associação dos polimorfismos do tipo indel com o risco de câncer

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
DIEGO MARQUES DA COSTA SANTOS
ASSOCIAÇÃO DOS POLIMORFISMOS DO TIPO INDEL COM O
RISCO DE CÂNCER COLORRETAL NA POPULAÇÃO DO RIO
GRANDE DO NORTE.
NATAL – RIO GRANDE DO NORTE
AGOSTO – 2016
DIEGO MARQUES DA COSTA SANTOS
ASSOCIAÇÃO DOS POLIMORFISMOS DO TIPO INDEL COM O
RISCO DE CÂNCER COLORRETAL NA POPULAÇÃO DO RIO
GRANDE DO NORTE.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Ciências Farmacêutica da Universidade Federal do
Rio Grande do Norte como parte dos requisitos para
obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêutica.
ORIENTADORA: PROFa DRa VIVIAN NOGUEIRA SILBIGER.
NATAL – RIO GRANDE DO NORTE
AGOSTO – 2016
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Santos, Diego Marques da Costa.
Associação dos polimorfismos do tipo INDEL com o risco de
Câncer Colorretal na população do Rio Grande do Norte / Diego
Marques da Costa Santos. - Natal, 2016.
120f.: il.
Orientador: Profª. Drª. Vivian Nogueira Silbiger.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Farmacêuticas. Centro de Ciências da Saúde. Universidade
Federal do Rio Grande do Norte.
1. Potencial biomarcardor de risco - Dissertação. 2. Câncer
colorretal - Dissertação. 3. INDEL - Dissertação. I. Silbiger,
Vivian Nogueira. II. Título.
RN/UF/BSCCS
CDU 616.348-006
INSTITUIÇÕES PARTICIPANTES E FINANCIADORAS
Instituições Participantes:
1. Laboratório de Bioanálise e Biotecnologia Molecular – Departamento de Análises Clínicas
e Toxicológicas, Universidade Federal do Rio Grande do Norte;
2. Laboratório de Genética Humana e Médica – Instituto de Ciências Biológicas,
Universidade do Pará;
3. Departamento de Cirurgia Oncológica – Liga Norte Riograndense Contra o Câncer, Natal,
Rio Grande do Norte;
4. Laboratório de Patologia e Citopatologia – Liga Norte Riograndense Contra o Câncer,
Natal, Rio Grande do Norte.
Instituições Financiadoras:
1. Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Editais:
481652/2012-4; e 483031/2013-5) – apoio financeiro à pesquisa;
2. Rede de Pesquisa em Genômica Populacional Humana (Biocomputacional/CAPES, Edital
nº 051/2013) – bolsa concedida;
3. Rede de Pesquisa em Genômica Populacional Humana (CAPES-Proamazonia, Edital:
3288/2013) – apoio financeiro à pesquisa;
4. Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Pará (ICAAF/FAPESPA, Edital: 155/2014)
– apoio financeiro à pesquisa;
5. Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Norte (FAPERN, Edital:
005/2011) – apoio financeiro à pesquisa.
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho para a minha
família, amigos, e a todos os indivíduos que
participaram deste estudo de forma direta ou
indireta,
possibilitando
a
construção
do
conhecimento na população brasileira. Dedico
também a todos os indivíduos que poderão se
beneficiar com este trabalho, pois eles são o
principal estímulo para o desenvolvimento da
pesquisa científica.
AGRADECIMENTOS
Este espaço é dedicado àqueles que, de alguma forma, contribuíram para que esta
dissertação fosse realizada. Não sendo viável nomeá‐los a todos, há, no entanto, alguns a
quem não posso deixar de manifestar o meu apreço e agradecimento sincero.
Inicialmente, eu agradeço à minha família. Sem o apoio deles para que eu seguisse os
meus sonhos; o suporte emocional para que eu não desistisse no meio deste processo; e o
companheirismo nos momentos de conquistas e frustação eu não teria conseguido finalizar
este projeto. Incluo nesta lista o Mateus (Teteu). Ele ainda nem nasceu, mas o titio sentiu o
apoio dele.
Ao exemplo de força e perseverança presente na minha família, a minha mãe e as
minhas avós. Guerreiras que conseguiram superar diversos obstáculos, mostrando que nunca
se deve abaixar a cabeça para um “não” que a vida dá.
Aos meus amigos, Madson Miguel, Letícia Costa, Rhadamés Menezes, Iaponira
Barbosa, Maria Isabel e as irmãs Lorenna e Layse Ferreira-Costa. Eles foram como uma parte
estendida da minha família, dando apoio e suportando as minhas chatices durante todos os
anos que nos conhecemos. E mesmo distante, devido a escolhas nas nossas vidas, eu sempre
senti que podia contar com eles para compartilhar os momentos tristes e felizes.
Ao meu namorado (Pierre Almeida), ouvinte atento de algumas dúvidas, inquietações,
desânimos e sucessos. Bem como pelo apoio, pela confiança, pela compreensão, pela
valorização, pelo amor e pela solidariedade. Sempre tão entusiasta do meu trabalho, dando
coragem para ultrapassar a culpa pelo tempo que a cada dia tirava.
Aos professores que deram todo o suporte e ensinamentos. A lista de professores se
estende aos que conheci durante o período que cursei a minha graduação em Farmácia
(UFRN) e a minha pós-graduação. Incluo nela aos professores que conheci durante o colégio.
Entretanto, eu delimitarei aos professores que abriram espaços para mim na pesquisa.
Ao Prof. Cícero Aragão (UFRN), que me ensinou a importância de ter procedimentos
padronizados dentro do laboratório.
À Profa. Janaina Crispim (UFRN), pois me mostrou o quão interessante é estudar o
câncer e da importância de se estudar o sistema imunológico.
À Profa. Vivian Silbiger e ao Prof. André Luchessi (UFRN), que me mostraram a
beleza que a biologia molecular traz para o entendimento das enfermidades e de como
podemos aplicar o conhecimento para melhorar o diagnóstico e prognóstico. Eles me
acolheram como aluno de iniciação científica em 2011, e desde então proporcionaram
diversos tipos de conselhos, conhecimentos e experiências.
À relação que tive com estes dois grandes professores, que são meus pais de pesquisa.
E por incrível que parece, eu até puxei algumas características deles, como por exemplo, a
inquietação; a vontade de compartilhar o que aprendeu de novo e o vício pelo trabalho.
Entretanto, apesar de ser uma relação longa, não foi cheia de flores. Assim como uma relação
de pais e filhos, tivemos nossos momentos de desentendimentos, mas no final, acabamos
entendendo o ponto de vista um do outro, e aprendemos mais um pouco.
À Profa. Ândrea Ribeiro-dos-Santos e ao Prof. Sidney Santos (UFPA), pois
concederam todo o apoio financeiro para o estudo e me acolheram no seu laboratório para
aprimorar meu conhecimento.
Aos profissionais da Liga Contra o Câncer, em particular ao Dr. Romualdo Correa, à
Dra. Aline Borges, à Dra. Fernanda Ito e ao Dr. Carlos Ramos, pelo suporte na seleção dos
pacientes.
Aos colegas do Laboratório de Bioanálise e Biotecnologia Molecular (LBBM/UFRN)
e do Laboratório Multiusuário (LabMult/UFRN), em particular ao pós-doutorando Raul
Bortolin. Graças a sua dedicação, paciência e conselhos, eu pude escrever este trabalho.
Eu não poderia deixar de mencionar as irmãs Lorenna e Layse Ferreira-Costa
(LBBM/UFRN), as alunas de iniciação científica que me acompanharam durante diversas
etapas. Juntos, trocamos conhecimentos, risadas, leseiras e frustrações. Quem mais, se não
elas duas, para me aturar? Até quando eu perguntava “Vamos trabalhar nos finais de semanas
e feriados para cumprir os prazos?”, elas estavam comigo.
Aos colegas do Mestrado em Ciência Farmacêutica 2014/2016, com quem vivi um
ambiente de verdadeira aprendizagem colaborativa.
Às pessoas que me acolheram na minha ida ao Pará, incluindo as pessoas do Laboratório de
Genética Humana e Médica (LGHM/UFPA), Núcleo de Pesquisa Oncológica (NPO/UFPA),
do grupo de oração chamado de “Nano” e as pessoas que conheci durante as disciplinas e fora
do ambiente universitário. O acolhimento que eles me forneceram foi essencial para conseguir
passar seis meses do meu mestrado longe da minha família (principalmente da minha
sobrinha, Princesa Sophia) e dos meus amigos.
Aos alunos de iniciação científica do LGHM, Rebbeca Laís, Lucas Cauê e Cíntia
Helena. Eles me aturaram mais do que qualquer outra pessoa na UFPA, trabalhando junto
comigo até no período de férias. Isso sem mencionar as risadas compartilhadas.
E por fim, mas não menos importante, a Deus. Pois Ele tornou tudo possível.
Agradeço a Deus por ter possibilitado que uma pessoa extremamente especial tenha entrado
na minha vida durante a graduação, mas que foi descansar junto d’Ele recentemente. O seu
nome é Ana Celly. Ela foi uma das pessoas que olhou para mim e disse: “Criatura, vá fazer
esse mestrado de uma vez! Segue o seu sonho.”. Por todas as pessoas que conheci. Pois cada
pessoa que entrou na minha vida, mesmo que não tenha permanecido, contribuiu de alguma
forma para eu ser quem eu sou. E sem sombra de dúvidas, eu irei carregar um pedaço de cada
uma das pessoas que cruzaram na minha vida para toda a eternidade. Também sou grato pelas
experiências que vivi e até mesmo pelas decepções que tive, pois estou aprendendo com todas
as experiências de vida.
“Tenho a impressão de ter sido uma criança
brincando
à
beira-mar,
divertindo-me
em
descobrir uma pedrinha mais lisa ou uma concha
mais bonita que as outras, enquanto o imenso
oceano da verdade continua misterioso diante de
meus olhos”.
(Isaac Newton)
RESUMO
O câncer colorretal (CCR) é um tipo de câncer que acomete a região do intestino grosso e
reto; sendo o terceiro câncer mais comum em homens e o segundo em mulheres no mundo. A
maior parte da susceptibilidade ao CCR é proveniente de variantes genéticas múltiplas, cada
uma com um efeito individual que, quando combinada, causa a diversidade de risco para o
desenvolvimento desse câncer. Dentre os tipos de mutações encontrados no genoma humano,
as inserções e deleções (INDEL) são a segunda classe mais comum; e o entendimento deste
tipo de mutação possui um potencial de impactar na expressão, na estrutura e até mesmo
função da proteína. Entretanto, sabe-se relativamente pouco sobre o impacto das INDEL no
risco de CCR, especialmente na população miscigenada do Brasil. Dessa forma o objetivo
deste trabalho é realizar um estudo do tipo caso-controle para determinar a associação de 16
INDEL com a susceptibilidade ao CCR na população do Rio Grande do Norte. Além disso,
foi também avaliado a distribuição relativa da ancestralidade entre o grupo caso e controle. Os
polimorfismos e os marcadores utilizado para a distribuição da ancestralidade foram
genotipados utilizando ABI PRISM 3130 e o GeneMapper ID v3.2. A análise estatística foi
realizada utilizando o R v 3.1. Em relação à ancestralidade genômica, foi observada diferença
significativa na distribuição da contribuição Africana entre os grupos. Em relação à análise de
associação entre o polimorfismo e o risco de desenvolver CCR, foi observado que o alelo D
do polimorfismo estudado no gene IL4, e o alelo I do polimorfismo do TYMS foram
associados com o aumento do risco de desenvolver CCR. No presente trabalho, também foi
avaliado o risco que a combinação genotípica do TYMS (rs151264360) e do IL4 (rs79071878)
aumenta consideravelmente o risco de ter CCR; e foi observado que se faz necessário a
presença de pelo menos 3 alelos de risco para conferir risco de ter CCR.
Palavras-chave: Potencial biomarcardor de risco; Câncer colorretal; INDEL.
ABSTRACT
Colorectal cancer (CRC) is a type of cancer that affects large intestine and rectum region, and
this is the third most common cancer worldwide in men and the second in women. The
genetic susceptibility to CRC comes from multiple genetic variants. Individually, these
genetic variants have modest effect. However, theses variants, when combined, cause a wide
range of risk. Among all mutations types found in the human genome, insertion-deletions
(INDEL) are the second most common class, which has a potential impact on the expression,
structure and protein function. However, there are a few studies about INDEL impact on CRC
risk. Thus the aim of this study is to evaluate the association of 16 INDEL with CRC
susceptibility in Rio Grande do Norte population. Furthermore, it was also evaluated the
relative ancestry distribution between case and control groups. Polymorphism and marker
used for ancestry distribution were genotyped using ABI PRISM 3130 and GeneMapper ID v
3.2. Statistical analysis was performed using the R v 3.1. Regarding the genetic ancestry, there
was significant difference in the distribution of the African contribution between groups.
Regarding the polymorphism association in CRC risk, it was observed that the D allele of IL4
and I allele of TYMS polymorphisms were associated with increased CRC risk. In this study,
it was also evaluated the combined effect of IL4 and TYMS polymorphism in CRC risk, and it
was observed that at least 3 allelic risks were necessary to confer CRC risk.
Keywords: Potential biomarkers of susceptibility; Colorectal cancer; INDEL.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 1
1.1. ASPECTOS GERAIS ............................................................................................................. 1
1.2. EPIDEMIOLOGIA ................................................................................................................ 1
1.3. CLASSIFICAÇÃO ................................................................................................................ 2
1.3.1. Anatomia do cólon e reto .......................................................................................... 2
1.3.2. Macroscopia do processo neoplásico ....................................................................... 3
1.3.3. Microscopia do câncer colorretal ............................................................................. 4
1.3.4. Tipo celular do câncer colorretal ............................................................................. 4
1.3.5. Grau de diferenciação das células tumorais............................................................. 5
1.3.6. Sistema de Estadiamento TNM do câncer colorretal ............................................... 6
1.4. FATORES DE RISCO ASSOCIADOS COM O CÂNCER COLORRETAL ......................................... 9
1.4.1. Tabagismo ................................................................................................................. 9
1.4.2. Etilismo...................................................................................................................... 9
1.4.3. Sedentarismo ........................................................................................................... 10
1.4.4. Sobrepeso ou obesidade .......................................................................................... 10
1.4.5. Hábitos Alimentares ................................................................................................ 11
1.4.6. Gênero ..................................................................................................................... 12
1.4.7. Idade ........................................................................................................................ 13
1.4.8. Histórico pessoal de pólipo e doença inflamatória no intestino............................. 13
1.4.9. Histórico familiar de pólipos e câncer colorretal ................................................... 14
1.4.10. Contribuição étnica ............................................................................................... 15
1.5. GENES CANDIDATOS........................................................................................................ 16
1.5.1. UCP2 ....................................................................................................................... 17
1.5.2. ACE ......................................................................................................................... 17
1.5.3. CASP8 ..................................................................................................................... 18
1.5.4. XRCC1..................................................................................................................... 19
1.5.5. TYMS ....................................................................................................................... 19
1.5.6. SGSM3 ..................................................................................................................... 20
1.5.7. HLAG ...................................................................................................................... 20
1.5.8. IL1A ......................................................................................................................... 21
1.5.9. IL4 ........................................................................................................................... 22
1.5.10. NFKB1................................................................................................................... 23
1.5.11 MDM2 .................................................................................................................... 23
1.5.12. TP53 ...................................................................................................................... 24
1.5.13. CYP2E1 ................................................................................................................. 25
1.5.14. CYP19A1 ............................................................................................................... 25
1.5.15. UGT1A1 ................................................................................................................ 26
1.6. VARIAÇÕES GENÉTICAS DO TIPO INSERÇÃO-DELEÇÃO ..................................................... 26
2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 30
2.1. OBJETIVO PRINCIPAL ....................................................................................................... 30
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................................. 30
3. METODOLOGIA............................................................................................................... 31
3.1. COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA ..................................................................................... 31
3.2. CASUÍSTICA .................................................................................................................... 31
3.3. CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO............................................................................. 31
3.4. COLETAS DAS AMOSTRAS ................................................................................................ 31
3.5. EXTRAÇÃO DE DNA ....................................................................................................... 32
3.6. AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DO DNA EXTRAÍDO ............................................................ 32
3.7. VARIÁVEIS COLETADAS .................................................................................................. 32
3.8. GENOTIPAGEM DOS POLIMORFISMOS ............................................................................... 33
3.9. ANÁLISE DA ANCESTRALIDADE RELATIVA POR MARCADORES AUTOSSÔMICOS ............... 35
3.10. ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................................... 36
4. RESULTADOS ................................................................................................................... 37
4.1. CARACTERÍSTICAS DEMOGRÁFICAS E CLÍNICAS .............................................................. 37
4.2. CONTRIBUIÇÃO DA ANCESTRALIDADE RELATIVA POR MARCADORES AUTOSSÔMICOS ..... 38
4.3. FREQUÊNCIA GENÉTICA E ALÉLICA ................................................................................. 40
4.4. ANÁLISE DE ASSOCIAÇÃO POLIMÓRFICA ......................................................................... 41
4.5. ANÁLISE COMBINADA DO GENÓTIPO DOS GENES IL4 E TYMS ......................................... 44
5. DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 45
6. CONCLUSÃO..................................................................................................................... 52
REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 53
ANEXO ...................................................................................................................................... I
ANEXO A – PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA ........................................................................... II
APÊNDICE .............................................................................................................................IV
APÊNDICE A – QUESTIONÁRIO ................................................................................................ V
APÊNDICE B – FICHA DE DADOS CLÍNICOS .......................................................................... VIII
APÊNDICE C – RESUMOS APRESENTADOS EM CONGRESSOS ...................................................IX
APÊNDICE D – MANUSCRITO DO ARTIGO PRODUZIDO DURANTE O MESTRADO ........................ X
1. INTRODUÇÃO
1.1. Aspectos gerais
O câncer é caracterizado como o crescimento celular descontrolado em relação a uma
célula normal, resultado do acúmulo de mutações genéticas; podendo ser iniciado em
qualquer órgão do corpo (ACS, 2016). No que se refere ao Câncer Colorretal (CCR), o órgão
acometido é o intestino grosso, no segmento do ceco até o reto.
Essa enfermidade é a terceira neoplasia mais prevalente no mundo e a quarta no Brasil
(FERLAY et al., 2015), podendo ter um bom prognóstico quando diagnosticado
precocemente. Contudo, a maior problemática deste tipo de tumor é o diagnóstico tardio, no
qual o paciente é diagnosticado em estágios mais avançado da doença, resultando no pior
prognóstico e, portanto, em uma menor sobrevida (MENEZES; OLIVEIRA; LUNDGREN,
2012).
Diversos fatores ambientais e genéticos estão fortemente associados com o processo
de carcinogênese (LIU et al., 2014; ZARIDZE, 2008). Estes fatores são amplos, variam de
acordo com o tipo de câncer, com a região geográfica (GOMEZ et al., 2015) e interagem
entre si. Entretanto, a susceptibilidade herdada é um componente importante de predisposição
do CCR, sendo atribuído um risco estimado de 12% a 35% (CZENE; LICHTENSTEIN;
HEMMINKI, 2002; LICHTENSTEIN et al., 2000; PETERS; BIEN; ZUBAIR, 2015).
Por se tratar de uma enfermidade com base genética, a susceptibilidade ao CCR, assim
como as outras neoplasias, tem sido influenciada pela frequência das mutações herdadas no
genoma, variando entre diferentes populações. Diante disso, torna-se importante analisar as
características genéticas da população de Natal para avaliar a susceptibilidade ao CCR, uma
vez que essa população tem influências de diversos grupos populacionais.
1.2. Epidemiologia
No mundo, estima-se a incidência de 1,4 milhões de pessoas diagnosticadas com CCR
em 2015 e a mortalidade de 750 mil (FERLAY et al., 2015). E estima-se para o ano de 2020,
um aumento de 13,6% na incidência e 8,5% na mortalidade (FERLAY et al., 2015).
O Brasil é o décimo país a ter o maior número de incidência de CCR no mundo
(FERLAY et al., 2015), com uma estimativa de 34 mil pessoas diagnosticadas durante o ano
de 2015 e mortalidade de 17 mil indivíduos (FERLAY et al., 2015). Além disso, estima-se
1
para o ano de 2020 um aumento de 28,6% na incidência e 29,7% mortalidade (FERLAY et
al., 2015).
Mundialmente, o CCR é o terceiro câncer mais prevalente entre o gênero masculino e
o segundo no gênero feminino (FERLAY et al., 2015). No Brasil a razão de incidência entre
mulheres e homens é de 1,2 (INCA, 2016), significando que o número de mulheres
acometidas por este processo neoplásico é 20% maior do que em homens.
1.3. Classificação
A classificação elucida as relações entre a clínica e o desenvolvimento patológico do
CCR, que é o ponto em que se inicia a investigação da causa, a evolução e o histórico natural
da doença (JASS, 2007). No câncer, a classificação tem sido tradicionalmente baseada na
morfologia microscópica e complementada através da imunofenotipagem, para os casos mais
complexos (JASS, 2007).
No CCR, a conduta clínica e as pesquisas têm prosseguido por muitas décadas no
conceito que esta enfermidade assumia uma condição homogênea no seu desenvolvimento,
sendo majoritariamente originado devido à progressão do adenoma (JASS, 2007). Contudo,
subtipos morfologicamente particulares têm sido reconhecidos e caracterizados por mostrarem
diferenças de acordo com o sítio anatômico (IACOPETTA, 2002).
1.3.1. Anatomia do cólon e reto
O cólon, também conhecido como intestino grosso, é anatomicamente dividido em
cinco regiões: o cólon direito (ceco e ascendente), o cólon médio (transverso), o cólon
esquerdo (descendente), o cólon sigmoide e o reto (Figura 01).
O CCR pode ser chamado câncer de cólon ou câncer retal, dependendo da região do
intestino grosso onde se origina. A diferença entre o câncer de cólon ou o retal está na
localização anatômica e na necessidade de um tratamento diferenciado entre eles. Entretanto,
como a biologia tumoral deles é a mesma, eles são muitas vezes agrupados como CCR.
2
Figura 01 – Representação ilustrativa do Intestino Grosso, região acometida pelo
Câncer Colorretal, e suas segmentações: C – Ceco; A – Cólon Ascendente; T – Cólon
Transverso; D – Cólon Descentente; S – Cólon Sigmóide; R – Reto. Fonte: Elaborado pelo
autor.
1.3.2. Macroscopia do processo neoplásico
A maioria dos CCR inicia-se com a formação de uma projeção do tecido no lúmen do
intestino grosso (pólipo), podendo passar por um processo de diferenciação para a formação
de uma massa cancerosa (Figura 02).
Figura 02 – Representação ilustrativa das etapas macroscópicas do processo de
carcinogênese do Câncer Colorretal. Fonte: Johns Hopkins Digestive Disorders Library.
Traduzido para o Português. Data de acesso: 14 de maio de 2016.
Os pólipos possuem um crescimento benigno, mas dependendo do tipo de pólipo o
processo de carcinogênese pode ser iniciado ou não. Os pólipos pré-cancerosos são compostos
principalmente por pólipo adenomatoso, séssil e displásico; e os pólipos não pré-cancerosos
são principalmente compostos por pólipos hiperplásicos e os inflamatórios. Contudo, apesar
dos pólipos não pré-cancerosos usualmente não se desenvolverem em câncer, os pólipos
maiores do que 1 cm tem um maior risco de tornar-se câncer (LIEBERMAN et al., 2012).
3
O pólipo adenomatoso dá origem ao tipo de lesão mais frequente no CCR que é o
adenocarcinoma (90% dos casos). Convencionalmente, o adenocarcinoma é caracterizado
com uma morfologia de característica glandular, que é a sua base histológica (FLEMING et
al., 2012).
1.3.3. Microscopia do câncer colorretal
O cólon é composto por várias camadas histológicas, que se inicia na mucosa e vai até
a serosa (Figura 03). A característica que define um adenocarcinoma no CCR é a invasão da
célula neoplásica através das camadas musculares da mucosa para a submucosa.
Figura 03 – Ilustração representativa das camadas histológicas do intestino grosso.
Fonte: Comitê Americano de Câncer (AJCC).
As lesões com as características morfológicas do adenocarcinoma que estão
confinados ao epitélio ou invadem a lâmina, carecem de invasão da musculatura da mucosa
para a submucosa, apresentando praticamente nenhum risco de metástase (BOSMAN; WHO;
IARC, 2010).
1.3.4. Tipo celular do câncer colorretal
Os tipos histológicos de tumores cometidos no cólon e no reto são genericamente
classificados como tumor epitelial, não epitelial e os tumores secundários. Os tumores
epiteliais podem ser adenomas, neoplasia intraepitelial (displasia) associado com doença
inflamatória crônica, carcinomas, carcinoides, mistura de carcinoide-adenocarcinoma e outros
tipos.
Os adenocarcinomas representam cerca de 95% dos casos de CCR, que se iniciam em
células glandulares produtoras de muco do epitélio do colón e do reto a partir de pólipos
4
adenomatosos e possuem três variantes histológicas neste tipo de tumor: tubular, tubuloviloso e viloso.
Os adenomas tubulares representam entre 75% a 85% dos pólipos adenomatosos e têm
< 5% de chance de se diferenciar a um processo maligno. Os adenomas túbulo-viloso
representam 10% a 15% dos pólipos e, geralmente, 20% a 25% dos casos podem vir a
desenvolver um processo maligno. Os adenomas vilosos consistem 5% a 10% dos casos de
pólipos e cerca de 35% a 40% podem vir a se diferenciar em um processo maligno (AMERSI;
AGUSTIN; KO, 2005).
Os outros tipos celulares que são menos comuns, mas que também cometem a região
colorretal, são: tumor carcinóide, tumor no estroma gastrointestinal, linfomas e sarcomas. Os
tumores carcinóides iniciam-se a partir de células especializadas marcadas com hormônios no
intestino. Os tumores no estroma gastrointestinal têm como precursores as células
especializadas na parede do cólon, chamadas de células intersticiais de Cajal, e podem ser
encontradas em qualquer região topográfica do trato gastrointestinal, mas é usualmente
localizada no cólon.
Os linfomas são câncer das células do sistema imunológico que se originam
tipicamente nos nódulos linfonoidais, mas podem também iniciar no cólon, reto ou em outros
órgãos. Os sarcomas podem iniciar nos vasos sanguíneos, na camada muscular ou outros
tecidos de conexão com a parede do cólon e do reto (ACS, 2016).
1.3.5. Grau de diferenciação das células tumorais
Outro fator que pode afetar o tratamento e perspectiva do paciente com CCR é o grau
de diferenciação do câncer. No geral, a diferenciação histológica do CCR é bastante sugestiva
e existe um vasto sistema de diferenciação sugerido pela literatura. Entre os esquemas
sugeridos, o número de estratificações e os critérios adotados para distinguir são
significativamente variados. Em alguns sistemas, o grau de diferenciação é descrito como o
quão próximo uma célula cancerosa aparenta com uma célula normal do tecido, quando
observado por microscopia (GOLDSTEIN; HART, 1999).
Apesar da complexidade dos critérios de estratificação, o sistema mais adotado é
dividido em quatro graus de diferenciação (do inglês, four-tiered): G1 – Bem diferenciado;
G2 – Moderadamente diferenciado; G3 – Mau diferenciado; e G4 – Indiferenciado
(BOSMAN; WHO; IARC, 2010; COMPTON, 2003).
5
Por uma grande parte, o diagnóstico patológico entre o G3 e o G4 são relativamente
consistentes e associados com pouca variabilidade. Entretanto, a distinção entre G1 e G2 é
menos reprodutível. A subjetividade e imprecisão na classificação do grau de diferenciação é
resultado da heterogeneidade dos tumores (ACS, 2016; BOSMAN; WHO; IARC, 2010;
COMPTON, 2003).
Desta forma, o sistema de classificação que divide em dois graus de diferenciação (do
inglês, two-tiered) elimina esta dificuldade para tornar o diagnóstico mais consistente. Este
sistema é classificado como: Baixo grau – G1 e G2; e Alto grau – G3 e G4 (ACS, 2016;
BOSMAN; WHO; IARC, 2010; COMPTON, 2003).
O câncer com baixo grau de diferenciação tende a crescer e invadir mais lentamente
do que os cânceres com alto grau de diferenciação. Na maior parte das vezes, a perspectiva é
melhor para câncer com baixo grau do que para o de alto grau no mesmo estágio. Além disso,
o uso do grau de diferenciação ajuda a decidir se o paciente deve receber um tratamento
adjuvante com a quimioterapia depois da cirurgia (ACS, 2016).
1.3.6. Sistema de Estadiamento TNM do câncer colorretal
Em 1932, o patologista britânico Cuthber Dukes (1890 – 1977) estabeleceu o sistema
de classificação para o CCR e diversas modificações surgiram dele, como o proposto por
Astler e Coller em 1954. Entretanto, na prática clínica, esse tem sido amplamente substituído
por um sistema de estadiamento mais detalhado, a Classificação de Tumores Maligno por
TNM (do inglês, TNM Classification of Malignant Tumours), descrito pelo Comitê
Americano de Articulação no Câncer (AJCC, do inglês American Joint Committee on
Cancer).
O sistema TNM é baseado em 3 principais características: quão profundo o tumor
primário tem crescido para o interior da parede do intestino e se tem crescido para áreas
próximas (T); se o câncer tem invadido uma região linfonoidal próxima (N); e se o câncer tem
sofrido metástase para outro órgão do corpo (M). Ver tabela 1.
6
Tabela 1 – Definição das características do Sistema TNM estratificada, de acordo com a
sétima edição do AJCC.
Tumor primário (T)
Tx – Não teve acesso ao tumor primário
T0 – Sem evidências do tumor primário
Tis – Carcinoma in situ: intraepitelial ou invasão da lâmina própria
T1 – Tumor invade a submucosa
T2 – Tumor invade a muscular própria
T3 – Tumor invade através da muscular própria até o tecido pericolorretal
T4a – Tumor penetra até a superfície do peritônio visceral
T4b – Tumor está invadindo ou aderido diretamente a outro órgão ou estrutura
Linfonodos Regionais (N)
Nx – Não teve acesso a região linfonóidal
N0 – Sem evidências de metástase nos linfonodos regionais
N1 – Metástases em 1 a 3 linfonodos regionais
N1a – Metástase em 1 linfonodo regional
N1b – Metástase em 2 a 3 linfonodos regionais
N1c – Tumor depositado na subserosa, mesentério ou tecido pericólico não peritonizado ou
tecido perirretal sem metástase nos linfonodos regionais
N2 – Metástases em 4 ou mais linfonodos regionais
N2a – Metástases em 4 a 6 linfonodos regionais
N2b – Metástases em 7 ou mais linfonodos regionais
Metástase Distante (M)
M0 – Sem metástases distantes
M1 – Metástases distantes
M1a – Metástases confinado em 1 órgão ou sítio
M1b – Metástases em mais do que 1 órgão, sítio ou no peritônio.
O número ou letra depois do T, N e M fornece maiores detalhes sobre cada um destes
fatores. Ademais, este número remete ao estágio do câncer e quanto maior, mais avançado. A
categorização do TNM tem sido determinada usualmente após o procedimento cirúrgico, e
essa informação pode ser combinada por estádios (Tabela 2).
7
Tabela 2 – Classificação do estádio do câncer colorretal de acordo com a sétima edição
da AJCC.
Estádio
T
N
M
Dukes*
MAC**
0
Tis
N0
M0
–
–
I
T1
N0
M0
A
A
T2
N0
M0
A
B1
IIA
T3
N0
M0
B
B2
IIB
T4a
N0
M0
B
B2
IIC
T4b
N0
M0
B
B3
IIIA
T1-T2
N1/N1c
M0
C
C1
T1
N2a
M0
C
C1
T3-T4a
N1/N1c
M0
C
C2
T2-T3
N2a
M0
C
C1/C2
T1-T2
N2b
M0
C
C1
T4a
N2a
M0
C
C2
T3-T4a
N2b
M0
C
C2
T4b
N1-N2
M0
C
C3
IVA
Qualquer T
Qualquer N
M1a
–
–
IVB
Qualquer T
Qualquer N
M1b
–
–
IIIB
IIIC
Nota: cTNM é uma classificação clínica, pTNM é uma classificação patológica. O prefixo yé usado para os cânceres que são classificados após um pré-tratamento neoadjuvante (por
exemplo, ypTNM). Patientes que tem uma resposta patológica completa são ypT0N0cM0,
que pode ser similar ao Estágio 0 ou 1. O prefixo r- é usado para aqueles cânceres que tiveram
recidiva após um intervalo livre da doença (por exemplo, rTNM). * Sistema de Estadiamento
de Dukes. ** Sistema de Estadiamento de Dukes modificado por Astler-Coller.
8
1.4. Fatores de risco associados com o câncer colorretal
Diferentes cânceres têm diferentes fatores de risco. No contexto geral, existem dois
tipos de fatores de risco, os comportamentais (estilo de vida) e os não comportamentais
(idade, gênero, histórico pessoal ou histórico familiar). Além disso, a interação gene-gene e
gene-fatores ambientais possuem uma influência significativa para a susceptibilidade do CCR.
1.4.1. Tabagismo
Estudos têm mostrado que o tabagismo aumenta o risco de adenomas colônicos e de
CCR (JACOBSON et al., 1994). O principal agente carcinogênico encontrado na fumaça do
cigarro são as aminas aromáticas, nitrosaminas, aminas heterocíclicas e hidrocarbonetos
aromáticos policíclicos (DURKO; MALECKA-PANAS, 2014). Essas substâncias são
metabolizadas pelo citocromo P450, podendo levar a mutações no DNA, principalmente nos
genes KRAS, BRAF e MYC (LEUFKENS et al., 2011).
As nitrosaminas têm a habilidade de ativar e ligar-se aos receptores nicotínicos de
acetilcolina, que resultam no aumento intracelular da concentração de espécies reativas de
oxigênio. O estresse oxidativo leva a ativação da via inflamatória do NFKB e COX-2 e
também promove a sinalização da cascata proliferativa pela via MAPK (YE et al., 2004).
Não existem dúvidas de que evitar o tabagismo diminui o risco de CCR e de outras
neoplasias, além também de prevenir o desenvolvimento de doenças (DURKO; MALECKAPANAS, 2014).
1.4.2. Etilismo
O risco de adenomas e CCR também estão associados com o consumo de bebida
alcoólica. Cho e colaboradores (2004) observaram que o consumo superior a 30 g/dia de
etanol resulta em um risco de 1,16 vezes de desenvolver CCR, enquanto que o consumo
superior a 45 g/dia de etanol aumenta o risco para 1,41 vezes. Em estudo in vitro, realizado
por Blasiak e colaboradores (2000), foi observado que os danos causados no DNA pelos
metabólitos do álcool aumentam com o aumento da dose.
Esses dados são explicados pelo metabolismo do álcool, o qual é baseado
principalmente na catálise e oxidação pelo álcool desidrogenase, catalase e citocromo P450,
resultando na formação do acetaldeído, que é um carcinógeno de primeira classe e é o
responsável por ocasionar dano no cromossomo (HAAS; YE; LÖHR, 2012).
9
Além disso, o consumo de álcool em longo prazo diminui a absorção de vitaminas do
complexo B (B1, B2,B12 e ácido fólico), o que causa o aumento da vulnerabilidade celular ao
estresse oxidativo (HAAS; YE; LÖHR, 2012). Esse aumento da concentração de espécies
reativas de oxigênio induz a cascata do NADPH oxidase, levando a ativação da via do
PI3K/AKT e do VEGF, que são responsáveis por promover a proliferação e metástase
(JACOBSON et al., 1994).
O álcool também inibe a expressão da enzima citocromo P450 2E1, que está envolvida
na síntese da vitamina A; e a baixa concentração desta vitamina resulta na diminuição da
expressão da proteína ativadora 1 - um fator de transcrição que controla a diferenciação e
proliferação celular (HAAS; YE; LÖHR, 2012). Pelos motivos expostos, recomenda-se uma
redução no consumo de bebidas alcoólicas, para reduzir o risco de desenvolvimento do CCR.
1.4.3. Sedentarismo
Muitas doenças crônicas, incluindo as cardiovasculares, pulmonares, doenças
musculoesqueléticas, diabetes tipo 2 e vários tipos de cânceres estão associados com uma
atividade física insuficiente (KUMOR et al., 2009). O mecanismo chave que explica sua
função no risco foca na diminuição da sensibilidade a insulina, no aumento da concentração
sérica de insulina, no aumento da massa corpórea e no aumento do volume do tecido adiposo,
o que leva a indução da inflamação crônica (HANDSCHIN; SPIEGELMAN, 2008). Outro
mecanismo está associado ao papel do hormônio leptina, produzido pelas células adiposas,
que induz a sinalização de vias proliferativas através da ativação das capases MAPK (Proteína
quinase ativada por mitogêno) e PI3K/AKT (Fosfoinositida 3-quinase).
A diretriz do Instituto Americano de Pesquisa em Câncer recomenda uma atividade de
60 minutos com uma intensidade moderada ou 30 minutos de atividades diárias de elevada
intensidade como medida preventiva (WISEMAN, 2008).
1.4.4. Sobrepeso ou obesidade
Muitos estudos têm indicado que o sobrepeso e a obesidade são fatores de risco para
diversos tipos de neoplasia (NAM et al., 2010; RENEHAN et al., 2008) e, segundo a Diretriz
Brasileira de Obesidade de 2016, esta classificação é feita utilizando o Índice de Massa
Corpórea (IMC). Indivíduos cujo IMC é ≥ 25 são classificados como sobrepesos e os que o
IMC é ≥ 30 são classificados como obesos. Além disso, avaliação combinada desse parâmetro
com a circunferência abdominal possibilita uma melhor análise antropométrica e identificar os
10
riscos nutricionais (BITES; OLIVEIRA; FORTES, 2012), sendo os indivíduos que possuem a
circunferência ≥ 94 cm (Homens) e ≥ 80 cm (Mulheres) têm uma elevada condensação de
gordura visceral.
O tecido adiposo é considerado como um órgão metabolicamente ativo, liberando
diversos hormônios e citocinas, estimulando as células T a promoverem uma inflamação
crônica de baixa-intensidade e também a resistência à insulina (GUTIERREZ; PUGLISI;
HASTY, 2009).
A secreção de hormônios produzidos pelo tecido adiposo, como leptina, adiponectina
e resistina, também contribuem para o desenvolvimento do quadro inflamatório e da
carcinogênese (BOOTH et al., 2002; KUMOR et al., 2009). Além disso, o aumento da
concentração sérica dos triglicerídeos em indivíduos obesos aumenta ainda mais a produção
destes hormônios, o que acentua o risco de carcinogênese (CHAVEZ; SUMMERS, 2010).
Apesar do mecanismo que aumenta a incidência de câncer em indivíduos obesos não
estar completamente esclarecido (DURKO; MALECKA-PANAS, 2014), sugere-se que a
redução da massa corpórea diminui a inflamação crônica, a intolerância à glicose, a
dislipidemia, podendo impactar da incidência do CCR.
1.4.5. Hábitos Alimentares
Os fatores alimentares, como dieta com predominância de carne vermelha, processada
e com baixa ingestão de fibras, vêm tendo um importante papel no aumento da incidência do
CCR registrados nos países (DERRY et al., 2013).
Uma dieta rica em carne vermelha também já foi associada com o aumento do risco de
desenvolver CCR (CHAN et al., 2011), isso pode ser explicado pelo aumento da ingestão de
ferro heme, o qual é encontrado em elevadas concentrações nas carnes vermelhas (DURKO;
MALECKA-PANAS, 2014). O ferro heme é degradado no intestino delgado por enzimas
heme oxidase 1, liberando o íon ferroso (ISHIKAWA et al., 2010).
O ferro promove a produção de espécies reativas de oxigênio, especialmente o
peróxido de hidrogênio, que induz mutações genéticas e a expressão de diversas citocinas (IL6, IL-8, TNFα, NF-κB), levando ao aumento da citotoxicidade e estimulação da resposta
inflamatória (KNÖBEL et al., 2007).
O modo de preparo da carne vermelha processada, especialmente frita ou grelhada em
elevadas temperaturas, também foi associado com o risco de CCR (DURKO; MALECKAPANAS, 2014), devido a degradação da creatinina muscular e de aminoácidos, resultando na
11
formação de numerosas aminas heterocíclicas carcinogênicas (MARTÍNEZ et al., 2007;
SUGIMURA et al., 2004).
Uma dieta rica em fibra consiste principalmente de vegetais, frutas e grãos. A presença
destes componentes em refeições contribui para diminuir o tempo de trânsito no trato
gastrointestinal, a diluição do conteúdo colônico e a melhoria da fermentação bacteriana, o
que leva ao aumento da produção de ácidos graxos de cadeia curta (acetato, propionato e
butirato) (SCHARLAU et al., 2009).
A fibra dietética também possui ação antiinflamatória, diminuindo a produção de IL-6,
TNF-alfa e COX-2, além de induzir a expressão do iNOS (KACZMARCZYK; MILLER;
FREUND, 2012; REDDY et al., 2000). Os ácidos graxos de cadeia curta interferem em várias
regulações do ciclo celular, proliferação e apoptose, tais como nos genes: beta-catenina; p53;
p21; Bax e caspase 3 (FEREGRINO-PÉREZ et al., 2008).
Uma dieta pobre em vitaminas do complexo B pode impactar no reparo e na metilação
do DNA, devido a sua função na síntese do DNA (POWERS, 2005). Tem sido evidenciado
que baixa concentrações séricas de folato podem aumentar a capacidade de invasão das
células cancerígenas através da ativação da via de sinalização Hedgehog Shh, por
hipometilação, e a estimulação da via do NFKB (WANG et al., 2012). Entretanto, essa
associação é apenas para a ingestão de ácido fólico na dieta natural e não para a sua
suplementação farmacológica (GIOVANNUCCI, 2002).
1.4.6. Gênero
A exposição ao estrogênio tem sido reconhecida como um fator de risco para o
desenvolvimento de diversos tipos de cânceres (CAVALIERI; ROGAN, 2014). O estrogênio
contém um anel benzeno na sua estrutura, o benzeno e os hidrocarbonetos aromáticos cíclicos
são eletrofílicos (CAVALIERI; ROGAN, 2010). Essa estrutura permite que eles reajam
covalentemente com grupos nucleofílicos do DNA, RNA e proteína (MILLER; MILLER,
1966, 1981a, 1981b).
Os estrogênios são metabolizados para uma ortoquinona eletrofílica que pode reagir
no DNA formando adutos na posição N-3 da adenina e N-7 da guanina (CAVALIERI;
ROGAN, 2010). Entretanto, a formação destes adutos na adenina e guanina desestabiliza a
ligação glicosil e subsequentemente há a depurinação do aduto, onde a desoxirribose é clivada
e forma o sítio apurínico (LI et al., 2004; SAEED; ROGAN; CAVALIERI, 2009; STACK et
al., 1996). Pelos motivos expostos, o mecanismo de inicialização do câncer pelo estrógeno
12
tem sido esclarecedor para a prevalência no gênero feminino para alguns tipos de cânceres
(CAVALIERI; ROGAN, 2014).
1.4.7. Idade
A exposição de agentes extrínsecos ou intrínsecos pode levar ao acúmulo de danos no
genoma. Estes danos podem possuir mutações pontuais, translocações, perda ou ganho de
cromossomos, encurtamento dos telômeros ou pela integração do material genético do vírus.
Para minimizar essas lesões, os organismos evoluíram uma complexa rede de mecanismo de
reparo do DNA que são coletivamente capazes de lidar com a maior parte do dano causado ao
DNA (LORD; ASHWORTH, 2012). O envelhecimento pode alterar as defesas antitumorais,
fazendo pessoas mais velhas serem as mais vulneráveis ao desenvolvimento de neoplasias
malignas (LÓPEZ-OTÍN et al., 2013; YANCIK; RIES, 1994).
1.4.8. Histórico pessoal de pólipo e doença inflamatória no intestino
Os indivíduos que possuem histórico pessoal de pólipos adenomatosos, principalmente
os grandes ou se teve um grande número de pólipos, além dos que já foram diagnosticados
com CCR, mesmo que tenham removido completamente o tumor, possuem um alto risco de
desenvolver CCR. As chances disso acontecer são maiores se o indivíduo for diagnosticado
com CCR quando mais jovem (ACS, 2016).
As doenças inflamatórias no intestino são um fator de risco bem conhecido para o
desenvolvimento de displasia e carcinoma. A principal hipótese é a liberação de fatores de
crescimento e citocinas que modulam o meio inflamatório no tecido tumoral (MAGER et al.,
2016).
Em síntese, destacam-se duas principais vias inflamatórias que são funcionalmente
diferentes: a via inflamatória que conduz a atividade antitumoral para inibir o
desenvolvimento do tumor (MLECNIK et al., 2014; REISSFELDER et al., 2015); e um
conjunto de citocinas que desencadeiam um processo inflamatório crônico, favorecendo a
carcinogênese (GRIVENNIKOV et al., 2012), Figura 04.
13
Figura 04 – Conjuntos de citocinas envolvidas no processo de carcinogênese.
Citocinas expressas no tumor e/ou estroma celular com propriedades antitumoral, pró-tumoral
ou ambas as atividades. Fonte: Mager e colaboradores (2016).
As lesões displásicas, nos pacientes com doença inflamatória crônica, podem ser
planas (ou seja, endoscopicamente invisíveis) ou ter projeções para o lúmem (FLEMING et
al., 2012). Além disso, as lesões proeminentes são de difícil ou impossível distinção dos
adenomas esporádicos (FLEMING et al., 2012). O equilíbrio entre estas duas vias
inflamatórias dentro do estroma tumoral determina o curso do desenvolvimento de CCR e são
alvos de estudos para o diagnóstico e abordagens terapêuticas (MAGER et al., 2016).
1.4.9. Histórico familiar de pólipos e câncer colorretal
O CCR é tradicionalmente dividido em casos esporádicos e familiar, onde 20 – 25%
dos casos de CCR são diagnosticados como familiar (DE LA CHAPELLE, 2004). O câncer,
por ter um componente hereditário, é causado por mutações em células germinativas, as quais
são herdadas geneticamente, contribuindo para a iniciação do processo de carcinogênese
(JOHNS; HOULSTON, 2001). Esse risco torna-se maior se o familiar foi diagnosticado
quando com uma idade inferior a 45 anos, ou se mais de um parente de primeiro grau foi
acometido pela enfermidade (ACS, 2016; WHIFFIN; HOULSTON, 2014).
As primeiras evidências da transmissão Mendeliana no CCR foram reportadas em
estudos realizados com grandes famílias (WHIFFIN; HOULSTON, 2014); e mostraram que
14
mutações de alta penetrância conferem a predisposição ao CCR, principalmente para a
Síndrome de Lynch (genes MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2), a Síndrome de Polipose Juvenil
(genes SMAD4 e BMPR1A), a Síndrome Peutz-Jeghers (gene STK11) e na Polipose
Adenomatosa Familiar (gene APC) (BOSMAN; WHO; IARC, 2010; WHIFFIN;
HOULSTON, 2014). Entretanto, essas condições representam menos do que 5% de todos os
casos de CCR (PETERS; BIEN; ZUBAIR, 2015).
A susceptibilidade herdada para o CCR, após a exclusão dos genes de alto risco
conhecidos, sugere que a maior parte desta susceptibilidade provavelmente seja poligênica
com a codominância de variantes genéticas múltiplas, cada uma com um efeito individual
modesto que, quando combinadas, causa uma diversidade de risco na população (WHIFFIN;
HOULSTON, 2014).
A identificação de mais mutações, tanto de baixa quanto de alta penetrância,
contribuem significativamente para o entendimento do processo molecular que ocorre no
câncer, o que facilita as estratégias de prevenção, diagnóstico e o desenvolvimento de alvos
terapêuticos (DE LA CHAPELLE, 2004).
1.4.10. Contribuição étnica
Outro fator relatado como associado com o risco de desenvolver o CCR são os grupos
étnicos populacionais, no qual foi evidenciado através da diferença incidência de CCR na
população afro-americana em relação aos outros grupos étnicos nos EUA (ACS, 2016). A
causa desta diferença epidemiológica não está totalmente esclarecida, e estudos vêm focando
o fator socioeconômico como a principal causa (GUINDALINI et al., 2015; RICHARDS;
REKER, 2002). Entretanto, alguns outros estudos sugerem que isto possa não ser totalmente
verdade (IOANNOU; CHAPKO; DOMINITZ, 2003; SWAN et al., 2003). Um crescente
número de evidências vem dando suporte aos fatores biológicos como um importante papel
nesta discrepância (KUPFER; BURKE, 2014), destacando-se a diferença na susceptibilidade
genética (KUPFER et al., 2010, 2014) entre estes grupos populacionais.
O trabalho de Sameer e colaboradores (2011), os quais realizaram um estudo do tipo
caso-controle na população de Kashmir, região noroeste do Sul da Ásia, associaram o
polimorfismo no CYP2E1 com o risco de desenvolver o CCR (86 casos e 160 controles).
Contudo, Silva e colaboradores (2012) realizaram o mesmo modelo de estudo na população
do estado de São Paulo e não encontraram diferença significativa na frequência do genótipo
entre o grupo caso-controle (131 casos e 206 controles). Essa divergência demonstra o
15
impacto que diversos polimorfismos possuem em diferentes populações étnicas, por
apresentarem frequências e influências genéticas diferentes (CHONG et al., 2014).
Essa teoria é reforçada com os estudos realizados por Cassiano et al. (2015) e Amador
et al. (2016), no qual avaliaram a influência que a ancestralidade genômica tem sobre a
distribuição dos polimorfismos na população miscigenada, mostrando a importância de
investigar a frequência das variantes polimórficas em diferentes regiões da população
brasileira.
1.5. Genes candidatos
Os genes listados na Figura 5 apresentam potencial atividade em vias que contribuem
para o processo de carcinogênese, sendo importante investigar as suas variações genéticas
com o risco de desenvolver o câncer, na resposta ao tratamento e até mesmo no prognóstico,
para melhor entender o processo de patogênese do CCR.
Figura 5 – Potenciais genes que influenciam nas 10 características do câncer (do inglês,
Hallmarkers of cancer). 1 – Sustentável sinalização proliferativa; 2 – Evasão da sinalização
para a supressão tumoral; 3 – Evasão da destruição pelo sistema imune; 4 – Potencial
replicativo ilimitado; 5 – Promoção de processo inflamatório; 6 – Invasão e metástase celular;
7 – Indução da angiogênese; 8 – Instabilidade genômica; 9 – Resistência a sinalização da
apoptose; e 10 – Desregulação energética na célula. Fonte: Hanahan e Weinberg (2011).
Imagem adaptada pelo autor.
16
1.5.1. UCP2
O gene da Proteína Desacoplada a Mitocôndria do tipo 2 (UCP2) [HGNC: 12518,
Entrez Gene: 7351, Ensembl: ENSG00000175567, OMIM: 601693, UniProtKB: P55851] está
localizado na região genômica 11q13.4. As UCP são membros de uma grande família de
proteínas carreadoras de ânions da mitocôndria, facilitando a transferência de ânions tanto do
interior da mitocôndria para o exterior quanto o inverso.
Funcionalmente, este gene vem sendo associado com doenças relacionadas à
obesidade (DE OLIVEIRA et al., 2016; PHEIFFER et al., 2016) e doenças cardiovasculares
(RUBATTU et al., 2015). Ele também está associado no processo de resposta ao estímulo à
hormônios como a insulina (GIRALT; VILLARROYA, 2016; NESSA; RAHMAN;
HUSSAIN, 2016), a hipóxia (VARELA; SCHWARTZ; HORVATH, 2016) e superóxido.
Além disso, o aumento na expressão do UCP2 está associado com diferentes tipos de câncer
(DALLA POZZA et al., 2012; LEE et al., 2005; QIAO et al., 2015), assim como o CCR em
humanos (DERDÁK et al., 2006).
Kuai e Zhang (2010) observaram que o aumento da expressão do UCP2 pode
influenciar na agressividade do tumor e na metástase. Isto se deve ao mecanismo adaptativo
para reduzir a geração de espécie reativa de oxigênio (DERDAK; GARCIA; BAFFY, 2009),
protegendo a célula cancerosa da via apoptótica (FÜLÖP et al., 2006). Em estudo realizado
por Hu e colaboradores (2013) concluiu que mutação na região promotora (rs659366, C/T),
quando associado com o consumo de carne vermelha, pode contribuir para o risco de CCR.
1.5.2. ACE
O gene da Enzima Conversora de Angiotensina do Tipo I (ACE) [HGNC: 2707,
Entrez Gene: 1636, Ensembl: ENSG00000159640, OMIM: 106180, UniProtKB: P12821] está
localizado na região genômica 17q23.3. A sua proteína encontra-se localizada nos lissosomos,
nos endossomos, na membrana plasmática e no espaço extracelular.
A ACE é uma enzima que está envolvida na catálise da conversão da angiotensina I na
sua forma fisiologicamente ativa, angiotensina II, tendo um papel importante no sistema
renina-angiotensina. Este gene está relacionado com a patogênese de diversos cânceres, como
o de pulmão (NACAK et al., 2010), mama (HAIMAN et al., 2003), próstata (YIGIT et al.,
2007), gástrico (SUGIMOTO et al., 2006) e o oral (VAIRAKTARIS et al., 2007). Além
disso, a expressão deste gene pode afetar a proliferação celular do tumor, a migração,
angiogênese e a metástase (RÖCKEN et al., 2005). Estudos epidemiológicos realizados por
17
Vairaktaris e colaboradores (2007) corroboram com estes achados, indicando que a inibição
do ACE pode diminuir o risco do câncer.
Zhou e Lin (2015) realizou um estudo do tipo de meta-análise que avaliou a
susceptibilidade do polimorfismo do tipo inserção e deleção (INDEL) no íntron 16 deste gene
(rs4646994, 247 pb sequência Alu) na população da Grécia, da Alemanha e da China.
Contudo, esse polimorfismo não foi associado com o risco de CCR e sugeriram que mais
estudos devem ser realizados em outros grupos populacionais para confirmar os achados,
além de avaliar a interação entre gene-gene e gene-fatores ambientais.
1.5.3. CASP8
O gene da Caspase 8 (CASP8) [HGNC: 1509, Entrez Gene: 841, Ensembl:
ENSG00000064012, OMIM: 601763, UniProtKB: Q14790] está localizado na região
genômica 2q33.1. A sua proteína encontra-se localizada no citoplasma, no interior do núcleo e
da mitocôndria. A CASP8 é membro da família de protease de cisteina e ácido aspártico e está
envolvida no processo de morte celular induzida por Fas e outros estímulos apoptótico.
Funcionalmente, diversas doenças, como o câncer, estão associadas com este gene. A
INDEL de 6 pb na região promotora (rs3834129) impossibilita a ligação com uma proteína
estimuladora e reduz a expressão da CASP8, resultando na diminuição da reatividade dos
linfócitos T a apoptose, após a estimulação por células cancerosas (SUN et al., 2007). Por
isso, é biologicamente razoável supor uma relação de potencial entre este polimorfismo e o
câncer (PENG et al., 2014).
Peng et al. (2014) realizou um estudo do tipo meta-análise na população da Grécia, da
China e do Reino Unido, em que avaliou a associação do INDEL rs3834129 com a
susceptibilidade ao CCR. Eles observaram que a deleção nesta região pode ter um papel
protetor na susceptibilidade da população asiática.
No entanto, os resultados deste estudo são inconsistentes com o que foi reportado no
estudo do tipo caso-controle por Theodoropoulos e colaboradores (2011), na Grécia (402
casos e 480 controle), e por Pittman e colaboradores (2008), no Reino Unido (4016 casos e
3749 controles). Esses resultados sugerem que este polimorfismo, quando combinado com
fatores dietéticos, pode estar associado com o desenvolvimento de CRC (WU et al., 2013).
18
1.5.4. XRCC1
O gene da Proteína de Reparo de Complemento Cruzado do Tipo 1 (XRCC1) [HGNC:
12828, Entrez Gene: 7515, Ensembl: ENSG00000073050, OMIM: 194360, UniProtKB:
P18887] está localizado na região genômica 19q13.2. A sua proteína encontra-se localizada
no interior do núcleo.
O XRCC1 está envolvido na eficiência do reparo do DNA quebrado em fita simples
pela exposição dos íons de radiação e agentes alquilantes. Essa proteína interage com a DNA
ligase III, polimerase beta e outras polimerase para participar no processo de reparo. Sua
ativação ocorre durante o processo de meiose e de recombinação nas células germinativas.
Em células de mamíferos, quatro diferentes mecanismos de reparo do DNA têm sido
identificados: reparo por excisão de bases, reparo por excisão de nucleotídeos, reparo de
incompatibilidade (do inglês, mismatch) e reparo para reversão de danos/rupturas na fita dupla
(CHRISTMANN et al., 2003; YU et al., 1999). Todas estas vias são estritamente reguladas
para a manutenção da integridade do genoma e modular a capacidade do reparo na resposta ao
dano no DNA (NACCARATI et al., 2007).
Mutações neste gene podem prejudicar na eficiência da atividade de reparo do DNA
(SIEWCHAISAKUL et al., 2016), resultando no aumento da instabilidade genética (DE
BOER, 2002) e no aumento da susceptibilidade ao CCR quando associado com fatores
ambientais (HUANG et al., 2015).
1.5.5. TYMS
O gene Timidilato Sintase (TYMS) [HGNC: 12441, Entrez Gene: 7298, Ensembl:
ENSG00000176890, OMIM: 188350 e UniProtKB: P04818] está localizado na região
genômica 18p11.32. A sua proteína encontra-se localizada em toda a célula, concentrando-se
no núcleo e na mitocôndria. Esta enzima tem um papel chave no metabolismo do ácido fólico
e catalisa o metabolismo do desoxiuridina à timina, usando o 5,10-metilenotetrahidrofolato
como cofator. Esta função mantém o monofosfato de timidina-5-prime (dTMP) numa
concentração crítica para a replicação e reparo do DNA (ZHOU et al., 2012).
O aumento da expressão do TYMS induz a transformação de células a um fenótipo
maligno, em cultura in vitro (RAHMAN et al., 2004). Além disso, polimorfismos funcionais
neste gene pode afetar a resposta do paciente a monoterapia com Fluoracil (CASTILLOFERNÁNDEZ et al., 2010).
19
Zhou e colaboradores (2012) realizou uma revisão sistemática para avaliar a
associação entre dois polimorfismos no TYMS com o risco de ter câncer (rs151264360 e
rs183205964). Eles observaram que 2 Repetição de 28 bp (VNTR, rs183205964) na região 5'UTR possa estar associada com o aumento do risco de câncer gastresofágico na população
asiática, e pode promover um efeito protetor contra o CCR na população caucasiana. Eles
também observaram que a inserção de 6 pb (rs151264360) na região 3'-UTR pode estar
associada com a susceptibilidade no câncer de mama nos Asiáticos (ZHOU et al., 2012).
Na meta-análise realizada por Wang e colaboradores (2014) destes mesmos
polimorfismos na susceptibilidade ao CCR, foi evidenciado que, no geral, estas variações
polimórficas não tinham associação com o CCR. Entretanto, quando estratificado por grupos
étnicos, foi encontrado associação apenas para o rs183205964 na população caucasiana
(WANG et al., 2014c).
1.5.6. SGSM3
O gene da Pequena Proteína G Moduladora de Sinalização do Tipo 3 (SGSM3)
[HGNC: 25228, Entrez Gene: 27352, Ensembl: ENSG00000100359, OMIM: 610440,
UniProtKB: Q96HU1] está localizado na região genômica 22q13.1. A sua proteína encontrase localizada no citoplasma celular.
O SGSM3 está envolvido na atividade GTPase e tem o papel de suprimir o
crescimento celular mediado por NF2 (Merlin), componente chave da via de sinalização da
Hippo. A via de sinalização Hippo está envolvida em restringir a proliferação celular e
promover a apoptose.
Como muitos cânceres são marcados pela divisão celular não controlada, esta via de
sinalização tornou-se cada vez mais importante no estudo do câncer (HALDER; JOHNSON,
2011; HARVEY; TAPON, 2007; PAN, 2010). Todavia, até o presente momento, este gene foi
associado
com
o
câncer
hepático
(WANG
et
al.,
2014b)
e
o
de
mama
(NOURASHRAFEDDIN et al., 2015; TAN; ZHANG; SUN, 2016), não há estudos de
associação com o CCR.
1.5.7. HLAG
O gene do Complexo de Histocompatibilidade Marjoritária de Classe I do Tipo G
(HLAG) [HGNC: 4964, Entrez Gene: 3135, Ensembl: ENSG00000204632, OMIM: 142871,
20
UniProtKB: P17693] está localizado na região genômica 6p22.1. A sua proteína encontra-se
localizada no endossomo, no aparelho de golgi e no retículo endoplasmático.
O HLAG, assim como os outros HLA de classe I, é um heterodímero que contém uma
cadeia pesada e uma cadeia leve (microglobulina beta-2). A cadeia pesada está ancorada na
membrana plasmática.
Nove alterações situadas em regiões que afetam a degradação, a estabilidade e o
splicing do mRNA (HVIID et al., 2003; LARSEN; HVIID, 2009); e três destas variantes
genéticas estão associados com a regulação transcricional e pós-transcricional do HLAG
(CASTELLI et al., 2014; PORTO et al., 2015). Em particular, a INDEL de 14 pb na posição
+2960 (rs371194629) influencia na estabilidade do mRNA e é a mais estudada (GARZIERA
et al., 2015). A deleção de 14 pb promove uma maior estabilidade no mRNA, causando uma
maior expressão da proteína (HVIID et al., 2003).
Sugere-se que as células tumorais podem escapar ao reconhecimento do sistema
imunológico pela expressão do gene HLAG, o que explica o porquê que a expressão desta
molécula está associada com um mau prognóstico do paciente com CCR (GARZIERA;
TOFFOLI, 2014; GARZIERA et al., 2015; GUO et al., 2015; YE et al., 2007; ZEESTRATEN
et al., 2014) e têm sido reportado que polimorfismos neste gene também podem afetar na
susceptibilidade ao câncer hepático, de mama, de tireoide, dentre outros (DIAS et al., 2015).
Entretanto, ainda não há estudos no contexto do CCR (DIAS et al., 2015).
1.5.8. IL1A
O gene da Interleucina 1 Alfa (IL1A) [HGNC: 5991, Entrez Gene: 3552, Ensembl:
ENSG00000115008, OMIM: 147760, UniProtKB: P01583] está localizado na região
genômica 2q14.1. A sua proteína localiza-se no citoplasma e no espaço extracelular.
A IL1A é uma citocina pleiotropica envolvida em várias respostas imunes, no
processo inflamatório e na hematopoese. Essa citocina é produzida pelos monócitos e
macrófagos, sendo liberada durante uma resposta à injúria celular e então induzindo a
apoptose. Além disso, a inflamação crônica causada pelo aumento da expressão do IL1A pode
induzir a divisão celular, aumentando a possibilidade de erros na replicação, de um reparo
ineficaz no DNA e uma subsequente mutação no genoma (GAO et al., 2009; TRABERT et
al., 2014).
Estudos têm mostrado que polimorfismos na região 3'-UTR pode alterar a regulação
pós-transcricional deste gene, influenciando no risco de desenvolver câncer (CHIN et al.,
21
2008; GAO et al., 2009; JAZDZEWSKI et al., 2008; LANDI et al., 2008, 2011; LI et al.,
2013). Diversos grupos vêm investigando a relação entre o INDEL de 4 pb na região 3'-UTR
(rs3783553) no câncer hepático (DU et al., 2014; WANG et al., 2014a), no câncer
nasofaríngea (YANG et al., 2011), no câncer gástrico (ZENG; LI; LI, 2014), no câncer
tireoidiano papilífero (GAO et al., 2014), no câncer cervical (PU et al., 2014), no câncer
epitélio ovariano (ZHANG et al., 2014) e CCR (YAN et al., 2015).
Yang e colaboradores (2015) foi o primeiro estudo que avaliou o efeito do INDEL de
4 pb na região 3'-UTR (rs3783553) no CCR. Eles realizaram um estudo do tipo caso-controle
(339 casos e 313 controles) em descendentes da população Han Chinesa. Entretanto, não
observaram diferença significativa entre o grupo caso e controle, enquanto que os outros
estudos que fizeram a associação do mesmo polimorfismo em outros cânceres observaram
que o homozigoto para inserção possui menos risco de desenvolver câncer. Estes achados
sugerem que o efeito do rs3783553 pode variar de acordo com o tipo de câncer (YAN et al.,
2015) e grupo étnico.
1.5.9. IL4
O gene da Interleucina 4 (IL4) [HGNC: 6014, Entrez Gene: 3565, Ensembl:
ENSG00000113520, OMIM: 147780, UniProtKB: P05112] está localizado na região
genômica 5q31.1. A sua proteína encontra-se localizada no espaço extracelular.
O IL4 é uma proeminente citocina antiinflamatória da resposta Th2 do sistema imune;
e a expressão desta citocina está aumentada nos eventos iniciais do desenvolvimento do CCR,
incluindo pólipos hiperplásicos, adenomas e adenomas serrilhados (MARSZAŁEK et al.,
2012).
O efeito que o IL4 pode estar favorecendo a proliferação celular do CCR foi
confirmado através da exposição de diversas linhagens celulares desta neoplasia em elevadas
concentrações de IL4, e, ao inibir a atividade do IL4 através de anticorpos, a proliferação
celular é inibida (KOLLER et al., 2010). Acredita-se que isso possa servir como mecanismo
de escape da resposta imune, a fim de promover a progressão do tumor (VOLONTÉ et al.,
2014).
A repetição de 70 pb (rs79071878) no íntron 3 pode influenciar na produção de sua
respectiva citocina, e tem sido associado com o câncer gástrico (BHAYAL et al., 2015) e
outras doenças inflamatórias (ANOVAZZI et al., 2010; CABANTOUS et al., 2009).
22
Entretanto, este é o primeiro estudo que indica uma associação entre o polimorfismo
rs79071878 e o risco de desenvolver CCR.
1.5.10. NFKB1
O gene Fator Nuclear Kappa B (NFKB1) [HGNC: 7794, Entrez Gene: 4790, Ensembl:
ENSG00000109320, OMIM: 164011, UniProtKB: P19838] está localizado no 4q24 e sua
proteína concentra-se no interior do núcleo, mas também pode ser encontrado no citoplasma
celular.
O NFKB é um regulador transcricional que é ativado por vários estímulos intra e
extracelulares, como as citocinas, radicais oxidantes livres, irradiação por ultravioleta e
produtos de bactérias e vírus. Quando ativado, o NFKB1 se transloca do citoplasma para o
núcleo e interage a sítios κB do DNA para regular a transcrição de genes relacionados com a
proliferação celular, diferenciação e apoptose (CERHAN et al., 2008; CHEN et al., 1999).
A ativação inapropriada do NFKB1 tem sido associada com diversas doenças
inflamatórias e resistência a sinais de apoptose (HUANG et al., 2005), enquanto que sua
persistente inibição pode levar ao desenvolvimento de células imunes inapropriadas ou no
atraso do desenvolvimento celular.
A deleção de 4 pb na região promotora do gene NFKB1 (rs28362491) foi associada
com a diminuição da transcrição do gene e com o aumento do risco de CCR entre a população
da Suécia (KARBAN et al., 2004) e da Malásia (MOHD SUZAIRI et al., 2013), mas não na
população Chinesa (LEWANDER et al., 2007).
Andersen e colaboradores (2010) avaliaram o efeito desta INDEL no risco de CCR e
investigaram a possível interação com o estilo de vida da população da Dinamarca (378 casos
e 756 controles). Nesse estudo, os pesquisadores observaram que indivíduos que são
portadores desta variante alélica, quando expostos a carne vermelha e processada, eram mais
susceptíveis ao CCR do que homozigotos para a inserção (ANDERSEN et al., 2010).
Entretanto, Kopp et al. (2015) não encontraram fortes associações na interação deste
polimorfismo com a dieta e o estilo de vida (915 casos e 1719 controles).
1.5.11 MDM2
O Gene da Oncoproteína MDM2 (MDM2) [HGNC: 6973, Entrez Gene: 4193,
Ensembl: ENSG00000135679, OMIM: 164785, UniProtKB: Q00987] está localizado na
23
região genômica 12q15. A sua proteína encontra-se concentrada, principalmente, no interior
do núcleo, podendo ser localizada no citoplasma celular.
O MDM2 é uma fosfoproteína nuclear que liga e inibe a ativação da proteína TP53,
como parte de um feedback negativo autoregulatório (HONDA; TANAKA; YASUDA, 1997;
JONES et al., 1995; LÉVEILLARD et al., 1998). O aumento da expressão do MDM2 pode
resultar em uma inativação excessiva da proteína TP53, diminuindo a função de suprimir o
tumor, afetando o ciclo celular e a apoptose (BROOKS; GU, 2006), além de estar fortemente
associado com o risco de CCR (BI et al., 2016).
Polimorfismos na região promotora (rs2279744, G/T) impacta significativamente
sobre o processo de carcinogênese, através da atenuação da função da p53 em estudos de
modelo animal (POST et al., 2010) e em humanos (BOND et al., 2004).
Além disso, a deleção de 40 pb na região promotora (rs3730485, INDEL) tem sido
associada com uma diminuição da transcrição do MDM2 em linhagens celulares (LALONDE
et al., 2012); e desequilíbrio de ligação desta INDEL é maior do que do rs2279744 (HU et al.,
2006). Alguns pequenos estudos tem avaliado o potencial efeito desta deleção com a
susceptibilidade ao câncer e foi reportado que esta mutação pode estar associada com o
aumento do risco de CCR (GANSMO et al., 2016), bem como de outros tipos de cânceres,
incluindo o hepático (DONG et al., 2012), de pulmão (HU et al., 2006), mama (MA et al.,
2006), ovário (KANG et al., 2009) e esôfago (MA et al., 2012) na população chinesa.
1.5.12. TP53
O gene da Supressor de Tumor p53 (TP53) [HGNC: 11998, Entrez Gene: 7157,
Ensembl: ENSG00000141510, OMIM: 191170, UniProtKB: P04637] está localizado na
região genômica 17q13.1. A sua proteína encontra-se localizada no citoplasma, no interior do
núcleo e na mitocôndria.
A TP53 responde a diversos estresses celulares para regular genes alvos que induzem
o ciclo celular, a apoptose, a senescência, o reparo do DNA e a mudanças do metabolismo
celular (MCLURE; TAKAGI; KASTAN, 2004; RILEY et al., 2008). A expressão da TP53 se
encontra aumentada em diversas linhas celulares transformadas, em relação a células normais,
o que leva a acreditar que está envolvido no processo de diferenciação celular e de
malignidade no câncer (BROSH; ROTTER, 2009; SUN et al., 2016).
Aproximadamente 100 variantes genéticas têm sido identificados na TP53 (listadas no
http://p53.iarc.fr) (GARRITANO et al., 2010), muitas das quais mostram uma variação na
24
frequência de acordo com a população e região geográfica. Existe evidência que rs17878362
pode influenciar a expressão da TP53 (GEMIGNANI et al., 2004) e no splicing alternativo do
mRNA deste gene (MARCEL et al., 2011).
O polimorfismo intrônico mais comum neste gene é a INDEL de 16 pb no intron 3
(rs17878362) (STACEY et al., 2011), tendo sido associado com o risco de desenvolver CCR
(GEMIGNANI et al., 2004; PERFUMO et al., 2006) e o câncer de mama (COSTA et al.,
2008; WANG-GOHRKE et al., 2002). Contudo, seus efeitos na susceptibilidade ao câncer
aparentam ser inconsistentes entre os estudos (HU et al., 2010a; LU et al., 2011; STACEY et
al., 2011; WHIBLEY; PHAROAH; HOLLSTEIN, 2009).
1.5.13. CYP2E1
O gene do Citocromo P450, Subfamília II E1 (CYP2E1) [HGNC: 2631, Entrez Gene:
1571, Ensembl: ENSG00000130649, OMIM: 124040, UniProtKB: P05181] está localizado
na região genômica 10q26.3. A sua proteína encontra-se localizada no retículo
endoplasmático. O CYP2E1 é uma monoxigenase que catalisa muitas reações envolvidas no
metabolismo de fármacos e síntese de colesterol, esteroides e N-nitrosaminas.
Polimorfismos que comprometem a atividade deste gene têm sido associados com o
processo de carcinogênese do CCR, principalmente quando ocorre próximo a região
promotora 5’-UTR (JIANG et al., 2013; NEAFSEY et al., 2009; POHL; SCINICARIELLO,
2011), especialmente a inserção de 96 pb (JIANG et al., 2013; QIAN et al., 2013). Porém, um
estudo do tipo caso-controle realizado no Brasil (131 casos e 206 controles) não observou
associação entre o INDEL de 96 pb com o aumento no risco de CCR (SILVA et al., 2012).
1.5.14. CYP19A1
O gene da Citocromo P450, Subfamília XIXA1 (CYP19A1) [HGNC: 2594, Entrez
Gene: 1588, Ensembl: ENSG00000137869, OMIM: 107910, UniProtKB: P11511] está
localizado na região genômica 15q21.2. A sua proteína encontra-se localizada no retículo
endoplasmático. A aromatase (CYP19A1) é uma monoxigenase que catalisa muitas reações
envolvidas no metabolismo de fármacos e síntese de colesterol e outros lipídeos. Além disso,
é a principal enzima na metabolização do estrogênio a estradiol (SATO et al., 2012), um dos
fatores que pode estar associado ao processo de carcinogênese (CHETRITE et al., 2000).
Mutações neste gene afetam a atividade da aromatase, o que pode refletir no
metabolismo do estradiol e, consequentemente, vem sendo associado com o processo de
25
carcinogênese (CHETRITE et al., 2000; SATO et al., 2012) e na sobrevida do paciente
(SLATTERY et al., 2011). Lin e colaboradores (2010) observaram, no estudo do tipo casocontrole (158 casos e 563 controle), que um polimorfismo no CYP19A1 está associado com o
risco de CCR.
1.5.15. UGT1A1
O gene UDP Glucuronosiltransferase 1A1 (UGT1A1) [HGNC: 12530, Entrez Gene:
54658, Ensembl: ENSG00000241635, OMIM: 191740, UniProtKB: P22309] está localizado
na região genômica 2q37.1. A sua proteína encontra-se localizada no retículo endoplasmático.
O UGT1A1 é uma glucuronidase que transforma pequenas moléculas de lipídeos, como o
estrogênio, aminas heterocíclicas e hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, em metabólitos
mais hidrossolúveis.
A presença de alguns polimorfismos neste gene já foi associada com o risco de
desenvolver CCR (TANG et al., 2005; VAN DER LOGT et al., 2004), sugerindo que
alterações genéticas no UGT1A1 podem modificar o metabolismo de alguns compostos
carcinogênicos (GIRARD et al., 2008). Além disso, alteração na expressão deste gene pode
levar a citoxicidade severa induzida pela fluoropirimidina (OTA et al., 2009), como o
fluorouracil (5-FU).
1.6. Variações genéticas do tipo inserção-deleção
O genoma humano contém um grande número de variações genéticas (IONITA-LAZA
et al., 2009; LANDER et al., 2001), como as inserções/deleções de um ou mais nucleotídeos
(INDEL), a variação no número de cópias (CNV, do inglês Copy-Number Variation) que
pode envolver uma sequência de DNA e polimorfismos em um único nucleotídeo (SNP, do
inglês Single Nucleotide Polymorphism), que é a substituição de um nucleotídeo na sequência
do DNA.
Os SNPs são as variações genéticas mais comuns e em estudos genéticos, podem ser
usados tanto como marcador genético quanto como fator genético funcional, além de afetar a
função do gene ou a expressão (SAVAS; LIU, 2009). Entretanto, estes SNPs não
necessariamente afetam as funções biológicas do organismo (SAVAS; LIU, 2009).
A segunda classe de variações genéticas mais comuns no genoma humano são as
INDELs, que resultam na alteração da sequência dos aminoácidos (do inglês, frameshit), e
quando presentes na região codificante, podem afetar a função da proteína e/ou a sua estrutura
26
(KHURANA et al., 2016; LIU et al., 2016). A presença desta variação genética pode também
impactar na regulação do gene, quando presente na região não-codificante (KHURANA et al.,
2016) (Tabela 3). Além disso, até o presente momento, um quarto de todas as doenças
Mendelianas estão associadas com INDELs (STENSON et al., 2003). Entretanto, sabemos
relativamente pouco sobre o impacto do INDEL sobre a biologia humana e na doença
(MILLS et al., 2011), especialmente na população miscigenada do Brasil. Assim, o
entendimento das INDELs é importante para determinar o perfil genético das variações
genômicas (MILLS et al., 2011) e detecção de mutações (BALL et al., 2005; IENGAR,
2012).
27
Tabela 3 – Potencial efeito biológico de mutações em diferentes regiões do gene.
Localização
Potencial efeito biológico
genética
Região Promotora Altera a expressão do gene
5'-UTR
3'-UTR
Exón codificante
Sítio de splice
Altera a expressão do gene e a
tradução proteica
Altera a expressão do gene e a
estabilidade do mRNA
Altera a função da proteína e a
estrutura
Altera a estabilidade do mRNA e
a função da proteína
Altera o splice do mRNA, a
estabilidade o mRNA e a função
da proteína
Fonte: SAVAS e LIU (2009)
Biologia por trás do efeito da
mutação
Altera a regulação do gene, como o
sítio de ligação do fator de
transcrição
Altera a regulação do gene, como a
estrutura cap
Altera a regulação do gene, como
modificar sítios de ligação dos
microRNAs
Altera a sequência de aminoácidos
da proteína
Altera a sequência do mRNA
Altera a sequência da região
codificante e a sequência de
aminoácidos da proteína
Altera a sequência do sítio de splice
consenso
Tendo em vista que poucos estudos avaliam o efeito das INDELs no risco de CCR na
população miscigenada, bem como a população Brasileira, faz-se importante avaliar se as
mutações listadas na Tabela 4 afetam no risco de CCR. Isso poderá ser útil no diagnóstico na
prática clínica, possibilitando um melhor prognóstico aos pacientes.
28
Tabela 4 – Lista das inserções-deleções analisadas no presente estudo e o local no gene
em que ela ocorre.
Gene
dbSNP ID
Variação pb
Região
ACE
rs4646994
289
Intron 16
CASP8
rs3834129
6
Promotora
SGSM3
rs56228771
4
3'-UTR
CYP2E1
96
Flanqueada a 5'-UTR
CYP19A1
rs11575899
3
Intron 4
HLAG
rs371194629
14
3'-UTR
IL1A
rs3783553
4
3'-UTR
IL4
rs79071878
70
Intron 3
MDM2
rs3730485
40
Promotora
NFKB1
rs28362491
4
Promotora
TP53
rs17878362
16
Intron 3
TP53
rs17880560
6
Flanqueada a 3'-UTR
TYMS
rs151264360
6
3'-UTR
UCP2
45
3'-UTR
UGT1A1
rs8175347
2
3'-UTR
XRCC1
rs3213239
4
Flanqueada a 5'-UTR
dbSNP ID = Código de registro da variação genotípica; pb = Pares de base.
29
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo principal
Determinar a associação de 16 INDEL, em genes envolvidos no processo de
carcinogênese, com o risco de desenvolver CCR na população do Rio Grande do Norte
(Região Nordeste do Brasil).
2.2. Objetivos específicos

Determinar a frequência alélica e genotípica dos polimorfismos investigados no
grupo caso e controle;

Estimar o perfil de ancestralidade dos indivíduos investigados por um painel
previamente desenvolvido com marcadores autossômicos;

Estimar o risco da variação alélica no diagnóstico de câncer colorretal.
30
3. METODOLOGIA
3.1. Comitê de Ética em Pesquisa
O presente projeto seguiu as diretrizes regulamentadas da pesquisa envolvendo seres
humanos que constam na resolução do Conselho Nacional de Saúde nº 196/96 e nº340/04 e
foi executado após aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Liga Norte-Riograndense
Contra o Câncer (CEP-LIGA), Anexo A.
Os indivíduos selecionados foram informados sobre o protocolo de estudo e somente
participaram aqueles que assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido e
responderam a um questionário (Apêndice A). As informações clínicas dos participantes do
grupo caso foram obtidas através do preenchimento de uma ficha (Apêndice B), através de
consultas ao prontuário.
3.2. Casuística
O presente estudo é do tipo caso-controle. Os participantes do grupo caso (n = 140)
foram diagnosticados com CCR e tratados na Liga Norte Riograndense Contra o Câncer (Rio
Grande do Norte - Natal). Eles foram recrutados entre os anos de 2012 e 2014. O grupo
controle (n = 140) é composto por doadores de sangue do serviço de hemoterapia (Hemovida,
Rio Grande do Norte - Natal) que não tiveram diagnóstico de câncer prévio. Eles foram
recrutados no ano de 2014.
3.3. Critérios de inclusão e exclusão
O grupo caso do estudo foi composto por indivíduos de ambos os sexos, com a idade
superior a 18 anos, com diagnóstico de CCR confirmado por biópsia. Foi excluído do estudo
indivíduos com diagnóstico prévio de qualquer outro tipo de neoplasia confirmado por
biópsia.
O grupo controle foi constituído por doadores de sangue que se autodeclararam livre
de câncer prévio, de ambos os sexos e idade acima de 18 anos. Foram excluídos do estudo
indivíduos que possuíam qualquer histórico pessoal de neoplasia.
3.4. Coletas das amostras
De todos os indivíduos selecionados para o estudo, foi coletado amostras de sangue
periférico (5 mL), utilizando sistema de coleta a vácuo em tubo com EDTA (1mg/mL de
31
sangue). As amostras obtidas do grupo caso foram coletadas no ambulatório da Liga NorteRiograndense Contra o Câncer e as amostras obtidas do grupo controle foram coletadas de
doadores de sangue do Hemovida.
3.5. Extração de DNA
A partir do sangue total conservado em EDTA, foi realizado o isolamento do material
genético utilizando o conjunto de reagente de extração de DNA QIAamp DNA Blood
(Qiagen), seguindo as orientações do fabricante. O processo de extração do DNA foi realizado
no Laboratório de Biologia Molecular (LABIOMOL) do Departamento de Análises Clínicas e
Toxicológicas, Faculdade de Farmácia - UFRN.
3.6. Avaliação da qualidade do DNA extraído
A quantificação do DNA obtido foi determinada por meio do fluorímetro Qubit® 2.0
Fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, EUA), a fim de se avaliar a concentração de ácidos
nucleicos não degradados.
A avaliação do grau de pureza foi feita através da relação 260/280 e 260/230, obtidos
por meio da absorbância do material genético (260 nm), da absorbância das proteínas (280
nm) e dos eventuais resíduos de solventes orgânicos que podem interferir na amplificação do
material genético (230 nm). Esses valores foram obtidos pelo equipamento NanoVue Plus™
UV/Visible Spectrophotometer (GE Healthcare Limited, Little Chalfont, UK).
A integridade do DNA foi avaliada através da análise de eletroforese em gel de
agarose a 0,8%, a 100 volts, 60 mA, no período de 20 minutos. O revelador utilizado foi o
GelRed™ Nucleic Acid Gel Stain, 10,000X in DMSO (Biotium Inc., Hayward, CA). A
análise da qualidade foi realizada no Laboratório de Biologia Molecular (LABIOMOL) do
Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Farmácia - UFRN.
3.7. Variáveis coletadas
As variáveis coletadas com a finalidade de descrição da amostra foram as abaixo
indicadas.
a) Variáveis demográficas e clínicas:
- Idade: agrupada em duas categorias (maior que 45 anos e menor ou igual a 45 anos).
Obtido com base na idade que o indivíduo possuía na data do diagnóstico.
- Gênero: masculino ou feminino.
32
- Etilismo: eventualmente, frequentemente ou nunca. Obtido por autodeclaração em
questionário.
- Tabagismo: atualmente, parou ou nunca. Obtido por autodeclaração em questionário.
- Atividade física: sim ou não. Obtido por autodeclaração em questionário.
- Localização do tumor: cólon ou retossigmóide. Definida pela descrição dos exames
de colonoscopia e anatomopatológico presente no prontuário médico. Considera-se reto o
segmento até 12 cm da margem anal.
- Recidivas: sim ou não. Definida pela descrição dos exames de colonoscopia e
anatomopatológico presente no prontuário médico. Considera-se recidiva como o
reaparecimento do tumor confirmado por métodos de diagnóstico por imagem, sendo local ou
não.
- Óbito: sim ou não. Definida pela descrição presente no prontuário médico.
b) Variáveis anatomopatológicas:
- Estadiamento TNM: utilizou-se a classificação TNM com base nos dados obtidos dos
laudos anatomopatológicos arquivados nos prontuários médicos. A classificação foi feita de
acordo com a última edição do TNM, proposta pelo American Joint Committe on Cancer
(AJCC). Para fins de análise estatística, optamos por agrupar cada componente que compõe o
Estadiamento TNM em duas categorias. T: T1-T2, T2-T3 e Tx; N: N0, N1-N2 e Nx; M: M0,
M1. O estádio do tumor foi agrupado em quatro categorias: Estádio I; Estádio II; Estádio III e
Estádio IV.
- Grau de diferenciação: utilizou-se a classificação padronizada no Departamento de
Anatomia Patológica da Liga Norte-Riograndense Câncer, que segue a classificação
preconizada por Broders (1925), adaptada para 4 categorias. Grau 1 - Bem diferenciado; Grau
2 - Moderadamente diferenciado, Grau 3 - Pouco diferenciado; Grau 4 - Indiferenciada. Para
fins de análise estatística, optamos por agrupar os graus 1,2 e 3,4 em duas categorias. Essa
variável foi obtida a partir da descrição dos laudos anatomopatológicos arquivados nos
prontuários médicos.
3.8. Genotipagem dos polimorfismos
A genotipagem das amostras foi realizada utilizando a técnica de PCR Multiplex para
amplificar os 16 marcadores (Tabela 5) investigados simultaneamente.
33
Tabela 5 – Lista dos polimorfismos analisados neste estudo, o seu dbSNP, conjunto de
iniciadores e tamanho do produto de PCR formado.
Gene [Var. pb]
dbSNP
Sequência dos iniciadores (5'...3')
Tam. do prod.
ACE [289]
rs4646994
F – ATCCTGTAAGCCACTGCTGGA
94–382 pb
R – GGCGAAACCACATAAAAGTGA
CASP8 [6]
rs3834129
F – CTCTTCAATGCTTCCTTGAGGT
249–255 pb
R– TGCATGCCAGGAGCTAAGTAT
SGSM3 [4]
rs56228771
F – CTAGTAGGCTCCTGGCCTCTTT
117–121 pb
R– CAGAACCTTGGACCTGAATAC
CYP2E1 [96]
F– GTCCCAATACAGTCACCTCTTT
397–493 pb
R– GGCTTTTATTTGTTTTGCATCTG
CYP19A1 [3]
rs11575899
F– TGCATGAGAAAGGCATCATATT
122–125 pb
R– AGGCACATTCATAGACAAAAA
HLAG [14]
rs371194629
F– TGTTTAAAGTGTCACCCCTCAC
192–206 pb
R – CAGTTCAGCATGAGGAAGAGG
IL1A [4]
rs3783553
F – TGGTCCAAGTTGTGCTTATCC
230–234 pb
R – ACAGTGGTCTCATGGTTGTCA
IL4 [70]
rs79071878
F – GGGTCAGTCTGGCTACTGTGT
217–287 pb
R – AAATCTGTTCACCTCAACTGC
MDM2 [40]
rs3730485
F – GGAAGTTTCCTTTCTGGTAGGC
192–232 pb
R – TTTGATGCGGTCTCATAAATTG
NFKB1 [4]
rs28362491
F – ATGGACCGCATGACTCTATCA
366–370 pb
R – GGCTCTGGCATCCTAGCAG
TP53 [16]
rs17878362
F – GGGACTGACTTTCTGCTCTTGT
148–164 pb
R– GGACTGTAGATGGGTGAAAAG
TP53 [6]
rs17880560
F – TCCATTCATAACTCAGGAACCA
135–141 pb
R – TTAAATCCCGTAATCCTTGGTG
TYMS [6]
213–219 pb
rs151264360*/ F– TCCAAACCAGAATACAGCACA
rs16430
R– TCAAATCTGAGGGAGCTGAGT
UCP2 [45]
F – CCCACACTGTCAAATGTCAACT
119–164 pb
R – CCATGCTTTCCTTTTCTTCCT
UGT1A1 [2]
rs8175347
F – CTCTGAAAGTGAACTCCCTGCT
135–137 pb
R – AGAGGTTCGCCCTCTCCTAT
XRCC1 [4]
rs3213239
F– AACCAGAATCCAAAAGTGACC
243–247 pb
R– GGGAAGAGAGAGAAGGAGAG
dbSNP = Registro da variação genética; Var. pb = Número de pares de bases que varia entre o
genótipo da inserção ou deleção. Tam. do Prod. = Tamanho do produto de amplificação; F =
Forward; R = Reverse; * = Registro atualizado da Inserção-Deleção, de acordo com o 1000
Genome.
A amplificação foi realizada no termocilador ABI Verity (Life Technologies, Foster
City, CA, USA). O assay de genotipagem da PCR utilizado foi o QIAGEN Multiplex-PCR kit
(QIAGEN), de acordo com a instrução do fabricante. As amostras foram incubadas a 95ºC
34
por 15 min, seguidos por 35 ciclos de 94ºC por 45 s, 60ºC por 90 s e 72ºC por 1 min, com a
extensão final de 70ºC por 30 min.
A análise do fragmento do produto da PCR foi realizada utilizando a técnica de
eletroforese por capilaridade, 1,0 μL do produto da PCR foi adicionado a 8,5 μL de
formamida altamente deionizada (HI-DI Formamide, Life Technologies) e 0,5 μL de
GeneScan 500 LIZ size standard (Life Technologies). Os fragmentos do DNA foram
separados utilizando o analisador genético ABI PRISM 3130 (Life Technologies) e analisado
utilizando o GeneMapper ID v.3.2 software (Life Technologies).
3.9. Análise da ancestralidade relativa por marcadores autossômicos
A ancestralidade relativa por marcadores autossômicos foi realizada de acordo com o
método descrito por Santos e colaboradores (2010), utilizando 48 marcadores autossômicos
informativo da ancestralidade (AIM, do inglês Ancestry Informative Markers) padronizados e
validados.
Os marcadores foram selecionados empregando duas principais características:
diferença significante na frequência alélica entre a população Africana, Europeia e/ou
Ameríndia (≥ 40%); e localizados em diferentes cromossomos; ou em regiões físicas
distantes, quando no mesmo cromossomo (SANTOS et al., 2010).
A estimação da ancestralidade parental das amostras foi realizada considerando três
populações parentais que foi avaliada por Santos e colaboradores (2010): Africana (da
Angola, República de Moçambique, República Democrática do Congo, República dos
Camerões e a Costa do Marfim), Europeia (principalmente Portugueses) e Nativos
Americanos (indivíduos de tribo indígenas da região Amazônica do Brasil).
A reação da PCR foi realizada utilizando o sistema multiplex, cada uma das reações
contém 16 pares de iniciadores fluorescentes. O produto de amplificação foi analisado por
eletroforese, utilizando o sequenciador automático ABI Prism 3130 sequencer e o
GeneMapper ID v.3.2 software. A sequência dos iniciadores, as condições de ciclagem da
PCR e as condições da eletroforese por capilaridade foi descrito por Santos e colaboradores
(2010). A proporção individual dos ancestrais genéticos foi estimada utilizando o
STRUCTURE v.2.3.3 software, assumindo a população Europeia, Africana e Ameríndia
como as ancestrais.
35
3.10. Análise estatística
Todas as análises estatísticas e gráficas foram realizadas utilizando o R package
v.3.1.2 (R DEVELOPMENT CORE TEAM, 2015). A comparação entre os participantes do
grupo caso e controle em relação às variáveis categóricas foram testadas utilizando o teste de
Qui-quadrado. As comparações feitas com variáveis contínuas foram realizadas utilizando o
teste não paramétrico de Mann-Whitney.
A análise de regressão logística foi realizada utilizando o SNPassoc package v.1.9-2,
para estimar a forma de associação entre cada variação genética e o CCR. O modelo genético
adotado para a análise foi o Modelo Aditivo, pois permite verificar a relação entre o alelo e o
risco de ter CCR, sem considerar nenhum tipo de dominância ou recessividade. Todos os
testes estatísticos foram baseados na probabilidade bicaudal e o valor de p considerado
significante foi 0,05.
36
4. RESULTADOS
4.1. Características demográficas e clínicas
O presente estudo contou com a participação de 140 indivíduos diagnosticados com
CCR e 140 indivíduos sem câncer. A tabela 6 mostra as características demográficas dos
participantes deste estudo. Os resultados mostraram uma diferença significativa entre os
grupos caso e controle em termos de idade, gênero, etilismo e tabagismo.
Tabela 6 – Características demográficas dos participantes.
Característica
Total n = 280 Casos n = 140 Controles n = 140 Valor de p
Idade (anos)
48 (21–93)
59 (23–93)
37 (21–81)
< 0,001
< 45
136 (48,7)
23 (16,5)
113 (80,7)
≥ 45
144 (51,3)
116 (83,5)
27 (19,3)
Gênero
< 0,001
Masculino
172 (61,6)
62 (44,6)
110 (78,6)
Feminino
108 (38,4)
78 (55,4)
30 (21,4)
Etilismo
< 0,001
Nunca
180 (65,1)
118 (85,5)
62 (44,9)
Consome/Consumiu
96 (34,9)
20 (14,5)
76 (55,1)
Eventualmente
56 (20,4)
11 (8,0)
45 (32,6)
Frequentemente
40 (14,5)
9 (6,5)
31 (22,5)
Tabagismo
< 0,001
Nunca
182 (65,4)
68 (48,9)
114 (82,0)
Consome/Consumiu
96 (24,6)
71 (48,1)
25 (18,0)
Parou
66 (23,8)
55 (39,6)
11 (7,9)
Ainda consome
30 (10,8)
16 (11,5)
14 (10,1)
Os dados categóricos estão representados por número absoluto de indivíduos (porcentagem) e
foi analisado pelo Teste de Qui-quadrado. Os dados contínuos estão representados por media
(mínimo – máximo) e foi analisado pelo Teste de Mann-Whitney. Valores de p considerados
significativos estão destacados em negritos. Idade = Idade no diagnóstico.
As características clínicas dos pacientes com CCR são listadas na Tabela 7. O sítio do
tumor em que houve uma maior prevalência no diagnóstico foi na região retossigmóide
(82,1%). Utilizando o sistema de classificação TNM, observou-se predominância de tumor no
Estádio III (29,3%).
37
Tabela 7 – Características clínicas dos pacientes com câncer colorretal no momento do
diagnóstico e o tempo de acompanhamento.
Característica
Casos n = 140
Localização do Tumor
25 (17,9)
Cólon
115 (82,1)
Retossigmóide
Grau de diferenciamento
130 (92,9)
G1, G2
10 (7,1)
G3, G4
Profundidade do tumor (T)
1 (0,7)
T1, T2
114 (81,4)
T3, T4
Tx
25 (17,9)
Comprometimento dos linfonodos (N)
72 (51,4)
N0
42 (30,0)
N1, N2
26 (18,6)
Nx
Metástase em órgão distante (M)
106 (75,7)
M0
11 (7,9)
M1
23 (16,4)
Mx
Estadiamento
28 (20,0)
I
38 (27,1)
II
41 (29,3)
III
11 (7,9)
IV
22 (15,7)
Desconhecido
Ano do diagnóstico
2012 (1996–2014)
Acompanhamento desde o diagnóstico (anos)
3 (1–19)
40 (28,6)
Recidivas, Sim
Tempo em que a recidiva foi diagnosticada após o diagnóstico (anos) 2 (1 – 8)
18 (12,86)
Óbito, Sim
4 (1 – 19)
Tempo em que o paciente foi a óbito após o diagnóstico (anos)
Os dados categóricos estão representados por número absolutos (porcentagem), e os dados
contínuos estão representados por mediana (mínimo – máximo). A classificação dos tumors
foi realizada seguindo o sistema de classificação do American Joint Committee on Cancer
(AJCC).
4.2. Contribuição da ancestralidade relativa por marcadores autossômicos
Em relação à ancestralidade relativa, foi observada diferença significativa na
distribuição da contribuição Africana entre os grupos (valor de p = 0,049), Tabela 8. Na
Figura 6, observa-se a diferença na contribuição Africana entre o grupo caso-controle.
38
Entretanto, ao ser realizado uma análise de regressão logística multinominal, não foi
encontrada diferença entre os grupos estudados (Tabela 9).
Tabela 8 – Distribuição da contribuição da ancestralidade relativa entre os grupos casos
e controles.
Contribuição (%)
Total n = 280
Casos n = 140 Controles n = 140 Valor de P
Européia
65,3 (13,3–92,4) 64,2 (23,6–92,4) 66,4 (13,3–92,3)
0,243
Ameríndia
16,2 (2,1–55,9)
16,0 (2,1–55,9)
16,3 (2,5–49,8)
0,645
Africana
18,5 (2,8–66,0)
19,8 (2,8–61,1)
17,3 (3,0–66,0)
0,049
Os dados contínuos estão representados por media (mínimo – máximo) e foi analisado pelo
Teste de Mann-Whitney. Valores de p considerados significativos estão destacados em
negritos.
Figura 6 – Gráfico de densidade e de boxplot das três populações parentais
contribuintes no perfil genético da população Brasileira (Europeia, Ameríndia e
Africana), estratificado em grupos caso e controle. O gráfico foi gerado utilizando a função
qplot do pacote ggplot2, no R.
39
Tabela 9 – Distribuição da contribuição da ancestralidade relativa entre os grupos casos
e controles estratificados a cada 10%.
Contribuição
Total
Caso
Controle
OR [IC 95%] Valor de p
(%)
n = 280
n = 140
n = 140
Europeia
95–80
50 (17,9)
21 (15,1)
29 (20,7)
1,0 [Referência]
80–70
70 (25,1)
33 (23,7)
37 (26,4)
1,23 [0,59–2,56]
0,577
70–60
67 (24,0)
38 (27,3)
29 (20,7)
1,81 [0,86–3,80]
0,117
60–50
47 (16,8)
22 (15,8)
25 (17,9)
1,21 [0,54–2,71]
0,634
50–40
26 (9,3)
14 (10,1)
12 (8,6)
1,61 [0,62–4,18]
0,327
40–30
11 (3,9)
6 (4,3)
5 (3,6)
1,66 [0,45–6,16]
0,451
30–20
7 (2,5)
5 (3,6)
2 (1,4)
20–10
1 (0,4)
1 (0,7)
Ameríndia
02–10
90 (32,3)
45 (32,4)
45 (32,1)
1,0 [Referência]
10–20
113 (40,5)
60 (43,2)
53 (38,0)
1,13 [0,65–1,97]
0,661
20–30
47 (16,8)
18 (12,9)
29 (20,7)
0,62 [0,30–1,27]
0,193
30–40
21 (7,5)
11 (7,9)
10 (7,1)
1,10 [0,42–2,85]
0,844
40–50
7 (2,5)
4 (2,9)
3 (2,1)
50–60
1 (0,4)
1 (0,7)
Africana
02–10
81 (29,0)
36 (25,9)
45 (32,1)
1,0 [Referência]
10–20
89 (31,9)
41 (29,5)
48 (34,3)
1,07 [0,58–1,95]
0,832
20–30
66 (23,7)
38 (27,3)
28 (20,0)
1,70 [0,88–3,27]
0,114
30–40
28 (10,0)
15 (10,8)
13 (9,3)
1,44 [0,61–3,42]
0,405
40–50
8 (2,9)
5 (3,6)
3 (2,1)
2,08 [0,47–9,31]
0,337
50–60
5 (1,8)
3 (2,2)
2 (1,4)
60–70
2 (0,7)
1 (0,7)
1 (0,7)
Os dados contínuos estão representados por número absoluto (porcentagem) e analisadas pelo
Teste de Qui-quadrado. Valores de p considerados significativos estão destacados em
negritos. OR [IC 95%] = Regressão Logística com o intervalo de confiança de 95%.
4.3. Frequência genética e alélica
A frequência genotípica e alélica do grupo caso e controle estão listados na Tabela 10.
A frequência genotípica e alélica do polimorfismo no gene IL4 foram significativamente
diferentes entre os grupos caso e controle, quando comparado a prevalência de duas e três
repetições de 70 pb no intro 3 (valor de p = 0,01 para ambas análises). Além disso, indivíduos
do grupo caso apresentaram uma maior frequência de duas repetições de 70 pb do que o grupo
controle.
40
A análise da frequência genotípica e alélica feita nos polimorfismos nos genes ACE
[rs4646994], CASP8 [rs3834129], SGSM3 [rs56228771], CYP19A1 [rs11575899], CYP2E1
[INDEL, 96 pb], HLAG [rs371194629], IL1A [rs3783553], MDM2 [rs3730485], NFKB1
[rs28362491], TP53 [rs17878362 e rs17880560], TYMS [rs151264360], UCP2 [INDEL, 45
pb], UGT1A1 [rs8175347] e XRCC1 [rs3213239] não foram diferentemente significativos
entre os grupos casos e controles.
4.4. Análise de associação polimórfica
Todas as análises de associação polimórfica foram realizadas pela análise de regressão
logística para o modelo aditivo (Tabela 10). O alelo D do polimorfismo estudado no gene IL4,
e o alelo I do polimorfismo no gene TYMS, foram associados com o aumento do risco de
desenvolver CCR (valor de p = 0,001 e p = 0,0165, respectivamente).
A análise feita nos polimorfismos nos genes ACE [rs4646994], CASP8 [rs3834129],
SGSM3 [rs56228771], CYP19A1 [rs11575899], CYP2E1 [INDEL, 96 pb], HLAG
[rs371194629], IL1A [rs3783553], MDM2 [rs3730485], NFKB1 [rs28362491], TP53
[rs17878362 e rs17880560], UCP2 [INDEL, 45 pb], UGT1A1 [rs8175347] e XRCC1
[rs3213239] não foram diferentemente significativos entre os grupos casos e controles.
41
Tabela 10 – Frequência genotípica e alélica do grupo caso e controle em porcentagem e a análise da regressão logística para o modelo
aditivo.
Caso/Controle (n = 140/140)
Gene
dbSNP
Frequência Genotípica
Frequência Alélica
OR [IC 95%]f
Valor de p
II
ID
DD
Valor de p
I
D
Valor de p
ACE
rs4646994 21,0/14,3 49,3/54,3 29,7/31,4
0,335
45,7/41,4 54,3/58,6
0,315
1,62 [0,91–2,91]d
0,0985
e
CASP8
rs3834129 34,5/30,0 46,0/46,4 19,4/23,6
0,605
57,6/53,2 42,4/46,8
0,302
1,22 [0,72–2,07]
0,4554
d
SGSM3
rs56228771 7,2/3,6 30,2/36,4 62,6/60,0
0,274
22,3/21,8 77,7/78,2
0,883
0,91 [0,47–1,75]
0,7802
e
CYP19A1 rs11575899 35,8/37,9 49,6/50,0 14,6/12,1
0,82
60,3/62,9 39,7/37,1
0,83
1,16 [0,64–2,10]
0,6345
d
CYP2E1
0,7/0,7 17,3/12,9 82,0/86,4
0,588
9,4/7,1 90,6/92,6
0,342
1,99 [0,80–4,99]
0,1397
e
HLAG
rs371194629 14,7/13,6 43,4/50,0 41,9/36,4
0,538
36,4/38,6 63,6/61,4
0,597
1,14 [0,65–1,96]
0,6618
e
IL1A
rs3783553 46,0/52,1 38,8/37,9 15,1/10,0
0,368
65,5/71,1 34,5/28,9
0,154
1,42 [0,83–2,45]
0,1982
e
IL4
rs79071878 48,9/60,0 40,3/37,1 10,8/2,9
69,1/78,6 30,9/21,4
2,79 [1,48–5,26]
0,017
0,01
0,001
e
MDM2
rs3730485 50,4/50,7 43,2/37,1 6,5/12,1
0,219
71,9/69,3 28,1/30,7
0,49
1,37 [0,76–2,47]
0,3001
e
NFKB1
rs28362491 38,1/40,7 46,0/42,1 15,8/17,1
0,806
61,2/61,8 38,8/38,2
0,877
1,30 [0,75–2,25]
0,3483
d
TP53
rs17878362 3,6/1,4 27,3/32,1 69,1/66,4
0,383
17,3/17,5 82,7/82,5
0,941
1,13 [0,53–2,42]
0,747
d
TP53
rs17880560 7,2/7,1 39,6/32,9 53,2/60,0
0,489
27,0/23,6 73,0/76,4
0,857
1,79 [0,98–3,24]
0,0552
d
TYMS
rs151264360 46,0/42,9 43,9/42,1 10,1/15,0
0,459
68,0/63,9 32,0/36,1
0,311
2,04 [1,11–3,85]
0,0165
d
UCP2
6,6/9,3 35,3/44,3 58,1/46,4
0,149
24,3/31,4 75,7/68,6
0,06
0,63 [0,33–1,19]
0,1471
d
UGT1A1
rs8175347 11,5/10,8 44,6/46,0 43,9/43,2
0,785
33,8/33,8 66,2/66,2
1
0,69 [0,38–1,23]
0,2043
e
XRCC1
rs3213239 41,7/42,9 47,5/45,0 10,8/12,1
0,894
65,5/65,4 34,5/34,6
0,978
0,94 [0,53–1,68]
0,8403
Os dados estão representados como a porcentagem dos pacientes do grupo caso/ porcentagem dos pacientes do grupo controle. O Teste de Quiquadrado foi o utilizado. Valores de p considerados significativos estão destacados em negritos. dbSNP = Registro da variação genética; OR [IC
95%] = Regressão Logística com o intervalo de confiança de 95%; d = Modelo utilizado para a análise da regressão logística foi o D vs. I; e =
Modelo utilizado para a análise da regressão logística foi o I vs. D; f = Ajustado pela idade, gênero, etilismo, tabagismo e distribuição da
ancestralidade.
42
4.5. Análise combinada do genótipo dos genes IL4 e TYMS
A frequência do genótipo combinado do TYMS (rs151264360) e IL4 (rs79071878)
entre os grupos caso-controle foram representados na Tabela 11, sendo ainda realizada uma
regressão logística para observar o efeito da combinação do genótipo no risco de ter CCR
(Tabela 12). As variáveis de ajustes foram idade, gênero, o perfil de ancestralidade e o estilo
de vida (tabagismo e etilismo). Na regressão logística, foi associado que a presença de pelo
menos 3 alelos de risco (valor de p = 0,002) aumenta o risco de desenvolver CCR.
Tabela 11 – Frequência do genótipo combinando dos genes TYMS (rs151264360) e IL4
(rs79071878) nos grupos caso e controle.
Genótipo Combinado
Caso
Controle
IL4
TYMS
(n = 140)
(n = 140)
I/I
D/D
8 (5,8)
13 (9,3)
I/I
D/I*
31 (22,3)
I/I
I/I*
29 (20,9)
D/I*
D/D
4 (2,9)
D/I*
D/I*
22 (15,8)
D/I*
I/I*
30 (21,6)
D/D*
D/D
2 (1,4)
D/D*
D/I*
8 (5,8)
D/D*
I/I*
5 (3,6)
Os dados categóricos estão representados por número absoluto de indivíduos
* = Presença do Alelo de Risco.
37 (26,4)
34 (24,3)
8 (5,7)
21 (15,0)
23 (16,4)
0 (0,0)
1 (0,7)
3 (2,1)
(porcentagem);
Tabela 12 – Frequência aditiva do alelo de risco no grupo caso e controle para o
genótipo combinado dos genes TYMS (rs151264360) e IL4 (rs79071878) e a análise de
regressão logística.
Variante alélica*
Caso
Controle
OR [IC 95%]
Valor de p
0 alelo
8 (5,8)
13 (9,3)
1 [Referência]
1 alelo
35 (25,2) 45 (32,1)
2,24 [0,46 - 10,81]
0,447
2 alelo
53 (38,1) 55 (39,3)
3,42 [0,72 - 16,15]
0,292
3 alelo
38 (27,3) 24 (17,1)
13,81 [2,65 - 72,09]
0,002
4 alelo
5 (3,6)
3 (2,1)
25,81 [2,20 - 303,52]
0,039
Ajustado pela idade, gênero, etilismo, tabagismo e distribuição da ancestralidade. Valores de
p considerados significativos estão destacados em negritos. OR [IC 95%] = Regressão
Logística com o intervalo de confiança de 95%. * = A presença aditiva do alelo de risco para
a variante polimórfica do gene TYMS (rs151264360) e IL4 (rs79071878).
44
5. DISCUSSÃO
A diferença na incidência e sobrevivência do CCR varia de acordo com o grupo étnico
(ROBBINS; SIEGEL; JEMAL, 2012; SONEJI et al., 2010), especialmente na população
Americana afrodescendente, que tem a maior incidência de CCR e a menor razão de
sobrevivência em 5 anos, quando comparado com outros grupos étnicos (ROBBINS;
SIEGEL; JEMAL, 2012; SONEJI et al., 2010), apesar das estratégias de prevenção, de
diagnóstico precoce e de tratamento (ATKIN et al., 2010; DOUBENI et al., 2013; MANDEL
et al., 1993; NISHIHARA et al., 2013; SCHOEN et al., 2012; U.S. PREVENTIVE
SERVICES TASK FORCE, 2008).
No presente estudo, foi avaliado a associação de 16 INDEL (ACE, CASP8, SGSM3,
CYP19A1, CYP2E1, HLAG, IL1A, MDM2, NFKB1, TP53 [16 e 6 bp], TYMS, UCP2, XRCC1,
IL4 e UGT1A1) no risco de desenvolver o CCR na população Brasileira. Este é o primeiro
trabalho que busca identificar a associação dos polimorfismos do tipo INDEL nestes genes
com o risco de ter CCR em uma população miscigenada.
O INDEL no íntron 3 do gene IL4 (rs79071878) e na região 3’-UTR do gene TYMS
(rs151264360) foram associados com o risco de CCR. Além disso, foi observado que
individualmente estas INDEL conferem um risco moderado ao CCR, mas quando combinados
o risco de desenvolver o CCR aumenta consideravelmente. Estes achados são importantes por
corroborarem com outros estudos descritos na literatura.
A contribuição ancestral também foi avaliada entre o grupo caso e controle da
população estudada, sendo o primeiro estudo a realizar este tipo de avaliação em pacientes
com CCR na população miscigenada. Foi observado que há diferença significativa na
contribuição ancestral Africana entre o grupo caso e controle, sendo tal descoberta consistente
com outros estudos que tem sugerido que Americanos afrodescendentes possuem uma maior
prevalência de CCR, quando comparado com outros pacientes (CORLEY et al., 2013;
LIEBERMAN et al., 2008; WU; LONGSTRETH; NGOR, 2014). Além disso, a diferença de
prevalência vai além da diferença socioeconômica, podendo estar associada com aspecto
biológico e genético (KUPFER et al., 2010). Entretanto, ao se estratificar a contribuição
Africana entre os grupos a cada 10%, essa diferença foi perdida e mais estudos devem ser
realizados para confirmar os achados.
O trabalho mostrou também que a população estudada possui uma elevada
contribuição da população Europeia, bem como outros estudos que exploram a contribuição
relativa da ancestralidade em diferentes estados do país, utilizando marcadores no genoma
45
autossômico (MOURA et al., 2015), embora exista algumas variações na estimativa, como
mostrado por: Santos e colaboradores (2015) (Africana = 50%; Europeia = 43%; e Ameríndia
= 7%, no estado da Bahia), Pinto e colaboradores (2015) (Europeia = 46,1%; Americana =
30,3%; e Africana = 23,6%, no estado do Pará), e Carvalho e colaboradores (2015) (Europeia
= 50,5%; Ameríndia = 29,4%; e Africana = 20,4%, no estado do Pará).
Carvalho e colaboradores (2015) observou também que o perfil de ancestralidade pode
influenciar na susceptibilidade ao câncer. Além disso, Cassiano e colaboradores (2015)
demonstrou a influência que a ancestralidade tem sobre a distribuição dos polimorfismos.
Variações na atividade da citocina IL-4 têm sido associadas com a proliferação
celular, podendo afetar na transdução dos sinais nas vias relacionadas ao câncer (BHAYAL et
al., 2015). Neste trabalho, foi avaliado o INDEL de 70 pb no íntron 3 do gene IL4
(rs79071878). Esta variação gênica pode influenciar na produção de sua respectiva citocina, e
tem sido associado com o câncer gástrico (BHAYAL et al., 2015) e outras doenças
inflamatórias (ANOVAZZI et al., 2010; CABANTOUS et al., 2009). Entretanto, este é o
primeiro estudo que indica uma associação entre o polimorfismo rs79071878 e o risco de
desenvolver CCR.
O aumento na produção da IL-4 pode resultar no escape das células tumorais à
vigilância imunológica devido à diminuição da resposta imune celular. A resposta imune
celular pode ser inibida pela diminuição da expressão de citocinas relacionadas ao perfil Th1
e por diminuir qualitativamente e quantitativamente a resposta das células T CD8+, no
microambiente tumoral (BHAYAL et al., 2015; GAUR et al., 2014; NAKASHIMA et al.,
2002).
Nakashima e colaboradores (2002) e Amador e colaboradores (2016) observaram que
a frequência dos alelos desta INDEL, é diferente entre as populações. Nakashima e
colaboradores (2002) observaram também que há uma maior frequência do alelo I em
caucasianos e do alelo D em asiáticos (NAKASHIMA et al., 2002). Enquanto que Amador e
colaboradores (2016) observaram que o alelo I é mais frequente na população Europeia e o
alelo D na população Ameríndia e na Africana.
Esses resultados sugerem que a alta frequência do alelo I na população analisada neste
estudo pode ter relação com a elevada contribuição da população Europeia e que a diferença
genotípica entre o grupo caso-controle. Ademais, esta diferença pode ter sido influenciada
pela contribuição genética da população Africana, corroborando com a importância de se
realizar mais estudos na população miscigenada.
46
A análise de regressão logística indicou que o alelo D foi associado com o risco de
desenvolver CCR (I vs. D; OR = 2,79; IC 95% = 1,48–5,26), confirmando os dados
reportados por Canbantous e colaboradores (2009) e Nakashima e colaboradores (2002).
Nakashima e colaboradores (2002) observaram uma diferença significativa na
produção do IL-4 entre os genótipos e a proporção de células Th. Além disso, analisaram que
o alelo D pode levar ao aumento da expressão desta citocina, sendo confirmados por
Canbantous e colaboradores (2009).
O gene TYMS atua essencialmente na biossíntese da timina e a sua expressão é
requerida no processo de replicação e reparo do DNA (BURDELSKI et al., 2015). A inserção
de 6 pb na região 3’-UTR pode influenciar significativamente a expressão do gene
(MANDOLA et al., 2004). Estudos indicam que este gene está associado com câncer de
mama (GUAN et al., 2015), gástrico (SHEN et al., 2014), colorretal (GALLEGOSARREOLA et al., 2008; ZHOU et al., 2012) e outros tipos de neoplasias malignas (SHAW et
al., 2013; ZHOU et al., 2012).
No presente estudo, não foi observado diferença significativa quando avaliado a
frequência alélica e genotípica entre os grupos caso e controle. Entretanto, na população
examinada há uma maior prevalência do alelo I. Estes resultados confirmam os achados
reportados por Gallegos-Arreola e colaboradores (2008), que comparou 253 pacientes com
CRC e 200 controles livres de câncer, no México.
A análise de regressão logística do polimorfismo no gene TYMS (rs151264360)
indicou que ao alelo I foi associado com o aumento do risco de CCR (D vs. I; OR = 2,04, IC
95% = 1,11–3,85; valor de p = 0,0165), consistente com os resultados de Mandola e
colaboradores (2004) e Rahman e colaboradores (2004).
Mandola e colaboradores (2004) observaram que essa variação polimórfica pode
aumentar a estabilidade do mRNA do gene e a expressão da proteína. Além disso, Rahman e
colaboradores (2004) ressaltaram que o aumento da expressão do gene TYMS pode induzir a
transformação de células de mamíferos em células com fenótipo maligno.
No presente trabalho, também foi avaliado o risco que a combinação genotípica dos
genes TYMS (rs151264360) e IL4 (rs79071878) no risco de ter CCR, além de ter sido
observado que se faz necessário a presença de pelo menos 3 alelos de risco para conferir risco
de ter CCR (OR = 13,81; IC 95% = 2,65–72,09; valor de p = 0,002) e que o risco aumenta
com a presença de 4 alelos (OR = 25,81; IC 95% = 2,20–303,52; valor de p = 0,039). Além
47
disso, nenhum estudo fez tipo de associação, o que abre um leque de possibilidades de
análises para validar o achado.
O presente estudo foi o primeiro a avaliar o efeito do INDEL no gene ACE
(rs4646994) na população Brasileira, e ao fazer a análise de frequência genotípica e alélica,
não encontrou diferença significativa. Este resultado corrobora com os achados observados
por Nikiteas e colaboradores (2007) (92 casos e 102 controles, na Grécia), Toma e
colaboradores (2009) (108 casos e 150 controles, Roménia) e Liu e colaboradores (2011) (241
casos e 299 controles, China). Entretanto, Röcken e colaboradores (2007) notaram que há
diferença na expressão do ACE nos pacientes com CCR e que este polimorfismo pode estar
associado a diferenças específicas entre o gênero (141 casos e 189 controles, Alemanha).
A deleção de 6 pb na região promotora da CASP8 (rs3834129) diminui
significantemente a sua expressão, afetando a atividade anti-tumoral dos linfócitos T
(PARDINI et al., 2014). Essa variação genética já foi associada com o CCR na população
Chinesa (930 casos e 890 controles), apesar de ter baixa penetrância (SUN et al., 2007).
Entretanto, assim como no presente estudo, outros estudos de associação realizados na
população Han Chinesa (305 caos e 342 controles) (XIAO et al., 2013), do Reino Unido
(4016 casos e 3749 controles) (PITTMAN et al., 2008) e no Consorcio EPICOLON entre
centros localizados na Espanha, Itália, EUA, Inglaterra, República Checa e Holanda (6733
casos e 7576 controles) (PARDINI et al., 2014) não observaram associação entre o rs3834129
e a susceptibilidade ao CCR. Essa discrepância entre os resultados pode estar relacionada com
a diferença específica da população, não só na variação gênica, mas também na interação
gene-fatores ambientais.
A inserção de 4 bp na região 3'-UTR do SGSM3 (rs56228771) pode afetar a regulação
pós-transcricional deste gene, influenciando na sua expressão (WANG et al., 2014b). Este
INDEL já foi associado com o efeito protetor contra a susceptibilidade de ter câncer hepático
na população Chinesa (502 casos e 513 controles) (WANG et al., 2014b). Contudo, não há
estudos sobre o efeito desta INDEL no CCR, sendo necessário mais estudo para validar os
achados obtidos neste trabalho.
Baseado na importância biológica, a inserção de 96 pb na região flaqueada a 5'-UTR
(alelo I) tem sido associado com o risco de CCR por aumentar (QIAN et al., 2013) o nível de
transcrição e da atividade da CYP2E1 (HAYASHI; WATANABE; KAWAJIRI, 1991). Essa
hipótese tem sido confirmada por diversos estudos realizados em diferentes populações
(JIANG et al., 2013; LE MARCHAND et al., 2002; MORITA et al., 2008, 2009; QIAN et
48
al., 2013; SAMEER et al., 2011). Além do mais, assim como no presente estudo, no trabalho
realizado por Silva e colaboradores (2012) não observaram diferença significativa na
frequência genotípica e alélica da variação gênica da CYP2E1 entre o grupo caso e controle
(131 casos e 206 controles, São Paulo - Brasil).
A deleção de 3 pb no íntron 4 da CYP19A1 (rs11575899) está associado com o
aumento da produção do estrogênio (CZAJKA-ORANIEC; SIMPSON, 2010) e com a
susceptibilidade ao câncer de próstata (HUANG et al., 2007), de mama (DUNNING et al.,
2004; KIM et al., 2009), melanoma (ESCOBAR et al., 2016) e leucemia linfoblastica aguda
(CARVALHO et al., 2015). Embora a atividade da CYP19A1 possa influenciar no CCR, este
trabalho foi o primeiro que avaliou a associação entre esta INDEL (rs11575899) com o risco
de CCR. Além disso, não foi possível observar associação desta deleção com o risco de CCR
na população Brasileira. Dessa forma, mais estudos devem ser conduzidos para confirmar os
achados.
A INDEL de 2 pb na região promotora (rs8175347) tem sido associado com uma
menor atividade da UGT1A1, quando comparado com 6 repetições (DEMING et al., 2008).
Entretanto, esta alteração vem sendo associada com efeitos tóxicos relacionados ao tratamento
com fluorouracil (5-FU) e irinotecan (DUFFY, 2015; KIM et al., 2015; LI et al., 2016;
SUENAGA et al., 2015), sendo este o primeiro estudo do tipo caso-controle que avalia o risco
que esta INDEL tem no desenvolvimento do CCR. Apesar de não ter sido encontrado
associação neste trabalho, novos estudos podem ser feitos para consolidar os resultados.
A INDEL de 45 pb na região 3'-UTR do gene UCP2 pode afetar a estabilidade do
mRNA (ESTERBAUER et al., 2001; LIU et al., 2012); o tempo de meia-vida do mRNA
expresso em indivíduos com a inserção de 45 pb é menor dos que tem a deleção
(ESTERBAUER et al., 2001). Entretanto, não há estudos relacionando este polimorfismo
com o câncer, precisando ser confirmado com outros trabalhos.
A INDEL de 14 pb na região 3'-UTR (rs371194629) do HLAG pode influenciar na
estabilidade do mRNA onde a presença da inserção está associada com a instabilidade do
mRNA e menor produção da proteína (CHEN et al., 2008; ROUSSEAU et al., 2003).
Entretanto, não há estudos relacionando este polimorfismo com o CCR, e mais estudos devem
ser conduzidos para confirmar os achados.
A inserção de 4 pb na região 3'-UTR do gene IL1A (rs3783553) foi associado com o
aumento da transcrição deste gene in vitro e in vivo (GAO et al., 2009). Diversos estudos
vêm evidenciando que o genótipo homozigoto para a inserção (alelo I) diminui o risco para
49
diversos tipos de câncers (GAO et al., 2009; HUANG et al., 2016; WANG et al., 2016;
YANG et al., 2011; YU et al., 2016; ZHANG et al., 2016). Entretanto, assim como no
presente estudo, Yan e colaboradores (2015) não observaram associação desta variação
polimórfica com o CCR (142 casos e 124 controles, população Han Chinesa). Ademais,
Amador e colaboradores (2016) mostraram que a frequência do rs3783553 varia entre a
população Ameríndia, a Africana e a Europeia, sendo o alelo I mais frequente na população
Africana e Europeia, o que explica a elevada frequência do alelo I na população estudada no
presente trabalho e reforça o efeito da ancestralidade na população miscigenada. Embora não
se tenha encontrado associação com o CCR, são necessárias mais pesquisas para confirmar os
achados, especialmente em diferentes grupos étnicos.
A presença da inserção de 16 pb no íntron 3 no gene TP53 (rs17878362) pode reduzir
a concentração basal da expressão deste gene (GEMIGNANI et al., 2004); e o INDEL de 6 pb
na região 3'-UTR (rs17880560) afeta a estabilidade do mRNA do TP53, por interferir a
regulação pós-transcricional. O rs17878362 tem sido associado com a susceptibilidade de
desenvolver diversos tipos de câncer (HU et al., 2010b; SAGNE et al., 2013;
VYMETALKOVA et al., 2015), inclusive para o CCR (GEMIGNANI et al., 2004;
POLAKOVA et al., 2009). No entanto, não há outros estudos de associação entre rs17880560
com a susceptibilidade ao CCR e apesar de não ter sido encontrado associação neste trabalho,
mais estudos devem ser conduzidos para confirmar os achados. Além disso, Sagne e
colaboradores (2014) observaram que a presença da variação alélica rs17878362 e
rs17880560, em homozigose, aumenta a susceptibilidade ao câncer e que a magnitude do
efeito é maior em indivíduos na fase infantil ou adolescente do que na fase adulta.
A deleção de 40 pb (alelo D) na região promotora do MDM2 (rs3730485) tem sido
reportada por aumentar da susceptibilidade ao câncer (DONG et al., 2012; HASHEMI et al.,
2014). Gansmo e colaboradores (2016) observaram que a variante polimórfica rs3730485 tem
associação com o CCR (1532 casos e 3746 controles, população da Noruega), divergindo dos
achados encontrados no presente estudo. Assim, se fazem necessárias mais pesquisas para
confirmar a associação deste INDEL com a susceptibilidade ao CCR, especialmente em
diferentes grupos étnicos.
A INDEL de 4 pb na região flanqueada a 5'-UTR (rs3213239) pode afetar a expressão
do XRCC1. Indivíduos homozigotos para a deleção de 4 pb foram associados com o risco de
desenvolver Leucemia de células B (CARVALHO et al., 2015). Entretanto, não há estudos
prévios de associação deste INDEL com o CCR. Apesar de não ter sido observado associação
50
entre a variante rs3213239 com a susceptibilidade de ter CCR, mais estudos devem ser
conduzidos para confirmar os resultados.
A INDEL de 4 pb na região promotora (rs28362491) no gene NFKB1 (ZHOU et al.,
2010) pode impactar na ligação da proteína nuclear, levando a redução da atividade
promotora (KARBAN et al., 2004) e está associada com o risco de ter câncer (WANG et al.,
2011; YANG et al., 2014), assim como no CCR (ANDERSEN et al., 2010; MOHD SUZAIRI
et al., 2013). Entretanto, a associação entre rs28362491 e o CCR têm sido divergente em
alguns estudos (KOPP et al., 2015), sugerindo que o efeito que este polimorfismo tem na
susceptibilidade ao câncer pode variar entre grupos étnicos e tipos específicos de câncer
(YANG et al., 2014). Ademais, Amador e colaboradores (2016) mostraram que a frequência
do rs28362491 varia entre a população Ameríndia, a Africana e a Europeia, sendo o alelo D
mais frequente na população Ameríndia e Africana, o que explica a elevada frequência do
alelo I na população estudada no presente trabalho e reforça o efeito da ancestralidade na
população miscigenada. Apesar de não ter sido observado associação entre a variante
rs3213239 com a susceptibilidade de ter CCR neste trabalho, mais estudos devem ser
conduzidos para confirmar os achados.
51
6. CONCLUSÃO
No presente estudo, foi observado que os polimorfismos nos genes IL4 (rs79071878) e
TYMS (rs151264360) estão associados com o aumento do risco de desenvolver CCR. Além
disso, foi observado que individualmente estas INDEL conferem um risco moderado ao CCR,
mas quando combinados o risco de desenvolver o CCR aumenta consideravelmente.
52
REFERÊNCIAS
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<www.cancer.org/Cancer/ColonandRectumCancer/DetailedGuide/index.>. Acesso em: 25
jun. 2016.
AMADOR, M. A. T. et al. Distribution of allelic and genotypic frequencies of IL1A, IL4,
NFKB1 and PAR1 variants in Native American, African, European and Brazilian populations.
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AMERSI, F.; AGUSTIN, M.; KO, C. Y. Colorectal cancer: epidemiology, risk factors, and
health services. Clinics in colon and rectal surgery, v. 18, n. 3, p. 133–40, ago. 2005.
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70
ANEXO
I
Anexo A – Parecer do Comitê de Ética
II
III
APÊNDICE
IV
Apêndice A – Questionário
Questionário
Nº:____
TODOS CONTRA O CÂNCER COLORRETAL - BUSCA PELO
DIAGNÓSTICO PRECOCE
Projeto de Pesquisa:
Pesquisadora Responsável: ____________________________________________________
Data inclusão: _____ / _____ / _____
I PARTE: Identificação do Sujeito da Pesquisa
Nome do voluntário:
Prontuário LNRCC:
Endereço:
Bairro:
Telefone:
Cidade:
Sexo: M
F
Data de nascimento: / /
Nº:
Bl:
apto:
CEP:
e-mail:
II PARTE: Parâmetros Socio-econômico
01. Nacionalidade (País): _______________________ (Brasileiro, italiano, espanhol , português, francês, etc)
02. Naturalidade (Cidade): _________________________
03. Raça/Cor:
( )BRANCA ( )NEGRA ( )PARDO ( )AMARELA ( )INDÍGENA ( )MESTIÇO
04. Qual Profissão exerce atualmente?
____________________________________________________________________
III PARTE: Parâmetros Clínicos pessoais e familiar
01. Apresenta alguma(s) destas Doenças?
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
(
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
)
OBESIDADE
Tratado? Sim ( )
Não ( )
DIABETES
Tratado? Sim ( )
Não ( )
HIPERTENSÃO
Tratado? Sim ( )
Não ( )
DISLIPIDEMIA
Tratado? Sim ( )
Não ( )
HIPERTIREOIDISMO
Tratado? Sim ( )
Não ( )
HIPOTIREOIDISMO
Tratado? Sim ( )
Não ( )
DOENÇA ENAL
Qual? ____________________________
DOENÇA HEPÁTICA
Qual? ____________________________
DOENÇA PULMONAR
Qual? ____________________________
DOENÇA INFLAMATÓRIA CRÔNICA
Qual? ____________________________
INFECÇÃO
Qual? ____________________________
CÂNCER
Qual? ____________________________
ANEMIA
Qual? ____________________________
VIROSE
Qual? ____________________________
ALERGIA
Qual? ____________________________
PARASITOSE
Qual? ____________________________
ALTERAÇÃO DAS FEZES
Qual? ____________________________
SANGUE NO PAPEL HIGIÊNICO
Qual frequência?___________________
PROBLEMA DE PRISÃO DE VENTRE
DIARRÉIA CONSTANTE
Qual frequência?___________________
PERÍODO MENSTRUAL
NÃO APRESENTA NENHUMA DOENÇA OU DESCONHECE
V
02. Tem História Familiar de alguma(s) destas Doenças?
( )
OBESIDADE
( )
DIABETES
Quem? ___________________________
( )
HIPERTENSÃO ARTERIAL SISTÊMICA
Quem? ___________________________
DISLIPIDEMIA (Aumento de colesterol,
( )
Quem? ___________________________
triglicerídeos ou redução de HDL)
( )
HIPER ou HIPOTIREOIDISMO
Quem? ___________________________
( )
FALECIDO POR CÂNCER
Quem? ___________________________
( )
OUTRAS
Qual? ____________________________
( )
NÃO APRESENTA HISTÓRIA FAMILIAR DE NENHUMA DOENÇA OU DESCONHECE
03. Faz uso de algum medicamento? SIM( ) NÃO( )
(Se SIM) Qual(is)?
__________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________________
______________________
04. Tem prisão de ventre/ dificuldade de evacuar? SIM( ) NÃO( )
Que frequencia?
_______________________________________________________________________________________
05. Tem cólicas abdominais? SIM( ) NÃO( )
Que frequencia?
_______________________________________________________________________________________
06.Já observou sangue nas fezes? SIM( ) NÃO( )
Que frequência?
_______________________________________________________________________________________
07. Notou alguma mudança no aspecto das suas fezes ? SIM( ) NÃO( )
Qual e que frequência?
_________________________________________________________________________________
08. Já realizou o exame de colonoscopia? SIM( ) NÃO( )
(Se SIM) Por quê? _________________________________________________________________________
Quantas vezes?_____________________________________________________________________________
IV PARTE: Parâmetros Físicos e Alimentares
01. Costuma praticar algum tipo de exercício? SIM( ) NÃO( )
(Se SIM) Qual (is)?
_____________________________________________________________________________________
Com que frequência? ( )TODOS OS DIAS ( ) DE 3 A x POR SEMANA
( ) MENOS DE TRÊS x / SEMANA
Duração do exercício: ( ) 30 MINUTOS ( ) 1 HORA ( ) MAIS DE 1 HORA
02. Exame Físico
a) Pressão Arterial:____x___mmHg
b) Peso:______Kg
c) Altura:_______metros
03. Faz uso de bebida alcoólica?
( ) TODOS OS DIAS
( )2 A 3x POR SEMANA ( )1x POR SEMANA
( )RARÍSSIMAS VEZES ( )NÃO
VI
04. Fuma? SIM( ) NÃO( ) PAROU DE FUMAR( )
(Se SIM) Quantos cigarros por dia?___________________
Há quanto tempo fuma?_______________________
Idade que começou a fumar? __________________
(Se PAROU DE FUMAR) Parou á quanto tempo?___________________
05. Você se considera uma pessoa:
( )CALMA
( )POUCO ANCIOSA/NERVOSA
( )ESTRESSADA/IRRITADA
( )MUITO ANCIOSA/NERVOSA
VII
Apêndice B – Ficha de dados clínicos
CÂNCER COLORRETAL – FICHA DE DADOS CLÍNICOS
ID:
Data de nascimento: ____/____/____
Prontuário:
Nome completo:
Sexo:
Idade do diagnóstico:
Data da cirurgia: ____/____/____
Data do laudo: ____/____/____
Localização:
( ) Ceco
( ) Ascendente
( ) Transverso
( ) Descendente
( ) Sigmóide
( ) Reto
Classificação histológica (OMS):
Tumor epitelial
1. ( ) Adenoma
a. ( ) Tubular
b. ( ) Viloso
c. ( ) Tubuloviloso
d. ( ) Serrado
2. ( ) Neoplasia intraepitelial (Displasia)
a. ( ) Glandular de baixo grau
b. ( ) Glandular de alto grau
3. ( ) Carcinoma
a. ( ) Adenocarcinoma
b. ( ) Adecocarcinoma
muscinoso
c. ( ) Carcinoma de
célula em anel-Signet
d. ( ) Carcinoma de
pequenas células
e. ( ) Carcinoma de
célula escamosa
f. ( ) Carcinoma
adenoescamoso
g. ( ) Carcinoma
medular
h. ( ) Carcinoma
indiferenciado
( ) Bem
( ) Moderado
( ) Pobre
( ) Indiferenciado
Estadiamento:
_____ T
_____ N
_____ M
i. ( ) Outros:
Grau de diferenciação:
Se houver presença de mestástase, especificar:
(
) Local
(
) Distante __________________________
Outro tumor primário: ( ) Não ( ) Sim
Local / Idade: ___________________________________________________________________
______________________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________
VIII
Apêndice C – Resumos apresentados em congressos
RESUMOS APRESENTADOS EM CONGRESSOS
SANTOS, DMC; COSTA, LRF; COSTA, LLF; OLIVEIRA, KM; PINTO, PDC; RIBEIRODOS-SANTOS, AKC; SANTOS, SEB; SILBIGER, VN; LUCHESSI, AD. Ancestry
distribution effect on allelic frequency of NFKB1 (rs28362491) in Brazilian population. In:
45ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular, 2016,
Natal/RN.
SANTOS, DMC; COSTA, LRF; COSTA, LLF; CORREA, RS; BORGES, AMP; ITO, FR;
RAMOS, CCO; RIBEIRO-DO-SANTOS, AKC; SANTOS, SEB; BORTOLIN, RH;
LUCHESSI, AD; SILBIGER, VN. Association of IL4 (rs79071878) and TYMS (rs51264360)
polymorphism with colorectal câncer (CRC) risk in Brazilian populations. In: 45ª Reunião
Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular, 2016, Natal/RN.
ARAÚJO, JNG; SANTOS, ICC; SANTOS, DMC; GENRE, J; TRINDADE, RL; RAMOS,
CCO; SILBIGER, VN; LUCHESSI, AD. Genetic markers of predisposition to thyroid
câncer: a pilot study in Rio Grande do Norte. In: 45ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira
de Bioquímica e Biologia Molecular, 2016, Natal/RN.
SANTOS, DMC; COSTA, LRF; COSTA, LLF; PINTO, PDC; LUCHESSI, AD; SANTOS,
SEB; RIBEIRO-DOS-SANTOS, AKC; SILBIGER, VN. Evaluation combined of IL4 and
TYMs genes in CRC risk. In: XXVIII Congresso Brasileiro de Genética Médica/ I Congresso
Latino Americano de Genética Humana/ II Congresso Brasileiro de Enfermagem em Genética
e Genômica, 2016, Belém do Pará/PA. Anais do XXVIII Congresso Brasileiro de Genética
Médica,
Oncogenética,
2016.
IX
1
Apêndice D – Manuscrito do artigo produzido durante o mestrado
2
Manuscript Type: Research Article
3
Reference: IEEE
4
Association of IL4 (rs79071878) and TYMS (rs51264360) Polymorphisms with
5
Colorectal Cancer (CRC) Risk in Brazilian Population: a Case-Control Study
6
7
Diego Marques1,2,5, Layse Raynara Ferreira Costa1,2, Lorenna Larissa Ferreira Costa1,2,
8
Romualdo da Silva Correa3, Aline Maciel Pinheiro Borges3, Fernanda Ribeiro Ito3,
9
Carlos Cesar de Oliveira Ramos4, Raul Hernandes Bortolin2, André Ducati Luchessi1,2,
10
Andrea Kely Campos Ribeiro dos Santos5, Sidney Emanuel Batista dos Santos5, Vivian
11
Nogueira Silbiger1,2*
12
1
13
Grande do Norte, Natal, Rio Grande do Norte, Brazil; 2Departamento de Análises
14
Clínicas e Toxicológicas, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, Rio
15
Grande do Norte, Brazil;
16
Riograndense Contra o Câncer, Natal, Rio Grande do Norte, Brazil;
17
Patologia e Citopatologia, Liga Norte Riograndense Contra o Câncer, Natal, Rio Grande
18
do Norte, Brazil; 5Laboratório de Genética Humana e Médica, Universidade Federal do
19
Pará, Belém, Pará, Brazil.
20
* Corresponding to: Vivian Nogueira Silbiger, Professor, Departamento de Análises
21
Clínicas e Toxicológicas, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, Rio
22
Grande do Norte, Brazil. Av. General Gustavo Cordeiro de Faria S/N, Petrópolis,
23
59012-570 - Natal - RN, Brazil. [email protected]. Telephone: +55 84 3342
24
9807, Fax: +55 84 3342 9833.
Laboratório de Bioanálise e Biotecnologia Molecular, Universidade Federal do Rio
3
Departamento de Cirurgia Oncológica, Liga Norte
4
Laboratorio de
25
X
26
ABSTRACT
27
BACKGROUND: Colorectal cancer (CRC) is the third most common cancer in men
28
and the second in women, worldwide. Among several mutations that may occur in the
29
human DNA, the influence of Insertion-Deletions (INDEL) on cancer risk. Few studies
30
have been developed in admixed population, such as Brazil. The understanding about
31
INDEL are important for profiling genetic variations within genomes because they may
32
cause human diseases, including CRC, by modifying coding region or mRNA stability.
33
The aim of this study was to perform a case-control study to determine the association
34
between CRC risk and 14 INDEL and 2 Variable Number Tandem Repeat (VNTR)
35
polymorphisms in genes involved in apoptosis signaling (CASP8 [rs3834129]),
36
GTPase-activating (SGSM3 [rs56228771]), steroids metabolism (CYP2E1 [96 bp],
37
CYP19A1 [rs28892005], and UGT1A1 [rs8175347]), immune system (HLAG
38
[rs371194629], IL1A [rs3783553], IL4 [rs79071878], and NFKB1 [rs28362491]),
39
MDM2-P53 pathway (MDM2 [rs3730485] and TP53 [rs17878362 and rs17880560]),
40
DNA replication and repair (TYMS [rs151264360] and XRCC1 [rs3213239]) and
41
angiogenesis (UCP2 [45 bp] and ACE [rs4646994]) in a population from Rio Grande do
42
Norte state (Northeast Region of Brazil). Moreover, it was also evaluated the autosomal
43
ancestry distribution between cases and controls, considering that the Brazilian
44
population is genetically influenced by many ethnic groups. METHODS: The research
45
participants were chosen based on a case-control study design, of which 140 individuals
46
were patients with CRC and 140 were cancer-free individuals from Rio Grande do
47
Norte state, Brazil. The polymorphisms and ancestry distribution were typed by
48
Multiplex-PCR using the ABI PRISM 3130 and analyzed with GeneMapper ID v3.2.
49
Statistical analysis was performed using R v3.1. RESULTS: The studied groups had
50
homogeneous ancestry distribution. Moreover, logistic regression analysis showed that
XI
51
polymorphism variations in IL4 (p-value=0.001) and TYMS (p-value=0.0165) genes
52
were associated with increased CRC risk. CONCLUSION: In summary, in this case-
53
control study, we showed that IL4 (rs79071878) and TYMS (rs151264360) were
54
associated with increase in CRC risk. This is the first study about the relation of these
55
polymorphisms with CRC in Brazilian population and it demonstrated to be a promising
56
research field. In addition, further population-based association studies should be
57
performed in other admixed groups to increase the knowledge about CRC
58
carcinogenesis.
59
Key words: Admixed population; Potential biomarker; Colorectal cancer;
60
Insertion-deletion polymorphism; INDEL; Variable Number Tandem polymorphism;
61
VNTR; Risk association
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
XII
76
77
BACKGROUND
78
According to GLOBOCAN [1], colorectal cancer (CRC) is the third most
79
common cancer type in men and the second in women, worldwide. It is estimated that,
80
in 2015, more than 1.4 million new cases of CRC were diagnosed and there were 750
81
thousand cases of death due to this type of cancer. In addition, an increase of 13.6% in
82
the number of patients diagnosed with CRC and an increase of 8.5% in the number of
83
death cases from CRC are expected for 2020 [1].
84
In the regional context, GLOBOCAN [1] also estimated that, in 2015, more than
85
34 thousand new patients with CRC were diagnosed in Brazil and about 17 thousand
86
patients with CRC will die. In addition, these predictions are estimated to increase by
87
28.6% and 29.7%, respectively, in 2020 [1].
88
The interaction between environment and genetic factors is strongly associated
89
with carcinogenesis [2], [3]. These factors are wide and vary according to the cancer
90
geographic regions [4]. However, the inherited susceptibility is a major component of
91
CRC predisposition, with an estimated 12–35% risk attributed to genetic factors [5]–[7].
92
Among several mutations that may occur in the human DNA such as
93
substitution, insertion, and deletion [8]. The second most abundant form of genetic
94
variation in humans, after Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs), are the Insertion-
95
Deletions (INDEL) [9].
96
The understanding about INDEL are important for profiling genetic variations
97
within genomes [10], [11] because they may alter human traits and cause human
98
diseases [9], [12], including CRC [13], by modifying the coding region [9], [12] or
99
mRNA stability [14].
XIII
100
Some pathways have been involved with carcinogenesis process, like as
101
apoptosis signaling [15], GTPase-activating [16], steroids metabolism [17], [18],
102
immune system [19], MDM2-P53 pathway [20], DNA replication and repair [21] and
103
angiogenesis [22].
104
Among genes involved in these pathways, recent studies have described the
105
effect of mutant allele in ACE [23], CASP8 [24], SGSM3 [25], CYP19A1 [24], CYP2E1
106
[26], HLAG [27], IL1A [28], IL4 [29], MDM2 [30], NFKB1 [31], TP53 [32], TYMS [33],
107
UCP2 [34], UGT1A1 [35], and XRCC1 [36] polymorphisms with the risk of cancer
108
development.
109
Furthermore, allele frequency varies among different populations [37], and few
110
studies have been developed in admixed populations, such as Brazil. In addition,
111
ancestry distribution in an admixed population may influence cancer development
112
susceptibility [24], [38] and impact on the polymorphism distribution [39].
113
Thus, the aim of this study was to perform a case-control study to determine the
114
association between CRC risk and 16 polymorphisms (14 INDEL and 2 Variable
115
Number Tandem Repeat (VNTR)) in genes involved in apoptosis signaling (CASP8),
116
GTPase-activating (SGSM3), steroids metabolism (CYP2E1, CYP19A1, and UGT1A1),
117
immune system (HLAG, IL1A, IL4, and NFKB1), MDM2-P53 pathway (MDM2 and
118
TP53), DNA replication and repair (TYMS and XRCC1) and angiogenesis (UCP2 and
119
ACE) in a population from Rio Grande do Norte state (in the Northeast Region of
120
Brazil). Moreover, the autosomal ancestry distribution between cases and controls was
121
also evaluated, considering that the Brazilian population is genetically influenced by
122
many ethnic groups.
123
124
XIV
125
METHODS
126
Ethics statement
127
The protocol used in this study was approved by the Committee for Research
128
Ethics of Liga Norte Riograndense Contra o Câncer (Rio Grande do Norte, Brazil). All
129
participants signed informed written consent prior to providing a blood sample.
130
131
132
Cases and controls
133
The research participants were chosen based on a case-control study design. The
134
patients in the case group (n = 140) were diagnosed with CRC as primary cancer and
135
treated in Liga Norte Riograndense Contra o Câncer (Rio Grande do Norte state,
136
Brazil). They were recruited between 2012 and 2014. The control subjects were blood
137
donors who self-declared being cancer-free (n = 140) from the hemotherapy service
138
(Hemovida, Rio Grande do Norte, Brazil) and were recruited in 2014.
139
Peripheral blood samples and questionnaire answers were collected from all
140
subjects. Clinicopathological data from the patients with CRC were obtained by
141
consulting the patients’ clinical charts.
142
143
DNA extraction and quantification
144
Genomic DNA was extracted by using a DNA extraction commercial kit,
145
QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany), and quantified with Qubit®
146
2.0 Fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
147
148
Polymorphism analysis
XV
149
150
Multiplex polymerase chain reaction (PCR) was used to simultaneously amplify
the 16 investigated markers, as shown in Table 1.
151
The amplification was performed on an ABI Verity thermocycler (Life
152
Technologies, Foster City, CA, USA). The PCR based genotyping assay used a
153
QIAGEN Multiplex-PCR kit (QIAGEN) according to the manufacturer’s instructions.
154
The samples were incubated at 95C for 15 min, followed by 35 cycles at 94C for 45 s,
155
60C for 90 s, and 72C for 1 min, with a final extension at 70C for 30 min. For
156
fragment analysis using capillary electrophoresis, 1.0 μL of PCR product was added to
157
8.5 μL of HI-DI deionized formamide (Life Technologies) and 0.5 μL of GeneScan 500
158
LIZ pattern size standard (Life Technologies). DNA fragments were separated by using
159
the ABI PRISM 3130 genetic analyzer (Life Technologies) and analyzed by using the
160
GeneMapper ID v.3.2 software (Life Technologies).
161
162
Analysis of genetic ancestry
163
Ancestry analysis was performed according to the method described by Santos et
164
al. [40] using 48 autosomal ancestry informative markers (AIMs). Three multiplex real
165
time-PCR reactions of 16 markers were performed and the amplicons were analyzed by
166
electrophoresis using the ABI Prism 3130 sequencer and GeneMapper ID v.3.2
167
software. The individual proportions of European, African, and Amerindian genetic
168
ancestries were estimated using STRUCTURE v.2.3.3 software, assuming three parental
169
populations (European, African, and Amerindian).
170
171
Statistical analysis
172
All statistical analysis and plotting were performed with the R package v.3.1.2
173
[41]. The comparisons between case and control participants in relation to the
XVI
174
categorical variables were tested in pairs by Chi-squared test. For the comparison of
175
ancestry index among the samples and age at diagnosis, we used Mann-Whitney test.
176
Logistic regression analyses were, performed by SNPassoc package v.1.9-2, carried out
177
to estimate additive model ORs and their 95% CIs were used to determine the
178
association strength between each genetic variation and CRC risk. All statistical tests
179
were based on a two-tailed probability and p-value < 0.05 was considered significant.
180
181
182
RESULTS
183
Demographic and clinical characteristics
184
We analyzed 140 subjects with CRC and 140 cancer-free individuals. Table 2
185
shows the demographic features of the groups. The case group was mainly composed of
186
females, while the control group had a higher proportion of males. The results showed a
187
statistically significant difference between the case and control groups in term of age at
188
diagnosis, gender and tobacco consumption. Regarding genomic ancestry, significance
189
was observed regarding African subjects (p-value = 0.049), Table 3. However, when
190
performed an analysis of multinomial logistic regression, there was no difference
191
between groups.
192
The clinical characteristics of the patients with CRC are listed in Table 4. The
193
first diagnosed prevalence was cancer in the rectosigmoid site (82.1%). Using the
194
guidelines of The American Joint Committee on Cancer (AJCC) staging system to
195
classify clinical and pathologic staging, the predominance of stage III (29.3%) is shown.
196
Additionally, they were followed-up for up to 18 years (median: 3 years).
197
198
Distribution of genotypes associated with susceptibility to CRC
XVII
199
Genotypic and allelic frequencies of the subjects are presented in the Table 5.
200
Genotypic frequency (p-value = 0.01) and allelic frequency (p-value = 0.01) of IL4 gene
201
polymorphism were significantly different between cases and controls when comparing
202
the prevalence of two (D) and three (I) tandem repeats of 70 bp in intron 3. Patients with
203
CRC presented higher frequency of two tandem repeats than the controls.
204
All analyses of polymorphism association were performed by logistic regression
205
analyses to the additive model (Table 5). The adjusted variables were age at diagnosis,
206
gender, alcohol consumption, tobacco consumption and ancestry distribution. Allele D
207
of the studied polymorphism in the IL4 gene was associated with an increased risk of
208
CRC development (p-value = 0.001). The allele insertion in the TYMS gene was also
209
associated with increased risk of developing CRC (p-value = 0.0165).
210
No statistical significance was detected when polymorphisms in ACE, CASP8,
211
CYP2E1, SGSM3, CYP19A1, HLAG, IL1A, MDM2 NFKB1, TP53 [16 and 6 bp], UCP2,
212
UGT1A1, and XRCC1 genes were analyzed using single and multiple logistic
213
regression.
214
215
DISCUSSION
216
Despite effective strategies for prevention, early detection, and treatment, [42]–
217
[47] there continue to differences in CRC incidence and survival by ethnicity [48], [49].
218
Specifically, African Americans have higher CRC incidence and lower 5-years survival
219
rates than other ethnic groups [48], [49].
220
In the present study, we evaluated the association between 14 INDEL (ACE,
221
CASP8, SGSM3, CYP19A1, CYP2E1, HLAG, IL1A, MDM2, NFKB1, TP53 [16 and 6
222
bp], TYMS, UCP2, and XRCC1) and 2 VNTR (IL4 and UGT1A1) and the risk of
223
developing CRC in a Brazilian population. To the best of our knowledge, this is the first
XVIII
224
study attempting to identify the association of these INDEL and VNTR polymorphisms
225
with CRC in this admixed population.
226
We observed that the VNTR polymorphisms in intron 3 of the IL4 gene
227
(rs79071878) and INDEL in the 3-untranslated region (UTR) of TYMS gene
228
(rs151264360) were associated with an increased risk of CRC. This is especially
229
important because it corroborates with other studies performed in different populations.
230
This study also evaluated the ancestry contribution of all subjects. Our results
231
showed that the cases and controls were significance different in relation to African
232
ancestry contribution. This finding is consistent with others studies have also suggested
233
that African Americans patients may have a higher prevalence of CRC compared with
234
others patients [50]–[52], and may have genetic association [53]. However, when
235
stratifying the African contribution between the groups every 10%, this difference was
236
lost; and more studies should be conducted to confirm the findings.
237
Studies exploring the relative contribution of ancestry in Brazilian populations
238
through autosomal genomics also showed higher European contribution across all
239
regions of the country [54], despite some variations in their estimations, as shown by
240
Santos et al. [55] (African = 50%, European = 43%, and Amerindian = 7% in Bahia
241
state), Pinto et al. [56] (European = 46.1%, American = 30.3%, and African = 23.6% in
242
Pará state), and Carvalho et al. [24] (European = 50.5%, American = 29.4%, and
243
African = 20.4% in Pará state).
244
In addition, Carvalho et al. [24] observed that ancestry distribution may
245
influence the susceptibility to cancer development and Cassiano et al. [39]
246
demonstrated that ancestry distribution impact on the distribution of gene
247
polymorphisms.
XIX
248
Variations in the IL-4 activity or in the IL-4 receptor due to mutations have been
249
associated with cell proliferation and might affect signal transduction pathways in
250
cancer [29]. We evaluated the VNTR of two and three tandem repeats of 70 bp in intron
251
3 of the IL4 gene (rs79071878), a variation that may influence the production of this
252
cytokine, and has been associated with gastric cancer [29] and other immunologic
253
diseases [57], [58]. However, this is the first study indicating an association between
254
this IL4 polymorphism and the risk of developing CRC.
255
Furthermore, higher IL-4 production may result in the escape of tumor cells
256
from immune surveillance due to diminished cell-mediated immune response. The cell-
257
mediated immune response may be inhibited by downregulating the expression of Th1
258
cytokines and by decreasing the quantity and quality of the CD8+ T-cell response in the
259
tumor microenvironment [29], [59], [60].
260
We showed a high frequency of the VNTR three tandem repeat allele in patients
261
with CRC (I = 0.69, I/I = 0.49, and I/D = 0.40) and controls (I = 0.79, I/I = 0.60, and I/D
262
= 0.37). Nakashima et al. [59] showed that allele and genotype frequency of this VNTR
263
in Japanese and Caucasian populations were strikingly different.
264
Moreover, allele D was more prevalent in Japanese (D = 0.67, D/D = 0.45, and
265
I/D = 0.45, 216 participants) than in Caucasian subjects (D = 0.09, D/D = 0, and I/D =
266
0.18, 246 participants) [59]. These results suggest that the higher frequency of allele I in
267
our population may be related to the high Caucasian contribution, confirmed by Amador
268
et al [61].
269
The logistic regression analysis indicated that the D allele was associated with
270
the risk of developing CRC (I vs. D, OR = 2.79, 95% CI = 1.48–5.26) and are consistent
271
with the data reported by Canbantous et al. [58] and Nakashima et al. [59].
XX
272
Nakashima et al. [59] observed significant differences among genotypes in the
273
IL-4 producing proportion of peripheral Th cells using an intracellular cytokine
274
detection assay and that the D allele may lead to IL-4 overexpression. These results
275
were confirmed by Canbantous et al. [58].
276
The TYMS gene plays an essential role in the biosynthesis of the DNA-
277
component thymidylate (dTTP) and is required for DNA replication and repair [62].
278
The insertion of 6 bp in the 3-UTR of TYMS primary transcript (rs151264360) may
279
significantly influence gene expression as shown by using a luciferase assay [14].
280
Studies indicate that it is associated with breast [63], gastric [64], colorectal [65], [66],
281
and other types of cancer [65], [67].
282
In our study, no statistical significance was observed when analyzing the
283
prevalence of allele (p-value = 0.311) and genotype (p-value = 0.459) polymorphisms
284
between the cases and controls. However, insertion polymorphism was more prevalent
285
in cases (I = 0.68, I/I = 0.46, and D/I = 0.44) and controls (I = 0.64, I/I = 0.43, and D/I =
286
0.42). These results were according with the findings reported by Gallegos-Arreola et
287
al. [66], who compared 253 patients with CRC and 200 controls from Mexico.
288
The logistic regression indicated that insertion of 6bp was associated with
289
increased CRC risk development (D vs. I, OR = 2.04, 95% CI = 1.11–3.85, p-value =
290
0.0165), consistent with Mandola et al. [14] and Rahman et al. [68] in vitro results.
291
Mandola et al. [14] demonstrated that this polymorphism insertion may increase
292
TYMS mRNA stability and TYMS protein expression. Moreover, Rahman et al. [68]
293
showed that TYMS overexpression may induce the transformation of mammalian cells
294
into a malignant phenotype.
295
296
CONCLUSIONS
XXI
297
In summary, in this case-control study, we showed that polymorphisms in IL4
298
(rs79071878) and TYMS (rs151264360) genes were associated with increase in CRC
299
risk. This is the first study about these polymorphisms with CRC in the Brazilian
300
population and demonstrated to be a promising research field.
301
302
303
DATA AVAILABILITY
Data are available upon request to the corresponding author.
304
305
DECLARATIONS
306
Abbreviations:
307
CRC - Colorectal Cancer; SNPs - Single Nucleotide Polymorphisms; INDEL -
308
Insertion-Deletions; ACE - Angiotensin I Converting Enzyme; CASP8 - Caspase 8,
309
Apoptosis-Related Cysteine Peptidase; SGSM3 - Small G Protein Signaling Modulator
310
3; CYP19A1 - Cytochrome P450, Family 19, Subfamily A, Polypeptide 1; CYP2E1 -
311
Cytochrome P450, Family 2, Subfamily E, Polypeptide 1; HLAG - Major
312
Histocompatibility Complex, Class I, G; IL1A - Interleukin 1, Alpha; IL4 - Interleukin
313
4; MDM2 - MDM2 Proto-Oncogene, E3 Ubiquitin Protein Ligase; NFKB1 - Nuclear
314
factor of Kappa Light Polypeptide Gene Enhancer in B-Cells 1; TP53 - Tumor Protein
315
P53; TYMS - Thymidylate Synthetase; UCP2 - Uncouplin Protein 2 (Mitochondrial,
316
Proton Carrier); UGT1A1 - UDP Glucuronosyltransferase 1 Family, Polypeptide A1;
317
XRCC1 - X-Ray Repair Complementing Defective Repair in Chinese Hamster Cells 1;
318
VNTR - Variable Number Tandem Repeat; II - Insertion Homozygous Genotype; ID -
319
Heterozygous Genotype; DD - Deletion Homozygous Genotype; OR - Odds Ratio; 95%
320
CI - Confidence Interval
321
XXII
322
Competing interests:
323
The authors declare that they have no competing interests.
324
325
Author contributions:
326
AKCRS, SEBS, ADL, and VNS conceived of the study, and participated in its
327
design and coordination. DM, LRFC and LLFC carried out the experiments. DM,
328
SEBS, RSC, AMPB, FRI, CCOR and VNS performed the statistical analysis. VNS,
329
ADL, RHB SEBS and AKCRS contributed reagents/materials/analysis tools. DM, VNS
330
e RHB helped to draft the manuscript. All authors read and approved the final
331
manuscript.
332
333
Acknowledgments:
334
We thank all participants who allowed us to carry out this study. We are also
335
grateful to the students and technicians from LGHM/UFPA/PA and LBBM-
336
LABMULT/UFRN/RN. DM, LLFC, and RHB were recipients of fellowships from
337
CAPES, and LRFC was the recipient of a fellowship from CNPq during this study.
338
339
Funding:
340
VNS received financial support by CNPq (protocol 483031/2013-5), and
341
FAPERN (protocol 005/2011). AKCRS received financial support by CAPES (protocol
342
051/2013) and FAPESPA (protocol 155/2014). The funders had no role in study design,
343
data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
344
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XXXII
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633
634
635
636
637
638
639
Table 1. List of polymorphisms analyzed in this study and its dbSNP, primers
sequence, and amplicon length.
Amplicon
Gene [variation bp] dbSNP
Primers sequence (5'...3')
length
ACE [318 bp]
rs4646994
F – ATCCTGTAAGCCACTGCTGGA
94–382 bp
R – GGCGAAACCACATAAAAGTGA
CASP8 [6 bp]
rs3834129
F – CTCTTCAATGCTTCCTTGAGGT
249–255 bp
R– TGCATGCCAGGAGCTAAGTAT
SGSM3 [4 bp]
rs56228771
F – CTAGTAGGCTCCTGGCCTCTTT
117–121 bp
R– CAGAACCTTGGACCTGAATAC
CYP2E1 [96 bp]
F– GTCCCAATACAGTCACCTCTTT
397–493 bp
R– GGCTTTTATTTGTTTTGCATCTG
CYP19A1 [3 bp] rs28892005
F– TGCATGAGAAAGGCATCATATT
122–125 bp
R– AGGCACATTCATAGACAAAAA
HLAG [14 p]
rs371194629
F– TGTTTAAAGTGTCACCCCTCAC
192–206 bp
R – CAGTTCAGCATGAGGAAGAGG
IL1A [4 bp]
rs3783553
F – TGGTCCAAGTTGTGCTTATCC
230–234 bp
R – ACAGTGGTCTCATGGTTGTCA
a, b
IL4 [70 bp]
rs79071878
F – GGGTCAGTCTGGCTACTGTGT
217–287 bp
R – AAATCTGTTCACCTCAACTGC
MDM2 [40 bp]
rs3730485
F – GGAAGTTTCCTTTCTGGTAGGC
192–232 bp
R – TTTGATGCGGTCTCATAAATTG
NFKB1 [4 bp]
rs28362491
F – ATGGACCGCATGACTCTATCA
366–370 bp
R – GGCTCTGGCATCCTAGCAG
TP53 [16 bp]
rs17878362
F – GGGACTGACTTTCTGCTCTTGT
148–164 bp
R– GGACTGTAGATGGGTGAAAAG
TP53 [6 bp]
rs17880560
F – TCCATTCATAACTCAGGAACCA
135–141 bp
R – TTAAATCCCGTAATCCTTGGTG
TYMS [6 bp]
rs151264360
F– TCCAAACCAGAATACAGCACA
213–219 bp
R– TCAAATCTGAGGGAGCTGAGT
UCP2 [45 bp]
F – CCCACACTGTCAAATGTCAACT
119–164 bp
R – CCATGCTTTCCTTTTCTTCCT
a, c
UGT1A1 [2 bp]
rs8175347
F – CTCTGAAAGTGAACTCCCTGCT
135–137 bp
R – AGAGGTTCGCCCTCTCCTAT
XRCC1 [4 bp]
rs3213239
F– AACCAGAATCCAAAAGTGACC
243–247 bp
R– GGGAAGAGAGAGAAGGAGAG
dbSNP = Register of genetic variation; bp = Base pairs; F = Forward; R = Reverse; a =
Variable Number Tandem Repeat (VNTR); b = Two and Three Tandem Repeat of 70
bp; c = Six and Seven Tandem Repeat of 2 bp.
33
640
641
642
643
644
645
646
647
Table 2. Participant demographic and clinical characteristics and their
stratification by case and control groups.
Characteristic
Total n = 280 Cases n = 140 Controls n = 140
p-value
Age (years)
48 (21–93)
59 (23–93)
37 (21–81)
< 0.001
< 45
136 (48.7)
23 (16.5)
113 (80.7)
≥ 45
144 (51.3)
116 (83.5)
27 (19.3)
Gender
< 0.001
Male
172 (61.6)
62 (44.6)
110 (78.6)
Female
108 (38.4)
78 (55.4)
30 (21.4)
Alcohol cons.
< 0.001
Never
180 (65.1)
118 (85.5)
62 (44.9)
Already
96 (34.9)
20 (14.5)
76 (55.1)
Eventually
56 (20.4)
11 (8.0)
45 (32.6)
Frequently
40 (14.5)
9 (6.5)
31 (22.5)
Tobacco cons.
< 0.001
Never
182 (65.4)
68 (48.9)
114 (82.0)
Already
96 (24.6)
71 (48.1)
25 (18.0)
Former
66 (23.8)
55 (39.6)
11 (7.9)
Current
30 (10.8)
16 (11.5)
14 (10.1)
Categorized data are presented by absolute numbers of individuals (percentage) and
analyzed by chi-square test. Continuous data are presented by mean (min–max) and
analyzed by Mann-Whitney test. Significant p-values are shown in bold. Age = Age at
diagnosis; Alcohol cons. = Alcohol consumption; Tobacco cons. = Tobacco
consumption.
34
648
Table 3. Genetic ancestry distribution between case and control groups.
Genetic
Total
Cases
Controls
OR [95% CI]
p-value
ancestry (%)
n = 280
n = 140
n = 140
European
65.3 (13.3–92.4) 64.2 (23.6–92.4) 66.4 (13.3–92.3)
0.243
95–80
50 (17.9)
21 (15.1)
29 (20.7)
1.0 [Reference]
80–70
70 (25.1)
33 (23.7)
37 (26.4)
1.23 [0.59–2.56]
0.577
70–60
67 (24.0)
38 (27.3)
29 (20.7)
1.81 [0.86–3.80]
0.117
60–50
47 (16.8)
22 (15.8)
25 (17.9)
1.21 [0.54–2.71]
0.634
50–40
26 (9.3)
14 (10.1)
12 (8.6)
1.61 [0.62–4.18]
0.327
40–30
11 (3.9)
6 (4.3)
5 (3.6)
1.66 [0.45–6.16]
0.451
30–20
7 (2.5)
5 (3.6)
2 (1.4)
3.45 [0.61–19.54]
0.161
20–10
1 (0.4)
1 (0.7)
Amerindian 16.2 (2.1–55.9)
16.0 (2.1–55.9)
16.3 (2.5–49.8)
0.645
02–10
90 (32.3)
45 (32.4)
45 (32.1)
1.0 [Reference]
10–20
113 (40.5)
60 (43.2)
53 (37.9)
1.13 [0.65–1.97]
0.661
20–30
47 (16.8)
18 (12.9)
29 (20.7)
0.62 [0.30–1.27]
0.193
30–40
21 (7.5)
11 (7.9)
10 (7.1)
1.10 [0.42–2.85]
0.844
40–50
7 (2.5)
4 (2.9)
2 (2.1)
2.00 [0.35–11.47]
0.437
50–60
1 (0.4)
1 (0.7)
African
18.6 (2.8–66.0)
19.8 (2.8–61.1)
17.3 (3.0–66.0)
0.049
02–10
81 (29.0)
36 (25.9)
45 (32.1)
1.0 [Reference]
10–20
89 (31.9)
41 (29.5)
48 (34.3)
1.07 [0.58–1.95]
0.832
20–30
66 (23.7)
38 (27.3)
28 (20.0)
1.70 [0.88–3.27]
0.114
30–40
28 (10.0)
15 (10.8)
13 (9.3)
1.44 [0.61–3.42]
0.405
40–50
8 (2.9)
5 (3.6)
3 (2.1)
2.08 [0.47–9.31]
0.337
50–60
5 (1.8)
3 (2.2)
2 (1.4)
1.87 [0.30–11.83]
0.504
60–70
2 (0.7)
1 (0.7)
1 (0.7)
1.25 [0.07–20.68]
0.876
649
Categorized data are presented by absolute numbers of individuals (percentage) and
650
analyzed by chi-square test. Continuous data are presented by mean (min–max) and
651
analyzed by Mann-Whitney test. Significant p-values are shown in bold.
652
653
654
655
35
656
657
658
659
660
661
662
663
Table 4. Clinical characteristics of patients with CRC at diagnosis and follow-up.
Characteristics
Cases n = 140
Tumor localization
25 (17.9)
Colon
115 (82.1)
Rectosigmoid
Tumor grade
130 (92.9)
G1, G2
10 (7.1)
G3, G4
Depth of invasion
1 (0.7)
T1, T2
114 (81.4)
T3, T4
Tx
25 (17.9)
Lymph node involvement
72 (51.4)
N0
42 (30.0)
N1, N2
26 (18.6)
Nx
Distant metastasis
106 (75.7)
M0
11 (7.9)
M1
23 (16.4)
Mx
AJCC stage
28 (20.0)
Stage I
38 (27.1)
Stage II
41 (29.3)
Stage III
11 (7.9)
Stage IV
22 (15.7)
Unknown
Year of diagnostic
2012 (1997–2014)
Follow-up since diagnosis (years) 3 (1–18)
40 (28.6)
Relapse, Yes
2 (1 – 8)
Relapse since diagnosis (years)
8 (5.7)
Death, Yes
4 (2 – 4)
Death since diagnosis (years)
Categorized data are presented by absolute numbers (percentage) and continuous data
are presented as median (min–max). Tumors were classified according to the guidelines
of the American Joint Committee on Cancer (AJCC) staging system.
36
Table 5. Genotype and allele frequency in percentage of patients with CRC and controls.
Caso/Controle (n = 140/140)
Gene
dbSNP
Genotype frequency
Allele frequency
II
ID
DD
p-value
I
D
p-value
ACE
rs4646994 21.0/14.3 49.3/54.3 29.7/31.4
0.335
45.7/41.4 54.3/58.6
0.315
CASP8
rs3834129 34.5/30.0 46.0/46.4 19.4/23.6
0.605
57.6/53.2 42.4/46.8
0.302
SGSM3
rs56228771
CYP19A1
rs11575899
CYP2E1
-
HLAG
7.2/3.6
OR [95% CI]f
p-value
1.62 [0.91–2.91]d
1.22 [0.72–2.07]e
0.0985
0.4554
30.2/36.4 62.6/60.0
0.274
22.3/21.8 77.7/78.2
0.883
0.91 [0.47–1.75]d
0.7802
35.8/37.9 49.6/50.0 14.6/12.1
0.82
60.3/62.9 39.7/37.1
0.83
1.16 [0.64–2.10]e
0.6345
90.6/92.6
0.342
1.99 [0.80–4.99]d
0.1397
0.7/0.7
17.3/12.9 82.0/86.4
0.588
9.4/7.1
rs371194629 14.7/13.6 43.4/50.0 41.9/36.4
0.538
36.4/38.6 63.6/61.4
0.597
1.14 [0.65–1.96]e
0.6618
IL1A
rs3783553
46.0/52.1 38.8/37.9 15.1/10.0
0.368
65.5/71.1 34.5/28.9
0.154
1.42 [0.83–2.45]e
0.1982
IL4a, b
rs79071878
48.9/60.0 40.3/37.1
10.8/2.9
0.017
69.1/78.6 30.9/21.4
0.01
2.79 [1.48–5.26]e
0.001
MDM2
rs3730485
50.4/50.7 43.2/37.1
6.5/12.1
0.219
71.9/69.3 28.1/30.7
0.49
1.37 [0.76–2.47]e
0.3001
NFKB1
rs28362491
38.1/40.7 46.0/42.1 15.8/17.1
0.806
61.2/61.8 38.8/38.2
0.877
1.30 [0.75–2.25]e
0.3483
TP53
rs17878362
3.6/1.4
27.3/32.1 69.1/66.4
0.383
17.3/17.5 82.7/82.5
0.941
1.13 [0.53–2.42]d
0.747
TP53
rs17880560
7.2/7.1
39.6/32.9 53.2/60.0
0.489
27.0/23.6 73.0/76.4
0.857
1.79 [0.98–3.24]d
0.0552
TYMS
rs151264360 46.0/42.9 43.9/42.1 10.1/15.0
0.459
68.0/63.9 32.0/36.1
0.311
2.04 [1.11–3.85]d
0.0165
35.3/44.3 58.1/46.4
0.149
24.3/31.4 75.7/68.6
0.06
0.63 [0.33–1.19]d
0.1471
11.5/10.8 44.6/46.0 43.9/43.2
0.785
33.8/33.8 66.2/66.2
1
0.69 [0.38–1.23]d
0.2043
UCP2
UGT1A1
a, c
rs8175347
6.6/9.3
XRCC1
rs3213239 41.7/42.9 47.5/45.0 10.8/12.1
0.894
65.5/65.4 34.5/34.6
0.978
0.94 [0.53–1.68]e 0.8403
Data are presented as the percentage of patients with CRC/percentage of controls. Chi-square test. Significant p-values are shown in bold. dbSNP
= Register of genetic variation on NCBI database; bp = Base pairs of DNA sequence; a = Variable Number Tandem Repeat (VNTR); b = Two (D)
and Three (I) Tandem Repeat of 70 bp; c = Six (D) and Seven (I) Tandem Repeat of 2 bp; d = D vs. I; e = I vs. D; f = Adjusted by age, gender,
alcohol consumption, tobacco consumption and ancestry distribution.
I