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Centro Universitário Feevale
Programa de Pós-Graduação em Qualidade Ambiental
Mestrado em Qualidade Ambiental
ANDRÉIA DALLA VECCHIA
DETECÇÃO MOLECULAR DE TORQUE TENO VÍRUS EM
AMOSTRAS DE ÁGUA
Novo Hamburgo, 2010.
Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
Centro Universitário Feevale
Programa de Pós-Graduação em Qualidade Ambiental
Mestrado em Qualidade Ambiental
ANDRÉIA DALLA VECCHIA
DETECÇÃO MOLECULAR DE TORQUE TENO VÍRUS EM
AMOSTRAS DE ÁGUA
Dissertação
apresentada
ao
Programa de Pós-Graduação em
Qualidade Ambiental como requisito
para a obtenção do título de Mestre
em Qualidade Ambiental.
Orientador: Prof. Dr. Fernando Rosado Spilki
Novo Hamburgo, 2010.
DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP)
Vecchia, Andreia Dalla
Detecção molecular de Torque Teno Vírus em amostras de água /
Andreia Dalla Vecchia. – 2010.
84 f. ; 30 cm.
Dissertação (Mestrado em Qualidade Ambiental) – Feevale, Novo
Hamburgo-RS, 2010.
Inclui bibliografia e apêndice.
“Orientador: Prof. Dr. Fernando Rosado Spilki”.
1. Toque Teno Vírus (TTV). 2. Água - Análise. 3. Vírus entérico. 4.
Meio ambiente. I. Título.
CDU 543.3:578
Bibliotecária responsável: Susana Fernandes Pfarrius Ladeira – CRB 10/1484
Centro Universitário Feevale
Programa de Pós-Graduação em Qualidade Ambiental
Mestrado em Qualidade Ambiental
ANDRÉIA DALLA VECCHIA
DETECÇÃO MOLECULAR DE TORQUE TENO VÍRUS EM
AMOSTRAS DE ÁGUA
Dissertação de mestrado aprovada pela banca examinadora em 22 de fevereiro de
2010, conferindo ao autor o título de mestre em Qualidade Ambiental.
Componentes da Banca Examinadora:
Prof. Dr. Fernando Rosado Spilki (Orientador)
Centro Universitário Feevale
Profa. Dra. Ana Cláudia Franco
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Profa. Dra. Sabrina Esteves de Almeida
Centro Universitário Feevale
AGRADECIMENTOS
Manifesto meu especial agradecimento a todas as pessoas que contribuíram e
permitiram que este trabalho chegasse ao seu final.
Ao Prof. Dr. Fernando Rosado Spilki, pela brilhante orientação, incentivo, dedicação
e confiança a mim depositada. Obrigada pelo aprendizado.
Ao Prof. Dr. Paulo Roehe – IPVDF que prontamente me acolheu e permitiu meu
aprendizado em seu laboratório.
À amiga Ms. Thais Fumaco Teixeira - IPVDF, pela dedicação e apoio desde o início
do mestrado, a ela devo minha gratidão.
À amiga e colega Márcia Regina Thewes – DMAE, por estar sempre presente,
prestando auxílio nas coletas e não medindo esforços para auxiliar-me.
À equipe de pesquisa do Laboratório de Microbiologia Molecular da Feevale, Raquel,
Joseane, Manoela, Juliana, Mariana, Roger, Bianca, Michele, Lucas, Thalita, Julio,
Gabriela pelo apoio, dedicação e auxílio prestados.
Aos colaboradores da UFRGS, docentes do Instituto de Ciências Básicas da Saúde,
Profa. Ms. Ana Beatriz Oliveira, Profa. Dra. Marisa Itapema Cardoso e Profa. Dra.
Sueli Van Der Sand do curso de pós-graduação em Microbiologia Agrícola e do
Ambiente (UFRGS), Gisele Nachtigall Garbinatto, Daniele Vargas de Oliveira, Julie
Graziela Zanin, Roberta Capalonga e a técnica Sayonara Peixoto da Rosa pelo
apoio nas coletas de estudo e fornecimento das análises bacteriológicas
Ao DMAE – Porto Alegre, Divisão de Pesquisa, especialmente à diretora Iara
Morandi e colaboradores, pelo auxílio prestado nas coletas de amostras e envio de
dados bacteriológicos.
Ao Centro Universitário Feevale pelo apoio no uso dos laboratórios e à Comissão de
Aperfeiçoamento de Ensino Superior CAPES - Prosup pelo auxílio financeiro.
A minha querida família, esposo Julio César, meus queridos pais, e todos familiares
de longe e de perto, que sempre manifestaram seu apoio, incentivo e entusiasmo.
Agradeço pela paciência, compreensão, carinho e atenção recebidos.
E principalmente a Deus! Por me conceder estímulo, persistência e permitir que
todas essas pessoas maravilhosas estivessem ao meu lado.
“Toda a nossa ciência, comparada com a realidade , é primitiva e infantil, no
entanto, é a coisa mais preciosa que temos”.
Albert Einstein
VII
RESUMO
Recentemente, o Torque teno vírus, agente viral constituído de DNA fita simples,
não-envelopado e excretado pela via entérica vem sendo considerado um excelente
candidato como agente viral marcador de contaminação fecal na água, devido à
presença de características semelhantes a vírus entérico e por estar amplamente
disseminado na população. Desta forma, o objetivo deste estudo foi investigar a
ocorrência de TTV em amostras de águas de diferentes procedências coletadas na
região de Metropolitana de Porto Alegre e de diferentes cidades do interior do
estado, bem como padronizar uma técnica de concentração viral e uma técnica de
reação em cadeia da polimerase aplicável à detecção molecular do TTV em
amostras de água, e relacionar com a contaminação bacteriana destas águas.
Foram utilizadas amostras de águas coletadas da estação de tratamento ETE São
João – Navegantes em Porto Alegre, águas do Arroio Dilúvio, água mineral e águas
oriundas de torneiras de escolas estaduais e municipais de três cidades do interior
do estado. Após a padronização e validação, os resultados apontam para presença
do TTV em 12,5% das amostras de efluente tratado da estação de tratamento (Porto
Alegre) e ausência do TTV em amostras de esgoto bruto desta estação, 28,5% de
positividade para águas do Arroio Dilúvio (Porto Alegre), 25% para água de escolas
municipais da cidade de Pelotas, 10,5% para amostras de escolas estaduais e
municipais de Caxias do Sul e negativo para o TTV em água de torneira para ambas
as escolas da cidade de Santa Cruz do Sul. Esses resultados demonstram que o
TTV está presente em amostras de água no Rio Grande do Sul.
Palavras - chave: TTV. Água. Ambiental. Vírus entérico.
VIII
ABSTRACT
Recently, the Torque teno virus, a single-stranded DNA, non-enveloped viral agent
which is secreted by the enteric route, has been considered an excellent candidate
as a viral marker of fecal contamination in water due to the presence of features
similar to enteric viruses and be widespread in the population. Thus, this study aimed
to investigate the occurrence of TTV in water samples collected from different
sources in the metropolitan region of Porto Alegre and other cities in the state, and
standardize a technique for virus concentration and a Polymerase chain reaction
technique applied to molecular detection of TTV in water samples, and relate to
bacterial contamination of groundwater. Samples collected from water treatment
plant Sewage Treatment Plant São João – Navegantes (Porto Alegre), Arroio Dilúvio
water, mineral water and tap water from state and municipal schools in three cities.
After the standardization and validation of detection techniques, the results indicate
the presence of TTV in 12.5% of the samples of treated effluent from treatment plant
(Porto Alegre) and absence of TTV in samples of raw sewage, 28.5% positivity for
Arroio Dilúvio samples (Porto Alegre), 25% for water in municipal schools in the city
of Pelotas, 10,5% for samples of state and municipal schools in Caxias do Sul.
Negative for TTV in tap water for both schools in the city of Santa Cruz do Sul. These
results shows that TTV is present in water samples in Rio Grande do Sul.
Keywords: TTV. Water. Environmental. Enteric viruses.
IX
LISTA DE ILUSTRAÇÕES E FIGURAS
Figura 1. Organização genômica do TTV .................................................................. 24
Figura 2. Mapa da localização da ETE São João – Navegantes............................... 37
Figura 3. Vista aérea da estação de tratamento de esgoto ETE São João ............... 37
Figura 4. Localização aproximada dos pontos 1, 2, 3, 4 e 5 do Arroio Dilúvio .......... 39
Figura 5. Mapa do Rio Grande do Sul e suas microrregiões ..................................... 41
Figura 6. Visualização da padronização da PCR ...................................................... 47
Figura 7. Número de resultados positivos para o vírus TTV...................................... 50
X
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Resultado viral e bacteriano para amostras da estação de tratamento São
João – Navegantes em Porto Alegre. ........................................................................ 49
Tabela 2. Resultado do TTV para amostras de água de torneira do interior do
estado ....................................................................................................................... 51
XI
LISTA DE SÍMBOLOS E SIGLAS
µl
Microlito
µm
Micrometro
BAV
Adenovírus bovino
CONSEMA
Conselho Estadual do Meio Ambiente
D.O.U
Diário Oficial da União
DMAE
Departamento Municipal de Água e Esgoto
DNA
Ácido desoxirribonucléico
ETE
Estação de Tratamento de Efluentes
GC
Genome copies
ICBS
Instituto de Ciências Básicas da Saúde
Kb
Kilobases
Nm
Nanômetro
NMP
Número Mais Provável
ORF
Open reading frame
Pb
Pares de base
PCR
Reação em cadeia da polimerase
pH
Pontencial de Hidrogênio
qPCR
Reação em cadeia da polimerase em tempo real
RNA
Acido ribonucléico
Rpm
Rotação por minuto
RT PCR
Reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa
SEPLAG-RS
Secretaria de Planejamento e Gestão do Estado do Rio Grande do
Sul
TTV
Torque teno vírus
UFRGS
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
UV
Ultravioleta
WHO
World Health Organization
Sumário
RESUMO .................................................................................................................... VII
ABSTRACT ................................................................................................................ VIII
LISTA DE ILUSTRAÇÕES E FIGURAS ................................................................................ IX
LISTA DE TABELAS ........................................................................................................ X
LISTA DE SÍMBOLOS E SIGLAS ....................................................................................... XI
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 14
2. OBJETIVOS .......................................................................................................... 19
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ............................................................................ 20
3.1 AGENTES VIRAIS COMO MARCADORES DE QUALIDADE DA ÁGUA ................... 20
3.2 TORQUE TENO VÍRUS ............................................................................................. 22
3.3 HISTÓRICO E IMPORTÂNCIA CLÍNICA DO TTV EM SERES HUMANOS ............... 24
3.4 EPIDEMIOLOGIA DO TTV ......................................................................................... 26
3.5 DETECÇÃO MOLECULAR DE VÍRUS EM AMOSTRAS AMBIENTAIS ..................... 27
3.6 TTV COMO MARCADOR DE POLUIÇÃO AMBIENTAL............................................. 28
3.7 SISTEMAS DE TRATAMENTO DE ESGOTO E ÁGUA PARA CONSUMO ............... 30
4. METODOLOGIA ................................................................................................... 35
4.1 AMOSTRAS DE ÁGUA UTILIZADAS E PROCEDIMENTO DE COLETA ................... 35
4.1.1 Amostras de Estação de Tratamento de esgoto - DMAE ................................ 35
4.1.2 Amostras do Arroio Dilúvio – Porto Alegre ..................................................... 38
4.1.3 Amostras de água de escolas Municipais e Estaduais ................................... 39
4.1.4 Amostras de água mineral ................................................................................ 41
4.2 PROCESSAMENTOS DAS AMOSTRAS ................................................................... 42
4.2.1 Concentração viral ............................................................................................. 42
4.2.2 Extração de DNA viral........................................................................................ 44
4.2.3 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e Eletroforese ................................. 45
4.3 ANÁLISES BACTERIANAS ........................................................................................ 47
5. RESULTADOS ...................................................................................................... 48
5.1 ANÁLISES DA ESTAÇÃO DE TRATAMENTO – PORTO ALEGRE ........................... 48
5.2 ANÁLISES DO ARROIO DILÚVIO – PORTO ALEGRE.............................................. 49
5.3 ANÁLISE PARA ÁGUA TRATADA DE ESCOLAS ..................................................... 50
5.4 ANÁLISES DE ÁGUA MINERAL ................................................................................ 51
6. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 52
7. CONCLUSÕES ..................................................................................................... 57
8. PERSPECTIVAS ................................................................................................... 58
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA .............................................................................. 59
APÊNDICE A – TORQUE TENO VÍRUS (TTV) E POLUIÇÃO FECAL .................................... 76
14
1. INTRODUÇÃO
O artigo 1º da Resolução Conama Nº 001, de 23 de janeiro de 1986,
publicado no D.O.U. de 17/2/86 define Impacto Ambiental como sendo qualquer
alteração das propriedades físicas, químicas e biológicas do meio ambiente. Tais
alterações podem ser causadas por qualquer forma de matéria ou energia
decorrente das atividades humanas que, direta ou indiretamente, afetam a saúde, a
segurança e o bem-estar da população. Além disto, podem afetar as atividades
sociais e econômicas, a biota, as condições estéticas e sanitárias do meio ambiente
e a qualidade dos recursos ambientais (BRASIL, 1986). Desta forma, a qualidade
ambiental pode ser entendida como sendo um conjunto de fatores interligados que
abrangem a qualidade do ar, da água, da rede de esgotos e a correta destinação
dos resíduos sólidos e líquidos gerados pela população, indústrias e por todos os
segmentos da sociedade (VARGAS; TERRA; SARMENTO, 2008). Por sua
importância no transporte de materiais entre diferentes matrizes ambientais e sua
necessidade para a manutenção das funções em organismos vivos, ocupa lugar de
destaque a água.
Com base no exposto acima, o tema qualidade da água potável é uma
questão de preocupação para a saúde humana. A problemática da crescente
escassez e da queda na qualidade da água disponível para consumo, higiene e
recreação é preocupação de ordem mundial, atingindo tanto países em
desenvolvimento
quanto
desenvolvidos
http://www.ana.gov.br/prodes/prodes.asp;
(TUNDISI,
2009,
http://www.onu-brasil.org.br/busca.php).
Os riscos de agravos à saúde humana ou animal relacionados ao uso de água com
baixa qualidade incluem desde a contaminação de agentes infecciosos até a
presença indesejável de produtos químicos com potencial tóxico ou genotóxico. As
doenças de veiculação hídrica constituem hoje a segunda causa de morbidades no
mundo todo, segundo dados da Organização mundial da Saúde (WHO
http://www.who.int/). Estes fatos apontam para o valor do gerenciamento e de
abordagens preventivas avançadas para o monitoramento e tratamento da água,
desde as fontes de captação até o consumidor final (WHO, http://www.who.int/). A
WHO referencia que os riscos à saúde humana são hoje e no futuro próximo
intensificado pela contaminação microbiológica dos recursos hídricos cada vez mais
15
escassos. Além disto, a água pode estar contaminada tanto por fezes humanas,
quanto por dejetos de animais (WHO, 2006).
Câmara e Tambellini (2003) registram que, no Brasil, o tema da Saúde
Ambiental tem a má qualidade de água para o uso humano, as deficiências no
saneamento, a poluição de mananciais hídricos, entre outros fatores, como
situações de especial risco à manutenção da saúde pública. Nesse contexto, se faz
urgente a adoção de estratégias, sejam de monitoramento, sejam de tecnologias de
mitigação, que permitam um desenvolvimento sustentável, tendo como foco a
preservação dos ambientes salubres para as futuras gerações. O ambiente constitui
hoje um ente inseparável e interdependente da saúde e deve ser considerado um
campo de ação na prevenção dos agravos em saúde pública. Para Gomes e Soares
(2004), a qualidade do meio ambiente é um fator determinante para melhoria da
qualidade de vida dos indivíduos e das populações. Além disto, o acesso à água
para o consumo de forma segura é essencial para a saúde, um direito humano
fundamental e um fator de política eficaz de proteção à saúde. Intervenções para
melhorias na qualidade da água proporcionam significativos benefícios para a saúde
da população, muitas vezes com notável redução nos gastos em atividades de
cunho terapêutico (WHO, 2008).
No caso do Brasil, calcula-se que metade da população brasileira está
submetida, ainda hoje, ao impacto do saneamento básico inadequado e de doenças
a ele relacionadas, muito evidenciadas nos estados do Norte e Nordeste do país
(NETTO e CARNEIRO, 2009). Todavia, essa situação mostra-se também bastante
presente em diversos estados das demais regiões, denunciando que o saneamento
básico inadequado é ainda um problema de escala nacional que necessita ser
tratado como prioridade. No caso do Rio Grande do Sul, enquanto 80% dos
domicílios estão conectados às redes de abastecimento de água, apenas 27,43%
estão interligados à rede geral de esgoto, segundo dados publicados pela Secretaria
de Planejamento e Gestão do Estado do Rio Grande do Sul (SEPLAG – RS,
http://www.seplag.rs.gov.br/download.asp?nomeArq=SaneamentoFinal.pdf).
Vale
ressaltar que a ligação à rede não resulta na maioria dos casos em tratamento do
esgoto, sendo que na maioria dos municípios gaúchos esses resíduos são lançados
diretamente nos corpos hídricos. Esta situação é idêntica àquela relatada para
outros países em desenvolvimento, onde as doenças relacionadas à veiculação
16
hídrica afetam principalmente a qualidade de vida das pessoas de classes menos
favorecidas nas populações (WHO, 2003).
Para controlar a contaminação microbiológica e ambiental dos recursos
hídricos, no atual sistema de tratamento e monitoramento microbiológico de esgotos
e tratamento de água, a Escherichia coli, pertencente ao grupo dos coliformes
termotolerantes, é a bactéria marcadora da poluição fecal em águas e esgoto
(BRASIL, 2004; RIO GRANDE DO SUL, 2006). Na década de 1990, algumas
autoridades governamentais européias incluíram nos padrões microbiológicos
utilizados na avaliação da qualidade da água, além dos indicadores bacterianos, a
análise de vírus entéricos, em especial Enterovírus e Adenovírus, como indicadores
virológicos (MEHNERT et al., 2001). Em cumprimento à legislação vigente, o
monitoramento prestado em nosso país por serviços de controle do saneamento
ambiental está voltado somente para análise bacteriológica da água, não
contemplando a análise virológica. Neste ponto, a resolução 518/2004 do Ministério
da Saúde, apenas sugere que se faça a pesquisa de Enterovírus com o objetivo de
atingir um padrão de ausência destes agentes, porém não se referenciam
metodologias, procedimentos, critérios e não se estabelecem parâmetros mínimos
ou máximos aceitáveis. Tal normativa passa atualmente por revisão, a qual deve
integrar a análise virológica da água de consumo (MIAGOSTOVICH, M.,
comunicação pessoal).
Em relação à detecção de vírus em amostras de água, esta teve seu início
há aproximadamente 60 anos (METCALF; MELNICK; ESTES, 1995), sendo o foco
inicial voltado aos estudos de disseminação de Poliovírus vacinal e selvagem em
amostras de água para consumo (BERG, 1974; FONG e LIPP, 2005). Anterior a este
evento, um surto de hepatite viral provocada pela contaminação de fontes de água
por esgotos do rio Jumna em Nova Delhi na Índia, também teve sua importância na
detecção de vírus em águas (BOSCH, 1998).
Assim, os vírus entéricos, tais como Poliovírus, Rotavírus, Calicivírus e o
Vírus da hepatite A e E, entre outros, são agentes virais que estão presentes no
trato gastrointestinal humano e em alguns casos também de outros animais. Estes
agentes são eliminados através das fezes e são geralmente transmitidos por via
fecal-oral, podendo em seu ciclo no ambiente, contaminar o solo, os alimentos e a
água (LECRERC et al., 2002; TAVARES et al., 2005). Estes vírus são importantes
17
agentes etiológicos de gastroenterites e hepatites em humanos e, em razão de sua
veiculação hídrica, são motivos de constante preocupação em saúde pública. Dada
sua disseminação hídrica, os mesmos se constituem hoje poluentes ambientais
(GUTIÉRREZ et al., 2007), afetando não só a vida humana quanto a biodiversidade
(PINA et al., 1998). Ainda que possam causar na maioria dos eventos, infecções
assintomáticas, os diferentes tipos de vírus entéricos podem causar diversas
doenças quando do consumo de água contaminada, tais como paralisia infantil,
meningite, doenças respiratórias e diarréia, a exemplo dos Rotavírus, o principal
agente etiológico de diarréia infantil no mundo (TEIXEIRA e LEAL, 2002). Há ainda o
contágio por agentes virais em atividades de banho ou recreação, como é caso de
infecções pelo vírus da Hepatite A ou Adenovírus (CUSACK, 2005; POND, 2005;
SHORT et al., 2006).
Além disto, conforme relatado, segundo dados da
Organização Mundial da Saúde, doenças relacionadas ao consumo e outros usos de
águas contaminadas estão entre as principais causas de morbidade e mortalidade
no mundo todo (HEDBERG e OSTERHOLM, 1993; WHO, 2003; COLFORD et al.,
2006).
Com o advento e a disseminação do uso de metodologias moleculares, uma
série de novos microrganismos tem sido descobertos. Dentre os novos vírus, há um
agente viral não-envelopado dotado de excreção pela via entérica, denominado
Torque teno vírus (TTV, NISHIZAWA et al., 1997). O TTV apresenta características
biológicas similares a vírus entéricos, é um vírus não-envelopado e excretado pela
via fecal, possui elevada resistência no ambiente e está amplamente disseminado
na população, desta forma, tem sido identificado como um excelente candidato no
uso como marcador de contaminação fecal em águas (GRIFFIN et al., 2008). No
presente estudo foi realizada a detecção molecular com vistas a determinar a
ocorrência do TTV em amostras de água colhidas na região Metropolitana de Porto
Alegre e municípios do interior do estado, abrangendo a Bacia do Guaíba e Bacia
Hidrográfica Litorânea. As amostras aqui estudadas foram de água superficial,
efluentes de estação de tratamento de esgoto, água mineral comercializada na
região metropolitana e também água tratada de torneira da cozinha de escolas
municipais e estaduais de três cidades do interior do estado do Rio Grande do Sul.
Para a realização deste estudo, utilizou-se a técnica de reação em cadeia da
polimerase (PCR), a qual possui elevada especificidade e sensibilidade e tem sido
18
muito utilizada, nos últimos anos, para detecção de vírus em amostras ambientais
(KATAYAMA et al., 2002; LEY et al., 2002). Com maior limitação, este método
sozinho não permite distinguir a presença de vírus infeccioso (vírions) da simples
presença de fragmentos genômicos e partículas virais não infecciosas (FONG e
LIPP, 2005). Dada a dificuldade inerente ao isolamento do TTV em cultivos
celulares, no presente estudo utilizou-se a amplificação de um pequeno fragmento
da região ORF2 do genoma de TTV que embora seja uma região altamente
heterogênea em seus aspectos globais, apresenta diversas regiões conservadas do
genoma viral que permitem detectar e, por conseguinte classificar a posteriori um
maior número de genogrupos de TTV em um mesmo conjunto de ensaios
(WATANABE et al., 2005). Este estudo é pioneiro no Rio Grande do Sul, onde nosso
grupo iniciou as primeiras pesquisas para detecção de vírus entéricos em amostras
de água há aproximadamente um ano e meio atrás.
19
2. OBJETIVOS
Geral
Investigar a ocorrência de TTV em amostras de água de diferentes origens,
coletadas em regiões diversas do estado do Rio Grande do Sul.
Específicos
- Padronizar uma técnica molecular de reação em cadeia da polimerase
aplicável a detecção de TTV em amostras de água de diferentes tipos;
- Investigar a relação entre a presença de TTV e a possível contaminação
fecal em amostras de águas colhidas na cidade de Porto Alegre, especialmente de
amostras coletadas na estação de tratamento do DMAE – ETE São João –
Navegantes e amostras de água superficial coletada ao longo do Arroio Dilúvio;
- Pesquisar a ocorrência de TTV e relacionar com a possível contaminação
fecal em amostras de água mineral de uso comercial na cidade de Porto Alegre;
- Investigar a ocorrência de TTV em amostras de água tratada obtida de
torneira da cozinha de escolas municipais e estaduais do interior do estado do Rio
Grande do Sul.
- Comparar a detecção molecular de TTV e detecção de coliformes fecais
em amostras de água, analisando o potencial do TTV como marcador de
contaminação fecal.
20
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1 AGENTES VIRAIS COMO MARCADORES DE QUALIDADE DA ÁGUA
No atual sistema de monitoramento da qualidade da água, a Escherichia coli
(coliformes termotolerante) e demais microrganismos pertencentes ao grupo dos
coliformes são as bactérias marcadoras da poluição fecal em águas e esgoto
(BRASIL, 2004; RIO GRANDE DO SUL, 2006). Tal indicador tem se mostrado
insuficiente e limitado, pois esses microrganismos podem não atestar o risco de
infecção por outros patógenos, especialmente vírus, no ambiente (DORE et al.,
2000; DURAN et al., 2002; HARAMOTO et al., 2005b; GRIFFIN et al., 2008). Já
foram identificados mais de 140 tipos de vírus de veiculação hídrica, alguns
potencialmente causadores de enfermidades em seres humanos (HAMZA et al.,
2009) que podem ser encontrados em esgotos sanitários, que por sua vez estarão
contaminando o ambiente aquático que mais tarde acaba sendo utilizado como fonte
de água potável. A contaminação viral de águas subterrâneas e poços também tem
sido relatada frequentemente (TEIXEIRA e LEAL, 2002).
Os vírus entéricos são em geral eliminados em quantidades relativamente
grandes pelas fezes de indivíduos infectados, podendo atingir títulos virais de
aproximadamente 108 a 1011 partículas virais por grama de fezes, conforme o agente
viral analisado (MEHNERT, 2003). A presença desses patógenos pode estar
associada tanto a infecções assintomáticas quanto à ocorrência de doenças em
indivíduos susceptíveis (TAVARES et al., 2005). As infecções são ocasionadas tanto
pela ingestão de água contaminada quanto pelo seu uso para recreação. Para
alguns agentes, apenas uma unidade infecciosa de vírus é o suficiente para iniciar
uma infecção em um indivíduo suscetível (GRAHAM et al., 1987).
Os vírus excretados pela via fecal são, em geral, não-envelopados, o que
lhes confere elevada resistência a condições ambientais adversas. Podem
permanecer viáveis por longos períodos na água, até mesmo em ambiente marinho
e em águas subterrâneas, resistindo a condições ambientais desfavoráveis ou letais
para outros microrganismos, tais como extremos de pH, elevadas temperaturas e
alta salinidade (LEY et al., 2002; FONG e LIPP, 2005). Tanto o consumo direto da
água, seu uso em atividades de higiene e recreação, quanto o uso de vegetais
21
folhosos ou moluscos contaminados na alimentação podem ser uma forma eficaz de
contágio por vírus entéricos (BOSCH, 1998; VINATEA et al., 2006).
Organismos
filtrantes
possuem
a
capacidade
de
armazenar
altas
concentrações de vírus no interior do seu corpo, a exemplo de organismos aquáticos
como os mariscos que tendem a concentrar bactérias e vírus em suas vísceras,
muitas vezes em níveis superiores aos da água circulante (ABAD et al., 1997;
PARASHAR e MONROE, 2001). Conforme mencionado anteriormente, também
alguns vírus potencialmente patogênicos podem ser transmitidos pelo uso de águas
para fins recreativos e no caso da Hepatite A, esta parece constituir uma importante
forma de contaminação (TAYLOR et al., 1995; SABACK et al., 2001).
Embora não se multipliquem quando estão dispersos no ambiente por serem
parasitos intracelulares obrigatórios, os vírus não-envelopados são geralmente mais
resistentes do que procariotos ou mesmo vírus envelopado aos métodos químicos e
físicos utilizados no tratamento de água e esgoto, a solventes, detergentes ou
compostos que no ambiente possam degradar sua estrutura. Assim, os vírus
entéricos apresentam vantagens em relação às bactérias como marcadores de
eficiência do processo de descontaminação da água, pois muitos agentes viras são
mais resistentes aos processos de desinfecção por tratamento de cloração e
radiação ultravioleta. Além disto, muitos dos procariotos são mais susceptíveis aos
processos de tratamento químico-físico e à degradação ambiental (JIANG et al.,
2007). Desse modo, a ausência ou baixa concentração de bactérias de presumida
origem fecal na água não significa ausência de vírus entéricos (JIANG et al., 2007).
De fato, os tratamentos primários (físicos) e secundários (químicos, cloração)
presentemente utilizados tem baixa eficácia na eliminação de vírus em água potável,
sendo hoje amplamente estudadas as alternativas em tratamentos terciários ou
melhoramentos ao tratamento secundário, como a adição de um passo de exposição
à radiação Ultra-violeta (UV, NIEUWSTAD et al., 1991), todavia, alguns agentes tem
elevada resistência aos raios UV, como no caso de Adenovírus (KO et al., 2005;
EISCHEID et al., 2009).
A ausência de rotinas em análise virológica pelos serviços de monitoramento
e fornecimento de água potável, tem se caracterizado como um problema de ordem
mundial. Acredita-se que esse fato venha contribuindo para os episódios de surtos
de gastroenterites e para a elevada prevalência de hepatites dos tipos A e E,
22
especialmente em áreas em desenvolvimento na Ásia, África e América Latina,
sendo freqüentemente associadas a surtos de doenças transmitidas pela água
(TEIXEIRA e LEAL, 2002; THERON e CLOETE, 2002). Os vírus entéricos não são
apenas excretados em grande quantidade pelas fezes e urina de indivíduos
infectados, como muitos deles são capazes de se manterem viáveis com sua
infectividade conservada na água, persistindo no ambiente por vários meses. Sua
inativação é dependente do tipo de vírus e do tratamento utilizado (HURST, 1991;
LAZAROVA et al., 1999 ), muitos destes, a exemplo do Rotavírus e Enterovíurs tem
demonstrado resistência à cloração (PAYMENT, 1985) e o Adenovírus também a
radiação (UV) (GERBA et al., 2002; THOMPSON et al., 2003). Estes vírus têm sido
isolados a partir de amostras de água potável que atendem aos padrões
bacteriológicos e químicos (LEE e KIM , 2002).
3.2 TORQUE TENO VÍRUS
O Torque Teno vírus (TTV) é um vírus não envelopado, pequeno, composto
por DNA fita simples, circular com polaridade negativa e formado por 3,4 – 3,9 kb de
comprimento (MUSHAHWAR et al., 1999; OKAMOTO et al., 2000a,b; WATANABE
et al., 2005; DEVALLE e NIEL, 2005) e diâmetro de 30-32 nm (ITOH et al., 2000). O
genoma é bastante reduzido, sendo composto por apenas 3.853 nucleotídeos
(BENDINELLI et al., 2001) e apresenta duas ou três possíveis Open Reading Frame
(ORFs) capazes de codificar 770 aa (ORF1), 202 aa (ORF2) e 105 aa (ORF3)
(MYATA et al., 1999) (Fig.1). Embora seja um vírus de DNA, mostra um elevado
grau de diversidade e apresenta diferentes genótipos (OKAMOTO et al., 1999). Além
disso, este vírus pode exibir características similares aos vírus entéricos patogênicos
(GRIFFIN et al., 2008). Inicialmente o TTV apresentava características compatíveis
com o gênero Anellovirus e família Circoviridae (MUSHAHWAR et al., 1999; MYATA
et al., 1999), atualmente a classificação se resume somente ao gênero Anellovirus
(BIAGINI et al., 2006). Este vírus tem sido detectado não apenas em humanos, mas
também em outros mamíferos, tais como felinos, caninos e suínos (DEVALLE e
NIEL, 2005). Posteriormente um novo vírus de DNA, pequeno, considerado parente
distante do TTV foi descrito (TAKAHASHI et al., 2000). Estes outros vírus
denominados de Torque teno mini vírus (TTMV), possuem o genoma ainda menor
23
que o TTV, apresentando em torno de 2,8 a 2,9 kb e 2.915 bases, menor que a
sequência genômica prototípica do TTV que apresenta 3.852 bases (NINOMIYA et
al., 2007). TTV e TTMV mostram divergência de sequências genômicas ainda maior
entre si do que entre os genótipos do TTV, porém é difícil de determinar o grau de
divergência visto que os fragmentos genômicos dos dois vírus não podem ser
facilmente alinhados. O TTV possui sequências com maior percentual de GC do que
as sequências nucleotídicas do TTMV, (65,4% e 58,5% respectivamente) (THOM et
al., 2003). Uma recente descoberta, de um novo anellovirus chamado de Torque
teno midi vírus (TTMDV) foi relatada, o mesmo possui genoma com extensão de 3.2
kb e tem sido demonstrada uma alta prevalência em chipanzés e não em seres
humanos (NINOMIYA et al., 2009).
O TTV já foi detectado em bovinos, suínos, aves, ovinos e em vários
primatas não humanos (BRASSARD et al., 2008, OKAMOTO
et al., 2000 a).
Estudos identificaram a presença de TTV suíno em até 66% de amostras de soro
coletadas de animais sadios. O genoma do TTV de origem suína é menor e possui
similaridade em torno de 45% em relação às sequências genômicas do TTV humano
(MCKEOWN et al., 2004).
Apesar do pouco conhecimento sobre suas propriedades biológicas, sabe-se
que o TTV apresenta considerável diversidade genética, tendo sido encontrados
cerca de quarenta genótipos, até o momento. Estes podem ser classificados em
cinco grupos que teoricamente podem apresentar diferentes níveis de virulência
(PENG et al., 2002; MAGGI et al., 2007). Entretanto, embora a associação do TTV
com indução de doença em humanos seja discutível, estudos indicam que o
genótipo 1, especificamente, tem possível maior participação nestes processos
(WATANABE et al., 2005). Além disto, os genótipos tipo 1 e 2 do TTV estão,
aparentemente, mais distribuídos geograficamente em todo o mundo (OKAMOTO et
al., 1998b), presente nos vários continentes (BENDINELLI et al., 2001). Embora a
pesquisa do TTV já tenha alcançado 10 anos de investigação, a distribuição da
infecção pelo TTV em seres humanos, por muitos considerada ubíqua, ainda
continua sendo um tema de discussão (VASILYEV et al., 2009).
24
Figura 1. Organização genômica do TTV apresentando as localizações correspondentes à
ORF1 (azul, 589-2901); ORF2 (vermelho, 353- 711) e ORF3 (verde, 2564-3077). Mapa criado com
base na sequência genômica disponível no GenBank sob o código de acesso NC_002076.
3.3 HISTÓRICO E IMPORTÂNCIA CLÍNICA DO TTV EM SERES HUMANOS
Acredita-se que seu nome esteja associado às iniciais (TT) do primeiro
paciente investigado pelo grupo de pesquisadores, embora essas iniciais também
possam representar uma abreviatura ou acronímia para Transfusion-transmitted
virus (NISHIZAWA et al., 1997; BENDINELLI et al., 2001). O TTV foi detectado
primeiramente pelo pesquisador japonês Nishizawa e seus colaboradores (1997), a
partir de amostras biológicas de pacientes com hepatite pós-transfusional de
etiologia
desconhecida.
Posteriormente,
foi
detectado
em
diversos
países
(OKAMOTO et al., 2000b; BASSIT et al., 2002, DEVALLE e NIEL, 2005; DINIZMENDEZ et al., 2004).
Inicialmente suspeitou-se que o TTV causava hepatites, mas recentes
estudos indicam que este vírus pode não provocar sérios problemas de saúde, pelo
fato de a infecção ativa ser altamente prevalente entre indivíduos aparentemente
saudáveis, sugerindo que o TTV seja desprovido de potencial patogênico (ABE et
al., 1999; WATANABE et al., 2005). Outros estudos, porém, indicam que vários
genótipos
podem
ser
responsáveis
por
provocar
doenças
em
humanos
(TAKAHASHI et al., 1998), em especial o genótipo I.
A presença do TTV foi identificada em aproximadamente 50% dos casos de
hepatites crônicas ou agudas e 12% de doadores de sangue em estudo realizado no
25
Japão (OKAMOTO et al., 1998a). Em estudo realizado no Brasil por Bassit et al.
(2002), foi observada a presença do TTV em 85,3% dos doadores de sangue e em
81,2% das crianças e adolescentes pesquisados. Outro estudo realizado por Kato et
al. (2003) demonstrou alta prevalência do TTV em uma população normal, sugerindo
que a infecção persiste na maioria dos indivíduos infectados. Mais recentemente, um
estudo realizado na Rússia por Vasilyev et al. (2009), demonstrou altíssima
presença deste vírus nesta população, chegando a atingir 94% de positividade para
este vírus e não havendo correlação com idade, além disto, este índice mostrou ser
superior ao descrito pela literatura (VASILYEY et al., 2009).
Tais resultados, além de um grande número de relatos da detecção do vírus
em indivíduos saudáveis e da ausência de um modelo experimental adequado para
a infecção, não permitem confirmar a participação do TTV como agente etiológico de
alguma doença específica em humanos, uma vez que o TTV é um vírus presente em
mais de 80% da população em todo o mundo (PRESCOTT e SIMMONDS, 1998;
HUANG et al., 2001).
O TTV causa infecções crônicas e está presente no plasma sendo capaz de
infectar muitos tecidos do corpo, além de estar presente em tecidos e fluidos
corporais de mais de 80% de doadores de sangue saudáveis (POLLICINO et al.,
2003) e estudos têm mostrado que o vírus persiste por períodos prolongados ou
indefinidamente no plasma de indivíduos infectados. Além disso, de acordo com o
estudo feito por Nasser (2007), o TTV é mais prevalente em indivíduos soropositivos
ao HIV em comparação com indivíduos saudáveis. Embora ainda a significância
clínica da associação do TTV com HIV necessite ser elucidada, esse estudo sugere
que a presença do TTV pode estar relacionada a uma diminuição da carga viral do
HIV em indivíduos portadores.
No Brasil, o TTV foi detectado em pacientes com doenças hepáticas
crônicas nas Regiões Sudeste e Norte do país (PINHO et al., 1998). Outros estudos
têm evidenciado a presença do DNA de TTV em tecidos e fluidos corporais (saliva,
urina, fezes e sêmen, pele) e em vários órgãos humanos como fígado, bílis, medula
óssea, linfonodo de linfa, músculo, tireóide, glândulas, pulmão, baço, pâncreas, rim,
região gástrica, garganta, cérebro e outros (OKAMOTO et al., 2001; MAGGI et al.,
2003).
26
3.4 EPIDEMIOLOGIA DO TTV
Inicialmente acreditava-se que a principal via de transmissão do TTV fosse a
transfusão sanguínea, ou pacientes com elevados riscos de contrair viroses pela via
parenteral como hemofílicos, que fazem hemodiálises ou usuários de drogas. Porém
a presença de TTV nas fezes de indivíduos saudáveis é ubíqua revelando que a
infecção pode estar amplamente disseminada na população humana, denunciando a
transmissão também pela via não parenteral (OKAMOTO et al., 1998a) . Assim, o
TTV, por ser um vírus não-envelopado e possuir excreção por diferentes vias,
incluindo a via fecal, pode ser considerado como um interessante candidato a
agente biológico marcador no estudo de contaminação fecal de águas, tal como
ocorre com outros microrganismos dotados de disseminação hídrica (FONG e LIPP,
2005). Os tratamentos com virucidas conhecidos e utilizados para inativar vírus
envelopados, como solventes-detergentes com aquecimento a seco a 95ºC por 96
horas, demonstram ser pouco efetivos na destruição da estrutura viral de vírus nãoenvelopados como o Adenovírus , Norovírus e HAV (WATANABE et al., 2005).
No que tange à infecção pelo TTV em outras espécies animais, existe
também muito ainda por esclarecer. Embora estudos complementares sejam
necessários para uma melhor compreensão deste agente, pesquisas moleculares
em outros hospedeiros apontam que 60 – 80% da população suína apresenta o TTV
em amostras de soro. Sendo a epidemiologia do TTV pouco compreendida,
suspeita-se que a rota fecal-oral represente uma importante via de transmissão
deste vírus também em suínos. Entretanto, estudos têm demonstrado uma baixa
prevalência do TTV em bovinos, o que poderia ser explicado pela replicação viral em
baixos títulos nesses animais e pela elevada variabilidade das amostras virais que
afetaria os limiares de detecção por métodos moleculares. Assim, futuras pesquisas
devem determinar a prevalência do TTV na espécie bovina e elucidar os fatores que
afetam as diferenças na prevalência TTV em suínos e bovinos (BRASSARD et al.,
2008). Há relatos também de infecção do TTV em chimpanzés e macacos rhesus
(OKAMOTO et al., 1998a; MUSHAHWAR et al., 1999). Porém pouco se sabe a
respeito de infecção em mamíferos menores, devido a grande dificuldade de se
obter replicação deste vírus em cultura de tecidos (MAGGI et al., 2001)
27
3.5 DETECÇÃO MOLECULAR DE VÍRUS EM AMOSTRAS AMBIENTAIS
Inicialmente, para a pesquisa de vírus em ambientes aquáticos utilizava-se
grande volume de água, chegando a serem usados em torno de 500 litros em cada
amostra submetida à detecção viral (HARAMOTO et al., 2004). Outros estudos
sugerem como recomendável o uso de 10 litros de água como amostra, com a
coleta em um processo de concentração das amostras por filtros e eluição,
centrifugação ou outras metodologias com o fim de concentrar as escassas
partículas virais presentes (HARAMOTO et al., 2005b). Estudos recentes têm
mostrado que a quantidade de amostra inicial pode ser significativamente reduzida
comparativamente a estudos anteriores, chegando em alguns deles a 500 ml, como
descreveram Haramato et al. (2005b) e Albinana-Gimenez et al. (2009). Este último
estudo mostrou que quantidades menores de amostra facilitam a detecção viral por
métodos moleculares, tendo sido comparados volumes de amostra de 40 mL, 1 litro,
10 litros e 50 litros. O estudo mostrou que amostras de 10 litros e 50 litros
apresentaram a menor taxa de detecção viral e uma alta inibição na reação em
cadeia da polimerase (PCR), dada a provável concentração de inibidores da reação
no processo, obtendo-se limites de detecção de 2,5 × 101 GC / L para 50 L e 1,25 ×
102 GC/L para 1 e 10 L. Encontrou-se, dessa forma, uma maior sensibilidade
analítica na detecção em amostras da ordem de 1 e 10L. Além disso, diversos
volumes de amostra de água de rio com alta turbidez e significativa contaminação
fecal foram comparados e o volume de 1L foi o que apresentou a maior taxa de
detecção viral (ALBINANA-GIMENEZ et al., 2009).
O TTV é transmitido pela via fecal-oral e pode ser detectado por meio de
ensaios moleculares que possuem características de sensibilidade e rapidez como,
por exemplo, a PCR (GRIFFIN et al., 2008), que nos últimos anos tem sido utilizada
para detecção de vírus em amostras ambientais (KATAYAMA et al., 2002; LEY et
al., 2002). O desenho de oligonucleotídeos para detecção de TTV muitas vezes está
voltado para a amplificação de sequências de uma região codificante, com sucesso
para detectar TTV do grupo 1, ao passo que para detectar TTV de todos os grupos
conhecidos normalmente têm sido utilizados iniciadores baseados em uma região
não codificante (OKAMOTO et al., 1998a; 2000c). Além disso, regiões conservadas
do genoma viral podem constituir alvos capazes de permitir a detecção de um
28
número maior de amostras de TTV, mesmo de genogrupos não conhecidos
(DEVALLE e NIEL, 2004).
O uso da PCR é de grande importância na detecção de contaminação por
vírus em amostras ambientais, principalmente pelo fato de que muitas vezes os
agentes virais estão extremamente diluídos nas amostras de água, necessitando,
portanto, de uma técnica de elevada sensibilidade para sua detecção (VAIDYA et al.,
2002). Essa metodologia ainda tem o benefício adicional da determinação de
sequências específicas do material genético detectado, auxiliando na caracterização
dos agentes encontrados por filogenia molecular. A principal desvantagem é que a
PCR ou outros métodos de detecção molecular não permitem distinguir partículas
virais viáveis de partículas não infecciosas na amostra em teste, o que só é possível
complementando os ensaios com cultivos celulares (TAVARES et al., 2005).
No caso específico da detecção de TTV em amostras de água, vários
estudos têm revelado o aspecto promissor deste agente, quando analisado ao lado
de outros agentes virais, como marcador de poluição fecal (GRIFFIN et al., 2008).
Mesmo no Brasil, outros grupos de pesquisa já obtiveram resultados de extrema
relevância sobre a relação entre TTV e poluição fecal. O relato mais recente no país
refere-se à cidade de Manaus (DINIZ-MENDEZ et al., 2008), em estudo no qual foi
utilizada a coleta de amostras de 2 litros de água de vários pontos na bacia de
cursos d'água que atravessam a cidade. Estas amostras foram submetidas a
concentração
viral
de
acordo
com
a
metodologia
descrita
anteriormente
(KATAYAMA et al., 2002) com algumas modificações, extração de material
genômico viral conforme métodos usuais e detecção por metodologia molecular por
reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real (qPCR) comparada à PCR
convencional. Os pesquisadores observaram a presença de TTV em 92% das
amostras de água analisadas e processadas por qPCR. Na mesma pesquisa
também foram analisadas as amostras seguindo a metodologia por PCR
convencional, na qual o resultado positivo para o TTV foi de 36,5%.
3.6 TTV COMO MARCADOR DE POLUIÇÃO AMBIENTAL
A frequência do TTV no sangue da população humana e a transmissão pela
via fecal-oral podem explicar sua ocorrência em todo o mundo (PRESCOTT e
29
SIMMONDS, 1998). No atual sistema de abastecimento e monitoramento da
qualidade e potabilidade da água, somente os coliformes totais e Escherichia coli
são parâmetros indicadores de contaminação fecal. Sabe-se que estes indicadores
bacterianos não asseguram total proteção à saúde pública, visto que muitas
doenças de origem viral podem ser oriundas de águas nas quais a ausência de
bactérias tenha sido detectada, além de se observar que após o tratamento da água
ainda se observa a presença do TTV e de outros vírus (GRIFFIN et al., 2008). Além
disso, estudos mostram ausência de relação entre TTV e sazonalidade,
representando desta forma um fator positivo no sentido deste vírus ser um indicador
de contaminação ambiental (DINIZ-MENDEZ et al., 2008), além de relatos de alta
frequência de TTV em águas antes e após tratamento. No Japão, o TTV foi
detectado em 97% das amostras de esgoto, sendo 18% antes da cloração e 24%
após a cloração, o que indica que o vírus estava amplamente disseminado na
população japonesa durante um ano de estudo (HARAMOTO et al., 2005a). Tais
dados podem ser comparados com o estudo realizado por Vaidya et al. (2002), na
Índia, no qual observou-se a presença de 14,5% e 2% de amostras positivas para o
TTV, respectivamente antes e após tratamento, o que significa prevalência muito
mais baixa. No Brasil, diferentemente ao estudo da realizado na Índia, Diniz-Mendes
et al. (2008) demonstrou elevada ocorrência (92%) do TTV em amostras em um
córrego que atravessa a cidade de Manaus, mostrando que o vírus pode ser um
indicador de contaminação viral humana em águas.
Embora haja grande divergência de opiniões de virologistas e ambientalistas
a respeito da efetividade deste vírus como marcador de contaminação ambiental, há
que se valorizar que este vírus pode ser considerado um indicador promissor em
relação aos tradicionais indicadores bacterianos e mesmo alguns outros vírus
entéricos, visto que sua transmissão ocorre por via fecal-oral e por apresentar
algumas características distintas dos demais vírus (GRIFFIN et al., 2008). Formado
por DNA de fita simples e circular, não apresenta envelope em sua estrutura
(NISHIZAWA et al., 1997; MIYATA et al., 1999), que lhe confere de certa forma certa
resistência. Isolados de TTV apresentam grande diversidade tendo em torno de 47%
– 70% de variação em seus aminoácidos (BIAGINI et al., 1999) e divergência no
genoma, apresentando regiões hiper variáveis na região traduzida (NISHIZAWA et
al., 1999) e regiões não traduzida apresentam sequências mais conservadas do
30
genoma (OKAMOTO et al., 1998b; LEARY et al., 1999). Embora, pouco se sabe
sobre a estabilidade ambiental deste vírus, Takayama et al. (1999) mostraram a
presença de infecciosidade do TTV após 95 horas de tratamento a seco, desta
forma acredita-se que este vírus possua características de resistência a estresse
ambiental (VERANI et al., 2006).
3.7 SISTEMAS DE TRATAMENTO DE ESGOTO E ÁGUA PARA CONSUMO
No Brasil, o atual sistema de tratamento de água para o consumo humano
segue as já citadas normativas determinadas pela portaria 518, de 25 de março de
2004 (BRASIL, 2004), na qual estabelece os procedimentos e responsabilidades
relativos ao controle e vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu
padrão de potabilidade. Sendo assim, este segmento define água potável como
sendo a que não oferece risco à saúde da população e cujos parâmetros físicos,
químicos, radiológicos e microbiológicos atendam aos padrões de potabilidade. Em
se tratando de parâmetros microbiológicos, atualmente, as bactérias do grupo
coliformes (coliformes totais) e a Escherichia coli (coliformes termotolerantes), esta
última exclusivamente de origem fecal, são consideradas o mais específico indicador
de contaminação fecal recente e de eventual presença de organismos patogênicos.
Desta forma, a presença destas bactérias tem sido considerada como sendo o
parâmetro microbiológico indicador de contaminação fecal na água. Portanto, é
considerada hoje, água potável para consumo humano aquela cujos padrões
microbiológicos revelem ausência dos microrganismos E. coli e coliformes totais em
100 mL de água, mas esses valores podem ter sua tolerância aumentada conforme
a demanda populacional atendida.
Para o tratamento de efluentes, a resolução do CONSEMA 128 de 2006
(RIO GRANDE DO SUL, 2006) define sobre os padrões de emissão dos efluentes
líquidos, os quais são lançados em águas superficias. Para tal evento, é necessário
que o esgoto sanitário gerado pela população seja tratado antes de ser despejado
em rios ou corpo receptor. Para isso, é imprescindível que o efluente gerado seja
tratado em estações de tratamento, as quais são compostas por um conjunto de
instalações e processos que tem por finalidade a redução do material contaminante
em águas. A resolução do Conama 357/2005, dispõe sobre a classificação dos
31
corpos de água e estabelece padrões de lançamentos de efluentes. Esta normativa
classifica os corpos receptores de águas doces em: classe especial: cujas águas
são destinadas ao consumo humano com desinfecção; classe I: águas destinadas
ao abastecimento humano após tratamento simplificado e que apresentam valores
máximos de 200 coliformes termotolerantes em 100 mL de água; classe II:
destinadas ao abastecimento humano após tratamento convencional e que não
exceda a 1.000 coliformes termotoletantes em 100 mL de água; classe III: águas
doces destinadas ao abastecimento para consumo após tratamento convencional ou
avançado, que apresentem no máximo 4.000 coliformes termotoletantes em 100 mL
de água em 80% das amostras; classe IV: águas destinadas a navegação e
paisagística (BRASIL, 2005a).
As estações de tratamento de águas residuais de esgoto, conhecidas como
Estação de Tratamento de Esgoto (ETE), adotam diferentes métodos de tratamento
que tem por finalidade reduzir ou minimizar a poluição dos esgotos. Existem vários
processos de tratamento de esgoto que são utilizados no mundo inteiro. Neste
trabalho enfatizam-se os tratamentos por lagoas de estabilização e por lodos
ativados, os quais são freqüentemente utilizados (FERREIRA, 2006). Muitas
estações fazem uso do tratamento de esgoto por lagoas de estabilização,
consideradas a forma mais simples de tratamento de esgoto. Compostas
basicamente por lagoas anaeróbias, facultativas e de maturação, consistem no
tratamento biológico onde o esgoto é tratado através da decomposição da matéria
orgânica pelas bactérias. Este processo é realizado em várias etapas, como
tratamento primário, secundário e terciário. Inicialmente as etapas são de tratamento
físico com a finalidade de remover os sólidos suspensos no esgoto, seguidas das
etapas de tratamento biológico que objetivam a redução da matéria orgânica,
demanda bioquímica de oxigênio (DBO), demanda química de oxigênio (DQO) e
nutrientes como fósforos e nitrogênios muito presentes no esgoto. Na sequência
outros tratamentos destinados à remoção biológica de poluentes tóxicos são
inseridos, além de tratamento para remoção de organismos patogênicos (VON
SPERLING, 2002).
O sistema de tratamento de efluentes líquidos por lodos ativados,
amplamente utilizado em todo mundo, é caracterizado pela alta eficiência na
remoção da matéria orgânica, além de estar associado a uma pequena área de
32
implantação, quando comparado a outros sistemas de tratamento (BENTO et al.,
2005). O tratamento por lodo ativado convencional é formado por um reator biológico
aerado artificialmente e um sedimentador. O processo opera na depuração
biológica, exclusivamente por via aeróbia, onde os compostos orgânicos e
inorgânicos presentes na água residuária são degradados por uma população
microbiana diversificada como muitas espécies de bactérias, protozoários e fungos
que são mantidos em suspensão num ambiente na presença de oxigênio (VON
SPERING, 1997; CLAAS, 2007). As próprias bactérias são as principais
responsáveis pela depuração da matéria carbonácea e pela estruturação dos flocos.
A participação da microfauna (protozoários e micro-metazoários) também favorecem
a manutenção da comunidade bacteriana equilibrada, a remoção de E. coli, a
redução da DBO e a floculação. Por serem extremamente sensíveis às alterações
no processo, os componentes da microfauna alternam-se no sistema em resposta às
mudanças nas condições físico-químicas e ambientais. Desse modo, a composição
da micro fauna do lodo ativado revela tendências do processo, quanto a eficiência
da remoção da DBO, DQO e na eficiência da remoção de sólidos suspensos (SS)
(SALVADO et al., 1995; HOFFMANN et al., 2001).
Embora no Brasil ainda não se disponham de sistemas de tratamento
aplicáveis à desinfecção de agentes virais em água destinada para o consumo ou
para efluentes de esgotos, muitos países utilizam tecnologias nesse sentido. A
utilização de tecnologias de desinfecção por ultravioleta (UV) é o tipo de tratamento
voltado à desinfecção de vírus mais frequentemente reportado através da exposição
de finas lâminas de água a lâmpadas de mercúrio que produzem UV em
comprimentos de onda com potencial de inativar a maioria das espécies de vírus
presentes na água (STANFIELD; LECHEVALLIER; SNOZZI, 2003). Entretanto, já foi
demonstrado que algumas espécies de Adenovírus são muitos resistentes à luz
ultravioleta e não são facilmente inativados como os outros agentes virais (WHO,
2004; THOMPSON et al., 2003).
Muitos países adotam esta tecnologia em nível doméstico, pois a luz
ultravioleta não tem contra-indicações e seu uso apresenta vantagens, pois não
apresenta adição de produtos químicos, e não interfere no sabor e odor, é simples
de operar, não necessitando de um profissional altamente qualificado para isto
(LAURENT, 2005). Além disto, não há risco de excesso de dosagem como ocorre
33
com os produtos químicos. A grande maioria dos processos de esterilização por UV
é usada para desinfecção de efluentes tratados, onde os microrganismos são
destruídos pela ação germicida da luz. A eficácia desta tecnologia para tratamento
de efluentes depende da intensidade, tempo de exposição e comprimento de onda
da fonte irradiante. Além disto, excesso de turbidez pode inibir o processo de
dissolução e comprometer a eficiência do processo. Esse tratamento também
apresenta a desvantagem em não apresentar proteção residual contra a
recontaminação (LAURENT, 2005).
Em relação ao aspecto ambiental, o sistema de tratamento por UV é uma
técnica ambientalmente sustentável e amplamente difundida, pois seu efeito nocivo
se restringe aos microrganismos presentes na água, não gerando desta forma
subprodutos nos corpos hídricos (BILOTTA e DANIEL, 2006). Ainda há que ressaltar
a crescente preocupação com o uso de cloro e os efeitos de compostos clorados
formados no processo de sobra à saúde humana (LAZAROVA et al., 1999).
Em se tratando do processo de cloração, que é desinfecção de
microrganismos pela ação do cloro, esta etapa tem sua tem importância
principalmente
para
inativar
algumas
bactérias
intestinais
gram-negativas
pertencentes ao grupo de coliformes. No entanto, esta prática é insuficiente para
inativar agentes virais como Enterovírus, Adenovírus, Norovírus e vírus da Hepatite
A que tem resistência variada à inativação por cloro (THERON e CLOETE, 2002).
Outro tratamento terciário recomendado para inativar vírus em água é o
processo de ozonização. A desinfecção pela utilização da molécula de ozônio,
fortemente oxidante e desinfetante, é pouco utilizada nos tratamentos de esgoto no
Brasil (SOUZA e DANIEL, 2008), mas tem sido considerado um excelente
desinfetante usado para inativar patógenos em água, principalmente em países
europeus. Muito embora o método por ozonização tenha demonstrado ser menos
efetivo que a desinfecção pela UV (FACINE et al., 2000), o ozônio apresenta
capacidade em remover substancias responsáveis pela cor, gosto e odor. Além
disso, elimina microrganismos resistentes a outros métodos de desinfecção, age
inativando bactérias, protozoários e vírus (BILOTTA E DANIEL, 2006). Após anos de
uso, a eficiência deste mecanismo na inativação de todos os agentes ainda é pouco
compreendida, visto que algumas bactérias são mais sensíveis ao ozônio e
geralmente os vírus entéricos apresentam maior resistência do que fagos e bactérias
34
ao tratamento (STANFIELD; LECHEVALLIER; SNOZZI, 2003). Estudo experimental
mostrou que vírus em águas residuárias foram totalmente inativados por tratamento
através de ozônio (XU et al., 2002). O ozônio também não possui estabilidade
residual e frequentemente é adicionada uma etapa de cloração para a proteção
residual das águas (STANFIELD; LECHEVALLIER; SNOZZI, 2003).
35
4. METODOLOGIA
4.1 AMOSTRAS DE ÁGUA UTILIZADAS E PROCEDIMENTO DE COLETA
As amostras originaram-se de diferentes locais de Porto Alegre e de cidades
do interior do estado. Procedeu-se a coleta de amostras de estudo seguindo
protocolo da Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental (CETESB, 1987)
com algumas modificações. Desta forma, frascos de 500 mL previamente
esterilizados por autoclavagem foram utilizados para a coleta de amostras de
campo. As amostras foram coletadas nas estações de tratamento (ETE’s) do
Departamento Municipal de água e esgoto (DMAE) especificamente da ETE São
João – Porto Alegre e amostragens de diferentes pontos do Arroio Dilúvio localizado
em Porto Alegre, água mineral de bombonas e água tratada obtida da torneira da
cozinha de Escolas municipais e estaduais do interior do estado. Para a correta
coleta e acondicionamento das amostras, as mesmas foram coletadas em frascos
de vidro de 500 mL estéreis (autoclavados) e livres de partículas grandes, detritos ou
folhas. Alem disto para minimizar a contaminação, a coleta foi realizada com a boca
do frasco voltado contra a corrente de água, tomando o máximo de cuidado para
não tocar na parte interna do frasco. Os coletores foram orientados a manterem as
mãos higienizadas, adicionalmente usar luvas no procedimento e não deixar as
amostras expostas à fumaça, pó ou outras impurezas. Após a coleta, as amostras
foram identificadas, registrando a localização do ponto, data e tipo de amostragem.
Imediatamente após a coleta, as amostras foram colocadas ao abrigo de luz solar e
mantidas em temperatura entre 2ºC e 8°C (em isopor com gelo) até o transporte ao
Laboratório de Biologia Molecular do Centro Universitário Feevale, onde as quais
foram mantidas sob refrigeração a 4ºC até o processamento.
4.1.1 Amostras de Estação de Tratamento de esgoto - DMAE
O DMAE é o departamento Municipal de água e esgoto responsável pela
coleta e tratamento do esgoto sanitário cloacal na cidade, além disto, é responsável
pela
captação,
tratamento
e
distribuição
de
água
em
Porto
Alegre
(http://www.portoalegre.rs.gov.br/dmae/). A estação realiza o tratamento do esgoto
36
cloacal de onze bairros da cidade e tem capacidade para tratar 444 litros de esgoto
por segundo, beneficiando assim uma população de aproximadamente 150 mil
habitantes da zona norte da capital (fig. 2). Para o presente estudo, amostras de
esgoto originalmente coletadas por profissionais do DMAE foram concedidas através
do processo de parceria de pesquisa nº 003.005689.08.2, o qual foi previamente
avaliado e autorizado por este órgão. Desta forma, amostras mensais de dois
pontos, afluente (aflu- esgoto bruto) e efluente (eflu - esgoto tratado) foram coletadas
no período de março a outubro de 2009 na estação de tratamento ETE São João –
Navegantes - DMAE, Porto Alegre (fig. 3). A coleta baseou-se em métodos já
descritos anteriormente, com o adicional que para a coleta destas amostras utilizouse um recipiente apropriado para este fim, o qual é inicialmente lavado com a própria
água do sistema e depois é emergido no tanque para a retirada da amostra. Esta
estação de tratamento tem por característica o tratamento do esgoto pelo método de
lodos ativados, tratamento que é amplamente utilizado no mundo todo, pelo fato de
apresentar alta eficiência associada à pequena área de implantação quando
comparados a demais sistemas de tratamento. Neste tratamento o esgoto é
inicialmente pré tratado e depois é direcionado para os tanques de aeração (fig. 3).
Neste processo o oxigênio é introduzido artificialmente ao esgoto, acelerando a
decomposição natural do material orgânico, que é degradado pelas bactérias que
removem 99% da matéria orgânica, melhorando a qualidade da água que é liberada
para o rio Guaíba. A ETE São João - Navegantes passou a operar neste sistema
desde 2001, quando o DMAE adaptou o sistema baseado em modelos tecnológicos
aprovados
em
países
(http://www.portoalegre.rs.gov.br/ecos/revistas/ecos19).
europeus
37
ETE
Figura 2. Mapa da localização da ETE São João – Navegantes, mostrando a grande quantidade
de bairros que a circunda. (Fonte: DMAE).
2
3
1
Figura 3. Vista aérea da estação de tratamento de esgoto ETE São João – Navegantes,
identificando os locais das coletas das amostras, 1: afluente (esgoto bruto) e 2: efluente
(esgoto tratado). 3: tanques de aeração. (http://www2.portoalegre.rs.gov.br/dmae/default. php).
38
4.1.2 Amostras do Arroio Dilúvio – Porto Alegre
O Arroio Dilúvio, localizado em Porto Alegre, percorre uma distância de 13,8
Km, atravessando a capital no sentido leste-oeste. Este arroio tem sua nascente no
Município de Viamão e, junto com demais arroios de pequeno porte, forma já em
Porto Alegre, a Barragem Lomba do Sabão. Este arroio tinha por finalidade original o
escoamento de seus afluentes e a coleta de águas pluviais. Porém, como ele
atravessa bairros de elevada taxa de ocupação, tem assumido um papel importante
no saneamento da região, onde então recebe águas de escoamento natural e
também efluentes cloacais de uma importante parcela da população que ocupa sua
área de drenagem, além da presença de vários estabelecimentos de saúde e
hospitais de grande porte que lançam seus efluentes. As cargas cloacais e pluviais
lançadas ao longo do Arroio constituem um aspecto negativo do ponto de vista de
Saúde pública, pois o mesmo lança diretamente ao Guaíba suas águas de péssima
qualidade sanitária (FARIA; NEUVALD; ALVES, 1994). Para o presente estudo
realizaram-se três coletas com periodicidade trimestral nos meses de janeiro a
setembro de 2009 nos 5 pontos distribuídos no percurso do arroio, O ponto 1 situase na nascente do arroio, na represa Lomba do Sabão, e os demais pontos 2, 3, 4 e
5 estão localizados na Avenida Ipiranga esquina com as Ruas Antonio de Carvalho,
Guilherme Alves, Ramiro Barcelos e Borges de Medeiros, respectivamente. O último
ponto está situado no local em que o arroio deságua no Guaíba (Fig. 4), neste ponto
tomou-se o máximo de cuidado para não coletar muito próximo da margem com o
Guaíba, para evitar interferências na composição das águas do arroio. Coletou-se
amostras de água da superfície do arroio até 50 cm de profundidade, as amostras
foram coletas com auxílio de um recipiente apropriado e imediatamente
acondicionadas nos frascos de coleta e mantidas em refrigeração até sua chegada
no laboratório. Para a correta coleta e acondicionamento das amostras, os
procedimentos seguiram as normas previamente determinadas (CETESB, 1987),
com alguns procedimentos assépticos citados anteriormente. Estas amostras foram
obtidas por colaboração com docentes do Instituto de Ciências Básicas da Saúde,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
39
Figura 4. Localização aproximada dos pontos 1, 2, 3, 4 e 5 do Arroio Dilúvio em Porto Alegre,
mostrando local das coletas. (Mapa cedido por Gisele Nachtigall Garbinatto).
4.1.3 Amostras de água de escolas Municipais e Estaduais
Amostras de água de escolas Municipais e Estaduais foram coletadas em garrafas
plásticas de 500 mL, gentilmente cedidas pela Profa. Ana Beatriz Oliveira (Centro
Colaborador em Alimentação e Nutrição Escolar do Sul, CECANE – SUL – UFRGS).
Estas amostras são oriundas das cidades de Santa Cruz do Sul, Pelotas e Caxias do
Sul, e foram coletadas de torneiras da cozinha destas escolas. O estado do Rio
Grande do Sul é constituído por 7 mesorregiões, cada mesorregião é composta por
diferentes microrregiões geográficas. As cidades de Pelotas, Santa Cruz do Sul e
Caxias do Sul estão entre as cidades mais populosas do estado e estão
representando a microrregião de Pelotas, Santa Cruz do Sul e Caxias do Sul (fig.5).
Estas microrregiões estão inseridas nas mesorregiões chamadas de Sudeste Riograndense,
Centro
Oriental
Rio-grandense
e
Nordeste
Rio-grandense,
respectivamente. As microrregiões de Santa Cruz do Sul e Caxias do Sul estão
40
localizadas na bacia hidrográfica do Guaíba; Pelotas está inserida na bacia
hidrográfica Litorânea (FEE - FUNDAÇÃO DE ECONOMIA E ESTATÍSTICA - RS,
2009, http://mapas.fee.tche.br/). O Serviço Autônomo Municipal de Água e Esgoto
(SAMAE) é uma autarquia vinculada à Prefeitura de Caxias do Sul e é responsável
pela captação, tratamento e distribuição de água à população. A água nesta cidade
é tratada seguindo as etapas de floculação, decantação, filtração e por último a
desinfecção e fluoretação (http://www.samaecaxias.com.br/site/default.asp). Para a
cidade de Pelotas, a captação, o tratamento e a distribuição da água são realizados
pelo Serviço Autônomo de Saneamento de Pelotas (Sanep). Esta instituição realiza
o tratamento da água pelos processos de coagulação e floculação, decantação,
filtração, e por último a desinfecção, fluoretação e neutralização do pH, esta última
etapa
é
realizada
no
reservatório
da
estação
de
tratamento
de
água
(http://www.pelotas.com.br/sanep/sanep/sanep.htm#). A cidade de Santa Cruz do
Sul realiza o tratamento da água através de serviços prestados pela Secretaria
Municipal de Meio Ambiente e Saneamento (SEMMAS) que incentivam a população
a realizar também a limpeza das caixas d’água. O tratamento das águas atende as
exigências dos padrões de potabilidade determinados pela portaria 518/2004
(http://www.pmscs.rs.gov.br/index.php?acao=noticias&noticias_id=4099).De maneira
semelhante às outras coletas, os cuidados de assepsia e armazenamento se fizeram
presentes no momento das coletas. Coletaram-se 34 amostras no período de julho a
setembro de 2009. Destas, 19 amostras são procedentes de Caxias do Sul, 8 de
Pelotas e 7 amostras da cidade de Santa Cruz do Sul. Assim, 23 amostras oriundas
de escolas municipais e 11 de escolas estaduais foram utilizadas para o estudo.
Estas amostras foram obtidas por colaboração com docentes do Instituto de
Ciências Básicas da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
41
Figura 5. Mapa do Rio Grande do Sul e suas microrregiões. Em destaque as três microrregiões
utilizadas no estudo, número 16: Caxias do Sul; 20: Santa Cruz do Sul e 33: Pelotas. (Mapa
modificado, disponível em: http://mapas.fee.tche.br/wpcontent/uploads/2009/08/microrregioes_rs_2009.png).
4.1.4 Amostras de água mineral
Amostras de água mineral de 200 mL provenientes de bombonas de 20 L
comercialmente disponíveis foram coletadas. A metodologia da coleta também
seguiu os cuidados de higiene e assepsia descritos anteriormente, tendo o máximo
de atenção em manter os exemplares livres de quaisquer impurezas disponíveis no
ambiente. Neste trabalho, 7 amostras de diferentes marcas comerciais foram
utilizadas para análise. Estas amostras foram obtidas por colaboração com docentes
do Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do
Sul.
42
4.2 PROCESSAMENTOS DAS AMOSTRAS
4.2.1 Concentração viral
Realizou-se a concentração viral, visto que, de forma geral, as partículas
virais encontram-se extremamente diluídas nas amostras de estudo. Desta forma,
segui-se metodologia descrita por Katayama et al. (2002) com algumas
modificações, especialmente relacionadas ao volume das amostras, os valores das
soluções utilizadas foram proporcionalmente ajustados ao volume de água usada
nos ensaios. Para a certificação da eficiência do método, antes do processamento
das amostras de estudo, realizou-se um teste experimental, onde uma amostra
padrão de Adenovírus bovino tipo 3 (BAV), gentilmente cedida pelo Dr. Eduardo
Furtado Flores (Setor de Virologia, UFSM) foi utilizada como modelo. Neste caso,
análises com Adenovírus como modelo foram realizadas, tendo em vista o cultivo
fácil deste agente in vitro, diferente do TTV, de cultivo fastidioso. Os procedimentos
de cultivo celular e viral foram realizados em parceria com o Laboratório de Virologia
do ICBS/ UFRGS. O vírus foi propagado em células de cultivo CRIB, de origem
bovina. As células foram mantidas em frascos plásticos contendo Meio mínimo
essencial de Eagle (E-MEM, Sigma) acrescido 2% de Soro Fetal Bovino (SFB,
Cultilab). Os cultivos foram mantidos em estufa a 37°C seguindo metodologia usual.
O BAV foi inoculado em monocamadas celulares semi-confluentes e após adição de
E-MEM sem SFB, os cultivos celulares inoculados foram novamente levados a 37°C
e observados diariamente quanto à presença de efeito citopático (CPE) por
visualização em microscópio invertido. Quando o CPE estava presente em
aproximadamente 70% do cultivo analisado, conforme inspeção visual, o
sobrenadante foi coletado, homogeneizado por agitação, aliquotado em criotubos e
conservado à temperatura de -70°C. Após, alíquotas de cultivo do BAV foram
submetidas à titulação viral, visando a quantificação do número aproximado de
doses infectantes (DI) presentes, utilizando para tanto a técnica de diluições
limitantes de base 10 em microplacas, seguindo metodologia usual anteriormente
descrita (SPILKI et al., 2006). Os títulos foram calculados conforme o método de
Spearman-Karber e então determinados os valores de diluição e, por conseguinte os
valores para doses infectantes.
43
Para os ensaios de concentração viral propriamente dita, água autoclavada,
inicialmente negativa para a presença de Adenovírus, foi aliquotada em frascos de
vidro contendo 500 mL, os quais foram inoculados com volumes de 100 µL contendo
100, 10, 1, 0,1 DI ou ainda menos, seguindo a diluição até 10-7 da solução inicial. Foi
mantido ainda um frasco não inoculado, como controle negativo. Todos os ensaios
foram realizados em duplicata.
No protocolo de concentração viral testado, pequenas modificações ao que
foi proposto por Katayama et al. (2002) foram inseridas, com base em experimentos
prévios e relatos da literatura, principalmente no que tange aos volumes utilizados,
bem como na opção em não realizar um passo adicional de ultracentrifugação.
Brevemente, às amostras experimentalmente contaminadas com BAV, no volume de
500 mL, foram adicionados inicialmente 0,3 g de MgCl2 (25 mM) e o pH foi ajustado
a 5,0 utilizando uma solução 1N de H2SO4, com auxílio de medidor de pH eletrônico.
Após, a mistura resultante teve sua passagem forçada pela membrana HA descrita
anteriormente, em carcaça de acrílico esterilizada, com auxílio de uma bomba de
vácuo de 1 hp, a qual exerceu uma pressão negativa sobre o sistema de 1 atm, em
uma velocidade de filtração de aproximadamente 100 mL/ min. Aproveitando este
mesmo sistema de vácuo, a membrana foi lavada com 87,5 mL de uma solução 0,5
mM de H2SO4 pH 3,0. No passo seguinte realizou-se a etapa de eluição onde, ainda
sob pressão negativa, passou pela membrana 2,5 mL de uma solução 1 mM de
NaOH com pH 10,5. O filtrado resultante foi então neutralizado com 12,5 µl de 50
mM H2SO4 e tampão Tris-EDTA (TE) 100X concentrado. Esse material foi aliquotado
a partir do copo coletor e mantido a -70°C até o processamento.
Com vistas a realizar a PCR, foi feita a extração de ácidos nucléicos virais
para o Adenovírus, utilizando para tanto o “kit” comercial RTP DNA/RNA Virus Mini
Kit (Invitek), seguindo instruções do fabricante igualmente ao protocolo usado para a
extração do DNA do TTV citado neste trabalho. O DNA viral assim obtido foi usado
como molde para a amplificação por PCR. Utilizando ferramentas de bioinformática,
foram desenhados oligonucleotídeos com potencial de alinhamento em regiões
altamente conservadas do genoma de Adenovírus, com base em sequências
disponíveis
no
oligonucleotídeos
Genbank
escolhidos
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/).
foram
denominados
ADV-F1
Os
(5’-
CAGTGGTCGTACATGCACAT-3´) e ADV-R1 (5’-TCGGTGGTGACGTCGTGG-3´), e
44
amplificam em torno de 130 pares de bases do fragmento genômico alvo. As
reações de PCR foram realizadas em volume final de 50µL, contendo 3 µL de
solução de DNA extraído da amostra a testar e diluídos em 20 µL de H2O ultrapura,
1 µL de solução com 20 pmol de cada iniciador (ADV-F1 e ADV-R1) e 25 µL da
solução pré-pronta 2X PCR Master Mix (Promega). A reação compreendeu uma
etapa inicial de 2 minutos a 94ºC seguida por 40 ciclos de 1 minuto a 94ºC para
desnaturação das cadeias, 1 minuto para anelamento dos iniciadores a 58°C e 1
minuto a 72ºC para extensão das cadeias, passados os ciclos, utilizaram-se mais 7
minutos a 72ºC para extensão final dos produtos. Após a reação, o produto foi
analisado por eletroforese em gel de agarose 1% em tampão TBE 1X com adição do
corante atóxico Blue Green (Promega) e posteriormente visualizados sob luz
ultravioleta (UV).
Observou-se a amplificação dos produtos de PCR na faixa de 100 a 1 DI
(dose infectante) viral diluída em 500 mL de água nas PCRs realizadas, sempre com
amplicons apresentando o tamanho esperado. Não houve amplificação em controles
negativos (água pura não inoculada) nem em diluições inferiores a 1 DI (0,1 DI em
diante). Tais resultados demonstram que para o vírus estudado (BAV) em situações
de contaminação artificial de água obtida em laboratório, a técnica descrita é
suficiente para a detecção de quantidades tão pequenas quanto uma DI, alcançando
portanto algo próximo do limite teórico de detecção, evitando o gasto adicional com
aparatos para ultracentrifugação ou floculantes.
Posteriormente, utizando-se da técnica anteriormente descrita, processou-se
a concentração viral das amostras de campo e de maneira semelhante o produto
obtido foi aliquotado em eppendorf de 1,5 mL a partir do copo coletor e mantido a 70°C até o processamento.
4.2.2 Extração de DNA viral
Para a realização da extração de ácidos nucléicos virais, utilizou-se o “kit”
comercial RTP DNA/RNA Virus Mini Kit (Invitek), seguindo instruções do fabricante.
O processo de extração viral procedeu-se na sequencia de eventos, onde
inicialmente colocou-se em um tubo tipo “eppendorf” de 1,5 mL, 200 µL de amostra
que foram homogeneizados com 200 µL de H2O ultrapura, após as misturas foram
45
transferidas a um "Extraction Tube". Em seguida vortecou-se e colocou-se o
"Extraction Tube" em banho-maria por 15 minutos a 65°C e após por 10 minutos a
95° C. Na sequência procedeu-se o pré-aquecimento do "Elution Buffer R" a 80°C
(60 ul para cada amostra) que manteve-se aquecido até seu uso no final da
extração. O processo inicial da ligação do DNA e RNA se procedeu adicionando 400
µL de "Binding Solution" ao "Extraction Tube" e em seguida homogeneizou-se e
transferiu-se a mistura pra um "Spin filter Set" e logo após centrifugou-se a 10.000
rpm por 1 minuto. Na sequência descartou-se o "RTA receiver" com o filtrado e
colocou-se o tubo com filtro novamente em um novo “RTA receiver tube”. Para a
realização da primeira lavagem adicionou-se 500 µL do "Wash buffer R1" ao último
"Spin filter Set" e novamente centrifugou-se a 10.000 rpm por 1 minuto, descartou-se
o filtrado e recolocou-se o Spin filter no “RTA receiver tube”. Na segunda lavagem
adicionou-se 800 µL do "Wash buffer R2" ao último "Spin filter Set" e novamente
centrifugou-se a 10.000 rpm 30 segundos, descartou-se o filtrado e recolocou-se o
Spin filter no RTA receiver tube, e na sequência centrifugou-se por 4 minutos na
velocidade de 14.000 rpm. Para finalizar, a coleta do DNA foi realizada colocando-se
o “RTA spin filter” num “eppendorf” de 1,5 mL e ao mesmo adicionou-se 60 µL do
"Elution buffer R" (pré-aquecido a 80°C). Em seguida deixou-se repousar à
temperatura ambiente por 3 minutos, após centrifugou-se por 1 minuto a 10.000 rpm,
e por fim coletou-se o líquido filtrado. O DNA viral assim obtido foi armazenado em
freezer a -70ºC para posterior processamento de amplificação dos fragmentos
genômicos virais alvo por PCR.
4.2.3 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e Eletroforese
A reação em cadeia da polimerase procedeu-se utilizando ferramentas de
bioinformática,
onde
foram
desenhados
oligonucleotídeos
com
potencial
alinhamento em fragmentos altamente conservados do gene ORF2 do Torque teno
vírus,
com
base
em
sequências
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/).
Os
disponíveis
iniciadores
no
escolhidos
Genbank
foram
os
seguintes: F1: 5' - GGG AGC TCA AGT CCT CAT TTG - 3' F2: 5' - GGG CCW GAA
GTC CTC ATT AG - 3' e - Rev: GCG GCA TAA ACT CAG CCA TTC - 3'.
Posteriormente utilizando-se para F1 (início posição 221 do genoma), F2 (posição
46
170 do genoma) e Ver (final na posição 272 do genoma), sendo que o conjunto dos
três oligonucleotídeos fornece um amplicon de 103 pb que amplificam em torno de
100 pares de bases do fragmento genômico alvo. Estes iniciadores apresentaram
sensibilidade para detectar amostras de TTV em amostras de soro de suíno e
também em humanos, embora outras espécies de TTV possam vir a ser
identificadas após sequenciamento genômico. A padronização e as reações de PCR
foram realizadas em volume final de 50µL, contendo 1,0 µL de amostra de DNA
controle positivo na diluição de 1:100 diluído em 22,5 µL de H2O ultrapura, 0,5 µL de
solução 20 pmol de cada iniciador (F1, F2 e Rev) e 25 uL da solução pré-pronta 2X
PCR Master Mix (LGC). A reação compreendeu uma etapa inicial de 2 minutos a
94ºC seguida por 40 ciclos de 1 minuto a 94ºC para desnaturação das cadeias, 30
segundos para o anelamento dos iniciadores a 59°C e 30 segundos a 72ºC para
extensão das cadeias. Passados os ciclos, utilizaram-se mais 7 minutos a 72ºC para
extensão final dos produtos. Em todas as reações utilizou-se uma amostra positiva
de DNA viral previamente testada e como controle negativo utilizou-se uma amostra
de DNA extraído de cultivo celular não infectado (fig. 6). Após a reação, adicionou-se
1,0 µL do corante atóxico fluorescente (Blue Green) da marca LGC, a 10 µL do
produto da PCR, posteriormente a mistura foi analisada por eletroforese em gel de
agarose a 2% em tampão TBE 1X. A corrida inicialmente foi de 30V por 10 minutos,
seguidos de 90V por mais 30 minutos, posteriormente os resultado foram
visualizados sob luz ultravioleta (UV), analisados e fotografados. Em todas as
análises utilizou-se o marcador de peso molecular 100pb DNA (ladder) do fabricante
Promega com limite de detecção de 1.500pb a 100pb, o qual serviu para definir o
peso molecular dos fragmentos amplificados.
47
1
2
3
4
5
100 pb
Figura 6 Visualização da padronização da PCR utilizando os controles positivos e negativos.
Eletroforese em gel de agarose 2%, adicionado do corante atóxico Blue Green (Promega) e
visualizados sob luz ultravioleta. Amostras 1 e 2: controles positivos; 3 e 4: controles
negativos, 5: marcador de peso molecular.
4.3 ANÁLISES BACTERIANAS
Processou-se a análise das características bacteriológicas levando em
consideração a presença ou ausência de coliformes totais e coliformes
termotolerantes (Escherichia coli, de origem exclusivamente fecal). Tais análises
foram realizadas pelo setor de bacteriologia da Divisão de Pesquisa do DMAE,
localizado no bairro Menino Deus em Porto Alegre e por estudantes e bolsistas do
curso de mestrado em Microbiologia Agrícola e do Ambiente, da Universidade do Rio
Grande do Sul – UFRGS, e os resultados gentilmente cedidos para comparação.
48
5. RESULTADOS
5.1 ANÁLISES DA ESTAÇÃO DE TRATAMENTO – PORTO ALEGRE
A tabela 1 apresenta o número de amostras positivas para os vírus TTV e os
resultados das análises bacterianas (coliformes totais e E.coli) para um total de 16
amostras, oito provenientes de esgoto bruto (aflu) e oito amostras de esgoto tratado
(eflu). Os exemplares do estudo foram coletados mensalmente no período de março
a outubro de 2009, na estação de tratamento São João – Navegantes Porto Alegre.
O TTV foi identificado em apenas uma amostra das oito analisadas para o efluente
tratado desta estação de tratamento, sendo assim 12,5% destas amostras foram
positivas para este agente viral, identificado em amostras de efluente (esgoto
tratado) no mês de setembro. Não foi detectada a presença de TTV em todas as
amostras para esgoto bruto (aflu) (0/8). Os resultados mostram a contaminação
destas águas quando se evidenciou a presença de altíssimos índices de coliformes
totais e E. coli em esgoto bruto (aflu), no caso específico do mês de março onde a
E. coli chega a atingir valores de 17.000.000 NPM/100 mL em amostras de esgoto
bruto. A contaminação bacteriana também se destaca no efluente tratado (eflu) do
mesmo mês, atingindo valores de 120.000 NPM/100 mL. Além disto, observa-se
uma considerável redução destes microrganismos bacterianos no efluente tratado, a
exemplo da amostra do mês de outubro, que apresentou o menor índice de E. coli,
cerca de 2.900 NPM/100 mL. Os padrões de lançamentos dos efluentes
determinados pela resolução 357/2005 do Conselho Nacional do Meio Ambiente –
CONAMA, determinam que bactérias do grupo coliformes termotolerantes, cujo
corpo receptor seja água doce de classe 3, que ainda podem ser destinadas ao
abastecimento para consumo humano, determina que os limites não devam exceder
a 4.000 NPM/100 mL em 80% das amostras durante um ano (BRASIL, 2005a). De
acordo com os resultados apresentados na tabela 1, somente o efluente do mês de
outubro, que apresentou para E. coli valores de 2.900 NPM/100 mL, encontra-se em
conformidade com estes padrões, os demais resultados excedem em muito o valor
máximo. Embora o pH não seja um parâmetro essencial para avaliar a presença de
vírus entéricos em amostras de água, nestes ensaios os resultados apresentaram
valores de pH próximos à neutralidade em todas as amostras.
49
Tabela 1. Resultados das análises da presença de TTV, Coliformes totais
(NMP/100mL), Escherichia coli (NMP/100mL) e pH dos pontos Afluente (aflu) e
Efluente (eflu), da ETE São João – Navegantes Porto Alegre.
Períodos de coletas
Pontos/parâmetros
AFLU
EFLU
Mar
Abr
Mai
Jun
Jul
Ago
Set
Out
TTV
-
-
-
-
-
-
-
-
C. totais
4,2x10
7
4,4x10
7
1,3x10
7
2,0x10
7
1,6x10
7
1,7x10
7
9,9x10
6
1,4x10
7
E.coli
1,7x10
7
8,7x10
6
3,1x10
6
6,5x10
6
1,6x10
7
3,1x10
6
1,6x10
6
2,4x10
6
pH
7,1
TTV
-
7,1
7,2
-
C. totais
6,1x10
5
E.coli
1,2x10
5
pH
6,8
-
4,4x10
4
1,1x10
4
6,7
7,3
7,1
-
-
1,1x10
5
5,2x10
1,8x10
4
5,8 x10
6,6
6,6
7,0
5
4
6,8
-
1,2x10
5
6,1x10
4
6,7
6,8
+
1,2x10
5
2,5x10
4
6,7
-
3,6x10
4
5,1x10
4
2,5x10
4
2,9x10
3
6,7
6,7
5.2 ANÁLISES DO ARROIO DILÚVIO – PORTO ALEGRE
A figura 7 mostra a presença dos vírus Torque teno vírus nos 5 pontos
coletados ao longo do Arroio Dilúvio em Porto Alegre. Umas três coletas com
intervalos de aproximadamente 3 meses foram realizadas
entre
os meses de
janeiro a setembro de 2009, totalizando assim 15 amostras para este estudo.
Entretanto, uma amostra do ponto 5 e da terceira coleta foi perdida, portanto 14
amostras foram processadas e analisadas. Os resultados mostram a presença do
vírus TTV em 28,5% (4/14), embora tenha mostrado maior representatividade em
relação à análise anteriormente apresentada, os resultados mostram pouca
prevalência deste vírus em águas contaminadas oriundas deste Arroio. O ponto 5
(mais próximo do Guaíba) foi o que apresentou maior positividade para o TTV.
As análises bacterianas evidenciaram a presença de bactérias Gram
positivas pertencentes aos gêneros Enterococcus e Staphylococcus. Bactérias
Enterococcus foram identificadas em todos os pontos do arroio e para bactérias do
gênero Staphylococcus, sua presença foi verificada em 4 pontos, com exceção do
ponto 1 ( nascente do arroio) que não teve representantes para este gênero. Para as
bactérias Gram negativas, identificou-se a presença dos grupos bacterianos E.coli
Shighella, Salmonella em todos os pontos estudados, exemplares de Pseudomonas
não foram identificadas no ponto 1 (nascente). Desta forma, a presença dos
50
microrganismos bacterianos especialmente do grupo E.coli em todos os pontos,
denuncia que a água do arroio está contaminada por produtos de origem fecal.
Número de Amostras
3
2
TTV
1
0
pto 1
pto 2
pto 3
pto 4
pto 5
Pontos de Coleta
Figura 7 Número de resultados positivos para o vírus TTV detectado em 3 coletas dos 5 pontos
do Arroio Dilúvio em Porto Alegre.
5.3 ANÁLISE PARA ÁGUA TRATADA DE ESCOLAS
Um total de 34 amostras de água tratada provenientes de torneiras das
cozinhas de Escolas Municipais e Estaduais das cidades de Santa Cruz do Sul,
Pelotas e Caxias do Sul foi utilizado para as análises. A tabela 2 mostra o número de
amostras e percentual de amostras que foi detectada presença de Torque teno
vírus. As análises detectaram a presença do TTV, de maneira geral, para este tipo
de água e nas três cidades envolvidas em 11,7% (4/34) das amostras de água
tratada de torneira de escolas municipais e estaduais. O TTV foi identificado em 25%
(2/8) das escolas municipais de Pelotas, sendo que para esta cidade não foi possível
a coleta de amostras em escolas estaduais e em 10,5% (2/19) das escolas
estaduais e municipais de Caxias do Sul. Além disto, o TTV não foi detectado em
amostras de água de escolas municipais e estaduais do município de Santa Cruz do
Sul. Quanto à presença de coliformes termotolerantes, embora não tenha se obtido
resultado das análises para estas águas de torneiras originárias do interior do
estado, cabe aqui salientar que a presença de bactérias E. coli (termotolerantes)
51
foram identificadas em 8% (10/120) das escolas municipais e estaduais no município
de Porto Alegre.
Tabela 2. Localização e número de amostras positivas para o TTV em escolas
Municipais e Estaduais de cidades do interior do Rio Grande do Sul.
Escola
Escola
Municipal
Estadual
(0/7) 0%
4
3
8
(2/8) 25%
8
0
19
(2/19) 10,5%
11
8
Localização
N
TTV (%)
Santa Cruz do Sul
7
Pelotas
Caxias do Sul
5.4 ANÁLISES DE ÁGUA MINERAL
Água
mineral
destinada
ao
consumo
humano
deve
atender
as
características microbiológicas determinada pela resolução RDC nº 274, de 22 de
setembro de 2005 (BRASIL, 2005b) que referencia como padrões aceitáveis os
parâmetros microbiológicos determinados pela Norma de Qualidade para Consumo
Humano. Esta estabelece padrões de ausência de E. coli em 100 mL de água, além
disto, determina ausência de coliformes totais em 100 mL de água (BRASIL, 2004).
Os resultados bacteriológicos identificaram a presença de bactérias coliformes totais
em todas as amostras estudadas, porém ausentes para coliformes termotolerantes
(E. coli) nestas amostras testadas. Os testes para a detecção viral não identificaram
a presença do Torque teno vírus nas sete amostras de água mineral de uso
comercial analisadas neste estudo.
52
6. DISCUSSÃO
Os resultados indicam baixa prevalência do vírus TTV em todas as amostras
deste estudo, quando comparados a outros agentes virais como o Adenovírus e
Enterovírus. Estes vírus têm sido encontrados em percentual superior ao TTV, para
águas de superfície a ocorrência de ambos os vírus já tem sido relatada em 76,8%
(53/69) e para água de torneira 58% (29/50), em estudo realizado na Korea (LEE et
al., 2005). Recentemente, no Brasil, Barella et al. (2009), demonstraram alta
prevalência de Adenovírus em geral (100%) e 84% (42/50) para o Adenovírus
humano da espécie F, alta ocorrência também para o vírus da Hepatite A (HAV)
48% (24/50) em amostras de esgoto doméstico da cidade de Limeira, São Paulo,
durante um ano de estudo. Tais estudos demonstram em comparação ao TTV, que
a ocorrência do mesmo é apenas esporádica em amostras ambientais previamente
contaminadas e de água tratada oriundas de nosso estado, ainda que tenhamos
carência de estudos analisando o mesmo conjunto de amostras para diferentes
vírus.
Neste estudo, obtivemos 12,5% (1/8) de amostras positivas para o TTV em
efluente tratado coletado na ETE - São João. Por outro lado, todas as amostras de
efluente bruto desta ETE foram negativas para o TTV. Desta forma, não há estudos
envolvendo a pesquisa de TTV em amostras de efluentes de estação de tratamento
no Brasil. Este resultado está muito distante dos resultados encontrados por
Haramoto et al. (2005a), que identificou a presença do TTV em 97% das amostras
de afluente de esgoto no Japão (93/96), demonstrando que o vírus esta amplamente
disseminado nestas amostras. Neste estudo, dezoito por cento foram do efluente
foram positivas para o TTV antes da cloração e 24% das amostras de efluente final
foram positivas durante um ano de estudo realizado no Japão. Além disto, o referido
estudo também demonstrou a ausência de TTV no efluente para reuso, o qual passa
por um processo de tratamento que utiliza filtração e ozonização. Outro estudo
também realizado por Haramoto et al. (2008) naquele país, revelou elevadas
quantidades de TTV em águas residuárias, chegando atingir valores de 4,8 x 104
cópias de genoma por litro de água. Em resultados semelhantes ao encontrado
neste trabalho, Vaidya et al. (2002) na Índia, mostraram a presença do TTV em
14,5% em amostras processadas por ensaios moleculares Nested PCR (nPCR) em
53
esgoto antes do tratamento e 2% de amostras positivas para o TTV em amostras
após o tratamento de esgoto, significando desta forma prevalência muito baixa deste
vírus em esgoto bruto e esgoto tratado. A alta presença de indicadores de
contaminação fecal bacteriana do grupo coliforme não apresentou relação com a
presença do TTV nestas análises. Altos índices de bactérias do grupo coliformes,
especialmente a E. coli de origem exclusivamente fecal, estão relacionadas com
regiões caracterizadas pela grande massa populacional que descarta seus efluentes
líquidos em esgotamentos sanitários captados e tratados pela ETE São João –
Navegantes. Os níveis elevados principalmente de E.coli no efluente tratado não
estão entre os limites máximos aceitáveis de 4.000 NPM/100 mL (BRASIL, 2005a)
para o descarte em corpos hídricos. Desta forma, sugere-se que os métodos de
tratamento destes efluentes nesta estação de tratamento sejam revistos para evitar
o lançamento de águas excessivamente contaminadas em corpos receptores.
O trabalho desenvolvido por Diniz-Mendes et al. (2008), demonstraram alta
prevalência do TTV em amostras extraídas de um córrego localizado na cidade de
Manaus. No referido estudo 92% (48/52) das amostras foram positivas para o TTV
identificadas por PCR em Tempo Real (qPCR) e 37% (19/52) quando processadas
por PCR convencional, durante um ano de estudo. No estudo aqui apresentado,
evidenciou-se baixa prevalência do TTV em amostras obtidas do Arroio Dilúvio em
Porto Alegre, onde detectou-se a presença do Torque teno vírus em 28,5% (4/14)
das amostras estudadas. Resultados deste estudo, quando comparado ao de DinizMendez et al. (2008) observa-se semelhança, pois ambos obtiveram baixa
positividade para o TTV 28,5% e 37% quando da utilização do método por PCR
convencional. Salienta-se aqui a diferença encontrada por Diniz-Mendez et al.
(2008), quanto à utilização das técnicas moleculares, pois os mesmos identificaram
37% de positividade por PCR convencional e 92% quando processada por PCR em
Tempo Real (qPCR). Além disto, neste estudo observou-se uma maior positividade
do TTV no ponto 5, onde o Arroio Dilúvio deságua no Lago Guaíba. Neste local,
ocorre a mistura das águas do Arroio com a do Lago Guaíba, demonstrando que
pode haver interferência na composição das águas neste ponto, e assim sugere-se
uma maior investigação em águas neste local. Em relação aos resultados da análise
bacteriana nas amostras do Arroio Dilúvio, embora o trabalho tenha objetivado a
verificação da contaminação por bactérias do grupo coliformes, especialmente do
54
subgrupo coli que estão presentes nestas águas, a presença de outros grupos
bacterianos foi identificada, demonstrando a diversidade de microrganismos
bacterianos disponíveis nestas águas. De acordo com a legislação vigente estas não
são padrão microbiológico de potabilidade da água para consumo humano, mas
podem estar relacionados a problemas de saúde pública. Muitos destes grupos
bacterianos são freqüentemente isolados de pacientes portadores de infecções
gastrointestinais, a exemplo da Salmonella, grande responsável por intoxicações
alimentares (COSTALUNGA e TONDO 2002; SHINOHARA et al., 2008).
Especialmente a S. typhi, Salmonella entérica responsável por causar a febre tifóide,
muito frequente em países em desenvolvimento e associada a precárias condições
de saneamento e higiene, pode ser transmitida por veiculação hídrica, provocado
sérios problemas à saúde (MIRZA et al., 2000). Além disto, S. typhi, foi encontrada
em água de poços, provocando surto que afetou 10 indivíduos em 2 dias, numa
região da Turquia (ISERI et al., 2009). Embora doenças como a febre tifóide estejam
relacionadas à falta de saneamento básico, na região Sul do país um caso desta
doença foi recentemente diagnosticado em um paciente que reside em Maringá/PR.
Esta cidade possui índices de coleta e tratamento de esgoto próximos de 88%
(SCODRO et al., 2008). Estes dados são de fundamental importância, pois de
acordo com Joshi et al. (1973), bactérias do grupo Salmonella não foram eliminadas
por processo de tratamento por lagoas de estabilização de águas residuais
domésticas quando da utilização de 2 células no tratamento. Por outro lado,
estiveram ausentes no tratamento em águas domésticas que foram processadas
utilizando 3 células. Desta forma, entende-se que a ocorrência em alguns casos de
enfermidades provocadas por estes microrganismos também pode estar associada à
ineficiência do tratamento de água.
Os resultados da análise virológica para amostras oriundas de torneira de
escolas municipais e estaduais mostraram que quando analisadas no contexto geral
para as três cidades, o TTV foi detectado em 11,7% (4/34) de todas as amostras
deste tipo. Porém quando os resultados são analisados individualmente por cidade e
por caracterização de escola (municipal ou estadual), observa-se a presença de
25% (2/8), 10,5% (2/19) e 0% (0/7) respectivamente para escolas municipais de
Pelotas, escolas estaduais e municipais de Caxias do Sul e escolas municipais e
estaduais de Santa Cruz do Sul (Tabela 2). Com isso evidencia-se a diferença da
55
presença do TTV nas diferentes regiões de nosso estado, onde se observa a
ausência do TTV em uma cidade e presença em 25% e 10,5% para outras
duas.microrregiões. No entanto, não há outros trabalhos que demonstram a
pesquisa de TTV em amostras de água tratada obtida de torneira. Vários estudos
têm detectado a presença de vírus entéricos, especialmente de Enterovírus e
Adenovírus, em água de torneiras em áreas urbanas na região da Korea. No referido
estudo, Lee e Kim (2002), identificaram que 47,8% (11/23) das amostras foram
positivas para o Enterovírus e 39,1% (9/23) para o Adenovírus, e ambos os agentes
virais foram detectados em 21,7% (5/23) das amostras. Estes dados demonstram a
contaminação e alta prevalência de vírus entéricos em água de torneira distribuída à
população. Neste ponto, outro estudo também identificou a presença do vírus
Norovírus (NV) em águas de torneira no Japão, onde os autores detectaram para os
NV-G1 e NV-G2 4,1% (4/98) e 7,1% (7/98) respectivamente (HARAMOTO,
KATAYAMA e OHGAKI 2004). Portanto, nossas análises, bem como os resultados
citados por outros autores, demonstram que agentes virais persistem em águas
mesmo após o tratamento, indicando que agentes virais entéricos são resistentes
aos processos de tratamento convencional prestados por serviços de saneamento
em águas destinadas ao consumo humano. Os resultados da análise bacteriológica,
em água de torneira, demonstraram que 8% das escolas municipais e estaduais de
Porto Alegre apresentaram água imprópria para consumo, com presença de
coliformes fecais nestas amostras. Com isso, os dados indicam que os métodos de
tratamentos convencionais usualmente adotados devam ser revistos quanto a sua
eficácia na remoção de contaminantes de origem fecal.
Em relação aos resultados da análise de água mineral, nenhuma amostra foi
positiva para o TTV. Embora não há trabalhos envolvendo a pesquisa com o TTV
em amostras de água mineral, cabe salientar a presença de outros vírus em
amostras desta origem. De acordo com estudo realizado por Beuret et al. (2002),
uma alta prevalência do vírus Norovírus (NV) foi encontrada em diferentes marcas
de água mineral em países europeus. Neste estudo 85% das amostras de águas
minerais foram positivas para este vírus utilizando amplificação de acido nucléicos e
RT - PCR. Além disto, estudo realizado por Biziagos et al. (1988) para a presença
dos vírus Hepatite A e vírus Políovírus Tipo 1, demonstrou que ambos os agentes
virais foram detectados em garrafas de água mineral mantidas por um período de
56
um ano em temperatura de 4ºC. Quando as águas foram armazenadas a
temperatura ambiente o Poliovírus tipo 1 não foi detectado após este período,
embora o vírus da hepatite A ainda permanecia infeccioso. Estes dados demonstram
assim, resistência por 1 ano em água mineral de ambos os vírus a temperatura de 4º
C e resistência do vírus da hepatite A também em temperatura ambiente. No
presente estudo, ainda que houvesse contaminação por coliformes termotolerantes
nas amostras de água mineral, não foi detectada a presença do vírus TTV. As
análises de colimetria apontaram a ausência de coliformes termotolerantes para
todas as amostras de água mineral testadas, porém a presença de coliformes totais
foi constatada em todos os exemplares. Não há neste caso, nenhuma correlação
demonstrável entre a presença de TTV e coliformes, portanto.
Outros estudos realizados em amostras de água oriundas de rios
demonstraram baixa prevalência do vírus TTV, ao que foi observado na Itália por
Verani et al. (2006), onde neste estudo realizado por ensaios molecular PCR o TTV
esteve presente em 25% das amostras analisadas durante um ano de estudo,
indicando baixa prevalência para o TTV em amostras de água oriundas de um rio
que recebe efluentes da estação de tratamento. De maneira semelhante, estudo
realizado por Haramoto et al. (2009) o TTV foi detectado em 5,6% ( 1/18) das
amostras de água obtidas em 18 rios no Japão. Há que ressaltar que parece haver
grande variação nas taxas de contaminação por TTV conforme o tipo de água
analisado, vide os trabalhos de Haramoto et al. (2005a, 2009) citados: 97% de
contaminação em afluentes de esgoto, contra apenas 5,6% em águas de rio.
Desta forma, os resultados aqui apresentados indicam que o TTV não seria
indicado como um marcador de contaminação fecal em águas em geral, mas talvez
tenha um valor como marcador em um ou outro tipo de água. Tal fato ainda não foi
totalmente elucidado para outros agentes virais.
Futuros estudos devem ser realizados com o TTV, buscando compreender a
biologia deste vírus, especialmente tentando identificar as estratégias de
disseminação do vírus nas populações humanas e animais.
Além disto, outros
estudos buscando principalmente identificar a presença do TTV na população
humana e animal de nosso estado também se fazem necessários.
57
7. CONCLUSÕES
Obteve-se aqui a adaptação um conjunto de técnicas laboratoriais para
concentração e detecção molecular do TTV em amostras de água. Foram
analisadas amostras de afluentes e efluentes de ETE, evidenciando a presença do
TTV em 12,5% das amostras do esgoto tratado, 25% das amostras de torneira da
microrregião de Pelotas e 10,5% na microrregião de Caxias do Sul, água de Arroio
(28,5%) e ausência do TTV em água mineral. Desses dados, concluiu-se em
comparação com a detecção de coliformes fecais, ao menos nas condições desse
estudo, o TTV não constitui um marcador viral confiável de contaminação fecal da
água para todas as matrizes aquáticas ou todas as situações.
A utilização dos métodos aplicados neste estudo, concentração e extração
viral, bem como a amplificação de fragmentos gênomicos do TTV pela reação em
cadeia da polimerase (PCR), mostrou ser eficiente, apresentando boa sensibilidade
e especificidade, pois permitiu a detecção do TTV em amostras de diferentes
origens. Este vírus foi detectado em amostras de água superficial, em efluente de
esgoto tratado de estação de tratamento e em água tratada de torneira.
58
8. PERSPECTIVAS
As principais perspectivas são aprimorar as técnicas laboratoriais aqui
utilizadas, expandir o número de amostras analisadas e buscar outros vírus de
excreção fecal, com melhor potencial de determinação da contaminação fecal da
água. Também será importante proceder ao seqüenciamento dos fragmentos
genômicos amplificados e análise filogenética molecular das amostras aqui
descritas, como uma tentativa de determinar os hospedeiros naturais de TTV
detectados.
59
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