indicando que os genes podem estar concentrados apenas nos parentais resistentes,
evidenciando o caráter de resistência. A severidade continua sendo importante na
seleção, pois demonstra melhor o caráter seletivo e pela facilidade de avaliação. Para
oídio da soja o gene de resistência foi mapeado em uma população F2:3, derivada do
cruzamento entre os genótipos BR01-22106 (resistente) e PI 200487 (suscetível). A
resistência ao oídio nesta população foi determinada por um único gene dominante e
permitiu o mapeamento de um loco red no grupo de ligação C2 da soja. Os marcadores
associados ao Rpp e Red identificados neste trabalho mostraram-se potencialmente úteis
na seleção assistida de plantas resistência para o desenvolvimento de cultivares elites
carregando estes genes e para manter competitividade e sustentabilidade do agronegócio
brasileiro da soja.
Palavras-Chave: Glycine max, Phakopsora pachyrhizi, Erysiphe diffusa, microssatélites,
resistência a doença.
xi
SOYBEAN RESISTANCE TO ASIAN RUST AND POWDERY MILDEW: INHERITANCE
OF QUALI-QUANTITATIVE CHARACTERES AND GENETIC MAPPING
SUMMARY - The pathogenic fungi Phakopsora pachyrhizi and Erysiphe diffusa cause the
Asian rust and powdery mildew diseases, respectively, in soybean and are responsible for
severe yield reduction around the world. The aim of this work was to study the inheritance
of qualitative and quantitative resistance characters and to map disease resistance genes
in F2 e F2:3 soybean populations, derived from the crosses between Asian rust resistance
genotypes, PI 200487 and PI 200526, with the susceptible genotype BRI98-641. Both
genotypes revealed a dominant resistance gene that was mapped in the same soybean
linkage group (LG-N). In addition, quantitative analysis demonstrated that the additivedominant model was sufficient to explain the inheritance of both characters, number of
uredinia and severity, showing that some additional genes can contributed to soybean
response to Asian rust severity in the two populations. However, the number of uredinia
showed to be less influenced by environmental conditions, demonstrating that gene could
be concentrated the in PI 200487 and PI 200526 and be evidence for resistance character.
The severity remains important in the selection process because showing the best
selective character and the available to evaluation. For powdery mildew, the resistance
gene was mapped on linkage group C2 in a F2:3 populations derived from the cross
between BR01-22106 (resistant) and PI 200487 (susceptible) genotypes. The powdery
mildew resistance was determined by one dominant gene, mapped on linkage group C2 of
soybean. The associate markers to Rpp and Red genes will be very useful to assist the
selection of resistant plants on the development of elite cultivars carrying these genes and
keep the competitiveness and sustainability of soybean Brazilian agribusiness.
Keywords: Glycine max, Phakopsora pachyrhizi, Erysiphe diffusa, microsatellites, disease
resistance.
CAPITULO 1 - CONSIDERAÇÔES GERAIS
1 INTRODUÇÃO
A cultura da soja vem se expandindo progressivamente, tornando-a de grande
importância econômica no mundo. Atualmente, são produzidas, por ano, cerca de 236
milhões de toneladas deste grão. Nesse contexto, o Brasil aparece como o segundo maior
produtor, com uma produção de 60,2 milhões de toneladas na safra 2007/08,
aproximadamente 25% de toda a produção mundial. De modo geral, estresses bióticos e
abióticos limitam a distribuição geográfica das culturas e acarretam reduções significativas
no crescimento e na produtividade de espécies economicamente importantes (CONAB,
2009).
Algumas doenças fúngicas têm recebido grande atenção devido aos prejuízos que
têm causado à produção de soja. Dentre elas, a ferrugem asiática é atualmente a principal
doença que acomete a produção de soja no Brasil e uma das mais importantes do mundo.
Outra doença, o oídio da soja, também tem apresentado severa incidência em diversas
cultivares em praticamente todas as regiões sojícolas, desde os Cerrados até o Rio
Grande do Sul (SARTORATO & YORINORI, 2001).
A primeira doença denominada como ferrugem asiática da soja (Phakopsora
pachyrhizi Sydow & Sydow), é descrita na literatura apresentando cinco genes resistentes
dominantes, classificados como Rpp1 a Rpp5 (CHENG & CHAN, 1968; HIDAYAT &
SOMAATMADJA, 1977; BROMFIELD & HARTWIG, 1980; HARTWIG, 1986; GARCIA et
al., 2008), sendo que os genes Rpp1 e Rpp3 não são mais efetivos no Brasil devido à alta
virulência do patógeno, e os outros genes que permanecem efetivos já foram mapeados
através de marcadores moleculares nos grupos de ligação J, G, N e C2 da soja (SILVA et
al., 2008; GARCIA et al., 2008; HYTEN et al., 2009). Além destes genes, existem
genótipos que possuem genes de resistência a ferrugem como, Hyuuga e a PI 200492,
2
nos quais ainda não se determinou a relação com os genes Rpp, porém localizados nos
grupos de ligação C2 e G (HYTEN, 2006; MONTEROS et al., 2007)
Outra doença que acomete os níveis de produção da soja em várias regiões
brasileiras é o oídio da soja [Erysiphe diffusa (Cooke & Peck) BRAUN & TAKAMATSU,
2000], que a partir da safra 1996/1997 teve uma maior importância decorrente a diversos
surtos epidêmicos relatados. Estudos de herança identificaram a presença de um único
gene dominante controlando a resistência ao oídio (GONÇALVES et al., 2002; UNÊDATREVISOLI et al., 2002; ARIAS et al., 2004). No entanto, muitos dos genótipos de soja
ainda não foram mapeados, abrindo a possibilidade de se identificar um novo gene de
resistência ao oídio da soja como ocorreu nos estudos que identificaram o gene de
resistência ao oídio (Rmd) mapeado no grupo de ligação J (POLZIN et al., 1994).
O desenvolvimento de genótipos de soja resistentes às principais doenças é uma
necessidade para a agricultura do país. O alto custo de um programa de melhoramento
genético, principalmente, devido às avaliações extensivas dos genótipos, indica a
necessidade da criação de estratégias para aumentar sua eficiência. Mecanismos de
seleção que possibilitem identificar genótipos promissores, logo no início da fase de
avanço de gerações, após os cruzamentos, são de grande interesse, por exemplo, a
identificação de marcadores moleculares ligados a genes que conferem resistência a
patógenos. A utilização de marcadores moleculares pode, ainda, permitir a localização
genômica dos locos de resistência, o que cria a possibilidade de clonagem dos mesmos
através de estratégias de clonagem posicional, facilitando assim a piramidação de genes
em cultivares elites, além de facilitar o entendimento de mecanismos moleculares e
evolução de resistência a doenças permitindo a seleção de marcadores moleculares em
programas de melhoramento.
3
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Soja
A soja é uma planta da família Fabaceae gênero Glycine. A espécie cultivada no
Brasil é a Glycine max (L.) Merrill. Antes de existirem registros escritos sobre a sua
utilização, sabe-se que a soja era um grão fundamental para a alimentação na Ásia,
especialmente na China, Japão e Coréia. A produção e consumo de soja não teve grande
expressão fora da Ásia até 1900, mas desde então o seu consumo na Europa, América e
África aumentou exponencialmente e esta cultura assumiu significativa importância tanto
na alimentação humana como animal. Atualmente, os países com maior produção do grão
são os Estados Unidos, o Brasil e a Argentina.
A produção mundial corresponde a 236,08 milhões de toneladas, com uma área
plantada de 93,9 milhões de hectares. Este complexo agroindustrial da soja movimenta
aproximadamente US$ 215 bilhões/ano (USDA, 2008). A sojicultura brasileira apresenta
números expressivos que traduzem a grande importância econômica e social que a
atividade gera para a economia do país. O Brasil consolida-se como o segundo maior
produtor mundial, com área plantada de 21,25 milhões de hectares, 0,3% menor que a da
safra 2007/2008, estima-se uma redução de produção na ordem de 3,8% (2,3 milhões de
toneladas) em relação à safra anterior. Tal fato se deve às estiagens ocorridas na Região
Sul, sobretudo no Paraná e Rio Grande do Sul, e na Região Centro Oeste, principalmente
no Mato Grosso do Sul, que contribuíram para a redução da produtividade média do país,
afetando, sobremaneira, a produção nacional estimada em 57,76 milhões de toneladas
(CONAB, 2009).
O Brasil é o maior exportador do mundo em grãos de soja, tendo também
participações no farelo e no óleo de soja. O quadro de oferta e demanda mostra que o
país exporta em média 40% do que produz, demonstrando a dependência do comércio
exterior. Isto o torna vulnerável às incertezas da economia mundial. Ainda assim, as
expectativas são de estabilidade nas cotações ao longo do ano de 2009, principalmente
4
porque, ao contrário do milho, basicamente não há outra commodity que concorra com a
soja no que se refere ao teor protéico a ser usado no arraçoamento (CONAB, 2009).
Nosso país é o único entre os maiores produtores mundiais de soja que tem
capacidade de expandir sua área plantada e, consequentemente, aumentar sua produção
podendo, desta forma, alcançar o primeiro lugar como produtor mundial.
O complexo soja é formado por soja em grãos, óleo de soja bruto, óleo de soja
refinado, farelo de soja e demais óleos e derivados do óleo. Com uma cadeia produtiva
organizada e eficiente distribuída por todo o país, a soja deve ser uma das principais
opções de matéria-prima na produção de biodiesel. Esta planta fornece alimento para o
homem, para os animais domésticos e matérias-primas para a indústria. Avaliando-se o
agronegócio sojícola brasileiro, por trás de todo o caminho que percorre a produção do
grão até chegar às mãos dos consumidores, há uma cadeia que gera empregos,
pesquisa, movimenta economias locais e gera conhecimento global.
2.2 Doenças que ocorrem na soja
A ampliação da sojicultura para novas fronteiras agrícolas com diferentes
condições edafo-climáticas tem aumentado as demandas por tecnologias que dêem
sustentação ao sistema de produção, como a resistência genética às doenças. Entre os
principais fatores que limitam a obtenção de altos rendimentos estão as doenças.
Aproximadamente 40 doenças que acometem a cultura da soja causada por fungos,
bactérias, nematóides e vírus já foram identificadas no Brasil. Esse número continua
aumentando com a expansão da soja para novas áreas e como conseqüência da
monocultura. A importância econômica de cada doença varia de ano para ano e de região
para região, dependendo das condições climáticas de cada safra. As perdas anuais de
produção por doenças são estimadas em cerca de 15% a 20%, entretanto, algumas
doenças podem ocasionar perdas de quase 100% se constituindo deste modo uma
ameaça à produtividade e competitividade da soja nacional (EMBRAPA, 2008).
5
2.2.1 Ferrugem asiática da soja (Phakopsora pachyrhizi)
2.2.1.1 Agente causador
A soja é infectada por duas espécies de Phakopsora que causa a ferrugem:
Phakopsora meibomiae (Arthur) Arthur, nativa do Continente Americano, ocorrendo desde
Porto Rico, no Caribe, até o sul do Paraná, e a ferrugem mais agressiva Phakopsora
pachyrhizi Sydow & Sydow, presente na maioria dos países asiáticos, na Austrália, na
África (Zâmbia, Zimbábue e África do Sul) e ausente nas Américas até a safra 1999/00. A
partir de 1992, após comparações com espécimes americana e asiática, a espécie P.
meibomiae foi considerada pouco agressiva à soja e raramente provocando perdas,
ocorrendo em condições de temperaturas amenas e umidade relativa elevada, diferente
do fungo P. pachyrhizi, que está adaptado a temperaturas que variam de 15ºC a mais de
30ºC e que pode causar severas perdas na cultura de soja em todas as regiões onde
ocorram períodos de molhamento de folha por mais de 10 horas. Atualmente a
diferenciação pode ser realizada a partir de amostra de DNA através de estudos
moleculares das sequências internas transcritas (Internal Transcribed Spacer - ITS)
(FREDERICK et al., 2002).
2.2.1.2 Histórico da doença
A ferrugem asiática da soja P. pachyrhizi, foi descrita pela primeira vez no Japão
em 1902. Em 1914 surgiu em caráter epidêmico em vários países no sudoeste da Ásia e,
em 1976, foi descrita em Porto Rico (VAKILI & BROMFIELD, 1976). Em janeiro de 1998
foi constatada em Uganda, Kenia e Ruanda, e em março de 2001 foi detectada na África
do Sul, tendo atingido caráter epidêmico em 2002. No continente Sul-americano foi
descrito pela primeira vez no Brasil em 1979, no município de Lavras (MG) (DESLANDES,
1979). No entanto, foi motivo de grande preocupação somente a partir da safra
2001/2002, onde no Paraguai causou danos de até 50%, em áreas não protegidas
(MOREL PAIVA, 2001). Na safra 2001 também foram verificados focos no Brasil, contudo
6
as maiores perdas foram verificadas nas safras seguintes. Em 2002 a doença foi
verificada na Argentina, na Bolívia em 2003, e no Uruguai, Colômbia e Estados Unidos
em 2004. No Brasil, desde sua detecção em 2002, a doença atingiu dispersão em
praticamente 100% da área de cultivo, provocando dano estimado em aproximadamente
10%, embora em diversas regiões tenha sido superior a 50%. Desde a primeira detecção,
a importância da ferrugem asiática no Brasil tornou-se incontestável devido principalmente
às perdas severas que tem causado na cultura da soja.
2.2.1.3 Epidemiologia
Os uredósporos são facilmente disseminados pelo vento, para lavouras próximas
ou a longas distâncias, porém, não são transmitidos pela semente. Supõe-se que esporos
do fungo tenham atravessado o Oceano Atlântico ou o Oceano Pacífico, vindo dos países
do Sul da África (Zimbábue e Zâmbia, desde 1998, ou África do Sul, em 2001), onde a
doença tem causado severas perdas, ou da Austrália, onde a ferrugem ocorre há várias
décadas (EMBRAPA, 2003).
O processo infeccioso inicia-se quando os uredósporos germinam e produzem um
tubo germinativo que cresce através da superfície da folha até formar um apressório. A
penetração ocorre diretamente através da epiderme, ao contrário das outras ferrugens
que penetram através dos estômatos. As urédias podem se desenvolver de 5 a 10 dias
após a infecção e os esporos dos fungos podem ser produzidos por até três semanas.
De modo geral, as ferrugens são parasitas obrigatórios (biotróficos), desenvolvendo
estratégias eficientes para explorar células vivas como fontes de alimento. O ciclo de vida
de P. pachyrhizi inicia-se com os uredósporos, oriundos das urédias, que atingem as
folhas de soja, na face superior ou inferior, e germinam se a temperatura for favorável e
se houver pelo menos seis horas de molhamento foliar. Dos uredósporos germinados
forma-se um tubo germinativo, capaz de penetrar os tecidos foliares. Na infecção por P.
pachyrhizi, a penetração ocorre diretamente pela epiderme intacta, podendo também
ocorrer pelos estômatos (ZAMBOLIN, 2006).
7
Nas ferrugens em geral, o tubo germinativo forma um apressório, estrutura que
facilita a penetração da hifa. No tecido foliar, a hifa de infecção entra em contato com uma
célula do mesofilo formando a célula mãe do haustório, que realiza a penetração nas
células hospedeiras e a diferenciação do haustório. Esta é uma estrutura altamente
ramificada, delimitada pela membrana celular da célula hospedeira, denominada de
membrana extra-haustorial, formada pela matriz extra-haustorial e pela parede celular do
fungo. O haustório proporciona uma ampla superfície de contato com a célula hospedeira
e através dele são adquiridas quantidades massivas de açúcares e aminoácidos por
mecanismos de simporte a favor de gradiente de prótons. Propõe-se que a formação
desta estrutura dependa de compostos voláteis, como o nonanal, decanal e acetato de
hexenil, emitidos pelo hospedeiro (MENDGEN et al., 2006; PANSTRUGA, 2003).
2.2.1.4 Sintomatologia
Os
sintomas
da
ferrugem
podem
aparecer
em
qualquer
estádio
de
desenvolvimento da planta, como em cotilédones, folhas e hastes, sendo mais
característicos nas folhas. Os primeiros sintomas são caracterizados por minúsculos
pontos mais escuros do que o tecido sadio da folha, de coloração esverdeada a cinzaesverdeada, com correspondente protuberância (urédia) na face inferior da folha. As
urédias
aparecem
predominantemente
na
superfície
inferior,
mas
podem,
esporadicamente, aparecer na superfície superior das folhas (TECNOLOGIA..., 2008).
Progressivamente, as urédias adquirem cor castanho-clara a castanho-escura,
abrem-se em um minúsculo poro, por onde são liberados os uredósporos. Os
uredósporos, inicialmente de coloração hialina (cristalina), tornam-se bege e acumulam-se
ao redor dos poros ou são carregados pelo vento. À medida que prossegue a
esporulação, o tecido da folha ao redor das primeiras urédias adquire coloração castanhoclara (lesão do tipo TAN) a castanho-avermelhada (lesão do tipo Reddish Brown - RB),
formando as lesões que são facilmente visíveis em ambas as faces da folha. As urédias
que deixaram de esporular apresentam as pústulas, nitidamente, com os poros abertos, o
8
quê permite distinguir da pústula bacteriana, que frequentemente tem sido confundida
com a ferrugem.
2.2.1.5 Perdas
No Brasil, na safra 2001/02, a ferrugem asiática ocasionou perdas de grãos
estimadas em 569 mil toneladas, equivalente a US$125,5 milhões. Na safra seguinte
(2002/03), os prejuízos atingiram mais de US$1,3 bilhões refletindo em um volume de
perda de grãos, estimado em 758 milhões de dólares, e o gasto com o controle químico,
avaliado em 592 milhões de dólares (YORINORI & LAZZAROTTO, 2004). Na safra
2003/2004, a perda em volume de grãos foi estimada em cerca de 4,6 mil toneladas e a
doença foi observada no RS, SP, PR, MT, GO e BA. Além da seca ocorrida no período, a
disseminação do patógeno no território brasileiro tem sido apontada como causa da
redução de produtividade do grão. Os prejuízos neste período foram avaliados em
aproximadamente US$ 2,286 bilhões, refletindo um volume de perda de grãos de US$
1,225 bilhões, um gasto com controle químico de US$860 milhões e uma redução na
arrecadação de impostos para o governo de US$201 milhões (YORINORI &
LAZZAROTTO, 2004).
Na safra 2006/2007 as perdas foram ainda maiores. De acordo com o
levantamento da Embrapa, o prejuízo causado pela ferrugem nesta safra foi de US$ 2,19
bilhões só em perdas de grãos. Estima-se que os prejuízos pela redução da produção do
grão causado pelo fungo da ferrugem asiática, na safra brasileira de 2007/2008, foram de
418,5 mil toneladas, representando 1% da produção nacional, e exibindo financeiramente
um prejuízo de US$204,5 milhões, que somado ao gasto para o controle da doença,
resultou em um custo total de US$1,97 bilhão. As perdas mais amenas da última safra,
bastante favoráveis aos produtores, resultaram de práticas de manejo adotadas durante a
mesma, como o “vazio sanitário” (período sem plantas de soja vivas no campo), de 60 a
90 dias, com o objetivo de reduzir a quantidade de inóculo da ferrugem nos cultivos da
9
safra verão, além da condição climática desfavorável à manutenção e multiplicação do
fungo na entressafra de 2007 (EMBRAPA, 2008).
2.2.1.6 Controle da doença
A evolução desta doença na América do Sul provocou um esforço coletivo de
diversas instituições com o objetivo de produzir uma das mais significativas alterações
nos diversos conceitos relacionados ao manejo e controle de doenças foliares em cultivos
anuais de grande escala. Produto deste esforço, diversos posicionamentos foram
ajustados a uma realidade em que a grande escala é uma plena realidade e cujas
respostas necessitaram ser adequadas tanto do ponto de vista operacional como
logístico. Um enfoque multidisciplinar tem sido empregado ao manejo desta doença já que
estudos sobre o manejo de nutrientes e genético vêm evidenciando através de resultados
obtidos com um controle químico da ferrugem da soja.
A utilização de cultivares resistentes seria o método mais viável de controle. No
entanto, até o momento, não estão disponíveis cultivares com resistência completa ao
patógeno. Contudo, uma grande variação é observada entre cultivares no período de
latência e na taxa de progresso da doença, parâmetros da resistência parcial. Esta
característica, intrínseca a cada cultivar, pode ser aliada ao melhor gerenciamento do
controle químico.
O fator de maior relevância para o controle químico é o momento da aplicação.
Aplicações realizadas de forma preventiva têm propiciado maior eficiência de controle,
além do período residual dos fungicidas ser preservado. As aplicações realizadas de
forma curativa além de comprometer a eficácia de controle do fungicida, são realizadas
após a planta já ter sofrido o estresse metabólico, devido à interação patógenohospedeiro, no sentido de impedir o progresso da doença. De qualquer maneira,
problemas gerenciais têm se caracterizado pelo maior entrave à adoção das estratégias
corretas de controle.
10
2.2.1.7 Genótipos resistentes
No patossistema soja-ferrugem asiática há relatos da existência de cinco genes
dominantes controlando a resistência, denominados de Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4 e Rpp5,
identificados em introduções de plantas (CHENG & CHAN, 1968; HIDAYAT &
SOMAATMADJA, 1977; BROMFIELD & HARTWIG, 1980; HARTWIG, 1986; GARCIA et
al., 2008). No entanto, a estabilidade dessa resistência é preocupante, devido ao
patógeno apresentar alta diversidade genética, dificultando o desenvolvimento de
cultivares que sejam efetivas por longo período (HARTMAN et al., 1994). Vinte raças de
ferrugem asiática foram identificadas em amostras coletadas em plantas de soja e
hospedeiros selvagens no Japão (YAMAOKA et al., 2002), nove raças em 42 isolados em
Taiwan e 59 raças em 69 isolados na Tailândia. No Brasil, embora não haja comprovação
científica, devido à inexistência de trabalhos com hospedeiros diferenciadores de raças
até o momento, admite-se que haja também inúmeras raças fisiológicas do patógeno em
campos de soja. A resistência mediada pelos genes dominantes Rpp é monogênica e
raça-específica, frequentemente explicada pela teoria gene-a-gene.
A resistência parcial ou a resistência que reduz a taxa de infecção foi também
relatada para a ferrugem onde linhagens com resistência parcial em avaliações de campo
foram classificadas como moderadamente resistentes, uma vez que poucas lesões se
desenvolveram durante o ciclo da cultura. De acordo com HARTMAN et al. (1994), a
identificação e a utilização da resistência parcial, em programas de melhoramento de
soja, têm sido limitadas. Os métodos de avaliação consomem tempo e dificultam a
incorporação em programas de melhoramento.
Dois tipos de resistência, a horizontal e a vertical, são observados entre os
genótipos de soja (BROMFIELD & HARTWIG, 1980). A vertical é a mais utilizada devido à
facilidade de ser trabalhada, mas tem sido quebrada com facilidade, indicando a presença
de raças do fungo, como aconteceu com a resistência conferida pelos genes Rpp1 e
Rpp3 que foi quebrada pela nova raça. Por isso, a obtenção de cultivares de soja
resistente à ferrugem asiática é um grande desafio para a pesquisa.
11
Já a resistência horizontal envolve a redução na taxa de desenvolvimento da
doença, sendo mais efetiva contra um número maior de raças do patógeno. Entretanto, a
quantificação deste tipo de resistência é mais difícil, limitando sua utilização (TSCHANZ &
WANG, 1985). Devido às limitações no emprego de estratégias para obtenção de
genótipos apresentando ambos os tipos de resistência, outros métodos têm sido
utilizados, com o objetivo de evitar reduções de produtividade devido à ocorrência da
doença, dentre eles o estudo de tolerância de cultivares.
O mapeamento utilizando marcadores moleculares possibilitou até o presente
momento a identificação e localização de genes de resistência à ferrugem. Um primeiro
estudo foi realizado na cultivar FT2, onde foi mapeado o gene de resistência RppFT2 no
grupo de ligação C2 (BROGIN, 2005). No mesmo grupo de ligação, no genótipo japonês
Hyuuga, este gene foi posicionado entre os marcadores Satt460 e Satt307 a 0,8cM e
2,4cM, respectivamente (MONTEROS et al., 2007). O gene da cultivar FT2 não está mais
ativo no Brasil devido à alta diversidade e virulência do patógeno que teve sua resistência
quebrada, permanecendo ativo somente o gene presente no genótipo Hyuuga. HYTEN
(2006) relata que no grupo de ligação C2 da soja, na mesma posição onde está localizado
o marcador Satt460, encontra-se posicionado o gene de resistência à ferrugem Rpp3,
mapeados nos genótipos PI462312 e PI578457. O locus Rpp1 mapeado no grupo de
ligação G confere resposta imune ao isolado de ferrugem Índia-73-1, este locus Rpp1 foi
mapeado entre os marcadores Sct_187 e Sat_164, à uma distância de 0,4 cM de ambos
os marcadores (HYTEN et al., 2007). SILVA et al. (2008) mapearam os genes Rpp2 e
Rpp4 em regiões consideradas hot spots para genes de resistência. O locus Rpp2 foi
mapeado por volta de 25 cM de um cluster para genes de resistência no grupo de ligação
J da soja. O locus Rpp4 foi mapeado no grupo de ligação G. Locus de característica
quantitativa (QTLs) para genes de resistência a várias doenças também tem sido
reportados nessa região.
12
2.2.2 Oídio da soja (Erysiphe diffusa sin. Microsphaera diffusa)
2.2.2.1 Agente causador
Os oídios constituem um dos mais importantes e bem estudados grupos de fungos
parasitas de plantas. O termo “oídios” tem sido usado para designar a doença como
também a classe de fungos ascomicetos, pertencentes à ordem Erysiphales, família
Erysiphacea. Eles são facilmente reconhecidos por formarem colônias esbranquiçadas de
aspecto pulverulento sobre as superfícies de partes aéreas de plantas vivas. Além de sua
simplicidade, a expressão “oídios” detém a vantagem de descrever diretamente a forma
dos esporos imperfeitos dessa doença (STADNIK & RIVERA, 2001). O oídio da soja tem
sido causado pela fase anamorfa Pseudoidium, que é caracterizada por conidióforos
produzindo apenas conídios e apressórios.
2.2.2.2 Morfologia
As características de todas as estruturas dos oídios podem ser de grande valor
taxonômico. Para os fungos de características anamórfica, o micélio primário é hialino e
com paredes finas. As paredes das hifas, conídios e estruturas peridiais são estruturas
muito uniformes (BRAUN, 1995). Os apressórios são estruturas protuberantes laterais das
hifas, responsáveis pela fixação do micélio à superfície foliar e iniciação do haustório. Eles
também ocorrem no final dos tubos germinativos de conídios. Os haustórios são formados
dentro de células epidérmicas ou, raramente, em células de camadas mais profundas. Os
haustórios aparecem como estruturas globosas a periformes.
A resistência do hospedeiro a oídios pode ser vista como a capacidade de planta
evitar ou atrasar a penetração e/ou o subsequente desenvolvimento do fungo.
Resumidamente as plantas podem reagir ao ataque fúngico pela formação de papilas,
reações de hipersensibilidade, síntese de compostos antimicrobianos e/ou alterações
metabólicas em seus tecidos. Porém, independentemente da resposta ao ataque, o
13
metabolismo dos vegetais infectados é afetado sensivelmente como consequência da
interação entre o patógeno e o seu hospedeiro (STADNIK & MAZZAFERA, 2001).
2.2.2.3 Histórico
O oídio da soja, causado pelo fungo ascomiceto (E. diffusa), é uma das doenças
mais antigas dessa leguminosa, provocando perdas de até 40% no rendimento.
O oídio foi observado primeiramente na Alemanha em 1921 (WAHL, 1921). Na
América seu primeiro relato foi em 1931, nos Estados Unidos (LEHMAN, 1931). Desde
então a doença tem sido relatada em diversos países da América do Norte e Sul, como,
Brasil, Canadá, Peru, Porto Rico, Venezuela, Bolívia, Paraguai e Argentina (PLOPER et
al, 1999), Ásia (República Popular da China) e África (África do Sul).
O oídio foi inicialmente identificado em plantas de soja em casa de vegetação e a
campo, em final de ciclo de cultivares tardias, sem causar danos significativos. Somente
após vários anos é que a doença passou a causar redução de rendimentos. No Brasil, até
a safra de 1995/96, o oídio era considerado uma doença secundária na economia
agrícola. Era observada principalmente em casas de vegetação e a campo, em cultivares
tardias, ao final da safra (abril-maio) na Região Sul, e nas regiões altas dos Cerrados, em
altitudes acima de 800m e em cultivos de invernos sob irrigação com pivô central. Na
safra de 1996/97, favorecida por um clima chuvoso e temperaturas amenas, uma
epidemia de oídio atingiu as cultivares suscetíveis, envolvendo todas as áreas de
produção de soja. Após essa epidemia, houve uma alteração do clima nas safras
subsequentes com predominância de estiagem e altas temperaturas, restringindo as
áreas mais afetadas às regiões Sul e dos Cerrados (SARTORATO & YORINORI, 2001).
2.2.2.4 Epidemiologia
Um estudo detalhado do processo de germinação, de infecção e de reprodução de
E. diffusa foi realizado por MIGNUCCI & CHAMBERLAIN (1978), utilizando a cultivar de
14
soja Harasoy. A germinação ocorreu sobre a folha após 3 horas de inoculação. Com oito
horas o apêndice de infecção penetra nas células epidérmicas. O fungo penetra nas
cutículas e forma os haustórios nas células epidermais, não infectando as células do
mesofilo e não penetrando na câmara estomática. As colônias se formam à medida que
as hifas se estendem e se ramificam. A formação de conídios inicia-se 108 horas após a
inoculação. Com 144 horas da inoculação, a célula na extremidade do conidióforo
apresenta um conídio bem definido com três a cinco células por conidióforo. O rápido
crescimento do fungo resulta na distribuição de colônias e no surgimento de novas
colônias, mas não causa sintoma visível. O aumento da infecção inibe significativamente
a fotossíntese e, ao contrário de outros patógenos, a E. diffusa inibe substancialmente a
transpiração.
Estudos sobre o efeito da temperatura no desenvolvimento do oídio mostraram que
quanto mais baixa a temperatura, mais rápido e severo foi o desenvolvimento do fungo. A
temperatura mais favorável é de 18ºC, sob a qual, as reações de resistência e
suscetibilidade entre as cultivares podem ser distinguidas (MIGNUCCI et al., 1977). Para
a ocorrência de oídio, as condições mais favoráveis são a baixa umidade do ar (clima
seco) e temperaturas amenas (18-22ºC) (REIS, 2004). BALARDIN (2002) afirma que
temperaturas superiores a 30ºC inibem o desenvolvimento da doença. O molhamento
foliar é um fator inibidor no estabelecimento do oídio. Esta é uma das razões pelas quais
a doença apresenta uma severidade elevada durante os estádios vegetativos.
Precipitação intensa e frequente pode se constituir em um fator inibidor ao
desenvolvimento do oídio.
2.2.2.5 Sintomas e desenvolvimento da doença
Patógenos causadores de oídios são parasitas biotróficos obrigatórios de plantas,
que para obtenção de nutrientes formam haustórios no interior das células do hospedeiro,
sem, no entanto, matá-las. O fungo E. diffusa desenvolve-se em baixa umidade relativa
do ar e em temperaturas amenas e seus sintomas são observados em toda parte aérea
15
da soja, incluindo folhas, hastes, pecíolos e vagens (YORINORI, 1986; SINCLAIR &
HARTMAN, 1999; HUCKELHOVEN, 2005). Os sintomas apresentados pelo oídio podem
variar de clorose, ilhas verdes, manchas ferruginosas, desfolha acentuada ou a
combinação desses sintomas, dependendo da reação das cultivares. Manchas cloróticas
e necrose nas nervuras indicam reação de hipersensibilidade (SINCLAIR & HARTMAN,
1999). Todavia, o sintoma mais evidente é a própria estrutura (sinal) branca e
pulverulenta do fungo sobre as superfícies das partes infectadas. O fungo pode se
desenvolver abundantemente sobre as partes infectadas sem apresentar sintomas
visíveis. Com o passar dos dias, a coloração branca do fungo muda para castanhoacinzentado, dando aparência de uma cobertura de sujeira nas duas faces da folha.
Embora raramente causem a morte da planta, eles exaurem as suas reservas nutricionais
que poderiam ser utilizadas para fins produtivos, reduzindo a atividade fotossintética em
até 50%, e perdas de rendimento de até 35% (DUNVLEAVY et al., 1978; MIGNUCCI &
BOYER, 1979, PHILLIPS, 1984)
Tanto o patógeno, como o desenvolvimento dos sintomas parece ser afetado pela
cultivar, idade e posição da folha e idade da planta no momento da inoculação. Em geral,
as folhas inferiores de plantas mais jovens são mais suscetíveis do que folhas superiores
(MIGNUCCI & LIM, 1980).
2.2.2.6 Perdas
Nos níveis de produção da soja, em várias regiões brasileiras, o oídio da soja a
partir da safra 1996/1997, teve maior importância decorrente aos diversos surtos
epidêmicos relatados desde a região Sul até as regiões Sudeste e Centro Oeste do Brasil,
causando perdas de produção de até 25% (REIS et al., 1997; EMBRAPA, 2003),
principalmente no Sul e nas chapadas altas dos Cerrados. A falta de resistência na
maioria das cultivares e quebra da resistência nas cultivares que a apresentavam têm
exigido um grande controle químico nessas regiões. O mesmo ocorre na Bolívia, onde a
soja é cultivada no inverno (STADINIK & RIVERA, 2001)
16
2.2.2.7 Controle da doença
O método mais eficiente de controle do oídio é através do uso de cultivares
resistentes. Devem utilizar cultivares que sejam classificadas como resistentes a
moderadamente resistentes ao fungo. Outra forma de evitar perdas do oídio é não semear
cultivares suscetíveis nas épocas mais favoráveis à ocorrência da doença, tais como
semeaduras tardias ou safrinha e cultivo sob irrigação no inverno. O controle químico,
através da aplicação de fungicidas foliares, pode ser utilizado. Os fungicidas se
constituem em uma medida adicional de controle de doenças foliares, principalmente
quando ocorrem condições climáticas favoráveis, e quando as cultivares que possuem
resistência genética não é recomendado para a região de cultivo ou não estão disponíveis
para o plantio (EMBRAPA, 2008).
Nos Estados Unidos, além da ocorrência esporádica (GRAU, 1985), o oídio deixou
de ser uma doença de importância econômica devido ao uso de cultivares resistentes e,
portanto, não há recomendação de fungicidas (SINCLAIR & HARTMAN, 1999). No
entanto, em países como Argentina, Brasil, Paraguai e Bolívia (cultivo de inverno), o uso
de fungicidas ainda se faz necessário (SARTORATO & YORINORI, 2001).
2.2.2.8 Genótipos resistentes
Cultivares resistentes tem tido a resistência quebrada devido aos processos de
seleção de variantes presentes na população do patógeno, incapazes de serem
reconhecidos pelo produto do gene R, indicando o aumento da variabilidade do patógeno,
porém faltam estudos que confirmem a existência de raças fisiológicas. Estudos
moleculares das sequências internas transcritas (ITS) do rDNA vem sendo utilizadas para
identificar quais espécies de oídio estão presentes na soja (TAKAMATSU, et al., 2002;
ALMEIDA et al., 2008). As observações sobre a variabilidade patogênica de E. diffusa tem
sido circunstanciais e baseadas em variações das reações das cultivares em diferentes
anos ou regiões produtoras de soja.
17
Estudos sobre herança da resistência em soja ao oídio demonstram que dois
genes são responsáveis pela resistência. Um gene dominante, denominado Rmd -c,
mantém a planta resistente durante todo o ciclo da soja (LOHNES & BERNARD, 1992).
Outro gene, também dominante e denominado de Rmd, é responsável por conferir
resistência de planta adulta (MIGNUCCI & LIM, 1980). Neste caso, as plantas apresentam
suscetibilidade na fase inicial de desenvolvimento, porém, adquirem resistência à medida
que vão atingindo a fase adulta. Sob condições menos favoráveis ao oídio da soja as
plantas com o gene Rmd apresentam pouco ou nenhum oídio no campo. Aparentemente,
a variabilidade patogênica do fungo tem superado a resistência de algumas cultivares,
exigindo contínuo trabalho de melhoramento genético e estudos da diversidade de genes
resistentes nos germoplasmas disponíveis.
A presença de genes maiores na herança de resistência ao oídio também é
relatada por MIGNUCCI & LIM (1980). A resistência completa é controlada por um gene
dominante Rmd-c, alélico ao gene que conferem resistência a planta adulta (Rmd). O
gene Rmd-c é originário da cultivar CSN e está associado com o gene Rps2 que confere
resistência à podridão radicular de Phytophtora (Phytophtora megasperma var. sojae)
(LOHNES & BERNARD 1992). No Brasil, estudos de herança também vêm sendo
realizados e indicando a presença de um único gene controlando a resistência ao oídio da
soja (GONÇALVES et al., 2002; UNÊDA-TREVISOLI et al., 2002; ARIAS et al., 2004).
O gene de resistência Rmd, presente na cultivar Minsoy, está ligado ao gene E3
que confere a característica de retardamento de floração quando o comprimento natural
do dia é prolongado por 20 horas com uso de luz fluorescente (BUZZELL & PALMER,
1989). O gene Rmd, por sua vez está ligado ao gene Rj2 que confere a característica de
não-nodulação com certas estirpes de Bradyrhizobium japonicum e ao gene Rps2, que
confere resistência à podridão de Phytophothora. A ordem desses genes no mapa
genético da soja é Rj2RmdRps2 (LOHNES et al., 1993). Essa sequência foi confirmada
com mapeamento no grupo de ligação J da soja, identificando assim genes ligados a
resistência (Resistance-Like Gene - RLGs) e correlacionada com o mapa genético da soja
obtido pelo USDA-ARS (POLZIN et al., 1994, GRAHM et al., 2002). Existe indicação de
18
que o mesmo gene Rmd está ligado com o locus para resistência à podridão parda da
haste da soja (Phialophora gregata), sendo, portanto, recomendado que esses genes
sejam utilizados como marcadores em programas de melhoramento de soja para
resistência a essas doenças (LOHNES & NICKELL, 1994).
2.3 Mecanismos de agressão e defesa nas interações planta-patógeno
A presença dos patógenos nos tecidos das plantas implica no contato entre eles e
células vegetais vivas, contendo ou capazes de produzir substâncias tóxicas,
sinalizadoras em respostas à atividade agressora. Assim sendo, para uma eficiente ação
parasítica e também patogênica, pressupõe-se o sucesso da infecção da planta
hospedeira, com a retirada de nutrientes para atender as necessidades metabólicas do
parasita, à custa da neutralização dos mecanismos bioquímicos de defesa, presentes no
tecido vegetal ou desencadeados em resposta a infecção (MISAGHI, 1983).
Alguns organismos dispõem de força mecânica para penetrar diretamente na
cutícula e na parede das células da epiderme. Assim ocorre, por exemplo, em conídios de
Erysiphe, Colletotrichum, Alternaria e com basidiósporos de fungos causadores de
ferrugem, como as espécies de Phakopsora, Puccina e outras, que germinam, fixam na
superfície de suas hospedeiras por meio de apressório, a partir do qual cresce uma hifa
fina e despontada, o tubo de penetração, que termina por perfurar a cutícula e adentrar a
epiderme, podendo atingir o mesofilo (DEAN, 1997).
Muitas das enzimas produzidas por fitopatógenos têm como substratos os
componentes da parede celular vegetal, e outras, os constituintes de seu protoplasma. A
parede celular é uma importante barreira física a ser ultrapassada para que o fungo possa
penetrar e ocorrer e colonizar a planta hospedeira. Portanto, a degradação ou a alteração
do tecido vegetal poderá depender da atuação de enzimas sobre as principais camadas e
componentes da parede celular, onde predominam várias substâncias complexas como
cutina nas células epidérmicas de folhas e caules verdes, celulose e hemiceluloses,
substâncias pécticas, lignina e proteínas. Em conjunto, as enzimas produzidas por
19
patógenos e envolvidas na degradação da parede celular são denominadas enzimas
degradadoras de parede (MEDEIROS et al., 2003).
Na natureza, a resistência de plantas a doenças é uma regra ao passo que, a
suscetibilidade é exceção (PASCHOLATTI & LEITE, 1995). Basta observar a infinidade de
microrganismos aos quais as plantas estão expostas diariamente, para se comprovar que,
apenas uma pequena parte destes é capaz de provocar doenças nas plantas. Esta defesa
é garantida por mecanismos pré-formados, como a espessura da cutícula, o número e
disposição de estômatos e de tricomas e ainda de mecanismos de respostas pósformadas, como substâncias fungitóxicas e antiproteícas, atuantes nestes vegetais
(PASCHOLATTI & LEITE 1995).
Fatores que afetam a pré-penetração do fungo podem servir como mecanismos de
defesa para a planta. Cada fator resulta na redução da taxa de germinação, na formação
incorreta do tubo germinativo na superfície da folha, impedindo o reconhecimento do
estômato, ou na menor frequência na formação do apressório.
A variação na resistência ao patógeno muitas vezes é controlada pela segregação
de genes de resistência (Resistance - R) e de seus produtos gênicos, que direta ou
indiretamente interagem com “elicitores específicos” produzidos pelos patógenos e
codificados por genes de avirulência (avr) (HAMMOND-KOSACK & JONES, 1997).
Estruturas constitutivas de diferentes órgãos da planta têm funções de defesa, pois,
são portadores de estabilidade química e propriedades físicas capazes de evitar adesão e
penetração de microrganismos. Por outro lado, certas estruturas podem ser formadas em
resposta à agressão patogênica.
De modo geral, os mecanismos estruturais de defesa podem ser pré-formados
(presente de modo constitutivo) ou induzidos (formados após o contato com o patógeno)
pelo agente agressor. Está bem estabelecido que uma variedade de produtos fúngicos
induza respostas elicitores defensivas em ambas as plantas hospedeiras e nãohospedeiras, e que, algumas respostas também podem ser acionadas por produtos
vegetais liberados durante a degradação da parede celular.
20
2.4 Marcadores moleculares
O desenvolvimento de marcadores moleculares de DNA proporcionou um grande
impulso para a determinação da variabilidade genética dentro e entre espécies de um
mesmo gênero, para a determinação da conservação e ordem de genes em espécies de
gêneros diferentes (sintenia) e em estudos genômicos mais elaborados identificando
genes específicos.
A primeira técnica de visualização de fragmentos de DNA foi descrita por
SOUTHERN (1975), derivando a técnica conhecida por Polimorfismo no Comprimento de
Fragmentos de Restrição (RFLP - Restriction Fragment Lenght Polymorphism; BOTSTEIN
et al., 1980). Mais tarde, surge uma nova técnica denominada Minissatélites ou locos de
Seqüências Adjacentes que se Repetem em Número Variável (VNTR - Variable Number
of Tandem Repeats; JEFFREY et al., 1985).
Com o surgimento da técnica de Reação de Polimerase em Cadeia (Polymerase
Chain Reaction - PCR; MULLIS & FALOONA, 1987), aliou-se o poder da informação
gerada por marcadores moleculares à rapidez da técnica baseada em ciclos contínuos de
desnaturação e amplificação das fitas de DNA mediados pela enzima DNA polimerase em
pontos específicos do genoma, determinados pelo anelamento de primers (seqüência de
nucleotídeos de tamanho pequeno, variando geralmente entre 20 a 30 bases) específicos
de seqüências complementares a este ponto. Várias outras técnicas utilizam o princípio
da técnica de PCR, tais como os marcadores do tipo: Polimorfismo de DNA Amplificado
ao Acaso (Random Amplified Polymorphic DNA – RAPD; WILLIAMS et al., 1990), Regiões
Amplificadas Caracterizadas por Sequências (Sequence Characterized Amplified Regions
- SCAR; PARAN & MICHELMORE, 1993), Microssatélites ou Seqüência Simples
Repetidas (Simple Sequence Repeats - SSR; LITT & LUTTY, 1989), Polimorfismo de
Comprimento de Fragmentos Amplificados (Amplified Fragment Lenght Polymorphism AFLP; VOS et al., 1995) e os Polimorfismos de Base Única (Single Nucleotide
Polymorphisms - SNPs; COLLINS et al., 1998).
21
Os microssatélites são regiões no genoma eucarioto que possuem repetições em
tandem de mono-, tri-, tetra-, penta ou até mesmo hexanucleotídeos, que se repetem de
10 a 60 vezes ou mais raramente até milhares de vezes. As sequências de DNA que
flanqueiam os microssatélites são geralmente conservadas entre os indivíduos de uma
mesma espécie, permitindo a confecção de primers específicos que as amplificam, via
PCR (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998). Os genomas cloroplástico e mitocondrial
também
possuem
microssatélites,
mas
em
geral,
trata-se
de
repetições
mononucleotídicas (POWELL et al., 1996; FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998).
Os primeiros marcadores microssatélites foram desenvolvidos em humanos e, mais
recentemente, têm recebido grande atenção dos melhoristas e geneticistas de plantas.
Vários estudos têm demonstrado que os microssatélites são amplamente distribuídos no
genoma das plantas superiores (POWELL et al. 1996). No genoma vegetal, é encontrado
um microssatélite a cada 6-7 kb (CARDLE et al., 2000).
Em plantas, esses marcadores já foram descritos em milho, soja, arroz, trigo,
cevada e em feijão. No melhoramento vegetal, a utilidade dos microssatélites resulta de
fatores importantes, tais como, o alto grau de informação contido em cada alelo,
distribuição por todo genoma, codominantes e sua fácil genotipagem via PCR (POWELL
et al., 1996). Quando os microssatélites são individualmente amplificados, usando um par
de primers complementares às sequências únicas que os flanqueiam, eles quase que
invariavelmente mostram extensivo polimorfismo para tamanho de bandas. A variação do
tamanho dos produtos de PCR é consequência da ocorrência de diferentes números de
unidades repetitivas dentro da estrutura do microssatélite. Esta variabilidade dos
microssatélites pode ser originada de permuta desigual ou erro da DNA polimerase
durante o processo de replicação, conhecida como pareamento desigual que ocorre
devido a um fenômeno chamado de deslizamento ou slippage (CHARLESWORTH et al.,
1994; TÓTH, et al., 2000).
Dessa maneira, cada microssatélite, independentemente do elemento repetitivo,
constitui um loco genético altamente variável, multialélico e de grande conteúdo
informativo. Assim, a variação no comprimento do produto gerado pela PCR é em função
22
do número de unidades de microssatélites. Cada segmento amplificado de tamanho
diferente representa um alelo do mesmo loco. Dessa forma, os polimorfismos surgem
quando há número diferente de repetições de um dado motivo. Tendo em vista as
vantagens apresentadas pelos microssatélites, eles têm sido usados como marcadores
genéticos por sua grande distribuição no genoma eucarioto e pelo seu alto polimorfismo,
apresentam ainda a vantagem de serem codominantes. Têm sido utilizados em estudos
evolutivos, para fingerprinting, teste de paternidade, mapas de ligação, e em estudos de
genética de populações (PRIMMER et al., 1997).
Os SNPs representam uma fonte abundante de variação genética. Esses
polimorfismos são gerados por substituição de uma única base ou pequenos eventos de
inserção e deleção, ocorrendo em uma taxa muito baixa, de aproximadamente 10-7
alterações por sítios por geração ou menos. A grande vantagem dos SNPs em
comparação aos outros marcadores moleculares reside na abundância de polimorfismos
entre alelos de determinado gene.
2.5 Mapas genéticos
A partir da década de 80, com o advento dos marcadores de DNA, o mapeamento
genético tornou-se, efetivamente, ilimitado a todas as espécies vegetais (BOSTEIN et al.,
1980). Mapas genéticos que levaram décadas para serem desenvolvidos em virtude da
restrita disponibilidade de marcadores morfológicos e isoenzimáticos foram amplamente
saturados com o uso de marcas moleculares. Assim ocorreu em milho (HELENTJARIS et
al., 1986), em arroz (MCCOUCH et al., 1988), em trigo (CHAO et al., 1989), em batata
(GEBHARDT et al., 1989), em soja (CREGAN et al., 1999; SONG et al., 2004); e em
tomate (TANKSLEY et al., 1992). Várias espécies para as quais os estudos de herança
eram restritos, e tampouco havia sido descrita ligação gênica entre qualquer tipo de
marcador, tiveram mapas genéticos rapidamente desenvolvidos, como o eucalipto
(GRATTAPAGLIA & SEDEROFF, 1994), o kiwi (TESTOLIN et al., 2001) e o maracujá
(CARNEIRO & VIEIRA, 2002).
23
O primeiro conceito de um mapa genético foi apresentado por Alfred H.
STURTEVANT (1913), que ordenou cinco caracteres ligados ao sexo no cromossomo Y
da Drosophila melanogaster. Este fenômeno foi interpretado como ligação gênica, que é a
base do mapeamento genético (MORGAN et al., 1915).
A grande disponibilidade de marcadores neutros, altamente polimórficos, cuja
herança não sofre influência ambiental, aliada a procedimentos estatísticos complexos,
tem permitido a construção de mapas de ligação para a maioria das espécies vegetais de
interesse agronômico, até mesmo para aquelas de longo ciclo de vida, como as florestais
e as frutíferas. A construção de mapas de ligação tem como base a análise de
segregação de centenas de marcadores e, por isso, é computadorizada. Programas como
"Mapmaker" (LANDER et al., 1987), "Linkage 1" (SUITER et al., 1983), "Gmendel" (LIU &
KNAPP, 1992), “GQMol” (CRUZ & SCHUSTER, 2006) foram desenvolvidos e estão
disponíveis na internet, para auxiliar na análise genética dos dados visando à construção
de mapas genéticos.
Cada vez mais, mapas genéticos de ligação vêm sendo utilizados em várias
espécies, principalmente após o desenvolvimento de diferentes classes de marcadores
moleculares (CARNEIRO & VIEIRA, 2002). No entanto, os primeiros mapas genéticos
baseavam-se em marcadores morfológicos e citológicos. Estes últimos eram obtidos a
partir de alterações cromossômicas (aneuploidias, translocações, deleções e inversões),
principalmente em culturas de fácil observação das alterações fenotípicas causadas por
essas modificações, como milho, tomate e ervilha. No entanto, esses marcadores são
restritos as espécies de amplo conhecimento citológico. A partir do desenvolvimento de
marcadores bioquímicos (isoenzimas) e moleculares (DNA), o mapeamento genético
passou a ser utilizado em várias espécies, até mesmo para aquelas as quais nem sequer
havia ainda estudos de ligação a algum marcador.
Os mapas genéticos têm importante papel em muitas áreas da genética, como a
análise de QTLs, clonagem baseada em posição no mapa, melhoramento por meio da
seleção assistida por marcadores (SAM) e, mais recentemente, na genômica
comparativa. A seleção indireta, por meio de marcadores genéticos, tem sido sugerida
24
para características de baixa herdabilidade, que requerem grandes populações para sua
mensuração (FERREIRA, 1995).
Desse modo, um mapa genético saturado com marcadores passou a ser a base
para estudos avançados de genética, incluindo a identificação e isolamento de genes e
estudos da estrutura, expressão e função desses genes, como enfatizam OLIVEIRA et al.
(2005) em seus trabalhos. Altas resoluções em regiões específicas isto é, próximas a
genes de interesse, são fundamentais para a identificação, isolamento e clonagem de
genes, que vem se tornando uma realidade em espécies com mapas genéticos bem
definidos (ROOSE et al., 2000). Nos últimos anos, mapas integrados de muitas espécies
têm sido publicados. Devido ao aumento na densidade dos locos e no decréscimo no
número de intervalos, estes mapas consensos têm fornecido uma identificação mais
precisa de genes principais e/ou QTLs de importância agronômica. Adicionalmente eles
têm auxiliado a conduzir a seleção assistida por marcadores e estudar a estrutura e
organização do genoma, estudos de evolução e introgressão de genes.
O mapeamento genético se tornou mais frequente, principalmente após o advento
da tecnologia de sequenciamento de alta produção, que tem gerado informações
abundantes sobre sequências de DNA para os genomas de muitas espécies de plantas.
Isto inclui o sequenciamento de sequências genômicas completas para espécies modelo
como Arabidopsis thaliana, soja, cevada, milho, eucalipto. Adicionalmente, às etiquetas de
sequências expressas (Expressed Sequence Tags - ESTs) de outras importantes
espécies cultivadas têm sido geradas, e ferramentas poderosas de bioinformática têm
anotado milhares de sequências como genes funcionais putativos.
Neste contexto, marcadores moleculares representam a tarefa de relacionar estas
informações
geradas
de
sequências
de
DNA
com
fenótipos
particulares.
Consequentemente há uma forte demanda em melhorar técnicas de marcadores visando
utilizar a informação de sequências disponíveis. Um mapa saturado é a base para
estudos avançados de genética, incluindo a identificação, isolamento e estudos da
estrutura, expressão e função dos genes. Neste contexto, a clonagem de genes se tornou
uma realidade em espécies com mapas genéticos bem definidos. Entretanto, a
25
construção de mapas de alta resolução que permitam identificar marcadores moleculares
próximos ou até mesmo completamente ligados ao gene é um pré-requisito para a
clonagem de genes baseada em mapa.
A seleção da população para mapeamento envolve a escolha dos genitores e a
determinação do tipo de cruzamento (F 2, retrocruzamento, e outros), sendo considerada
uma etapa crítica para o sucesso da construção do mapa (STAUB et al., 1996). A escolha
do tipo de população mais apropriada ao mapeamento está relacionada com o tipo de
marcador empregado (TANKSLEY et al., 1988).
No entanto, independentemente dessa escolha, duas condições básicas devem ser
atendidas: o máximo de polimorfismo entre os genitores, e que sejam produzidas
gerações em que os locos estejam em desequilíbrio de ligação (TANKSLEY, 1993).
O desequilíbrio de ligação entre os locos segregantes é atribuído à ligação física
entre os locos, que por sua vez resulta da redução da frequência de recombinação entre
genes situados em regiões próximas ao longo de determinado cromossomo (WEIR, 1996;
COELHO, 2000). O desequilíbrio de ligação, decorrente da ligação física entre os locos,
atinge seu ponto máximo nas populações derivadas de cruzamentos controlados e, como
consequência, a capacidade de detectar a ligação também é máxima (TANKSLEY, 1993;
LIU, 1998). Cabe ressaltar que o desequilíbrio não deve ser causado por seleção ou
deriva genética.
Marcadores moleculares, segundo HU & VICK (2003) e CHEN et al. (2006),
realizam um importante papel na genômicas estrutural e funcional de animais, plantas e
espécies microbianas. A detecção de loco de características quantitativas (Quantitative
Loci Traits - QTLs), principais em mapas de ligação genéticos baseada em marcadores
moleculares, oferece uma refinada visão da arquitetura genética de caracteres
quantitativos e uma ferramenta potencial para melhoramento efetivo por meio de seleção
assistida por marcadores (YOSHIMARU et al., 1998; LING et al., 2000).
Para estabelecer a relação entre as distâncias genéticas entre dois locos no mapa
e a frequência de gametas recombinantes criaram-se as funções de mapeamento
(LYNCH & WALSH, 1998). Um grande número de funções de mapeamento tem sido
26
desenvolvido (HALDANE, 1919; KOSAMBI, 1944; RAO et al., 1977; FELSENSTEIN,
1979; KARLIN, 1982), sendo as funções de Haldane e Kosambi as mais utilizadas no
mapeamento genético de vegetais (STAUB et al., 1996).
A função de Haldane admite que a ocorrência de permuta entre as cromátides não
irmãs ocorra de maneira independente com ausência de interferência. Ao contrário, a
função de Kosambi admite a ocorrência de permutas próximas como eventos não
independentes (presença de interferência). Assim, esta função assume a interferência
completa entre regiões arbitrariamente próximas, sendo decrescente para locos mais
distantes, e iguais a zero para locos independentes (WEIR, 1996).
Outro aspecto importante, é que não existe correlação entre distância física
(número de pares de bases) e distância de mapa, ou seja, existem regiões
cromossômicas de apenas algumas dezenas de milhares de pares de bases (distância
física pequena) em que a probabilidade de recombinação é alta (regiões-alvo de
recombinação – hot spots). Ao mesmo tempo, há regiões de alguns milhões de pares de
bases (distância física grande) onde a recombinação é praticamente suprimida e a
distância entre os locos, mínima como nas regiões centroméricas e teloméricas
(TANKSLEY et al., 1992; FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1996; JIANG et al., 1997;
SALIBA-COLOMBANI et al., 2000).
O método mais importante e comum de mapeamento utiliza a frequência de
recombinação para determinar a distância relativa entre duas características ligadas.
STURTEVANT (1913) estabeleceu que a frequência de quiasmas entre dois genes
ligados é de certa forma proporcional à distância física entre ambos. Esse princípio é a
base para o mapeamento genético. Uma unidade de centiMorgan equivale a
aproximadamente 1% de recombinação quando os marcadores estão bastante próximos,
ou podem diferir da porcentagem de recombinação quando estão mais distantes em vista
da ocorrência de crossing-over duplo, triplo, etc. Diversas funções de mapeamento têm
sido utilizadas na correção das distâncias calculadas em porcentagem de recombinação
para a distância em centiMorgan (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1996).
27
Os caracteres mapeados devem distribuir-se de acordo com um padrão de
segregação mendeliana. Este padrão pode ser verificado através do teste do Quiquadrado ( 2). De modo geral recomenda-se, preferencialmente, o descarte dos locos que
apresentam distorções da segregação mendeliana para não comprometer a qualidade do
mapa (BEARZOTI, 2000).
Nas análises baseadas em modelo, também chamadas de LOD score ou análise
paramétrica, admite-se que todos os aspectos do modelo estatístico, exceto a taxa de
recombinação, são conhecidos. A verossimilhança é a probabilidade de se observar um
quadro da distribuição de genótipos em uma família, dada a existência da ligação com um
valor q da recombinação versus a mesma probabilidade estimada para segregação
independente. Um valor de LOD maior que 3 indica que a hipótese alternativa tem uma
verossimilhança mil vezes maior que a hipótese nula, e é indicativo da existência da
ligação entre o marcador e o fenótipo estudado. Valores de LOD score maiores que 1,5 e
menores que três sugerem a existência de ligação, enquanto valores iguais ou menores
que -2 indicam a inexistência de ligação.
3 OBJETIVOS
Este estudo visa selecionar marcadores moleculares microssatélites que estejam
fortemente ligados a genes que conferem resistência à ferrugem asiática e ao oídio da
soja, possibilitando o mapeamento destes genes nos diferentes grupos de ligação da soja,
dando deste modo subsídios ao programa de melhoramento da soja e por fim, a obtenção
de cultivares com resistência/tolerância a esse patossistema (ferrugem asiática e oídio da
soja). Os resultados obtidos aqui auxiliarão na solução dos problemas decorrentes da
introdução
desses
patógenos
e
ainda
sustentabilidade do agronegócio da soja.
na
manutenção
da
competitividade
e
28
3.1 Objetivos Específicos
Assim, para que ocorra uma interação e aceleração na busca destes novos genes,
bem como o entendimento dos mecanismos de reação dos genótipos de soja a cada um
destes patógenos, o presente estudo contempla os seguintes objetivos específicos:
- Estudar a herança de caracteres qualitativos e quantitativos nos genótipos de soja
relacionados à resistência ao oídio e ferrugem asiática da soja e;
- Selecionar e identificar marcadores moleculares microssatélites fortemente
ligados aos genes de resistência à ferrugem asiática e ao oídio da soja;
29
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CAPÍTULO 2 - RESISTÊNCIA À FERRUGEM ASIÁTICA DA SOJA: HERANÇA DE
CARACTERES QUALITATIVOS E QUANTITATIVOS E MAPEAMENTO GENÉTICO
RESUMO - A ferrugem asiática da soja, causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi
Sydow & Sydow vem causando grandes perdas nas áreas sojícolas de muitos países. O
objetivo principal desse trabalho foi estudar a herança de caracteres qualitativos e
quantitativos e mapear genes de resistência a esta doença, utilizando uma população de
plantas F2 e F2:3 derivada do cruzamento entre os genótipos resistentes PI 200487
(Kinoshita) e PI 200526 (Shira Nui) com o genótipo suscetível BRI98-641. As populações
de mapeamento e os genótipos parentais foram inoculados com esporos de P. pachyrhizi,
sendo avaliadas quanto ao tipo de lesão como resistentes (lesões RB) ou suscetíveis
(lesões TAN), índice de severidade e número de urédias. Modelos genéticos de média e
de variância também foram ajustados para os caracteres quantitativos. Um total de 214
marcadores microssatélites foram testados para os genitores dos cruzamentos, sendo os
polimórficos utilizados para genotipar as plantas da geração F2, que foram inoculadas e
avaliadas para resistência/suscetibilidade à ferrugem. As duas populações apresentaram
um gene dominante para o caráter, os quais foram mapeados no mesmo grupo de
ligação, o GL-N da soja. Nas análises quantitativas, o modelo aditivo-dominante foi
suficiente para explicar a herança dos dois caracteres. Foi detectada a presença de genes
que contribuem para aumento ou redução da severidade de doença nos dois parentais
resistentes e também na testadora suscetível envolvida nos dois cruzamentos. Para o
caráter número de urédias os genes podem estar concentrados apenas nos parentais
resistentes. A seleção para número de urédias é mais eficiente que para severidade, pois
é menos influenciada pelas variações ambientais. Apesar disso, o caráter severidade
continua sendo extremamente interessante para processos seletivos por permitir ganhos
com seleção e ser mais fácil de ser avaliado.
Palavras-chave: Glycine max, microssatélites, Phakopsora pachyrhizi, resistência a
doença
47
Introdução
A ferrugem asiática da soja, causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi, tem sido
relatada em todo mundo, exibindo financeiramente um prejuízo no Brasil de US$ 204,5
milhões que, somado ao gasto para o controle da doença, resultou em um custo total de
US$ 1,97 bilhão (EMBRAPA, 2008).
Enquanto cultivares com resistência à ferrugem asiática da soja não estão
disponíveis, são necessárias várias aplicações de fungicidas foliares, que se constitui na
ferramenta viável para minimizar os danos causados, onerando os custos da produção
para o agricultor.
O
patógeno
apresenta
uma
alta
diversidade
genética,
dificultando
o
desenvolvimento de cultivares que sejam efetivas por um longo período. Vinte raças de
ferrugem asiática foram identificadas em amostras coletadas em plantas de soja e
hospedeiros selvagens no Japão, nove raças em 42 isolados em Taiwan e 59 raças em
69 isolados na Tailândia. No Brasil, embora não haja comprovação científica, devido à
inexistência de trabalhos com hospedeiros diferenciadores de raças até o momento,
admite-se que haja também inúmeras raças fisiológicas do patógeno em campos de soja.
A resistência mediada pelos genes dominantes Rpp é monogênica e raça-específica,
frequentemente explicada pela teoria gene-a-gene.
Devido à alta especificidade desta interação planta-patógeno no reconhecimento
entre moléculas elicitoras do fungo e o produto dos genes R da planta, essa resistência
frequentemente é quebrada pelo patógeno, o que normalmente causa elevados danos à
cultura.
Até o momento os esforços de pesquisas buscando identificar genótipos de soja
resistentes resultou na identificação de cinco genes dominantes de resistência à ferrugem
asiática dominantes, descritos e nomeados Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4 e Rpp5,
identificados nas introduções das plantas (PIs), PI 200692, PI 230970, PI 462312 (Ankur),
PI 459025 e PI 200526, respectivamente (CHENG & CHAN, 1968; HIDAYAT &
SOMAATMADJA, 1977; BROMFIELD & HARTWIG, 1980; HARTWIG, 1986; GARCIA et
48
al., 2008). Outras fontes de resistência à ferrugem asiática da soja vêm sendo
extensivamente estudada em instituições públicas e privadas em muitos países. O
surgimento de novas raças do patógeno tem sido capaz de quebrar a resistência de
alguns genótipos, como aconteceu recentemente com Rpp1 e Rpp3 (GODOY, 2005).
Pesquisas biotecnológicas com marcadores moleculares microssatélites ou SSR
(Simple Sequence Repeats) vêm sendo desenvolvidas para mapear os genes de
resistência à ferrugem asiática no mapa genético da soja. Seis destes genes de
resistência já foram identificados e mapeados, nomeados Rpp1 no GL-G (HYTEN et al.,
2007), Rpp-FT 2 (BROGIN 2005) e Rpp-Hyuuga (MONTEROS et al., 2007) no GL-C2,
Rpp2 no GL-J e Rpp4 no GL-G (SILVA et al., 2008), Rpp5 no GL-N (GARCIA et al., 2008)
e Rpp3 (HYTEN et al., 2009).
Testes de alelismo identificaram que os genótipos PI 200487 (Kinoshita) e PI
200526 (Shira Nui) possuem um gene Rpp independente em relação aos locos Rpp2 e
Rpp4 e ativo contra o isolado brasileiro que quebrou a resistência dos genes Rpp1 e Rpp3
(LAPERUTA et al.2008; GARCIA et al.2008; RACHID, 2008).
Assim, os objetivos deste trabalho foram estudar a herança de caracteres
qualitativos e quantitativos e confirmar o mapeamento dos genes maiores que conferem
resistência à ferrugem presentes nos genótipos PI 200487 (Kinoshita) e PI 200526 (Shira
Nui).
Material e Métodos
Material Genético
Duas
populações
distintas
foram
utilizadas
para
análises
fenotípicas
e
mapeamento molecular, obtidas a partir dos cruzamentos PI 200487 (Kinoshita) x BRI98641 e PI 200526 (Shira Nui) x BRI98-641 (daqui por diante referidas como populações
KBR e SBR, respectivamente). Essas populações consistiram de 117 e 115 indivíduos,
49
respectivamente, e foram desenvolvidas na Embrapa Soja, Londrina, Paraná, Brasil,
durante as safras 2006/07 e 2008.
As duas populações de mapeamento F2:3 e os genitores foram cultivados em casade-vegetação para a avaliação da resistência à ferrugem e para a coleta de folhas. Os
tecidos foliares foram estocados a -80ºC para a extração de DNA. As sementes dos
genótipos em estudo foram cedidas pelo Banco Ativo de Germoplasma de Soja (BAGs)
da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa Soja).
Instalação e delineamento do experimento
O experimento foi instalado em casa-de-vegetação com temperatura controlada,
variando de 20 a 28ºC. Quinze indivíduos de cada genótipo parental e de cada F2:3 para
cada cruzamento foram cultivadas em vasos com 20 cm de diâmetro e 25 cm de altura,
contendo cerca de 4,5kg de uma mistura de solo, areia e esterco bovino, distribuídos sob
delineamento em blocos ao acaso, sendo cada parcela representada por uma planta.
Inoculação e Avaliação
Como o agente causador da ferrugem da soja é um parasita obrigatório, a
população do patógeno foi mantida em plantas suscetíveis de soja em casa-devegetação. O inóculo consistiu de uma população fúngica coletada em campos comerciais
no estado do Mato Grosso e mantida na cultivar BRSMS Bacuri em condições de casade-vegetação. Os urediniósporos foram coletados batendo-se as folhas infectadas sobre
uma bandeja plástica e diluídos em água destilada com 0,05% (v/v) de “Tween 20”
(Uniqema) para uma concentração final de aproximadamente 150.000 esporos/ml. As
plantas foram inoculadas quando atingiram o estádio de desenvolvimento V3-V4 de
acordo com a escala proposta por FEHR & CAVINES (1977). A inoculação das plantas,
utilizando-se pulverizador manual, foi realizada ao anoitecer para evitar a inviabilização
50
dos uredósporos pela falta de água livre na folhas e baixa umidade do ambiente,
causados pelas temperaturas mais altas na casa-de-vegetação durante os horários de
maior insolação.
Doze dias após a inoculação, os genitores e as famílias F2:3 , foram analisados
qualitativa e quantitativamente para os seguintes caracteres: tipo de lesão, número de
urédias e nível de infecção. A classificação para o tipo de lesão foi visual, caracterizando
os tipos de lesões como resistentes ou suscetíveis. Lesões de resistência ou RB (Reddish
Brown) caracterizam-se pela cor castanho-avermelhada, com pouca ou nenhuma
esporulação, enquanto as lesões de suscetibilidade ou TAN caracterizam-se pela cor
castanho-claro com alta esporulação de urédias. A contagem do número médio de
urédias por lesão foi realizada com o auxílio de uma lupa com capacidade de aumento de
20x. O nível de infecção ou a severidade foi avaliado com base na escala diagramática
descrita por MARTINS et al. (2004). Na primeira avaliação, foi tomado o trifólio mais
infectado (normalmente o terceiro), o qual foi identificado para que as próximas avaliações
fossem realizadas sempre no mesmo trifólio. Os caracteres qualitativos e quantitativos
foram avaliados três vezes, ao longo de três semanas consecutivas.
Extração de DNA e Estratégia de Mapeamento
Amostras de tecido foliar das plantas F2 dos dois cruzamentos foram coletadas e
mantidas em ultra freezer (-80ºC) até o momento da extração de DNA. A extração de DNA
dos genótipos parentais e dos indivíduos da geração F 2 foi realizada com base no
procedimento descrito por KEIM et al. (1988), com algumas modificações. O DNA foi
então quantificado por análise espectrofotométrica e diluído para uma concentração de
10ng/µl.
O polimorfismo entre os genótipos parentais foi verificado com o teste de
marcadores de microssatélites distribuídos nos vinte grupos de ligação da soja
desenvolvidos pelo Centro de Pesquisa Agrícola de Beltsville – BARC/ARS (CREGAN et
al., 1999; SONG et al., 2004). A informação de sequências dos iniciadores para todos os
51
marcadores
microssatélites
utilizados
está
disponível
no
site
“Soybase”
(http://soybase.agron.iastate.edu/resources/ssr.php; SOYBASE, 2008). Para garantir uma
cobertura suficiente de todo o genoma da soja, pelo menos um marcador polimórfico em
cada 30 cM foi utilizado, em cada um dos 20 grupos de ligação da soja.
Foram utilizados também marcadores microssatélites ligados a genes de
resistência a várias outras doenças já mapeadas em soja, como resistência a Phakopsora
pachyrhizi (SILVA et al., 2008; MONTEROS et al., 2007; BROGIN, 2005), Phytophthora
(SANDHU, 2005; DEMIRBAS et al., 2001), Microsphera diffusa (POLZIN et al., 1994),
Meloidogyne javanica (FUGANTI et al., 2004), Fusarium solanum f. sp. glycines
(FRONZA, 2003), Heterodera glycines (BENEVENTI et al., 2004; SCHUSTER et al.,
2001), Phialophora gregata (KLOS et al., 2000; BACHMAN et al., 2001), uma vez que os
genes de resistência a doenças podem encontrar-se agrupados.
Com objetivo de acelerar a identificação de marcadores ligados a resistência a
ferrugem foi utilizada a estratégia de análises de agrupamentos segregantes (Bulked
Segregant Analysis – BSA; MICHELMORE et al., 1991), com algumas modificações.
Foram formados dois grupos, o primeiro consistindo de 10 indivíduos da população F2
caracterizados como resistentes e 10 indivíduos caracterizados como suscetíveis. Esses
grupos foram obtidos a partir dos resultados das avaliações fenotípicas à ferrugem
asiática da soja na população segregante F2, permitindo a seleção de somente plantas
homozigotas para cada fenótipo diferente, trabalho similar ao realizado por BROGIN
(2005). As amostras de DNA dos genitores e dois agrupamentos, para cada cruzamento,
foram usados para a análise de microssatélites. Para confirmar uma possível ligação,
marcadores polimórficos encontrados entre os agrupamentos com diferenças alélicas
foram usados para genotipar os indivíduos de toda a população F2.
A amplificação dos locos microssatélites foi realizada de acordo com a metodologia
descrita por AKKAYA et al. (1995), com modificações. A eletroforese para verificar os
fragmentos amplificados foi realizada em géis de poliacrilamida 10%.
52
Análise dos Dados
Análises quantitativas
Os caracteres nível de infecção, avaliado através da severidade da área foliar
infectada pelo patógeno, e número de urédias, foram obtidos a partir de 12 dias da
inoculação, ao longo de três semanas consecutivas. Os dados foram analisados através
de médias e variâncias das diferentes gerações (parentais e F2:3) utilizando os programas
computacionais GENFIT e Sistema de Genética e Quantitativa-SGQ (MATHER & JINKS,
1982). Os modelos genéticos aplicados sobre médias relacionadas às linhas puras e
gerações derivadas de cruzamentos entre elas são (MATHER & JINKS, 1982):
onde:
m é o efeito genético e ambiental comum no cruzamento;
[d] é o efeito genético aditivo;
[h] é o efeito genético de dominância;
[i] é o efeito genético da interação aditiva x aditiva;
[l] é o efeito genético da interação dominante x dominante.
Os modelos genéticos aplicados sobre as variâncias das gerações estudadas foram:
VP1 = E;
VP2 = E;
53
V1F3 (entre famílias) = 1/2 D + 1/16 H + (1/n) V2F3, e
V2F3 (dentro de famílias) = 1/4 D + 1/8 H + E.
onde:
VP1, VP2, V1F3 e V2F3 são, respectivamente, as variâncias do parental 1, parental 2,
geração F3, entre e dentro de famílias;
D é a variância genética aditiva;
H é a variância genética de dominância;
E é a variância ambiental aditiva, e
n é o número de indivíduos dentro das famílias F3.
Análises moleculares
Obtidos os resultados das avaliações da reação das famílias F2:3 à ferrugem que
caracterizaram as plantas F2 em homozigotas resistentes, heterozigotas e homozigotas
suscetíveis, foi aplicado o teste de qui-quadrado ( 2) para verificar se a segregação
observada para as três classes formadas corresponde à proporção esperada de um gene
dominante.
Todos os marcadores foram avaliados como codominantes. A reação à ferrugem
foi avaliada como um caráter qualitativo codominante, utilizando os resultados da
avaliação das progênies F2:3. A razão de segregação para os marcadores microssatélites
também foi submetida ao teste de aderência ao modelo com um único loco utilizando o
teste do Qui-quadrado (P>0,05). A análise de ligação e a construção do mapa foram
realizadas com o programa Mapmaker/EXP (LANDER et al., 1987) utilizando a função de
mapeamento de Kosambi (KOSAMBI, 1944). O critério de ligação foi um LOD escore 3,0
e uma distância máxima de 37,2 cM.
Após a construção do mapa genético, procedeu-se ao mapeamento dos QTLs por
54
meio do programa Mapmaker/QTL versão 1.1b, com um LOD score 2,0. Os QTLs foram
analisados por mapeamento por intervalo simples em populações F2:3 derivadas do
cruzamento SBR e KBR, utilizando marcadores codominantes e médias dos caracteres,
índice de severidade em diferentes tempos (1, 2 e 3) e número de urédias (1, 2 e 3)
submetida à análise para identificar a ligação entre o marcador e o caráter.
Resultados
As primeiras lesões causadas pelo patógeno nas folhas, com urédias em plena
esporulação, foram observadas doze dias após a inoculação. Os genótipos Kinoshita e
Shira Nui apresentaram lesões do tipo RB, características de genótipos resistentes à
ferrugem e a linhagem BRI98-641, altamente suscetível, apresentou somente lesões do
tipo TAN.
Dados quantitativos
Nas análises quantitativas, as médias, as variâncias e os graus de liberdade das
gerações parentais e F2:3, utilizados para a obtenção dos parâmetros genéticos de média
e variância dos caracteres severidade e número de urédias em reação à ferrugem
asiática, encontram-se na Tabela 1. Na tabela 2, estão resumidos os modelos de média e
variância ajustados para os dois caracteres quantitativos.
55
Tabela 1. Graus de liberdade (n), médias (x) e variâncias (Var.) conjuntas dos dois
experimentos, para o caráter severidade (1, 2 e 3) e número de urédias (1, 2 e 3),
das gerações parentais e F 2:3 .
Geração
PI200487 (R)
BRI98-641 (S)
PI200487 vs BRI98-641
PI200526 (R)
BRI98-641 (S)
PI200526 vs BRI98-641
Geração
PI200487 (R)
BRI98-641 (S)
PI200487 vs BRI98-641
PI200526 (R)
BRI98-641 (S)
PI200526 vs BRI98-641
Severidade 1
x
10,64
11,44
12,42
3,43
3,57
3,26
Urédia 1
n
x
14
1,50
15
5,40
1640
3,12
14
2,64
15
4,87
1660
3,15
n
14
15
1638
14
15
1666
Var.
47,32
56,30
72,74
5,49
6,42
6,61
Var.
0,27
1,54
1,95
0,4
0,27
0,95
Severidade 2
x
Var.
60,00
348,92
56,60
532,11
47,71
630,76
8,71
41,76
8,44
28,42
8,30
42,48
Urédia 2
n
x
Var.
8
2,00
0,001
9
6,11
1,11
1224
2,93
2,11
14
2,50
0,27
15
4,73
0,50
1656
3,14
0,84
n
14
15
1540
14
15
1657
n
15
15
1578
14
15
1644
Severidade 3
x
Var.
271,54
271,54
427,11
15,96
402,41
199,89
n
68,40
68,40
63,99
16,43
27,47
19,37
Urédia 3
x
4
4
617
14
15
1638
1,00
5,50
2,92
2,21
4,93
3,22
0,001
1,00
2,35
0,18
0,35
0,67
Var.
*(R) e (S): respectivamente, resistente e suscetível a ferrugem asiática da soja.
Nas análises genéticas com base no fenótipo, os efeitos aditivos [d] foram
significativos para número de urédias em todas as avaliações para os dois cruzamentos e
para severidade 1 e severidade 3 no cruzamento SBR (Tabela 2).
A dominância [h] foi significativa apenas para severidade 2 no cruzamento KBR e
para o número de urédias em todas as avaliações do cruzamento SBR e para urédia 2 do
cruzamento KBR. A dominância sempre foi direcionada para resistência ou redução da
severidade e do número de urédias (Tabela 2).
Nos modelos de variância, a variância aditiva (D) foi significativa em todas as
avaliações nos dois cruzamentos, enquanto a variância de dominância (H) participou
apenas no modelo para o caráter urédia 1 no cruzamento SBR. A interação genótipo x
microambiente (E1 e E2) esteve presente principalmente para o caráter número de
urédias no cruzamento KBR (Tabela 2).
56
Tabela 2. Modelos genéticos de médias e variância, efeito genético aditivo ([d]),
dominância ([h]), qui-quadrado ( 2), graus de liberdade (g.l), probabilidade (P),
efeito de variância genética aditiva (D), variância ambiental aditiva (E), efeito
microambiente (E1 e E2), herdabilidade (h2), ajustados nos caracteres severidade
(1, 2 e 3) e urédias (1, 2 e 3), avaliados para os dois cruzamentos.
PI200526
PI200487
x
x
BRI98-641
BRI98-641
Severidade 1
PI200526
PI200487
x
x
BRI98-641
BRI98-641
Severidade 2
PI200526
PI200487
x
x
BRI98-641
BRI98-641
Severidade 3
3,26±0,065
12,38±0,21
0,78±0,47
0,25
1,16
1
2
0,61
0,56
1,07±0,26
5,17±1,97
6,33±0,25
71,08±2,73
0,099
1,04
2
2
0,95
0,59
54,05
31,01
Urédia 1
8,3±0,16
58,18±3,83
-49,90±15,53
0,016
0,32
2
1
1
0,57
3,38+-1,26
63,31±19,50
41,51±1,60
611,46±24,52
0,70
1,33
2
2
0,70
0,51
36,05
37,45
Urédia 2
19,42±0,35
64,13±0,52
3,20±1,1
0,93
2,08
1
2
0,33
0,35
31,26±7,99
46,15±13,61
412,61±16,39
368,63±16,61
15,89+-6,22
0,06
1,67
1
2
0,8
0,43
53,0
40,0
Urédia 3
g.l
P
D
H
E
3,75±0,11
1,11±0,10
-2,42±0,45
0,80±0,27
3,32±1,14
0,33±0,090
3,13±0,43
1,73±0,13
3,17
1
0,07
2,18±0,31
-
3,61+-0,11
1,11+-0,11
-1,9+-0,47
1,69±0,21
0,41±0,058
4,05±0,17
2,05±017
-4,5±0,73
1,78±0,26
-
3,57±0,095
1,36±0,095
-1,40±0,40
1,67±0,18
0,25±0,046
2,95±0,80
1,95±0,81
1,56
1
0,21
1,02±0,26
-
E1
-
0,28±0,11
-
0,001±0,00053
-
0,001±0,00081
E2
0,51
1
0,47
32,0
2,50±0,23
1,10
1
0,29
91,0
1,1
2
0,57
97,0
3,30±0,22
1,79
1
0,18
83,0
1,62
2
0,44
98,0
4,16±0,31
0,87
1
0,35
47,35
Parâmetros
genéticos
m
[d]
[h]
2
g.l
P
D
E
E1
E2
2
gl
P
2
h
m
[d]
[h]
2
2
g.l
P
2
h
* Nas análises de média no carater urédia para o cruzamento SRB, não sobraram graus de liberdade para testar o modelo pelo qui-quadrado
A dominância [h] foi significativa apenas para severidade 2 no cruzamento KBR e
para o número de urédias em todas as avaliações do cruzamento SBR e para urédia 2 do
cruzamento KBR. A dominância sempre foi direcionada para resistência ou redução da
57
severidade e do número de urédias (Tabela 2). Nos modelos de variância, a variância
aditiva (D) foi significativa em todas as avaliações nos dois cruzamentos, enquanto a
variância de dominância (H) participou apenas no modelo para o caráter urédia 1 no
cruzamento SBR. A interação genótipo x microambiente (E1 e E2) esteve presente
principalmente para o caráter número de urédias no cruzamento KBR (Tabela 2).
Dados qualitativos
Em ambas as populações, a proporção de plantas resistentes e suscetíveis na
população F2 foi de 3:1, indicando a presença de um único gene dominante (Rpp)
conferindo resistência em Shira Nui e Kinoshita (Tabela 3). Este resultado foi confirmado
na geração F3, onde se observou a segregação de 1:2:1 envolvendo homozigotos
resistentes, heterozigotos e homozigotos suscetíveis das famílias F2:3 (Tabela 3).
Tabela 3. Resultado das análises de segregação e teste de Qui-quadrado da segregação
fenotípica quanto à resistência a ferrugem asiática da soja (geração F 2:3) e para
os marcadores moleculares microssatélites (geração F2), na população de
mapeamento.
Marcador/caráter
Proporção
a
observada
a
Proporção esperada
Qui-quadrado
b
c
Probabilidade (%)
A
B
C
A
B
C
2.542ns
Rpp(Shiranui)F2
22
29,50
96
88,50
11.08
2.231ns
32.71
Rpp(Shiranui)F2:3
27
65
23
29,50 59,0 29,50
2.58ns
Satt152
28
65
22
29,50 59,0 29,50
27.49
2.35ns
Satt675
28
64
22
29,50 59,0 29,50
30.87
2.68ns
Satt080
30
63
21
29,50 59,0 29,50
26.13
2.86ns
Satt624
28
64
21
29,50 59,0 29,50
23.95
0.31ns
83.39
Satt631
27
60
27
29,50 59,0 29,50
0.81ns
Rpp(Kinoshita)F2
84
33
42.83
5.34ns
Rpp(Kinoshita)F2:3
23
71
23
29,75 59,5 29,75
6.91
20.96ns
0.0028
Satt080
21
82
13
29,75 59,5 29,75
0.74ns
Satt152
28
55
33
29,75 59,5 29,75
69.02
3.1ns
21.20
Satt675
24
68
25
29,75 59,5 29,75
1.56ns
Satt530
24
63
26
29,75 59,5 29,75
45.69
0.16ns
Sat084
31
58
28
29,75 59,5 29,75
92.20
a
A, B e C representa: genótipo homozigoto equivalente ao da linhagem parental resistente, genótipo heterozigoto e
genótipo homozigoto equivalente ao da suscetível, respectivamente.
b
ns : não significativo ao nível de significância de 5% .
c
Probabilidade
58
Foram testados 87 marcadores microssatélites para o cruzamento SBR, sendo 28
marcadores polimórficos, e para o cruzamento KBR foram testados 127 marcadores
microssatélites, sendo 39 polimórficos e testados para determinação da ligação com o
gene de resistência, ou seja, uma eficiência de 32% e 31%, para cada cruzamento,
respectivamente.
Realizada a genotipagem dos indivíduos da geração F 2 com base na avaliação
fenotípica das famílias F2:3,verificaram-se a ligação putativa de cinco deles, ao loco Rpp
(Kinoshita) pertencentes ao grupo de ligação N, relacionados ao caráter: Satt080,
Satt675, Satt530, Satt152 e Satt084. Para o loco Rpp (Shira Nui) também se verificou a
ligação de cinco marcadores microssatélites no grupo de ligação N, relacionados com o
caráter de resistência: Satt631, Satt152, Satt675, Satt624 e Satt080. Esses marcadores
foram utilizados para a genotipagem da população de mapeamento F2.
A análise de ligação, utilizando o programa computacional Mapmaker, resultou no
mapeamento do gene de resistência à ferrugem asiática da soja (Rpp) no grupo de
ligação N do genoma da soja. Para o Rpp (Kinoshita) a distância entre eles são 20,00cM
do Satt080, a 13,31cM do Satt675, a 5,51cM do Satt530, a 17,69cM do Satt152 e a
34,96cM do Sat_084, os quais estão flanqueando o gene de resistência. Para o loco Rpp
(Shira Nui) a distância entre eles são 7,86cM do Satt080, a 6,94cM do Satt624, a 6,54cM
do Satt675, a 8,78cM do Satt152, e a 6.44cM do marcador Satt631, os quais estão
flanqueando o gene de resistência (Figura 1). Não houve distorção de segregação
significativa para nenhum dos locos de microssatélites analisados de acordo com o teste
do
2
(P>0,05) (Tabela 3).
59
Figura 1. Mapas de ligação da região genômica do Rpp Shira Nui (A), Rpp Kinoshita (B) e
o mapa consenso da soja (C). No lado esquerdo da figura (A e B) é mostrado o
mapa genético gerado neste estudo e no lado direito é mostrada parte do grupo
de ligação do mapa consenso N. (A) e (B), mostrando os marcadores mapeados
na região com distâncias cumulativas em cM. No lado direito do grupo de ligação
consenso são mostrados QTLs para locos de resistência mapeados nesta região
(SCN - Soybean Cist Nematode ou Nematóide de Cisto; SDS - Sudden death
syndrome ou Síndrome da morte súbita; Lf - Leaf area ou Área foliar; ScleroSclerotinia). Estas porções do mapa de ligação consenso foram geradas na
página da web do Soybase (mapa físico da cultivar Williams; SOYBASE, 2008).
Na porção final de cada mapa, QTLs identificados para número de urédias em
associação aos locos de microssatélites nas duas populações.
60
Foram identificados marcadores em associação com QTLs, envolvidos na
resistência à ferrugem asiática da soja avaliadas nas progênies F2:3 p ara os
cruzamentos SBR e KBR. O número médio de urédias foi significativamente associado
aos locos dos marcadores microssatélites (Figura 1), enquanto o nível de infecção
não foi associado e não integrado ao mapa de ligação.
Discussão
Herança dos genes maiores
Neste estudo, os padrões de segregação observados nos cruzamentos entre essas
duas fontes com o genótipo suscetível, demonstraram que as fontes Shira Nui e Kinoshita
têm sua resistência determinada por um gene dominante. Uma das fontes de resistência
estudadas neste trabalho, a PI 200487 (Kinoshita), está entre as fontes identificadas por
LAPERUTA et al. (2008), por apresentar um gene de resistência ativo contra o isolado do
fungo que quebrou a resistência conferida pelos genes Rpp1 e Rpp3 e por estar em loco
diferente em relação aos locos Rpp2 e Rpp4. Nos estudos de alelismo envolvendo
cruzamentos dessa fonte com os testadores (Rpp2 e Rpp4) realizados por esses autores,
o padrão de segregação foi compatível à presença de dois genes de resistência, um em
cada parental.
As fontes PI 200487 e a PI200526, também, foram observadas por PIEROZZI et al.
(2008) em estudos de herança com testadores suscetíveis e por RACHID (2008) em
estudos de alelismo envolvendo outras fontes de resistência. Esses autores também
observaram padrões de segregação compatíveis com a presença de um gene dominante
nesses materiais, confirmando os resultados deste trabalho.
61
Herança dos caracteres quantitativos
A presença da variância genética aditiva (D) significativa em todas as avaliações
realizadas para os caracteres severidade e número de urédias nos dois cruzamentos,
mostra que existem diferenças genéticas que podem ser exploradas através de seleção
nos programas de melhoramento de soja. No caso do caráter severidade, a presença de
D na ausência de [d] indica que os genes que controlam o caráter estão dispersos nos
dois parentais e, portanto, existem genes desejáveis para redução da severidade não só
no parental resistente como também no parental considerado suscetível à doença. Esse
fato ocorreu principalmente para o cruzamento KBR e mostra que existem diferenças
entre essas duas fontes estudadas, o que se confirma tanto pela presença mais frequente
de [d] no cruzamento SBR como pelas diferenças observadas nos valores da média (m)
entre cruzamentos.
A dominância esteve presente principalmente nos modelos de médias para o
caráter número de urédias do cruzamento SBR, mostrando que, embora a fonte Shira Nui
tenha um gene maior mapeando no mesmo GL de Kinoshita, existem outros genes
afetando esse caráter que são divergentes nessas duas fontes.
A interação genótipo x microambiente expressa pela presença de E1 e E2 nos
modelos de variância principalmente para o caráter número de urédias no cruzamento
KBR, indica que alguns genótipos estão reagindo diferencialmente às variações
microambientais, o que pode ser um fator complicador nas avaliações e para processos
seletivos realizados pelos programas de melhoramento. A presença da interação
predominantemente no cruzamento envolvendo a fonte Kinoshita é outro fato que a
diferencia da fonte Shira Nui.
As herdabilidades variaram de 31% a 54% para severidade e 32% a 98% para o
número de urédias (Tabela 2). Para severidade, o cruzamento SBR se destacou
apresentando as maiores herdabilidades na primeira e na última avaliação. Para o
número de urédias as herdabilidades foram mais elevadas para a maioria das avaliações
62
nos dois cruzamentos. No cruzamento KBR, a herdabilidade começou alta na primeira
avaliação e foram diminuindo nas demais avaliações.
De um modo geral, o modelo genético aditivo-dominante foi suficiente para explicar
os resultados para os dois caracteres quantitativos avaliados nas diferentes épocas, não
havendo nenhum indício da presença de efeitos epistáticos ou de interação não alélica
afetando a severidade ou o número de urédias. Como a linhagem testadora utilizada nos
dois cruzamentos foi a mesma, pode-se concluir que existem genes que contribuem para
aumento ou redução da severidade de doença nas folhas nos dois parentais resistentes e
também na testadora suscetível envolvidos nos dois cruzamentos. A mesma conclusão
não pode ser expandida para o caráter número de urédias, já que houve divergência entre
os parentais nos dois cruzamentos ao longo de todas as avaliações e, portanto, os genes
que afetam esse caráter podem estar concentrados apenas nos parentais resistentes.
A seleção para o caráter número de urédias é mais eficiente que para o caráter
severidade, pois é menos influenciada pelas variações ambientais. Apesar disso, o
caráter severidade continua sendo extremamente interessante para processos seletivos,
pois ainda permite ganhos com seleção e é mais fácil de ser avaliado.
Mapeamento molecular
Nas duas populações segregantes resistentes à ferrugem asiática da soja o gene
Rpp foi precisamente mapeado na região central do grupo de ligação N através de
marcadores moleculares microssatélites. No cruzamento KBR, os marcadores que
flanqueiam o gene são os Satt530 e o Satt080 e para SBR os marcadores que flanqueiam
o gene são Satt624 e Satt080 (Figura 1).
O mapeamento molecular resultou na identificação de um novo gene de resistência
à ferrugem asiática da soja Phakopsora pachyrhizi posicionado no grupo de ligação N,
chamado nesse trabalho de genes Rpp (Kinoshita) e Rpp (Shira Nui). A identificação de
novos genes de resistência à ferrugem asiática da soja é de grande importância para o
63
melhoramento de plantas aumentando a eficiência do processo de desenvolvimento de
cultivares resistentes.
O loco Rpp (Kinoshita) foi mapeado entre o Satt080 e o Satt530. Outros
marcadores localizados na mesma região (Figura 1B) não foram polimórficos na
população utilizada neste estudo. Situação similar ocorreu no loco Rpp (Shira Nui).
Entretanto, para obter um mapa saturado desta região, esforços adicionais de
mapeamento envolvendo diferentes populações e outros tipos de marcadores
moleculares são necessários.
O mapa de ligação gerado neste estudo mostrou que a ordem dos marcadores
moleculares tem consistência com o mapa de ligação consenso (SONG et al., 2004), com
apenas algumas inversões e diferenças mínimas ente as distâncias (Figura 1). As
diferenças na posição do mapa são esperadas nas análises de ligação onde as
populações geradas para o mapeamento são distintas. Estes mapas podem ser úteis na
seleção de marcadores adequados para a seleção assistida por marcadores em
programas de melhoramento, visando resistência a este patógeno. Embora alguns dos
marcadores mapeados nestas populações não estejam estreitamente ligados aos locos
de resistência, outros marcadores localizados na mesma região podem ser úteis em
germoplasmas diferentes.
Este estudo também possibilitou evidenciar a presença de QTL relacionado ao
caráter urédia para os cruzamentos SBR e KBR com alta variação fenotípica. Esta
variação foi explicada pelos marcadores associado ao QTL que se encontram no grupo
de ligação N da soja, onde foi mapeado o gene Rpp (Kinoshita e Shiranui) (Figura 1). Os
marcadores microssatélites que flanquearam o QTL no cruzamento SBR foram os
Satt080 e Satt624, como variação de 92% e 91%, respectivamente, confirmando o
flanqueamento observado na Figura 1 (A). Para o cruzamento KBR os marcadores
microssatélites que flanqueiam o QTL foram os Satt 080 e Satt530 com variações de 84%
a 92%, respectivamente, também evidenciado na Figura 2 (B). Estes resultados da
associação dos marcadores ao QTLs envolvidos na determinação de urédia estão sendo
64
determinados pelos efeitos aditivos-dominantes na característica de urédia. O pico do
LOD foi acima de 2,0 para todos os tempos avaliados e para todos os marcadores
envolvidos no mapa de ligação apresentados na Figura 1 (A-B). A precisão pode ser
maior com a inclusão de mais marcadores moleculares aproximando do gene Rpp
(Kinoshita)
Estes dados são bem semelhantes aos resultados obtidos nos modelos genéticos
aditivo-dominante (Tabela 2), onde permite observar estes efeitos atuando sobre o
caráter de urédia. Assim, este estudo pode confirmar a presença de QTLs entre os
marcadores que flanqueiam os genes Rpp (Kinoshita) e Rpp (Shiranui), apresentados
pelo alto valor da variação fenotípica.
Sabe-se que as plantas possuem um grande número de genes de resistência e, em
muitos casos, estes genes estão agrupados em regiões do genoma. Vários genes de
resistência a doenças em soja têm sido encontrados agrupados no genoma,
especialmente nos grupos de ligação F, G, J e N (LOHNES & SCHMMITTHENNER,
1997) e genes de resistência a nematóides ou QTL são encontrados nos grupos de
ligação A2, F, G e O (TAMULONIS et al., 1997; MUDGE et al., 1997). Genes análogos de
resistentes (RGA) foram mapeados em soja em alguns grupos de ligação e na
proximidade de genes de resistência a doenças e a nematóides (KANAZIN et al., 1996;
YU et al., 1996). QTLs para resistência ao fungo patogênico Sclerotinia sclerotiorum foram
encontrados nos grupos de ligação F, G, J e N (ARAHANA et al., 2001), onde existem
concentrações de genes de resistência para outros fungos patogênicos, como o Fusarium
(SDS), Phytophthora (Rps) e oídio (Rmd) (POLZIN et al., 1994; DEMIRBAS et al., 2001;
NITJI et al., 2001). Além disso, no grupo de ligação N, os marcadores Satt009 e Satt387
foram associadas à redução no tamanho da lesão para Sclerotinia, com o alelo favorável
proveniente do genótipo Williams 82 (ARAHANA et al., 2001). Williams 82 possui o alelo
Rps1k que confere resistência à podridão radicular Phytophthora (causada por
Phytophthora sojae MJ & JW GERDEMANN Kaufmann), que se encontra na mesma
região dos dois marcadores (DIERS et al., 1992). Um QTL para resistência à SDS foi
localizado próximo ao marcador Satt080 no grupo de ligação N, o marcador Satt 387
65
também foi fortemente associado com a incidência de doença (SHOEMAKER & SPECHT,
1995; NJITI et al., 2001).
Atualmente, novos marcadores microssatélites baseados no sequenciamento de
extremidades de bibliotecas BAC (Bacterial Artificial Chromosome ou Cromossomo
Artificial Bacteriano) estão sendo desenvolvidos pela Universidade do Sul de Illinois
(SCHULTZ et al., 2006). Adicional a estes marcadores, CHOI et al. (2007) adicionaram ao
mapa da soja novas sequências únicas de nucleotídeos (Single Nucleotide Polymorphism
- SNPs). Na região em que os genes Rpp (Kinoshita e Shira Nui) estão posicionados
encontram-se alguns SNPs disponíveis, o que facilita os estudos de mapeamento com
esses marcadores, aumentando a precisão em função da redução das distâncias no
mapeamento.
Esforços vêm sendo extensivamente realizados para identificação de genes Rpp no
genoma da soja. Um primeiro estudo foi obtido na cultivar FT2 em que foi mapeado o
gene de resistência RppFT2 no grupo de ligação C2 (BROGIN, 2005). Nessa mesma
região o gene de resistência proveniente do genótipo japonês Hyuuga também foi
mapeado entre os marcadores Satt460 e Satt307 (MONTEROS et al., 2007). O gene
mapeado na cultivar FT2 não está mais ativo no Brasil devido a alta diversidade e
virulência do patógeno, permanecendo ativo somente o gene presente no genótipo
Hyuuga. HYTEN (2006) relata, também, que no grupo de ligação C2, na mesma posição
onde está localizado o marcador Satt460, encontra-se posicionado o gene de resistência
à ferrugem Rpp3, mapeados nos genótipos PI 462312 e PI 578457. O loco Rpp1,
mapeado no grupo de ligação G confere resposta imune ao isolado de ferrugem Índia-731, usado no experimento de mapeamento. O locus Rpp1 foi mapeado entre os
marcadores Sct_187 e Sat_164, à distância de 0,4 cM de ambos os marcadores (HYTEN
et al., 2007). SILVA et al. (2008) mapearam os genes Rpp2 e Rpp4 em regiões
consideradas hot spots para genes de resistência. O locus Rpp2 foi mapeado por volta de
25 cM de um cluster para genes de resistência no grupo de ligação J, enquanto o locus
Rpp4 foi mapeado no grupo de ligação G, próximo a QTLs para genes de resistência a
várias doenças. Dos cinco genes mapeados até o momento, apenas os genes Rpp2,
66
Rpp4 e Rpp5 conferem resistência à raça de ferrugem asiática descoberta em 2003 no
Brasil (ARIAS et al., 2004; RACHID, 2008).
Estes novos marcadores podem ser úteis para aumentar a densidade de
marcadores nestas regiões. Os marcadores microssatélites ligados ao Rpp (Kinoshita) e
Rpp (Shira Nui), descritos neste trabalho, serão de grande utilidade para assistir a
introgressão de múltiplos locos em uma única cultivar e terão grande valor como um ponto
de início em direção à clonagem destes genes de resistência.
67
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75
CAPITULO 3 - MAPEAMENTO MOLECULAR DE UM NOVO GENE DE RESISTÊNCIA
AO OÍDIO DA SOJA
RESUMO - O oídio da soja, Erysiphe diffusa, desde a safra de 1996/97, passou a
provocar perdas no rendimento de até 40% no Brasil. Dentre as principais alternativas
para o combate do patógeno está o uso de cultivares resistentes. O principal objetivo
deste trabalho foi estudar a herança e mapear um novo gene de resistência ao oídio da
soja e para tal uma população F2:3, derivada do cruzamento BR01-22106 (resistente) e PI
200487 (suscetível), foi utilizada. A presença ou ausência da doença foi avaliada sobre a
população e sobre os parentais, naturalmente infectados pelo fungo em condições de
casa-de-vegetação, sendo os indivíduos classificados como resistentes (sem sintomas)
ou suscetíveis (com sintomas). A população de mapeamento foi avaliada com marcadores
microssatélites, realizando-se previamente uma análise de 10 indivíduos resistentes e 10
indivíduos suscetíveis, para identificação de marcadores ligados. O caráter resistência ao
oídio nesta população foi determinado por um único gene dominante e o estudo permitiu o
mapeamento de um loco red no grupo de ligação C2 da soja. Os marcadores associados
terão grande valor no processo de seleção assistida para este caráter, auxiliando na
manutenção da competitividade e sustentabilidade do agronegócio brasileiro da soja.
Palavras–Chave: Glycine max, microssatélites, Erysiphe diffusa
76
Introdução
A crescente expansão da cultura da soja para novas fronteiras agrícolas brasileiras
com diferentes condições edafo-climáticas tem aumentado as demandas por tecnologias
que dêem sustentação ao sistema de produção, como a resistência genética a doenças.
O oídio da soja Erysiphe diffusa [(Cooke & Peck); BRAUN & TAKAMATSU, 2000],
era considerado uma doença secundária no Brasil e, a partir da safra de 1996/97, passou
a ocorrer de forma generalizada em várias regiões sojícolas, provocando perdas no
rendimento de até 40% e tornando-se uma das doenças mais importantes dessa
leguminosa.
Cultivares resistentes tem-se tornado suscetíveis indicando a variabilidade do
patógeno, porém faltam estudos que confirmem a existência de raças fisiológicas.
Estudos moleculares das regiões espaçadoras internas transcritas (Internal Transcribed
Spacer - ITS) do rDNA vem sendo utilizadas para identificar quais espécies de oídio estão
presentes em soja (Glycine max) (ALMEIDA et al., 2008). As observações sobre a
variabilidade patogênica de E. diffusa tem sido circunstanciais e baseadas em variações
das reações das cultivares em diferentes anos ou regiões produtoras de soja.
Estudos sobre herança da resistência ao oídio em soja demonstram que existem
pelo menos dois genes responsáveis pela resistência. Um gene dominante, denominado
Rmd -c, mantém a planta resistente durante todo o ciclo da soja (LOHNES & BERNARD,
1992). Outro gene, também dominante e denominado de Rmd, é responsável por conferir
resistência de planta adulta (MIGNUCCI & LIM, 1980). No caso, as plantas apresentam
suscetibilidade na fase inicial de desenvolvimento, porém, adquirem resistência à medida
que vão atingindo a fase adulta. Sob condições menos favoráveis ao oídio da soja as
plantas com o gene Rmd apresentam pouco ou nenhum oídio no campo. Aparentemente,
a variabilidade patogênica do fungo tem superado a resistência de algumas cultivares,
exigindo contínuo trabalho de melhoramento genético de soja e estudo da diversidade de
genes resistentes nos germoplasmas disponíveis.
77
Marcadores microssatélites são uma excelente ferramenta molecular para o
posicionamento de características agronômicas nos cromossomos, com as vantagens de
serem eficientes, codominantes, estáveis e abundantes, e baseados em reação de
polimerase em cadeia (Polymerase Chain Reaction – PCR). Até hoje, vários
microssatélites foram identificados e distribuídos ao longo dos cromossomos pelo
Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (United States Department of
Agriculture - USDA-ARS), proporcionando uma excelente cobertura do genoma da soja.
(SONG et al., 2004). Marcadores microssatélites tem também sido amplamente utilizados
para detecção de diversidade genética, identificação genética de cultivares, genotipagem
e seleção assistida por marcadores em soja.
Este trabalho visou estudar a herança e mapear um novo gene de resistência ao
oídio da soja, dando subsídios a programas de melhoramento da soja para
resistência/tolerância a esse patossistema, auxiliando na manutenção da competitividade
e sustentabilidade do agronegócio brasileiro da soja.
Material e Métodos
O presente trabalho foi realizado utilizando a estrutura (casa-de-vegetação e
Laboratório de Biotecnologia Vegetal e Bioinformática) do Centro Nacional de Pesquisa
de Soja. A população de mapeamento foi constituída de 109 indivíduos F 2 e respectivas
famílias F2:3, originadas do cruzamento da linhagem BRI01-22106, resistente, e o
genótipo PI 200487, suscetível ao oídio. As sementes dos parentais foram obtidas da
coleção do Banco Ativo de Germoplasma da Embrapa Soja (Londrina, Paraná, Brasil). A
linhagem BRI01-22106 foi desenvolvida pelo programa de melhoramento da Embrapa
Soja, por possuir características agronômicas desejáveis de resistência à doenças e
pragas. ARIAS et al. (2004), através de estudos de herança constataram na linhagem
BR01-22106 apenas um gene dominante de resistência ao oídio da soja.
78
Em condições de casa-de-vegetação, principalmente no inverno, é comum o
aparecimento da doença sem necessidade de inoculação. Para garantir a presença do
patógeno foram mantidas plantas suscetíveis em fase anterior à instalação do
experimento, considerando-se que se trata de um parasita obrigatório. A infecção das
plantas no experimento ocorreu naturalmente, sem a necessidade de inoculação. Não
houve necessidade de nebulização com água, já que o fungo se desenvolve sobre folhas
secas.
O experimento foi instalado em casa-de-vegetação em maio de 2006, com
temperatura controlada, variando de 18 a 25ºC. A população F2 foi avaliada
qualitativamente, sob um delineamento em blocos casualizados. Em março de 2007,
foram avaliados 15 indivíduos de cada genótipo parental (BRI01-22106 e PI 200487) e de
cada uma das 109 famílias F 2:3. O experimento foi conduzido sob um delineamento em
blocos ao acaso, sendo cada parcela constituída de uma planta. A semeadura foi
realizada em vasos de 4,5 kg, contendo uma mistura de solo, areia e esterco.
Os parentais, a população F2 e as famílias F2:3 foram avaliadas qualitativamente,
após o florescimento classificando as plantas como resistentes (ausência de sintoma) ou
suscetíveis (presença de sintoma). Cada família F2:3, constituída de 15 plantas, foi
independentemente avaliada durante três semanas consecutivas, o que permitiu a
classificação de cada uma das 109 famílias F2:3 como homozigota resistente, heterozigota
resistente ou homozigota suscetível.
As amostras de tecido foliar dos parentais e da população F2, constituídas de três
folhas recém expandidas (estádio V2), foram coletadas e armazenadas no ultra freezer (80ºC). O DNA das amostras foi purificado de acordo com o protocolo descrito por KEIM et
al. (1988), com algumas modificações. O DNA foi então quantificado por análise
espectrofotométrica, através da leitura de absorbância a 260nm e 280nm, e a integridade
foi verificada em gel de agarose 0,8%.
Foi verificado inicialmente polimorfismos entre os parentais BRI01-22106 e
PI200487 através dos marcadores microssatélites, que foram previamente desenvolvidos
(SONG et al., 2004). Os marcadores microssatélites testados foram escolhidos para se
79
conseguir uma cobertura a cada 30 cM nos 20 grupos de ligação da soja (SONG et al.,
2004). Para facilitar a busca de possíveis marcadores ligados aos genes de resistência ao
oídio da soja, foi utilizada uma estratégia baseada na análise de agrupamentos
segregantes (Bulked Segregant Analysis - BSA; MICHELMORE et al., 1991), com
modificações. Foram formados dois grupos, o primeiro consistindo de 10 indivíduos
caracterizados como resistentes e 10 indivíduos caracterizados como suscetíveis,
escolhidos com base nas avaliações fenotípicas das famílias F2:3, permitindo a seleção de
somente plantas homozigotas para cada fenótipo diferente. As amostras de DNA dos
genitores e dos dois agrupamentos, para cada cruzamento, foram usadas para a análise
de microssatélites. Para confirmar uma possível ligação, marcadores polimórficos
encontrados entre os agrupamentos com diferenças alélicas foram usados para genotipar
os indivíduos de toda a população F2.
Para que os resultados tivessem ainda uma maior eficiência para encontrar uma
possível ligação, buscaram-se também marcadores microssatélites ligados a genes de
resistência a patógenos, como resistência a Phakopsora pachyrhizi (BROGIN, 2005;
MONTEROS et al.; HYTEN et al., 2007; SILVA et al., 2008), Phytophthora (SANDHU,
2005), Microsphera diffusa (POLZIN et al., 1994), Meloydogine javanica (FUGANTI et al.,
2004), Fusarium solani f. sp. glycines (FRONZA, 2003) Heterodera glycines (SCHUSTER
et al., 2001;), Phialophora gregata (BACHMAN et al., 2001), entre outros.
As amplificações foram feitas através da técnica de PCR, de acordo com a
metodologia descrita por AKKAYA et al. (1995), com modificações. Os produtos
amplificados foram separados por eletroforese em gel de poliacrilamida 10%, por
aproximadamente 4 horas. Para estimar o tamanho dos fragmentos foram utilizados
marcadores com fragmentos de DNA padrão com escala de 100 pares de bases (pb). Os
fragmentos obtidos foram corados com brometo de etídio e a aquisição da imagem foi
realizada através do sistema digital Kodak DC 290.
Todos os marcadores microssatélites foram testados para associação de
significância com a resistência ao oídio usando teste de aderência ao modelo de um locus
co-dominante utilizando o teste do Qui-quadrado ( 2) (P>0,05), utilizando o programa
80
Mapmaker/EXP (LANDER et al., 1987). Para as análises genéticas, a resistência ao oídio
da soja foi tratada como caráter qualitativo, através dos resultados das progênies F 2:3.
Para a análise de ligação o mesmo padrão de codificação foi utilizado tanto para
caracterizar a reação fenotípica ao oídio como para genotipagem dos marcadores
microssatélites nos indivíduos da geração F2, ou seja, a reação fenotípica foi codificada
como um marcador molecular e mapeada como uma característica qualitativa. O
programa (Mapmaker/EXP) foi utilizado para a realização da análise de ligação com o
valor de LOD score mínimo de 3,0 e opção de função de mapeamento de Kosambi
(KOSAMBI, 1944), com distância máxima de 37,2 centiMorgan (cM).
Resultados e Discussão
As plantas com sintomas de oídio foram visualizadas já nos primeiros estágios
foliares de crescimento, enquanto as avaliações das populações F2 e F2:3 foram iniciadas
no estágio V2. A linhagem BR01-22106 não apresentou sintoma de oídio, confirmando
sua resistência, enquanto o genótipo PI200487, suscetível, dado a presença de sintomas
de oídio.
Nas avaliações fenotípicas da população F2:3 observou-se que as plantas tiveram
comportamento de resistência parcial e resistência completa, pois ao longo das
avaliações plantas consideradas suscetíveis, tiveram os sintomas diminuídos até o
completo desaparecimento. AZEVEDO et al. (2005), observando a estabilidade nos
genótipos de soja em relação à infecção ao oídio, classificou como resistentes,
moderadamente resistentes, suscetíveis e moderadamente suscetíveis. Essas variações
encontradas na resistência podem ser resultantes da existência de variabilidade do
patógeno (raças fisiológicas), ou da influência de alguns genes presentes no parental
suscetível que estão controlando a característica de resistência e suscetibilidade na
população. Embora pouco se saiba sobre a base genética desse fenômeno, maior
resistência de plantas adultas ao oídio tem sido observada neste trabalho.
81
Das 109 famílias F2:3, 31 foram caracterizadas como homozigotas resistentes, 60
heterozigotas resistentes e 18 homozigotas suscetíveis, considerando que das plantas F 2
que deram origem a essas progênies, 86 foram resistentes e 23 foram suscetíveis. A
diminuição de indivíduos suscetíveis nas famílias F2:3 estão relacionados com o aumento
de indivíduos heterozigotos nesta população, uma vez que se tem uma representação
maior de cada indivíduo. Essa proporção observada foi testada para verificar a
conformidade com a proporção
mendeliana
esperada de 3:1, se
adequando
satisfatoriamente aos dados (Tabela 1), confirmando o trabalho de ARIAS et al. (2004) em
que a resistência oriunda da BR01-22106 é condicionada por um gene único dominante.
Tabela 1. Dados referentes a análises de segregação e teste de Qui-quadrado da
segregação fenotípica quanto à resistência a Erysiphe diffusa (geração F2:3) e
para os marcadores moleculares microssatélites (geração F2), na população de
mapeamento.
Marcador/caráter
Proporção
A
Red (F2)
Proporção esperadaa
observadaa
B
86
C
23
A
B
81,75
Qui-quadradob
Probabilidadec (%)
C
27,25
0,884ns
34.71
4,211ns
Red (F2:3)
31
60
18
27,25
54,5
27,25
12.17
ns
4,284
Satt277
29
62
18
27,25
54,5
27,25
11.73
2,211ns
27
61
21
27,25
54,5
27,25
33.10
Satt460
0,982ns
Satt263
30
56
23
27,25
54,5
27,25
61.21
3,771ns
Satt307
25
64
20
27,25
54,5
27,25
15.17
2,725ns
24
63
22
27,25
54,5
27,25
25.60
Satt316
2,083ns
35.30
Satt357
23
62
24
27,25
54,5
27,25
1,648ns
86
81,75
Satt708
21
27,25
19.92
a
A, B e C representa: genótipo homozigoto equivalente ao da linhagem parental resistente, genótipo heterozigoto
e genótipo homozigoto equivalente ao da suscetível, respectivamente.
b
ns : não significativo ao nível de significância de 5% .
c
Probabilidade a 5% de significância
Com o uso de marcadores moleculares foi possível localizar o gene de resistência
a oídio no genoma da soja. Foram testados 83 marcadores microssatélites para verificar
polimorfismo entre os genótipos parentais BR01-22106 e PI 200487. Um total de 53
marcadores microssatélites apresentou polimorfismo (aproximadamente 64%) e foram
82
utilizados no mapeamento. Em outros trabalhos de mapeamento na soja, níveis de
polimorfismo foram encontrados, variando de 43% a 37% (SILVA et al., 2008).
Para a identificação dos marcadores ligados a resistência ao oídio, inicialmente 10
plantas F2 homozigotas resistentes e 10 homozigotos suscetíveis que foram selecionadas
com base na avaliação da população F2:3, foram analisadas com os marcadores
polimórficos. Verificou-se a ligação putativa de sete deles com o caráter de resistência:
Satt277, Satt460, Satt307, Satt316, Satt357, Satt708 e Sat_263. Esses marcadores, que
pertencem ao grupo de ligação C2, foram utilizados para a genotipagem da população de
mapeamento F2. Todos apresentaram herança mendeliana e não houve distorção de
segregação significativa para quaisquer locos de microssatélites analisados, de acordo
com o teste do
2
(P>0,05) (Tabela 1), e apenas um marcador microssatélite teve padrão
de dominância.
O mapeamento molecular utilizando marcadores microssatélites resultou na
identificação de um novo gene de resistência ao oídio da soja Erishype diffusa, chamado
nesse trabalho de gene Red, que foi posicionado no grupo de ligação C2, flanqueado
pelos marcadores Satt307 e Sat_263 (Figura 1). Essa região do grupo de ligação C2 tem
sido associada com resistência a doenças fungícas, nematóides e insetos, como genes
relacionados à resistência a ferrugem, morte súbita e nematóide de cisto da soja.
83
Figura 1. Mapa de ligação da região genômica do gene Red. No lado esquerdo é
apresentado o mapa genético gerado neste estudo e no lado direito é mostrada
parte dos grupos de ligação consenso C2, indicando os marcadores mapeados na
região com distâncias cumulativas em cM. No lado direito do grupo de ligação
consenso são mostrados QTLs para locos de resistência mapeados nesta região
(SCN - Soybean Cist Nematode ou Nematóide de Cisto; SDS - Sudden death
syndrome ou Síndrome da morte súbita; Reprod - Reproductive period ou Período
Reprodutivo; Lf - Leaf area ou Área foliar; Lf wdth-Leaf width ou Largura da folha;
Lflt shape - Leaflet Shape ou Formato da folha; Fflr - First flower ou Início do
florescimento; Sd fill - Seed filling ou Enchimento de grãos; CID - Carbon isotope
discrimination ou discriminação isotópica do carbono). Estas porções do mapa de
ligação consenso foram geradas na página da web do Soybase (mapa físico da
cultivar Williams; Soybase, 2008).
84
A identificação de novos genes de resistência ao oídio da soja é de grande
importância para o melhoramento de plantas aumentando a eficiência do processo de
desenvolvimento de cultivares resistentes.
Os genes de resistência a ferrugem oriundos da cultivar FT-2 e Hyugga foram
mapeados no mesmo intervalo do gene Red (BROGIN, 2005; MONTEROS et al., 2007),
entre os marcadores Satt307 e Satt460. No entanto, ainda não se têm dados confirmando
se são dois genes de resistência independentes ou se são alelos do mesmo loco,
considerando que a resistência da cultivar FT-2 foi quebrada, permanecendo ativa apenas
a fonte de resistência ‘Hyuuga’. HYTEN (2006) relata, também, que nessa mesma
posição, próximo ao marcador Satt460, encontra-se posicionado o gene de resistência à
ferrugem Rpp3, mapeados nos genótipos, PI 462312 e PI 578457. A distância entre os
genes de resistência à ferrugem (‘Hyuuga’, PI 462312 e PI 578457) é menor que 2,3cM
de distância do gene de resistência Red, mostrando uma possível existência de um
agrupamento de genes de resistência nessa região. Um QTL de resistência a SDS foi
identificado próximo ao marcador Satt307 no cruzamento Pyramid x Douglas (NJITI et al.,
2002), enquanto que um QTL para resistência a nematóide de cisto em soja (Heterodera
glycines Ichinobe) foi localizado próximo a Satt100, no grupo de ligação C2 (WANG et al.,
2001).
Agrupamentos de genes de resistência não são incomuns, tendo sido registrados
em várias espécies de plantas (MILCHELMORE et al., 1998), inclusive em soja. KANAZIN
et al. (1996) mapeou em oito diferentes grupos de ligação da soja (D1, H, J, L, M, N e P)
classes de análogos de genes de resistência (Resistance Gene Analogs – RGAs), sendo
encontrados individualmente e agrupados. Genes de resistência a doenças em soja como
Rps1, Rmd, Rps2 e Rj2 e genes que conferem resistência a nematóide de cisto foram
mapeados agrupados no grupo de ligação J (LHONES et al., 1993). Em Arabidopsis, tem
se evidenciado que pelo menos 21 loci de doenças diferentes estão associados com
RGAs (AARTS et al., 1998).
A ligação existente entre o gene Red e outros genes de resistência pode ser
bastante útil no desenvolvimento de linhagens de soja com resistência a múltiplos
85
patógenos. Como o oídio pode ser facilmente avaliado em casa-de-vegetação, o gene
Red pode ser útil como marcador para seleção indireta para resistência a ferrugem e
outras doenças. Como esses genes estão em associação, mas em plantas diferentes,
uma estratégia seria agrupar os genes em um único genótipo, aumentando assim a
precisão da utilização de marcadores. Estratégia semelhante foi relatada por LHONES &
NICKELL (1994) com o gene Rmd com relação ao gene Rps2 que confere resistência a
Phytophthora durante a transferência dos alelos de resistência a cultivares elite.
Os marcadores mapeados nesse trabalho foram comparados com o mapa
consenso de SONG et al. (2004), sendo observado que não houve inversão na posição
dos marcadores, e as distâncias dadas em cM em relação ao mapa consenso
apresentaram diferenças mínimas.
Outro gene de resistência ao oídio (Microsphaera diffusa-Rmd) foi anteriormente
mapeado no grupo de ligação J (POLZIN et al., 1994), mostrando que a linhagem BRI0122106 apresenta um novo gene de resistência. Deste modo, os marcadores Sat_263 e
Satt307, que flanqueiam o gene Red, posicionados em uma distância de 3,22 e 4,74cM,
respectivamente, serão importantes para auxiliar na seleção assistida de genótipos
homozigotos contendo esse gene e facilitando a introgressão de locos de resistência ao
oídio da soja em cultivares elites. Saturação de novos marcadores moleculares nessa
região e clonagem de genes de resistência em plantas facilitará o entendimento de
mecanismos moleculares e evolução de resistência para o oídio da soja e permitirá
seleção assistida de marcadores em programas de melhoramento. CHOI et al. (2007),
adicionaram ao mapa de ligação da soja novas sequências únicas de nucleotídeos
(SNP’s). Na região em que o gene está posicionado encontram-se alguns SNP’s
disponíveis, o que facilita os estudos de mapeamento com esses marcadores,
aumentando a precisão em função da redução das distâncias no mapeamento.
GRIMMER et al. (2007) mapearam cinco genes dominantes de resistência ao oídio em
beterraba utilizando marcadores RFLP, ancorados com marcadores SNP’s.
A identificação de novos genes de resistência ao oídio da soja é de grande
importância para o melhoramento de plantas aumentando a eficiência do processo de
86
desenvolvimento de cultivares resistentes através da seleção assistida por marcadores.
Além disso, o uso de marcadores mais próximos possibilitaria a exploração de bibliotecas
genômicas de soja, com a identificação de clones BAC (Bacterial Artificial Chromosome)
contendo o gene de resistência ao oídio da soja, o que poderia levar a clonagem desse
gene. Dessa forma sua seqüência seria conhecida e marcadores específicos poderiam
ser desenvolvidos, permitindo inclusive a comparação com outros genes de resistência a
doenças já clonados. No entanto, estudos adicionais são necessários para confirmar
essas hipóteses e explorar melhor essa região onde o gene de resistência ao oídio está
localizado.
87
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94
CAPÍTULO 4 - CONCLUSÕES
1.
O estudo possibilitou o mapeamento genético dos genes de resistência para ambas
as doenças, ferrugem asiática e oídio da soja.
2.
Para ferrugem, nos dois cruzamentos (SBR e KBR) os genes de resistência foram
mapeados no mesmo grupo de ligação N da soja.
3.
No grupo de ligação N, foi detectado QTL que explicou uma grande porcentagem
da variação fenotípica do caráter número de urédia, predominando os efeitos aditivos e de
dominância para os dois cruzamentos.
4.
Houve correspondência significativa entre os QTLs identificados nas gerações
segregantes F2:3 e os marcadores que flanqueiam o gene Rpp.
5.
A seleção para o caráter número de urédias revelou-se mais eficiente, quando
comparadas com a seleção para o caráter severidade, pois é menos influenciada pelas
variações ambientais.
6.
O modelo genético aditivo-dominante foi suficiente para explicar os resultados para
os dois caracteres quantitativos, não havendo nenhum indício da presença de efeitos
epistáticos ou de interação não alélica afetando a severidade ou o número de urédias.
7.
É provável a existência de fatores modificadores que contribuem para aumento ou
redução da severidade de doença nas folhas nos dois parentais resistentes e também na
testadora suscetível envolvidos nos dois cruzamentos. A mesma eficiência não poder ser
associada ao caráter número de urédias, já que houve divergência entre os parentais nos
95
dois cruzamentos ao longo de todas as avaliações, sugerindo que os genes associados a
esse caráter podem estar concentrados nos parentais resistentes.
8.
A linhagem BRI01-22106 apresentou resistência completa ao fungo Erysiphe
diffusa.
9.
O mapeamento molecular utilizando marcadores microssatélites resultou na
identificação de um novo gene de resistência ao oídio da soja Erysiphe diffusa, chamado
nesse trabalho de gene Red. Este gene foi mapeado no grupo de ligação C2 da soja,
flanqueado pelos marcadores Satt307 e Sat_263
10.
Não foi constatado inversão na posição dos marcadores, e as distâncias, dadas em
cM, apresentaram diferenças mínimas em relação ao mapa consenso.
11.
Os resultados obtidos evidenciaram que novos marcadores devem ser adicionados
nos mapas gerados para as duas doenças ampliando a cobertura do genoma da soja,
visando ampliar o entendimento das bases genéticas desses patossistemas.
12.
Marcadores mais próximos possibilitariam a exploração de bibliotecas genômicas
de soja, com a identificação de clones BAC contendo o gene de resistência a essas
doenças o que poderia levar a clonagem desses genes.
13.
A identificação de novos genes de resistência a doenças é de grande importância
para
o
melhoramento
de
plantas
aumentando
a
eficiência
do
processo
desenvolvimento de cultivares resistentes através da seleção assistida por marcadores
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