gram-negativas -quando

XXV CONGRESSO BRASILEIRO DE ZOOTECNIA
ZOOTEC 2015
Dimensões Tecnológicas e Sociais da Zootecnia
Fortaleza – CE, 27 a 29 de maio de 2015
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA in vitro DO EXTRATO DE Cassia occidentalis SOBRE
Staphylococcus aureus E Escherichia coli DE AMOSTRAS CLINICAS
ANTIMICROBIAL ACTIVITY in vitro Cassia occidentalis OF EXTRACT OF BACTERIA
ISOLATED FROM Staphylococcus aureus and Escherichia coli SAMPLES COLLECTED CLINICS
Tereza Gabriela da Costa2, Tiago Venancio da Silva3, Resenângela da Costa Lunas4, Rosiane Araujo
Rodrigues4, Carlos Alexandre Carollo5, Anielly Rariane Quadros Paredes6, Ricardo Antonio Amaral de
Lemos7, Cássia Rejane Brito Leal7
1
Dados parciais de trabalho desenvolvido pelo PET Zootecnia em conjunto com o Laboratório de
Bacteriologia da FAMEZ (UFMS)
2
Acadêmica do curso de Zootecnia – UFMS, Campo Grande, MS, Brasil. Bolsista PET Zootecnia. E-mail:
terezagabrielacosta@gmail
3
Acadêmico do curso de Zootecnia – UFMS, Campo Grande, MS, Brasil. Bolsista PIBIC/UFMS, e-mail:
[email protected]
4
Zootecnistas graduadas na UFMS, Campo Grande, MS, Brasil. [email protected];
[email protected]
5 Professor CCBS/UFMS, Campo Grande, MS, Brasil. E-mail: [email protected]
6Mestranda em Biologia Vegetal –UFMS, Campo Grande, MS, Brasil. E-mail: [email protected]
7Professores da FAMEZ/UFMS, Campo Grande, MS, Brasil. E-mail: [email protected];
[email protected]
Resumo: A resistência desenvolvida pelos microrganismos às diversas drogas trouxe a necessidade de
obtenção de novas substâncias que apresentem efeito inibitório sobre agentes patogênicos. O presente
trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antimicrobiana in vitro do extrato bruto de Cassia
occidentalis sobre diferentes isolados bacterianos, obtidos de amostras clinicas do Hospital Veterinário da
UFMS. Foram avaliadas 10 amostras de bactérias Gram positivas (Staphylococcus aureus) e 10 bactérias
Gram negativas (Escherichia coli) pelo método de microdiluição em microplacas com posterior semeadura
em agar. Por meio dos resultados verificou-se que o extrato da folha de Cassia occidentalis tem efeito
inibidor sobre as bactérias testadas, no entanto não se pode afirmar qual composto químico foi o responsável
pela inibição.
Palavras–chave: atividade antimicrobiana, Cassia occidentalis, extratos, resistência
Abstract: The resistance developed by microorganisms to various drugs brought the need to obtain new
substances with inhibitory effect on pathogens. This study aimed to evaluate the in vitro antimicrobial
activity of the crude extract of Cassia occidentalis on different bacterial isolates obtained from clinical
specimens Veterinary Hospital UFMS. 10 samples were evaluated Gram positive bacteria (Staphylococcus
aureus) and Gram negative bacteria 10 (Escherichia coli) by microdilution method microplates were sown in
agar. By the results it was found that the Cassia occidentalis leaf extract has an inhibitory effect on the
bacteria tested, however we can not say which chemical was responsible for the inhibition.
Keywords: antimicrobial activity, Cassia occidentalis, extracts, resistance
Introdução
Devido ao desenvolvimento de resistência das bactérias às drogas as quais são expostas, é constante a
necessidade de pesquisa de novos meios e substâncias que tenham efeitos inibitórios sobre as mesmas. Os
antimicrobianos são empregados na agropecuária de três diferentes formas: como tratamento de infecções
bacterianas específicas, prevenção de infecções bacterianas e aditivo alimentar, como promotor de
crescimento (Andreotti & Nicodemo, 2004). Como recurso a essa nova ideologia, vem sendo cada vez mais
estudada a opção por fitoterápico, que apresente efeito significativos sobre estes patógenos resistentes e
possam ser introduzidos no sistema de produção.
A planta Cassia occidentalis, apresenta crescimento herbáceo nativa das Américas, é uma planta
leguminosa frequentemente encontrada como uma planta daninha que acomete pastagens, terrenos baldios e
plantações. Esta planta é caracterizada pela sua toxidez, entretanto estudos apontam que componentes
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provenientes desta planta tóxica possuem alguns princípios uteis em sua composição que pode ser utilizado
com aplicação farmacológica.
Neste estudo, foi pesquisada a concentração inibitória mínima de Cassia occidentalis, vulgarmente
conhecida como “fedegoso”, sobre amostras de bactérias Gram positivas e Gram negativas isoladas de
amostras clínicas do Hospital Veterinário da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul.
Material e Métodos
As folhas de Cassia occidentalis, foram colhidas no período da manhã no campo agrostológico da
FAMEZ/UFMS, em Campo Grande - Mato Grosso do Sul. As amostras foram imediatamente embaladas em
papel pardo e desidratadas em estufa com lâmpadas incandescentes por cinco dias. Após esta etapa foram
moídas em moinho de facas com peneira de 2mm.
Para extração foi utilizado o extrator de fluido pressurizado (DIONEX®) (ASE 150), método de
fração polar, solvente (etanol/água destilada 7:3), método 17, 130 °C, 1.600 psi, três ciclos, ciclo estático 4
minutos, lavagem 100%, curva de 100 segundos e ciclo 3. Os extratos obtidos foram concentrados em
evaporador rotativo e depois desidratados em um liofilizador (CHRIST®) (Alpha 2-4 LDplus) e a solução
utilizada foi à base de acetona e nitrogênio líquido. Depois de obtido o material em pó, estes foram
armazenados em frascos Falcon® e ao abrigo da luz. O extrato seco foi pesado e diluído em dimetilsulfóxido
(DMSO) na proporção de 20mg para 1mL de DMSO, contendo assim 20.000 µg de extrato em 1000 µL de
DMSO.
As amostras de bactérias usadas foram provenientes de processos infecciosos de animais atendidos
na rotina do Hospital Veterinário/FAMEZ. Entre as dez bactérias Gram negativas (Escherichia coli) usadas,
sete foram estocadas a partir de amostras clínicas de bovinos, duas de cães e uma de felino. Já as dez
bactérias Gram positivas (Staphylococcus aureus), sete amostras foram de bovinos, uma de cão, uma de
coelho e uma de hamster. As bactérias foram reativadas em caldo infusão de cérebro e coração (BHI) e
levadas a estufa de 36°C overnight. Após esta etapa as amostras foram repicadas em agar BHI e incubadas
por 24h em estufa de 36°C. Foram feitos testes morfotintoriais para confirmação de pureza das colônias
bacterianas.
Para a determinação da concentração inibitória mínima (CIM), as microplacas de 96 poços foram
preparadas com as diluições para cada amostra bacteriana em capela de fluxo laminar. As concentrações para
cada repetição foram: 100µL, 125µL, 150µL, 175µL, 188µL, 194µL e 197µL de solução salina,
respectivamente dos poços identificados nas colunas de 1 a 7. Nesses mesmos poços se adicionou,
respectivamente, 100µL, 75µL, 50µL, 25µL, 12µL, 6µL e 3µL do extrato diluído. A coluna 8 não foi
utilizada para evitar erros de distribuição nos controles realizados, pois a partir dos poços da coluna 9 foram
feitos os controles do estudo.
Assim, a coluna 9 foi usada para o primeiro controle, o branco do extrato (C1), e nos poços
adicionados apenas 3µL de extrato diluído e 207µL de solução salina. Na coluna 10 segundo controle, teste
com o dimetilsulfóxido (DMSO) (C2), foi depositado 197µL de solução salina, mais 3µL de DMSO. Na
coluna 11, do controle negativo do estudo (C3) foi utilizado 197µL de solução salina e 3µL do antibiótico
Penicilina para as bactérias Gram positivas e Gentamicina para as bactérias Gram negativas. E por fim na
coluna 12, foi realizado o controle positivo (C4) onde foi adicionado 200µL de solução salina .
Resultados e Discussão
Para as dez amostras coletadas de Staphylococcus aureus testadas, o extrato de Cassia occidentalis foi
capaz de inibir nove isolados com CIM de 750 μg e apenas um isolado com CIM de 500 µg. Entre as
amostras de Escherichia coli os dez isolados foram inibidos com CIM de 750 µg. Os resultados obtidos
apontam o potencial desta planta como agente antimicrobiano, sendo uma alternativa de fitoterápico para o
tratamento de bactérias patogênicas.
Na literatura há vários resultados de CIM, usando extratos de plantas, que são considerados
satisfatórios, variando de 0,3 mg/mL a 40 mg/mL, porém há trabalhos que consideram uma forte inibição
aquelas menores que 0,5 mg/mL (DUARTE et al., 2004). Neste contexto pode-se afirmar que os resultados
obtidos da CIM do extrato de Cassia occidentalis no presente estudo, foram acima dos encontrados por
DUARTE et al.2004, entretanto apresentaram atividade antimicrobiana significativa sobre amostras de
Staphylococcus aureus e Escherichia coli.
A ausência de estudos sobre a atividade antibacteriana de Cassia occidentalis impedem a comparação
entre os dados do nosso estudo com a literatura de referência. No entanto, outros estudos têm apontado a
presença de compostos biologicamente ativos nesta espécie botânica como alcalóides, flavonóides,
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glicosídeos e taninos que apresentaram atividade anti-helmintica, em ação conjunta ou individual, destes
compostos encontrados na planta Cassia ssp (KUNDU et al., 2014). Estudos realizados por KUMAR et
al.(2014) obtiveram resultados semelhantes do efeito do extrato de Cassia occidentalis como larvicida,
contra larvas do mosquito Culex quinquefasciatus, um importante vetor de bancroftose, sendo apresentado
como uma alternativa eficaz no controle dos mosquitos.
Nos resultados obtidos no controle branco do extrato (C1) em que se usou apenas extrato diluído e
solução salina, todas as amostras não apresentaram crescimento e no controle DMSO (C2), no qual foi
utilizado apenas DMSO na presença do microrganismo, todas apresentaram crescimento. No controle
negativo (C3) cujo resultado poderia variar entre positivo e negativo, devido o uso do antibiótico, solução
salina e inóculo, todas foram inibidas pelo antibiótico Penicilina para Gram positivas (S. aureus) e
Gentamicina para Gram negativas (E. coli). No controle positivo (C4) em que se usou apenas a solução salina
e a bactéria, nas dez amostras analisadas houve o crescimento.
Conclusões
Com base nos resultados pode ser concluído que o extrato bruto da folha de Cassia occidentalis
apresentou efeito antibacteriano sobre as duas espécies de bactérias testadas, apresentando grande
heterogeneidade entre as amostras cínicas coletadas, entretanto não se pode afirmar qual o possível composto
químico responsável por esta inibição, possibilitando o desenvolvimento de pesquisas a respeito destes
compostos e os seus efeitos sobre diferentes agentes bacterianos. A utilização do extrato de plantas como
fitoterápico é uma alternativa a ser implantada no tratamento de agentes patogênicos visando minimizar as
resistências ocasionadas com o uso inadequado de medicamentos.
Literatura citada
ANDREOTTI, R.; NICODEMO, M.L.F. Uso de antimicrobianos na produção de bovinos e
desenvolvimento de resistência. Campo Grande: Embrapa Gado de Corte, 2004.
DUARTE, M.C.T.; FIGUEIRA, G.M.; PEREIRA, B. et al. Atividade antimicrobiana de extratos
hidroalcólicos de espécies da coleção de plantas medicinais CPQBA/UNICAMP. Revista Brasileira de
Farmacognosia, v. 14, supl. 01, p. 06-08, 2004.
KUNDU, S.; ROY, S.; LYNDEM, L.M. Broad spectrum anthelmintic potential of Cassia plants. Jornal
Asian Pacific of Tropical Biomedicine, suppl. 01: S436-S441, 2014.
KUMAR, D.; CHAWLA, R.; DHAMODARAM, P. et al. Larvicidal Activity of Cassia occidentalis (Linn.)
against the Larvae of Bancroftian Filariasis Vector Mosquito Culex quinquefasciatus. Journal of
Parasitology Research, v. 236838, 2014.
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