ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS DIAZOTRÓFICAS DO SOLO E DE

1
ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS DIAZOTRÓFICAS DO SOLO E DE RAÍZES
DE Gossypium hirsutum, Saccharum officinarum E Zea mays CULTIVADOS EM
SOLOS DO CERRADO1
JULIANA RAINHO TEIXEIRA2; ADÃO DE SIQUEIRA FERREIRA3; MARIA
AMÉLIA DOS SANTOS3
RESUMO
Bactérias endofíticas estão presentes em algumas espécies vegetais estudadas,
colonizando intercelularmente e o sistema vascular. Existem vários efeitos positivos
atribuídos a essas bactérias, como a promoção do crescimento vegetal, controle
biológico de pragas e doenças nas plantas, fixação biológica de nitrogênio, indução de
resistência sistêmica e produção de sideróforos. No presente trabalho, foi pesquisada a
população endofítica de bactérias em raízes, folhas e caule de Gossypium hirsutum,
Saccharum officinarum e Zea mays cultivados em solos do Cerrado. As amostras
coletadas foram desinfectadas, maceradas e diluídas em série para obtenção das
suspensões, que a partir testa foram inoculadas em meios de cultura seletivos. Os
frascos foram incubados a 30°C por 7 dias. A população de bactérias foi estimada com
ajuda da tabela de McCrady. Posteriormente, as colônias de bactérias foram isoladas. A
maioria dos isolados foram Gram negativos, mostrando uma ampla diferença para as
características bioquímicas e fenotípicas, e uma grande diversidade biológica entre as
espécies vegetais. Isto possibilita pesquisa alternativa para aplicação de novas
biotecnologias de interesse agrícola.
Palavras-chave: proteção de plantas; milho; cana-de-açúcar; algodão; bactérias
endofíticas
ABSTRACT
Endophytics bacteria are present in some species vegetable studied, colonizing
intracellular and intercellular plant tissue. Some positive effects are attributed these
bacteria, such as the plant growth-promoting, biological control, plant diseases,
atmospheric nitrogen fixation, systemic resistance acquired and siderophore production.
In the present work, was researched the endophytic population of bacteria in roots,
leaves and stalks from Gossypium hirsutum, Saccharum officinarum and Zea mays
cultivated in soils of the Cerrado. The samples collected was disinfected, macerated and
diluted in series to obtain of the suspensions, which was inoculated in selective culture
medium. The flasks were incubated at 30°C for 7 days. The population of bacteria was
estimated by NMP with support of the McCrady table. After, the colonies of bacteria
were isolated. The isolates were characterized based on physiological and biochemical
aspects. The majority of the isolates were negative Gram, showing a wide difference to
the phenotypic and biochemical characteristics, and great biological diversity among
plants. This is a alternative research to apply in new biotechnologies of agricultural
interest.
1
FAPEMIG; 2 Acadêmica do Curso de Ciências Biológicas – Instituto de Biologia -Universidade Federal
de Uberlândia, Uberlândia, 38400-902, [email protected]; 3Docente do Instituto de Ciências
Agrárias – Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 38400-902.
2
Key words: plant protection; cotton; corn; sugarcane; endophyitics bacteria
INTRODUÇÃO
anualmente usados na agricultura, uma
O nitrogênio é um dos principais
componentes das biomoléculas, fazendo
parte da estrutura de ácidos nucléicos,
aminoácidos, proteínas, etc, o que o
torna,
portanto,
sobrevivência
e
essencial
à
crescimento
dos
organismos. Embora constitua quase
80% da atmosfera terrestre, o nitrogênio
gasoso, N2, é quimicamente inerte a
temperaturas comuns, e, diferentemente
de outros elementos que ocorrem na
natureza, suas reservas minerais são
relativamente
Apesar
de
termodinamicamente
favorável,
a
reação
de
de
raras.
redução
nitrogênio
atmosférico a amônia – fixação do
nitrogênio – requer uma energia de
ativação
ocorrendo
extremamente
alta,
espontaneamente
sem
não
a
presença de catalisadores adequados.
Na indústria, o processo de fixação do
nitrogênio desenvolvido por HaberBosch para a síntese de amônia emprega
altas temperaturas (entre 300 e 500oC) e
pressões acima de 300 atm, sendo
utilizados catalisadores a base de ferro
(Kim & Rees, 1994).
A principal finalidade da amônia
produzida é a fabricação de fertilizantes,
e mais de 100 milhões de toneladas são
demanda que implica grandes custos
financeiros, energéticos e, sobretudo,
ambientais
(Newton,
2000).
Essa
contaminação causa eutrofização de
lagoas e a acidificação de solos
cultiváveis, que por sua vez, provoca
aumento das perdas de oligonutrientes e
a liberação de metais pesados do solo
para os sistemas aqüíferos. Portanto, os
custos
econômicos
e
ambientais
relacionados à fertilização nitrogenada
têm estimulado a busca por alternativas
que possam diminuir a utilização deste
fertilizante sem que haja diminuição da
produção. Uma das possibilidades é a
inoculação de bactérias diazotróficas
que podem associar-se a plantas para
fixar nitrogênio atmosférico e, ou,
produzir substâncias promotoras de
crescimento
de
plantas
Maccheroni
Júnior,
(Azevedo,
Araújo,
2003).
Azotobacter vinelandii era até pouco
tempo a única bactéria reconhecida
capaz de fixar nitrogênio em condições
de total aerobiose, recentemente se
descobriu outro sistema de fixação de
nitrogênio tolerante a oxigênio em
Streptomyces
thermoaututrophicus.
Azobacter fixa nitrogênio em aerobiose
3
por possuir um sistema bem integrado
denominados diazotróficos ou fixadores
de proteção a sua nitrogenase que
de nitrogênio, é capaz de reduzir
compreende: proteção conformacional,
nitrogênio atmosférico à amônia. Esse
proteção respiratória, auto-proteção e
processo
é
outras
biológica
do
mudanças
morfológicas
e
chamado
de
nitrogênio
fixação
(FBN)
e
fisiológicas que permitem-lhe crescer
realizado pelo complexo protéico da
diazotroficamente
condições
nitrogenase, a enzima que catalisa a
(Espín,
reação (Eady & Postgate, 1974). A
totalmente
em
aeróbicas
www.microbiologia.org.mx/microbiose
participação
nlinea/).
biogeoquímico
da
FBN
do
no
nitrogênio
ciclo
é
Diversas pesquisas demonstram
sobretudo importante na medida em que
a capacidade de bactérias do solo, mais
a atividade das bactérias diazotróficas
especificamente
na
representa cerca de 60% do nitrogênio
promoção de crescimento de plantas
anualmente fixado na Terra (Kim &
(Glick, 1995). No entanto, geralmente, a
Rees, 1994). As bactérias diazotróficas
sobrevivência de bactérias diazotróficas
quebram a ligação que une os dois
na
átomos
ausência
da
de
rizosfera,
plantas
é
baixa,
do
nitrogênio
atmosférico,
principalmente para espécies como
transformando-os
Herbaspirillum seropedicae. Roesch et
alguns casos, a FBN pode suprir quase
al. (2005) indicaram em seu trabalho,
todas as necessidades do vegetal. O
que
reconhecimento
a
população
de
bactérias
em
da
amônia.
importância
Em
da
diazotróficas pode ser estimulada pela
microbiologia do solo e a busca de
presença
das
plantas,
e
alternativas para diminuir o consumo de
consequentemente,
elevado
a
fertilizantes nitrogenados possibilitaram
quantidade de células no solo para
aumento de pesquisas na área de fixação
níveis detectáveis pela técnica utilizada
biológica de nitrogênio. No Brasil, o
ou que a bactérias estava presente no
fertilizante nitrogenado representa o
interior da semente desinfestada de
maior custo entre os fertilizantes, já que
sorgo (Olivares et al., 2006).
sua compra não é subsidiada e a
A
do
quantidade requerida pela planta é uma
nitrogênio é, após a fotossíntese, o mais
das maiores em relação aos outros
importante processo do planeta.
macronutrientes, a exemplo do fósforo e
Na
fixação
natureza,
biológica
somente
um
pequeno número de microrganismos,
potássio.
A
cana-de-açúcar
que
demanda grande quantidade de N,
4
apresenta
uma
baixa
resposta
à
pelo
grupo
da
Doutora
Johanna
adubação nitrogenada, o que sugere que
Dobereiner na década de 70 do século
a interação de alguns microrganismos
passado. O meio é elaborado sem fonte
diazotróficos endofíticos com as plantas
nitrogenada, e com a condição de semi-
seja um sistema natural de reposição do
sólido que cria um ambiente com baixo
N exportando anualmente dos solos pela
nível de oxigênio, semelhante ao que
colheita (Canuto et al., 2003). O papel
ocorre em nichos no solo ou na planta,
da fixação biológica do nitrogênio, em
onde
outras plantas que não leguminosas, é
diazotróficas
de extrema importância para a condução
associadas a raízes de plantas. A
sustentável da agricultura (Teixeira,
formulação desse meio facilitou o
Melo, Vieira, 2005).
isolamento de bactérias do gênero
As
bactérias
estão
localizadas
bactérias
microaerofílicas
diazotróficas
Azospirillum, levando à descoberta de
podem ser de vida livre ou associativa.
duas novas espécies: A. lipoferum e A.
Esta
brasilense.
última
subdivisão
tem
sido
Após
essa
descoberta,
denominada endófita pois as bactérias
muitas espécies de diazotróficas foram
colonizam
isoladas
os
tecidos
de
plantas,
no
Brasil,
intercelular ou intracelularmente, sem
Gluconocetobacter
causar
Herbaspirillum
dano
aparente
à
planta
como
diazotrophicus,
seropedicae,
H.
hospedeira. A simbiose ocorre quando
rubrisubalbicans, A. amazonense e
planta e microrganismo estabelecem
espeécies de Burkholderia (Kuss, 2006).
uma interação positiva, na qual a planta
Na Coleção de Culturas de
fornece nutrientes para o crescimento
Bactérias Diazotróficas da EMBRAPA
das bactérias e estas por sua vez
Agrobiologia,
fornecem nitrogênio para a planta. A
estirpes de Rhizobium, Bradyrhizobium,
simbiose
Mesorhizobium,
pode
ser
detectada
pela
encontram-se
Azorhizobium
71%
e
colonização das bactérias, na epiderme
Sinorhizobium isoladas de diversas
e córtex da raiz, ou sistemicamente,
espécies de leguminosas de grãos,
colonizando toda a planta (Moreira &
forrageiras
Siqueira, 2002).
especialmente da Mata Atlântica e
Avanços
significativos
Amazônia;
e
25%
espécies
são
arbóreas,
estirpes
de
ocorreram na área da fixação biológica
Azospirillum,
de nitrogênio em gramíneas com a
Burkholderia, isoladas de trigo, arroz,
descoberta do meio semi-sólido NFb,
sorgo, dendê, abacaxizeiro e bananeira e
Herbaspirillum
e
5
de Acetobacter, isoladas de cana-de-
apresentando assim, potencial para sua
açúcar e batata-doce. Também, mantêm
utilização (Cerigioli, 2005).
culturas
de
Beijerinkia
Azotobacter,
e
outras
Azoarcus,
por
a produtividade de milho em resposta à
intercâmbio com coleções de diversos
aplicação do produto biotecnológico
países; e 4% são culturas modificadas
comercial
geneticamente
Azospirillum spp. no tratamento de
para
obtidas
Cavallet et al. (2000) avaliaram
estudos
com
diferentes finalidades (Pitard, 2002).
Estudos
demonstram
com
que
sementes.
cana-de-açúcar
endofíticos
como
Acetobacter diazotrophicus e outras
bactérias
geram
um
aumento
Graminante
aumento
Os
autores
médio
produtividade
à
de
com
base
de
observaram
17
o
%
na
uso
do
Graminante.
de
A Azotobacter paspali se associa
produção sem elevar custos pois reduz o
quase
emprego de insumos como adubos
Paspalum notatum cv. Batatais, e se
nitrogenados
1992),
multiplica principalmente nas raízes da
demonstrando que os endofíticos são
planta (Döbereiner, 1970), embora a
essenciais para a boa fixação de N2 e o
atividade da nitrogenase tenha sido
uso de N-fixado, para a nutrição das
detectada também na rizosfera e rizoma,
plantas.
porém não nas folhas (Döbereiner et al.,
(Döbereiner,
Existem muitos trabalhos com
que
exclusivamente
com
1972).
promoção de crescimento em milho
O presente trabalho teve como
utilizando rizobactérias com resultados
objetivo isolar bactérias diazotróficas
positivos
endofíticas
(Lalande
et
al.,
1989;
associadas
aos
tecidos
Döbereiner e Garcia-Salamone, 1995c;
vegetais
Ikeda et al., 1997; Botelho et al., 1998;
Saccharum officinarum, Zea mays e
Guitiérrez-Zamora e Martinez-Romero,
Paspalum notatum.
de
Gossypium
hirsutum,
2001). As populações endofíticas de
milho
apresentaram
características
relacionadas à promoção de crescimento
vegetal,
como
produção
de
AIA,
capacidade de fixação de nitrogênio e
de solubilização de fosfato. Algumas
espécies promoveram o aumento do
peso
da
raiz
e
da
parte
aérea,
MATERIAL E MÉTODOS
Plantas de algodão, cana-deaçúcar, milho e gramínea com sistemas
radiculares intactos foram coletados e
levados ao laboratório para posterior
análise de quantificação e isolamento.
6
Para o isolamento das bactérias,
as
raízes
das
espécies
bromotimol em KOH 0,2 M; 1mL de
vegetais
solução de vitaminas; 1000mL de água
estudadas foram imersas lavadas em
destilada, 1,75g – para meio semi-
água corrente. Após este procedimento,
sólido- ou 15g – para meio sólido- de
foram desinfestadas superficialmente
ágar e pH ajustado em 6,0.
com hipoclorito durante 1 min, e
O crescimento de bactéria foi
posteriormente enxaguadas 3 vezes com
evidenciado pela a presença da película
água
típica logo abaixo da superfície do meio
esterilizada.
Sob
condições
assépticas, foram, então, cortadas em
depois de 7 dias de incubação a 30oC.
posterior
A população de bactérias foi
maceração em cadinho de porcelana
estimada 4 a 6 dias após a incubação à
contendo solução salina, obtendo-se,
30oC pela técnica do número mais
assim, uma suspensão. Para obtenção da
provável (MPN) consultando a tabela de
suspensão de maceração do milho, as
McCrady para 3 repetições por diluição.
pequenos
pedaços
para
raízes desta planta foram cortadas em
As
bactérias
formadoras
de
fragmentos de 10 mm de comprimento e
cápsula (película característica) e as que
trituradas em um copo de liquidificador
mudaram a coloração do meio de azul
por 1 min na maior velocidade,
para amarelo, foram submetidas a
juntamente com solução salina.
etapas posteriores de isolamento e
obtida,
purificação pelo método de estrias ou
considerada como a diluição 10-1, foi
riscas em placas contendo meio LGI-P
realizada a série de diluições até 10-6 em
com 20 mg de extrato de levedura por
solução salina contida em tubos de
litro e meio Batata-P. As colônias foram
ensaio,
purificadas e mantidas no mesmo meio
Desta
suspensão
utilizando-se
pipetador
automático. Com outra ponteira estéril,
em baixa temperatura (5 oC).
começando da maior diluição para as
Os isolados foram cultivados em
menores, retirou-se 0,1mL e depositou
meios de cultura sólidos AN, 523, LGI-
no interior dos meios semi-sólidos LGI
P,
e LGI-P em vidros de penicilina.
O
acondicionados em placas de Petri para
meio LGI consistiu de 5 g de sacarose;
a caracterização morfológica de suas
0,2 g de K2HPO4; 0,6 g de KH2PO4; 0,2
colônias.
g de MgSO4.7H2O; 0,02 g de CaCl2;
A
Batata-P,
Batata
composição
e
dos
LB
meios
0,002 g de Na2MoO4.2H2O; 4mL de
(Dobereiner, Baldani, Baldani, 1995)
FeEDTA; 5mL de 0,5 % azul de
utilizados foi:
7
- AN (1000 mL de água destilada; 3 g
esfregaço por toda a extensão da
extrato de carne; 5 g de peptona e 15 g
lâmina. Este esfregaço foi fixado pela
de agar);
secagem ocorrida após a passagem da
- 523 (1000 mL de água destilada; 10 g
lâmina pela chama do bico de Bunsen,
de sacarose; 8 g de caseína; 4 g de
de modo leve e garantindo a fixação da
extrato de levedura; 2 g de K2HPO4; 0,3
mesma. A lâmina com o esfregaço foi
g de MgSO4.7H2O e 18 g de ágar);
submetida à coloração de Gram. A
- LGI-P (100 g de sacarose; 0,2 g de
lâmina com o esfregaço, foi coberta
K2HPO4; 0,6 g de KH2PO4; 0,2 g de
com corante cristal violeta durante 1
MgSO4.7H2O; 0,02 g de CaCl2; 0,002 g
min, e retirado com o uso de um filete
de Na2MoO4.2H2O; 0,01 g de FeCl3.
d’água. Logo em seguida, adicionou-se
H2O; 5 mL de 0,5 % azul de
solução de iodo pelo mesmo período
bromotimol em KOH 0,2 M, 1000 mL
anterior. A lâmina então, foi lavada com
de água destilada, 1,8 g de ágar e pH
álcool e depois água, até que todos os
ajustado em 5,5);
reagentes presentes fossem removidos.
- Batata-P (1000 mL de água destilada;
Após este procedimento, safranina foi
300 g de batata; 100 g de açúcar; 2 mL
adicionada sobre a lâmina por 30 s e
de solução de micronutrientes, 17 g de
lavada novamente com filete d’água. A
ágar e pH ajustado em 6,5 a 7,0);
lâmina
- Batata (1000 mL de água; 200 g de
microscópio, na lente de imersão, para
batata; 2,5 g de ácido málico; 2,5 g de
observação da coloração e forma das
açúcar cristal; 2 mL de solução de
células bacterianas. As bactérias Gram
micronutrientes; 1 mL de solução de
(-) apresentaram coloração vermelha e
vitaminas, 17 g de ágar e pH ajustado
as Gram (+), coloração azulada.
em 6,5 a 7,0);
foi
Alguns
seca
e
levada
isolados
ao
foram
- Luria Broth-LB (1000 mL de água; 10
selecionados para realização dos testes
g de peptona de caseína; 5 g de extrato
bioquímicos
de levedura; 10 g de NaCl e 15 g de
características microscópicas e culturais
ágar).
anteriormente avaliadas.
As
nesses
colônias
meios
de
que
cresceram
cultura
com
base
nas
O teste de utilização de citrato
foram
visou identificar microrganismo que
recolhidas, com ajuda da alça de
utiliza o citrato como única fonte de
repicagem esterilizada, para lâmina de
carbono e energia. O meio citrato-
vidro devidamente limpa e realizou-se o
Simmons apresentou a composição de
8
1000mL de água destilada; 2g de citrato
indiretamente a produção de flagelos.
de sódio; 0,2g de MgSO4.7H2O; 1g de
Se as bactérias cresceram por todo o
NH4H2PO4; 1g de K2HPO4; 5g de NaCl,
meio, ou seja, crescem deslocando-se da
20g de ágar e 15ml de azul de
linha de inoculação, o resultado seria
bromotimol.
positivo (presença de flagelo); negativo
Após ser autoclavado, o meio
quando
os
microrganismos
ficam
citrato sólido de cor verde que estava
restritos ao local da inoculação;
em tubos de ensaio, foram inclinados
- produção de sulfeto de hidrogênio: se
para que o líquido endurecesse em
havia a presença de uma película preta
posição inclinada, e possibilitasse assim
na superfície do meio, a produção era
fazer as estrias. Após 2 a 3 dias, as
positiva. O meio SIM tem o tiossulfato
placas foram observadas quanto à
como fonte de enxofre e o sulfato
mudança ou não de cor do meio de
ferroso como indicador da produção de
cultura, ou seja, se de verde (cor
sulfeto de hidrogênio. O sulfeto de
original do meio) passou para azul
hidrogênio produzido reage com o
escuro. O resultado positivo foi a
metal pesado formando sulfetos que
mudança de coloração da superfície do
apresentam
meio para azul.
(precipitado preto insolúvel);
coloração
negra
Os testes de produção de indol e
- produção de indol: o surgimento da
de H2S (sulfeto de hidrogênio) assim
coloração avermelhada no meio ao
como a prova de motilidade, foram
adicionar 2 a 3 gotas do reagente de
conduzidos usando-se o meio SIM que
Kovacs, indicou resultado positivo, ou
tem coloração amarela e textura firme.
seja, revelou a presença de indol pois o
A composição do meio SIM constou de
mesmo complexou-se com o aldeído,
1000mL
30g
em meio ácido, formando o composto
peptona; 3g de extrato de carne; 0,10g
colorido. O reagente de Kovacs é
de FeSO4.7H2O e 3g de agar.
composto
de
água
destilada;
por
p-
O isolado presente em alça de
dimetilaminobenzaldeído em solução de
metal de ponta reta foi inoculado no
HCl e álcool isoamílico. O indol é
meio SIM em linha reta, através da
resultante da degradação do aminoácido
técnica da punctura. Após 2 a 3 dias,
triptofano pela enzima triptofanase.
observou-se:
-
motilidade:
Para o teste de produção de
não
é
uma
prova
bioquímica e sim fisiológica, indica
ácido
foi
usado
o
meio
para
fermentação de glicose que consistiu de
9
1000mL de água destilada; 1g de
RESULTADOS
glicose; 2g de peptona; 5g de NaCl,
0,3g de KH2PO4, 3g de ágar e 3mL de
vermelho de metila. O meio, após
preparado, foi adicionado ao tubo de
ensaio em um volume de 5 mL. O
resultado positivo foi a mudança da
coloração do meio original que passou
de verde para amarela.
Foram encontradas populações
de
8,55x103,
9,9x104
e
4,05x103
bactérias endofíticas por grama de
matéria fresca no caule, raiz e folha,
respectivamente, de algodoeiro.
Foram obtidos mais de 80
isolados que se encontram estocados em
ependorfs e mantidos na geladeira.
O meio para teste de produção
de urease consistiu de 1000mL de água
destilada, 0,5g de NH4H2PO4, 0,5g de
K2HPO4, 0,2g de MgSO4.7H2O, 5g de
NaCl, 1g de extrato de levedura, 16mg
de vermelho de cresol e 17g de ágar. O
meio urease, de cor laranja em função
do indicador de pH, foi devidamente
preparado e autoclavado. A uréia foi
diluída em água destilada (20g para
200mL) e posteriormente filtrada com
seringa e filtro. Este filtrado foi
Algumas colônias crescidas em
meio Batata-P (Figura 1) apresentaram
uma película (cápsula) cobrindo-as.
Depois da caracterização à temperatura
ambiente em meio de cultura 523 e AN
(Figuras 2A, 2B e 2C), os isolados
foram enquadrados em 40 indivíduos
diferentes. Estes ao serem submetidos à
coloração simples e de Gram, foram
caracterizados, em sua maioria, como
bactérias Gram negativas e em forma de
bastão (Figuras 2D e 3; Tabela 1).
adicionado ao meio ainda em estado
líquido, com aproximadamente 60 ºC,
ou seja, antes de sua solidificação. A
mistura foi pipetada para tubos de
ensaio
previamente
esterilizados
e
inclinados para que o meio após
solidificado
possuísse
superfície
suficiente para realização das estrias. O
resultado positivo foi a mudança da
coloração laranja para rosa choque ou
rosa cereja. A urease é uma enzima que
degrada a uréia em duas moléculas de
amônia e uma de anidrido carbônico.
FIGURA 1 – Colônias de bactérias
crescidas em meio Batata-P que não
produziram cápsula
10
FIGURA 3 – Preparados de colônias
FIGURA 2 – Colônias bacterianas
bacterianos em lâminas microscópicas
caracterizadas à temperatura ambiente
submetidas a coloração simples e
em A, B e C. Em D, Formato de
diferencial (Gram).
bastonete
das
células
bacterianas
Gram positivas.
FIGURA
TABELA 1 - Caracterização de 15 isolados obtidos de raízes de milho, algodão, cana-deaçúcar e gramínea por características microscópicas.
Nº
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Isolados (origem)
M.SN. (milho)
M.V. 10-5 (milho)
M.N. 10-2 (milho)
Al.Ju01 (algodão)
Al.Ju07 (algodão)
Al.Ju07a (algodão)
Al.Ju31a (algodão)
Al.Jo05 (algodão)
Al.Jo09 (algodão)
Al.Jo13 (algodão)
Al.Jo17 (algodão)
Al.Jo26 (algodão)
Al.Jo30 (algodão)
IDPRGr01 (gramínea)
IDPRCa01 (cana-de-açúcar)
Gram
+
+
+
+
+
NCB
Forma
Bastonete
Bastonete
Bastonete
Coco
Coco
Coco
Coco
Bastonete
Bastonete
Bastonete
Bastonete
Bastonete
Bastonete
Indefinida
NCB
Motilidade
+
+
+
+
+
NCB
NCB
NCB
NCB = não houve crescimento bacteriano.
Dentre os 40 indivíduos, estes foram
Destes isolados, foram selecionados 15,
repicados em meios de cultura diversos
com características diferentes (Tabela 2)
para análise da colônia em cada meio.
11
que também foram submetidos ao testes
bioquímicos (Tabela 3).
TABELA 2 – Caracterização de quinze isolados obtidos de raízes de milho, algodão,
cana-de-açúcar e gramínea por características culturais das colônias em
meios de cultura.
Nº
1
Isolados
M.SN.
2
M.V. 10-5
3
M.N. 10-2
4
5
Al.Ju01
Al.Ju07
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Al.Ju07a
Al.Ju31a
Al.Jo05
Al.Jo09
Al.Jo13
Al.Jo17
Al.Jo26
Al.Jo30
IDPRGr01
IDPRCa01
523
Md/borda irregular/
redonda/amarela/
aspecto gosmento
Gr/borda irregular/ branca
com centro branco mais
escuro
Md/redonda/centro escuro e
borda esbranquiçada
Md/redonda/rosa claro
Redonda/borda
irregular/amarela
Redonda/amarela
Pq /branca
Redonda/esbranquiçada
Redonda/branca/não firme
Redonda/branca
Redonda/branca
Redonda/branca
Redonda/branca
Redonda/esbranquiçada
Redonda/esbranquiçada
NA
___________
LGI-P
___________
___________
Pq/redonda/
esbranquiçada**
___________
Pq/redonda/incolor**
Redonda/densa/ rosa
Redonda/borda
irregular/amarela
___________
Redonda/amarela
___________
___________
___________
___________
___________
___________
___________
___________
Redonda/firme/rosa claro
Redonda/firme/
esbranquiçada
Pq/ esbranquiçada
Redonda/ esbranquiçada
Pq/esbranquiçada*
Pq/esbranquiçada*
Pq/esbranquiçada**
Pq/esbranquiçada *
Gr/esbranquiçada*
Gr/esbranquiçada *
NCB
Gr/redonda/plana/centro
mais escuro/não firme**
NCB = não houve crescimento bacteriano; * Bactéria não acidificou o meio (sem
alteração de cor do meio original); ** Bactéria acidificou o meio (mudança de cor); Pq
= pequena; Md = média; Gr = grande.
TABELA 3 – Caracterização de quinze isolados obtidos de raízes de milho, algodão,
cana-de-açúcar e gramínea por testes bioquímicos.
No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Isolados (origem)
M.SN. (milho)
M.V. 10-5 (milho)
M.N. 10-2 (milho)
Al.Ju01 (algodão)
Al.Ju07 (algodão)
Al.Ju07a (algodão)
Al.Ju31a (algodão)
Al.Jo05 (algodão)
Al.Jo09 (algodão)
Al.Jo13 (algodão)
Al.Jo17 (algodão)
Al.Jo26 (algodão)
Al.Jo30 (algodão)
IDPRGr01 (gramínea)
IDPRCa01 (cana-de-açúcar)
Utilização de
citrato
+
+
+
+
+
-*
-*
-*
-*
H2S
+
NCB
NCB
NCB
Produção de
Indol
Ácido
+
+
+
+
+
NCB
+
+
+
+
+
+
NCB
NCB
NCB
+
NCB
+
Urease
+
+
+
-
NCB = não houve crescimento bacteriano; * Meio ficou amarelo, ou seja, produziu
ácido.
1
O teste de utilização de citrato
(Figura 4) foi positivo para os isolados
de milho e alguns de algodão (Figura 5),
ou seja, a bactéria utilizou o citrato
como fonte de carbono e por tanto,
mudou a cor do meio para azul. Isolados
de algodão, em sua maioria, e de canade-açúcar e gramínea foram citrato
negativos (não utilizam o citrato como
fonte de carbono) e por isso, não
promoveram mudança da cor do meio.
FIGURA 5 – Meio de cultura de cor
verde com bactérias citrato negativas.
Meio de cor azul, bactérias citrato
positivas.
A fermentação é um processo
metabólico de óxido-redução que ocorre
em meio anaeróbio. Pelo teste da
fermentação da glicose (Figuras 7 e 8),
observou-se que a bactéria pode ou não
utilizar este carboidrato como fonte de
carbono. O meio de fermentação da
glicose
proporcionou
o
resultado:
produção ou não de ácido (mudança de
FIGURA 4 – Isolados submetidos ao
cor do meio).
teste do citrato. Bactérias citrato
O teste em meio SIM (Tabelas 1
positivas representadas pelos três
e 3), revelou além da motilidade da
tubos
bactéria, se ela produz indol e H2S.
de
ensaio
coloração azul.
com
meio
de
Alguns
dos
apresentaram-se
isolados
como
de
algodão
sendo
indol
positivas (Figura 6). Os demais isolados
deram todos negativos.
2
FIGURA 6 – Bactérias indol positivas
(coloração vermelha).
FIGURA 8 – Em detalhe, à esquerda
bactéria produtora de ácido e à
direita, bactéria não produtora.
FIGURA 9 – Isolados bacterianos em
meio urease. Os três tubos à esquerda
FIGURA 7 – Isolados inoculados em
mostram
urease
positivo
(rosa
meio de fermentação da
choque). Os três à direita, urease
glicose e armazenados
negativo.
em estufa à 30ºC por
48h.
Em meio urease, apenas três dos
isolados selecionados foram positivos
quanto à produção de urease (Figura 9)
3
após 24 h de incubação à 30ºC, sendo
sensíveis ao ferro presente no meio
eles de cana-de-açúcar e gramínea.
SIM, ou seja, o ferro pode ser tóxico à
bactéria, impedindo-a de crescer.
DISCUSSÃO
Os isolados que em meio citrato
O processo de caracterização das
bactérias isoladas foi efetuado através
da determinação de um número mínimo
de propriedades.
menor
o
Sabe-se que quanto
número
de
observações
efetuadas, maior o risco de erros de
identificação.
Portanto,
os
ainda,
características,
bioquímicas.
para
outras
principalmente,
Fernandes,
amarelo, possuem permease citrato, que
faz o transporte do citrato para o interior
da célula bacteriana, produzindo muito
ácido deixando o meio amarelo, e não
azul.
Em meios sólidos, onde não
isolados
desse presente trabalho devem ser
observados,
transformaram o meio de verde para
Fernandes,
Rodrigues (2001) trabalharam com 20
isolados obtidos de folhas e raízes de
houve
No entanto, a identificação dos isolados
ainda
não
ficou
esclarecida.
A
completamente
investigação
das
atividades metabólicas das bactérias “in
vitro” auxilia o microbiologista na
identificação, pois muitas vezes, um
determinado microrganismo possui um
sistema
enzimático
específico,
promovendo transformação bioquímica
Uma provável explicação para
isolados
bacteriano,
os isolados não estavam devidamente
ativos ou o inóculo colhido para
realização da repicagem não continham
bactérias.
O resultado obtido com a maior
contagem do NMP de bactérias em
raízes de algodoeiro do que com outras
partes da planta já foi encontrado por
outros autores. Júnior et al. (200)
trabalharam
isolando
bactérias
diazotróficas em diferentes genótipos de
cana-de-açúcar,
encontraram
maior
freqüência de bactérias ocorrendo nas
raízes.
Herbaspitillum spp., Azoarcus
spp. e Acetobacter diazotrophicus, são
específica.
os
crescimento
provavelmente, deve-se ao fato de que
coqueiro e utilizaram muito mais testes
bioquímicos do que o presente trabalho.
o
bacterianos
que
não
cresceram em meio SIM e cresceram
nos outros, é que estes podem ser
bactérias
endofíticas
obrigatórias
(Döbereiner, Baldani, Baldani, 1995).
Como não foram utilizados,
respectivamente, os meios JNFb e NFb,
Herbaspirillum spp. e Azospirillum spp.
4
provavelmente não estão entre os
mais crescimento em meio LGI-P, por
isolados encontrados, visto que estes
este conter em sua composição, uma
meios são específicos para isolamento
alta concentração de sacarose em
destes grupos de bactérias.
relação ao meio LGI.
Acetobacter diazotrophicus é a
Cabe salientar que baseado na
única espécie desse gênero capaz de
análise de seqüência do 16 s rRNA, A.
fixar N2 e é selecionada através do meio
diazotrophicus foi redenominada como
LGI-P. Em meio sólido acrescido de
Gluconobacter diazotrophicus.
20mg de extrato de levedura, após
bactéria é Gram negativo, tolerante à
incubados à 30ºC por uma semana, as
ácido, aeróbio obrigatório e as células
colônias formadas são pequenas e de
são do formato de bastonete medindo de
cor
Baldani,
0,7-0,9 µm por 1-2 µm. As células
Baldani, 1995). No presente trabalho, a
bacterianas podem ser visualizadas
maioria das colônias crescidas em LGI-
individualmente, em pares ou estruturas
P, apresentou coloração esbranquiçada,
como cadeias sem endósporos.
laranja
(Döbereiner,
sendo assim, tudo indica que os isolados
Essa
Pelas características dos três
avaliados não sejam de Acetobacter
isolados
diazotrophicus.
possibilidade de tratar-se de espécie da
originados
de
milho,
há
O meio Batata-P é capaz de
ordem Enterobacteriales que caracteriza
purificar Acetobacter diazotrophicus e
por apresentar formato de bastonete,
apresenta colônias inicialmente claras e
Gram negativo, anaeróbicos facultativos
úmidas,
coloração
que, se forem capazes de se locomover,
chocolate após sete a dez dias de
fazem por meio de flagelos peritríquios.
incubação à 30ºC (Döbereiner, Baldani,
Fermentam a lactose para produzir
Baldani, 1995). Os resultados obtidos a
ácido e gás (Tortora, Funke, Case,
partir deste meio, foram colônias claras
2005). Há necessidade da realização de
e com um aspecto úmido, como descrito
mais
anteriormente.
fermentação/oxidação de sorbitol e
tornando-se
de
Porém,
a
coloração
chocolate não foi observada.
mais
não
bioquímicos
como
produção de acetoína, para confirmação
Testes em meio LGI foram
realizados,
testes
obtiveram
correta.
Hinton
descreveram
&
a
Bacon
ocorrência
(1995)
de
resultados satisfatórios como em LGI-P,
Enterobacter cloacae como simbionte
por este motivo não foram descritos no
endofítico em raízes de milho. Bactérias
presente trabalho. Provavelmente houve
do
gênero
Enterobacter
fixam
5
nitrogênio, porém requerem compostos
AGRADECIMENTOS
nitrogenados para crescer sob condições
estritamente
anaeróbicas
(Marin,
Baldani, Teixeira, Baldani).
Agradeço à Prof. Dra Maria
Amelia dos Santos, ao meu orientador
As espécies de Herbaspirillum e
Prof. Dr. Adão de Siqueira Ferreira e à
Azoarcus são isoladas pela inoculação
todos aqueles que diretamente ou
em meio semi-sólido JNFb que não foi
indiretamente ajudaram na realização
usado no presente estudo. Assim como
deste trabalho.
o LGI, o meio JNFb apresenta também
ausência de fonte de nitrogênio para
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
selecionar bactérias diazotróficas.
O sucesso na utilização de
bactérias
diazotróficas
não
está
AZEVEDO,
JÚNIOR,
J.L.;
W.;
MACCERONI
ARAÚJO,
W.L.
relacionado apenas a habilidade de
Importância
selecionar isolados, mas de integrar a
endofíticos na agricultura.
incorporação
Anual de Proteção de Plantas, v. 11,
e
manutenção
dessas
populações no campo com os sistemas
dos
microrganismos
Revisão
p. 333-363, 2003.
de produção agrícola utilizados.
BOTELHO, G. R.; GUIMARÃES, V.;
DE BONIS, M.; FONSECA, M. E. F.;
CONCLUSÃO
HAGLER, A. N.; HAGLER, L. C. M.
Com
base
nos
resultados
Ecology of a plant growth-promoting
obtidos, pode-se concluir que (1) existe
strain
grande
colonizing the maize endorhizosphere in
diversidade
de
bactérias
of
Pseudomonas
fluorescens
endofíticas; (2) as plantas estudadas se
tropical
diferenciam quanto às características
Microbiology and Biotechnology, v.
dos isolados; (3) os isolados são
14, p. 499-504, 1998.
diferentes
quanto
as
soil.
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características
bioquímicas e nutricionais e (4) as
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