universidade federal do rio grande do norte centro de

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
ALTERAÇÕES MORFOFISIOLÓGICAS E MOLECULARES EM RESPOSTA
A ESTRESSES ABIÓTICOS EM MAMONA (Ricinus communis L.)
SARA CAROLINE PINTO DE ALMEIDA SANTOS
Natal – RN
2014
SARA CAROLINE PINTO DE ALMEIDA SANTOS
ALTERAÇÕES MORFOFISIOLÓGICAS E MOLECULARES EM RESPOSTA A
ESTRESSES ABIÓTICOS EM MAMONA (Ricinus communis L.)
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências Biológicas, do Centro de
Biociências da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre em Ciências
Biológicas.
Orientadora: Profª. Drª. Katia Castanho Scortecci
NATAL – RN
2014
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho ao meu esposo, Alan César.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por permitir que eu chegasse até aqui e por me dar forças para seguir
sempre em frente. A Ele toda honra e toda glória!
À minha mãe, Maria da Conceição e meu pai, Sergimar Morais, pela educação,
incentivo e apoio.
Aos meus irmãos, Sâmara Camila e Eduardo Otávio, pela confiança, apoio e
companheirismo em todos os momentos.
À minha avó, Luiza Alves, exemplo de perseverança e bondade, e meu avô,
Otaviano Pinto (in memoriam) por todo apoio, dedicação e por tudo que sou
hoje.
À minha tia, Maria das Dores e seu esposo, Francisco Alves, pelo apoio e por
me darem todo suporte necessário ao longo desta caminhada.
Aos meus queridos primos, Mateus Pacis, Ana Beatriz, Isadora Dulcis e João
Otaviano, por sempre torcerem por mim e me proporcionarem tantos
momentos de alegria em família.
Ao meu esposo, Alan César, pela compreensão, paciência, por me apoiar em
todos os momentos, por acreditar em mim e me encorajar diante de qualquer
obstáculo e por toda ajuda, inclusive, na montagem e realização de
experimentos. Muito obrigada!
À minha orientadora, Professora Katia Castanho, por confiar este trabalho a
mim e permitir que eu fizesse parte do seu grupo de pesquisa antes mesmo de
me conhecer.
Ao Grupo de Plantas, em especial à Helaine Cristiane (Cris) pela valiosa ajuda
no desenvolvimento deste trabalho e por todos os conselhos, obrigada é
pouco, Cris! À Kellya Barreto pelo auxílio nas análises histológicas e pelos
desenhos da mamona. À Marília Gabriela pela ajuda nos experimentos e pela
amizade. À Renata Kaline, Isabel Sousa, Ana Karina, Nathalia Medeiros e
Nildiane Canário pelo apoio, amizade e por proporcionarem tantos momentos
de descontração. À Emanuela Alves, pelas longas conversas, ajuda nos
experimentos, incentivo e por ter se tornado uma amiga tão especial. Aos
colegas que não fazem mais parte do Grupo de Plantas, Paulo Fernandes, Ana
Cecília e João Gabriel. Muito obrigada!
À Máira Milani e à EMBRAPA Algodão pelo fornecimento das sementes de
mamona e pelas análises do teor de óleo.
Ao Professor João Paulo Matos, pelas valiosas sugestões na qualificação e
pela disponibilidade em tirar dúvidas.
Ao Professor Hugo Alexandre de Oliveira Rocha, por disponibilizar o espaço do
Laboratório de Biotecnologia de Polímeros Naturais (BIOPOL) para realização
das atividades enzimáticas.
À Professora Adriana Uchôa, pela excelente contribuição no exame de
qualificação e por aceitar o convite para participar da banca de defesa.
À Professora Márcia Maria Auxiliadora Pinheiro Margis, por aceitar o convite
para participar da banca de defesa.
À Professora Cristiane Elizabeth Costa, por abrir as portas do Laboratório de
Estudos em Biotecnologia Vegetal, e a seus alunos, Bruno e Denilsson pelo
auxílio nas medições de condutividade elétrica.
Ao Professor Marcos Costa e à técnica Rebecca Diniz, do Instituto do Cérebro,
pelo auxílio nas análises de microscopia óptica.
Às técnicas de laboratório da UFRN, Verônica Aquino, Mayara Madja, Socorro
e Melina.
Aos meus professores e orientadores durante a graduação na Universidade do
Estado do Rio Grande do Norte (UERN), Katia Maria Barbosa e Silva, Cynthia
Cavalcanti de Albuquerque e Ramiro Gustavo Valera Camacho, vocês foram
espelhos para minha formação.
Aos amigos que fizeram parte do Laboratório de Cultura de Tecido Vegetal
(LCTV) da UERN, Maiza Azevedo, Marciana Morais, Jocileide Marinho, Fábio
Mesquita e, em especial, Ricardo Gonçalves e Valdiglêzia Mesquita, que
sempre me incentivaram a seguir a diante e alçar voos cada vez mais altos.
Muito obrigada por tudo, amigos!
À CAPES pelo suporte financeiro.
“Não devemos ficar alheios aos desafios arrebatadores que a vida traz.
Devemos contrabalançá-los com longos olhares para as conquistas de Deus.”
(Max Lucado)
RESUMO
A queima de combustíveis fósseis destaca-se dentre as atividades
humanas como a principal responsável pelo aumento de gases poluentes na
atmosfera que provocam mudanças climáticas. Diante deste cenário, têm se
buscado alternativas menos poluentes e danosas que os combustíveis fósseis.
Muito recurso tem sido investido em pesquisas em diferentes espécies vegetais
que possam ser utilizadas na produção do biodiesel. Dentre estas plantas está
a mamona (Ricinus communis L.), uma planta oleaginosa pertencente à família
Euphorbiaceae, considerada rústica e que não exige grande disponibilidade de
água para seu desenvolvimento e produção. Por possuir um óleo rico em um
ácido graxo incomum (ácido ricinoléico), tem sido apontada como uma
oleaginosa com grande potencial para o cultivo em regiões semiáridas, como o
Nordeste do Brasil. Considerando isto, este trabalho teve como objetivo
contribuir para a compreensão das respostas das plantas de mamona a
estresses abióticos (hídrico e salino) por meio de análises morfofisiológicas e
moleculares. Para isso, as plantas de mamona foram submetidas a condições
de estresse salino (50, 100, 150 e 200 mM de NaCl) em ambiente controlado e
estresse hídrico (5, 10, 15 dias e 10 dias cíclico). Após os tratamentos, as
plantas foram sujeitas a diferentes análises quanto ao efeito dos estresses: a)
na expansão e retenção de água nas folhas; b) na anatomia foliar e de raízes.
Diante dos resultados obtidos, verificamos que a mamona sofreu diminuição de
área foliar com o aumento do estresse, no entanto restringiu a perda de água,
provavelmente pelo acúmulo de solutos compatíveis nas folhas. Alterações nas
estruturas do sistema vascular também foram observadas, no entanto,
inferimos que a mamona pode resistir ao estresse hídrico moderado (5 dias) e
ao estresse salino até 100 mM de NaCl, evitando a perda de água, mantendo o
turgor celular. Os dados obtidos neste trabalho auxiliaram na compreensão do
comportamento da mamona em condições de estresse abiótico, hídrico e
salino, assim como, na recuperação hídrica da planta após a retomada das
regas.
Palavras-chave: Oleaginosa; estresse hídrico; estresse salino; anatomia;
biblioteca subtrativa.
ABSTRACT
The use of fossil fuels has been considered one of reason for the
increase of pollution in the atmosphere and it may be related to the climate
changes. Then, the research of the new sources of fuels will be important.
Considering this, the use of biodiesel has been considered not as bad as petrol.
The castor bean (Ricinus communis L.) is an important oilseed, which belongs
to Euphorbiaceae family, and the oil found in the seed has important
characteristics for biodiesel. This plant is considered as “rustic” as it does not
need so much water for its development and oil production. Due to this, this
plant has been considered to be ideal in semi-arid regions, such as the
Northeast of Brazil. The aim of his study is to better understand the responses
to abiotic stresses (drought and salinity) from castor bean plants using
morphological, physiological and molecular tools. In order to do this, the castor
bean plants were subjected to salt stress (50, 100, 150 and 200 mM NaCl) in a
controlled environment and drought stress (5, 10, 15 days and 10 days cyclic).
After these treatments, these plants were subjected to different analyzes: a) the
expansion and retention of water from leaves; b) anatomy using leaves and
roots. Based on these results, we found that castor suffered decrease in leaf
area with increase drought stress, however restricted water loss, probably by
accumulation of compatible solutes in the leaves. The anatomy data showed
modifications in the vascular system. These modifications observed suggested
that castor bean plant may be resistant to stress as it was verified in 5 days of
drought as well as in 100 mM NaCl. In both conditions, these plants were fine.
Probably these plants keep some solutes in the cell and then maintain the cell
tugor. The data obtained in this study gave a better idea how castor bean plant
responds to abiotic stress conditions - drought and salt stress.
Keywords: Oilseed; drought stress; salt stress; anatomy; subtractive library.
LISTA DE ABREVIATURAS
% UMIDADE – Percentual de umidade no tecido
ABA – Ácido abscísico
CONAB – Companhia Nacional de Abastecimento
CRA – Conteúdo Relativo de Água
EDTA – Ácido etileno diamino tetracético
EROS – Espécies reativas de oxigênio
FAA – Formaldeído, álcool e ácido acético
NaCl – Cloreto de Sódio
NaOH – Hidróxido de Sódio
NBT - Nitro-blue tetrazolium
NPK – Nitrogênio, Fósforo e Potássio
SDS – Dodecil sulfato de sódio
ONG – Organização não governamental
PCR – Reação em cadeia de polimerase
pH – Potencial hidrogeniônico
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Comparativo de área e produção da mamona. Comparativo dos
estados da região Nordeste produtores de mamona safras de 2012/13 e
2013/14, de acordo o levantamento de janeiro de 2014 do boletim da CONAB.
......................................................................................................................... 19
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Mapa da produção agrícola de Mamona na safra 2013/14.
Destaque da produção de mamona para o estado da Bahia. Fonte:
Conab/IBGE. .................................................................................................... 18
Figura 2. Série histórica de área plantada com a cultura da mamona.
Comparativo da área plantada de mamona na região Nordeste das safras de
1990/91 a 2013/14 da Série Histórica do Plantio de Mamona da CONAB. ...... 20
Figura 3. Ilustração da Mamoneira, Ricinus communis L. Aspecto geral da
planta, ramo florífero (rf), flor masculina (fm), flor feminina (ff), fruto (f) e
semente (s). Modificado de www.plant-pictures.de. ......................................... 21
Figura 4. Esquema geral da síntese de triacilglicerol em plantas. No
plastídio ocorre a síntese de ácidos graxos. Os ácidos graxos sintetizados são
transportados para o citoplasma e na forma esterificada, chamada de Acil-CoA,
são incorporados em um esqueleto de glicerol, levando a formação de TAG. As
setas vermelhas indicam a via dependente de Acil-CoA (Via Kennedy). As
setas verdes indicam a via de biossíntese de TAG alternativa (Via
Independente de Acil-CoA). Nas formas ovaladas estão as enzimas envolvidas
na biossíntese de TAG: glicerol-3-fosfato aciltransferase (G3PAT), ácido
lisofosfatídico aciltransferase (LPAAT), ácido fosfatídico fosfatase (PAP),
diacilglicerol aciltransferase (DGAT), fosfolipídio: diacilglicerol aciltransferase
(PDAT) e colina fosfotransferase (CPT). ACP, proteína carreadora de acil; G3P, glicerol-3-fosfato; LPA, ácido lisofosfatídico; PA, ácido fosfatídico; DAG,
diacilglicerol; TAG, triacilglicerol; PC, fosfatidilcolina; LPC, lisofosfatidilcolina;
RE, retículo endoplasmático. Modificado de Cagliari et al., (2010). ................. 23
Figura 5. Esquema representativo do experimento de estresse hídrico em
plantas de Ricinus communis L., BRS Energia. Representação dos
tratamentos de restrição hídrica por 5, 10, 15 dias e 10 dias cíclico e coleta das
amostras ao fim de cada tratamento para análises. ......................................... 30
Figura 6. Folha de Ricininus communis representando as medidas
lineares obtidas para o cálculo da área foliar. Representação da quinta folha
expandida, utilizada para medição, onde a linha laranja, na horizontal
corresponde à largura (L) e a linha azul, na vertical, ao comprimento (C). . .... 31
Figura 7. Etapas de construção da biblioteca subtrativa de cDNA. (Retirado
de FERREIRA, 2008). ...................................................................................... 35
Figura 8. Fases do desenvolvimento da mamona. Representação
esquemática das fases do desenvolvimento da mamona, cultivar BRS Energia,
crescidas em casa de vegetação, desde a germinação da semente até a planta
adulta. Desenho ilustrado por Kellya Barreto. .................................................. 40
Figura 9. Plantas de Ricinus communis L., BRS Energia, submetidas a
diferentes períodos de estresse hídrico. A: Controle, com rega normal; B:
estresse hídrico de 5 dias; C: estresse hídrico de 10 dias; D: estresse hídrico
de 15 dias e E: estresse hídrico de 10 dias cíclico. Barra de 10 cm. ............... 41
Figura 10. Área foliar das plantas de mamona, BRS Energia, submetidas a
estresse hídrico. Médias de área foliar de plantas controle e plantas
submetidas ao estresse hídrico por 10 dias, 15 dias e 10 dias cíclico. As
plantas representadas como tratadas correspondem às plantas submetidas ao
estresse hídrico nos diferentes dias. Barras simbolizam o desvio padrão. (*)
corresponde a diferença significativa no intervalo de confiança de 95% (P
<0,05) pelo Teste de Tukey. ............................................................................. 42
Figura 11. Teor de umidade em folhas de Mamona, BRS Energia. Médias
do percentual de umidade de plantas controle e plantas submetidas ao
estresse hídrico por 5 dias, 10 dias, 15 dias e 10 dias cíclico. As plantas
representadas como tratadas correspondem às plantas submetidas ao estresse
hídrico nos diferentes dias. Barras simbolizam o desvio padrão. (*) corresponde
a diferença significativa no intervalo de confiança de 95% (P <0,05) pelo Teste
de Tukey........................................................................................................... 43
Figura 12. Seções transversais de folhas de Mamona, BRS Energia.
Seções de 10 µm de folhas de plantas cultivadas sem restrição hídrica, controle
(A) e com restrição hídrica de 5 dias (B), 10 dias (C), 15 dias (D) e 10 dias
cíclicos (E) coradas em Azul de Toluidina 0,05%, aumento de 10x. Barra de
200 µm. col: colênquima; pa: parênquima; fl: floema; xi: xilema; dr: drusa; pe:
parênquima esponjoso; ep ab: epiderme abaxial; pp: parênquima paliçádico; ep
ad: epiderme adaxial; cut: cutícula. .................................................................. 47
Figura 13. Seções transversais de raízes de Mamona, BRS Energia.
Seções de 10 µm de raízes de plantas cultivadas sem restrição hídrica,
controle (A) e com restrição hídrica de 5 dias (B), 10 dias (C), 15 dias (D) e 10
dias cíclicos (E) coradas em Azul de Toluidina 0,05%, aumento de 10x. Barra
de 200 µm. ep: epiderme; cor: córtex; pc: periciclo; mx: metaxilema; px:
protoxilema; cv: cilindro vascular. ..................................................................... 50
Figura 14. Modelo de respostas das plantas de mamona aos estresses
hídrico e salino. Esquema apresentando as alterações observadas em plantas
de mamona, BRS Energia, em resposta às condições de estresse hídrico e
salino. ............................................................................................................... 57
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 16
1.1 – Redução da emissão de gases e uso de biocombustível ....................... 16
1.2 – O agronegócio da Mamona ..................................................................... 17
1.3 - Ricinus communis L. ................................................................................ 21
1.4 - O estresse abiótico em plantas: estresse hídrico e salino ....................... 24
2. OBJETIVOS ................................................................................................. 27
2.1 - Objetivo Geral .......................................................................................... 27
2.2 - Objetivos Específicos ............................................................................... 27
3. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................. 28
3.1 – INDUÇÃO DE ESTRESSE HÍDRICO EM PLANTAS DE MAMONA ...... 28
3.1.1 – Delineamento experimental e análises estatísticas .............................. 31
3.2 – ANÁLISE DE ÁREA FOLIAR E TEOR DE UMIDADE NA FOLHA .......... 31
3.3 – ANÁLISE ANATÔMICA ........................................................................... 32
3.4 - EXTRAÇÃO DE RNA ............................................................................... 33
3.5 - CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECAS SUBTRATIVAS DE cDNA ............... 34
3.5.1 - Ligação.................................................................................................. 35
3.5.2 - Precipitação da ligação ......................................................................... 35
3.5.3 – Clonagem e transformação de bactérias .............................................. 36
3.5.4 – Extração do DNA plasmidial em pequena escala – Miniprep ............... 37
3.5.5 – Reação de sequenciamento e precipitação de DNA ............................ 38
3.6 – SEQUENCIAMENTO E BUSCA EM BANCO DE DADOS ...................... 39
4 – RESULTADOS ........................................................................................... 40
4.1 – Obtenção das plantas para tratamentos de estresse hídrico .................. 40
4.2 - Tratamentos de estresse hídrico .............................................................. 41
4.3 – Análise de área foliar e teor de umidade na folha ................................... 42
4.4 – Análise anatômica ................................................................................... 43
4.5 – Bibliotecas subtrativas de cDNA ............................................................. 51
5. DISCUSSÃO ................................................................................................ 52
6. CONCLUSÃO............................................................................................... 58
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................. 59
16
1 - INTRODUÇÃO
1.1 – Redução da emissão de gases e uso de biocombustível
O impacto causado no ambiente pelo uso de combustíveis fósseis tem
proporcionado diversas consequências, como as mudanças climáticas e o
aumento da concentração de CO2 na atmosfera, causando o efeito estufa
(LIMA, 2005). O quinto Relatório sobre Impactos, Adaptação e Vulnerabilidade
às Mudanças Climáticas do Painel Intergovernamental sobre Mudanças
Climáticas (IPCC, em inglês), apresentado em março deste ano, traz um
capítulo que aborda as projeções das mudanças climáticas para as Américas
do Sul e Central. A vulnerabilidade do abastecimento de água das regiões
semiáridas será aumentada devido às mudanças climáticas estimadas, além da
redução das geleiras andinas, diminuição de chuvas e aumento da
evapotranspiração, causando fortes impactos nos setores de geração de
energia hidrelétrica e agricultura (IPCC, 2014).
Contudo, este relatório destaca que a redução da emissão de gases,
principalmente CO2, decorrente de queimadas, desmatamento e queima de
combustíveis fósseis, de forma rápida poderá diminuir a severidade dos
impactos. Para alcançar este objetivo, o relatório sugere algumas práticas para
a adaptação às mudanças climáticas, como o melhoramento genético de
culturas para resistir aos eventos climáticos extremos e que possibilitem o
plantio em áreas já degradadas, sem a necessidade de expansão para áreas
preservadas, evitando o desmatamento, assim como, a implementação de
projetos de energias renováveis para aumentar o conhecimento sobre culturas
produtoras de energia (IPCC, 2014).
Sob este aspecto, vê-se a necessidade de investir em recursos
energéticos renováveis e que colaborem na redução da emissão de gases, tais
como os biocombustíveis. A produção de biodiesel a partir de óleos vegetais
tem despertado o interesse dos produtores, do governo e das instituições de
pesquisa. A Lei nº 11.097, de 13 de janeiro de 2005, define o biocombustível
como “combustível derivado de biomassa renovável para uso em motores a
combustão interna ou, conforme regulamento para outro tipo de geração de
17
energia, que possa substituir parcial ou totalmente combustível de origem
fóssil” e insere o biodiesel na matriz energética brasileira determinando a
adição do biodiesel ao diesel mineral. A partir de janeiro de 2008 a mistura de
2% de biodiesel (B2) ao diesel mineral foi obrigatória no Brasil. Desde janeiro
de 2010 a mistura utilizada é a denominada de B5, mistura de 5% de biodiesel,
conforme a Resolução nº 6/2009 do Conselho Nacional de Política Energética
(CNPE), publicada no Diário Oficial da União (DOU) em 26 de outubro de 2009.
Dentre as espécies com potencial para a produção do biocombustível
destaca-se a mamona (Ricinus communis L.) uma planta disseminada pelo
mundo todo, pelo fato de ser rústica, conseguindo alcançar elevada produção
de biomassa em lugares de baixa precipitação pluvial (BARROS-JUNIOR et al.,
2008; COSCIONE; BERTON, 2009).
1.2 – O agronegócio da Mamona
O Brasil já foi o principal produtor de mamona do mundo, entre 1975 até
o final da década de 1980, até ser superado pela Índia e China na década de
1990, devido a deficiências tecnológicas e falta de investimento (ONG
REPÓRTER BRASIL, 2008). Hoje, o Brasil ocupa a terceira posição no ranking
dos maiores países produtores de mamona do mundo e, junto com a Índia e a
China, representa mais de 90% da produção mundial de mamona.
A partir da safra de 1996/97, o Brasil teve um aumento da produção de
mamona, devido a um estímulo governamental, elevando a produtividade para
747 kg/ha, o que foi mais do que o dobro obtido na safra anterior (1995/96),
que foi de 355 kg/ha (EMATERCE, 2007).
Com o lançamento do Programa Nacional de Produção e Uso do
Biodiesel (PNPB), em 2004, o governo federal incentiva a expansão do plantio
da mamona, com o objetivo de fortalecer a agricultura familiar, uma vez que
esta seria a principal produtora de matérias-primas para produção do biodiesel.
O PNPB criou instrumentos como o Selo Combustível Social concedido pelo
Ministério de Desenvolvimento Agrário (MDA), o qual estabelece as condições
para os produtores industriais de biodiesel obter benefícios tributários e
financiamentos, desde que, entre outras coisas, o produtor industrial adquira
18
matéria-prima de agricultores familiares e garanta assistência e capacitação
técnica (BRASIL, 2004).
No Brasil, a região Nordeste é a maior produtora de Mamona, sendo os
principais produtores Bahia, Ceará, Piauí e Pernambuco, sendo a Bahia a
maior produtora de mamona no país, como ilustrado na figura 1.
Figura 1. Mapa da produção agrícola de Mamona na safra 2013/14.
Destaque da produção de mamona para o estado da Bahia. Fonte:
Conab/IBGE.
De acordo com o Boletim de Acompanhamento da Safra Brasileira de
Grãos da Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB) (CONAB, 2014)
19
emitido em janeiro deste ano, as expectativas de safra de mamona são boas,
com excelente crescimento na produção nacional, puxada pela retomada na
produção na Bahia, que sofreu uma grande quebra na safra passada devido à
seca na região nordeste, que foi severa nos últimos dois anos e prejudicou a
agricultura como um todo na região. Na tabela 1 estão os dados de área
plantada, em mil hectares (ha) e de produção, em mil toneladas, para as safras
de 2012/13 e 2013/14 de mamona nos estados principais produtores da cultura
na região Nordeste do Brasil, Bahia (BA), Ceará (CE), Pernambuco (PE) e
Piauí (PI). Comparando as duas safras, observamos um aumento de 48,4 mil
ha de área plantada no estado da Bahia para esta safra, enquanto nos estados
do Ceará e Pernambuco não houve aumento da área e no Piauí um discreto
aumento de 0,4 mil ha. Quanto à produção, são estimados aumentos em todos
os estados para esta safra. Para a Bahia um significativo aumento de 64,5 mil t,
seguido pelo Ceará, com aumento de 2,1 mil t, Pernambuco 0,2 mil t e Piauí
0,6 mil t.
Tabela 1. Comparativo de área e produção da mamona. Comparativo dos
estados da região Nordeste produtores de mamona safras de 2012/13 e
2013/14, de acordo o levantamento de janeiro de 2014 do boletim da CONAB.
ÁREA (Em mil ha)
Safra 2012/13 Safra 2013/14
PRODUÇÃO (Em mil t)
Safra 2012/13
Safra 2013/14
BA
CE
PE
PI
69,2
12,8
1,4
1,0
117,6
12,8
1,4
1,4
11,5
1,8
0,4
0,1
76,0
3,9
0,6
0,7
NE
84,4
133,2
13,8
81,2
Nos últimos 20 anos o plantio da mamona no Brasil sofreu grandes
oscilações, como é possível observar na figura 2, na qual estão os dados da
Série Histórica do Plantio da Mamona da Conab, para área plantada. Após uma
grande queda no início da década de 1990, houve uma recuperação gradativa
e na safra de 2004/05, atingiu uma área plantada de 207,6 mil hectares, a
maior área alcançada depois da decadência, isto pode ter ocorrido devido ao
incentivo promovido aos pequenos produtores pelo PNPB.
20
Segundo a ONG Repórter Brasil (2008) a decadência da cultura da
mamona na década de 1990 foi causada pelo abandono do melhoramento de
variedades e do manejo, destacando ainda, que sua produtividade depende
acima de tudo, da demanda a produção de variedades de ciclo curto,
adaptadas às novas e diversas condições climáticas, e com qualidade de óleo
compatível com as exigências da indústria do biodiesel.
Portanto, o cultivo da mamona pode, sim, ser uma fonte de renda para
comunidades rurais do nordeste brasileiro, fortalecendo a agricultura familiar,
uma vez que em um hectare de mamona é possível produzir mais de 1.000
litros de biodiesel por ano (O Biodiesel e a Inclusão Social, 2003), também
levando-se em consideração a consorciação da cultura da mamona com outras
culturas, como o feijão. Entretanto, são necessários investimentos em
tecnologias para melhoramento da mamona, manejo do solo e produção de
sementes de qualidade.
Figura 2. Série histórica de área plantada com a cultura da mamona.
Comparativo da área plantada de mamona na região Nordeste das safras de
1990/91 a 2013/14 da Série Histórica do Plantio de Mamona da CONAB.
21
1.3 - Ricinus communis L.
A mamona (figura 3), também conhecida por rícino, palma-christi, palmadecristo, carrapateira, bafureira, figueira do inferno, enxerida, regateira, entre
outras (BELTRÃO et al., 2001; RODRIGUES et al., 2002), pertence à família
Euphorbiaceae (BARROS-JUNIOR et al., 2008), que agrupa espécies de
grande importância econômica, com destaque para
mandioca (Manihot
esculenta Crantz), uma das principais fontes de amido para a alimentação
humana, a seringueira (Hevea brasiliensis Müll.Arg.), principal fonte de
borracha natural (CARUZO, 2010) e o pinhão-manso (Jatropha curcas L.), uma
planta oleaginosa que, assim como a mamona, tem sido alvo de pesquisas
para a produção do biodiesel.
A classificação taxonômica da mamona é feita da seguinte forma, de
acordo com o Taxonomy Browser, do National Center for Biotechnology
Information - NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/):
Super Reino: Eucaryota
Reino: Viridiplantae
Filo: Streptophyta
Superdivisão: Spermatophyta
Divisão: Magnoliophyta
Classe: Magnoliopside
Subclasse: Rosidae
Ordem: Malpighiales
Família: Euphorbiaceae
Subfamília: Acalyphoideae
Tribo: Acalypheae
Gênero: Ricinus
Espécie: Ricinus communis L.
Figura 3. Ilustração da Mamoneira, Ricinus
communis L. Aspecto geral da planta, ramo
florífero (rf), flor masculina (fm), flor feminina (ff),
fruto (f) e semente (s). Modificado de www.plantpictures.de.
22
A espécie em questão é originária da região Norte da África (JOLY,
2002) e chegou ao Brasil no período da colonização por intermédio dos
escravos africanos (MOREIRA et al., 1996). A adaptação da mamona às
condições edafoclimáticas do Brasil foi imediata, podendo ser encontrada em
praticamente todas as regiões do país de forma espontânea (MILANI et al.,
2009).
A cultivar de mamona objeto desse estudo é a BRS Energia, que foi
desenvolvida pela Embrapa com participação na validação dos genótipos da
Empresa de Pesquisa Agropecuária do Rio Grande do Norte (EMPARN). Esta
cultivar destaca-se pelo seu ciclo curto (dias após a emergência) que dura de
110 a 140 dias entre a germinação e a maturação dos últimos racemos,
metade do ciclo das cultivares BRS Nordestina e BRS Paraguaçu (EMBRAPA,
2011). A precocidade é uma das principais características do cultivar BRS
Energia, cujo ciclo médio é de 120 dias entre a germinação e a maturação dos
últimos racemos. A produtividade média da BRS Energia é de 1.800 kg.ha-1,
sob as mesmas condições edafoclimáticas das demais cultivares. A altura
média da planta é de 1,40 m, sendo considerada planta de baixo porte, o peso
de 100 sementes situa-se em torno de 53 g, além disso, os frutos da BRS
Energia são indeiscentes (EMBRAPA, 2007), esta característica que permite
uma colheita de modo programado, pois os frutos não caem no solo como os
das demais cultivares.
O teor do óleo na semente de mamona varia entre 35 % e 55 %, sendo o
padrão comercial 44 % (FREIRE et al., 2006), o seu principal constituinte são
os triacilgliceróis de ácido ricinoleico, cerca de 90 %, um ácido graxo incomum
devido às suas propriedades físicas e químicas únicas. Este ácido graxo faz
do óleo de mamona uma matéria-prima vital para o ramo industrial, podendo
ser aplicado em diversas áreas, como na produção de cosméticos, tintas,
revestimentos, lubrificantes, polímeros e compostos antifúngicos (CHIERICE;
CLARO-NETO, 2007; DRYER et al., 2008).
A biossíntese de triacilgliceróis (TAGs) na semente, como apresentada
na figura 4, começa com a síntese dos ácidos graxos (16:0 e 18:0) e a
desaturação do ácido esteárico originando ácido oléico (18:1) no plastídio, que
são exportados para o citoplasma e complexados à coenzima A (CoA),
formando Acil-CoA. No retículo endoplasmático (RE) o ácido oleico é
23
transferido para fosfatidilcolina (PC) para produzir ácido linoleico (18:2) e ácido
linolênico (18:3) (figura 4). Estes ácidos são incorporados por um esqueleto de
glicerol por sucessivas reações de acilação, produzindo, dessa forma, os
TAGs. Existem duas vias metabólicas distintas para a produção de TAGs, uma
dependente de acil-CoA e outra independente de acil-CoA, denominada Via
Kennedy (SOMERVILLE et al., 2000), indicadas na figura 4 pelas setas verdes
e vermelhas, respectivamente.
Figura 4. Esquema geral da síntese de triacilglicerol em plantas. No
plastídio ocorre a síntese de ácidos graxos. Os ácidos graxos sintetizados são
transportados para o citoplasma e na forma esterificada, chamada de Acil-CoA,
são incorporados em um esqueleto de glicerol, levando a formação de TAG. As
setas vermelhas indicam a via dependente de Acil-CoA (Via Kennedy). As
setas verdes indicam a via de biossíntese de TAG alternativa (Via
Independente de Acil-CoA). Nas formas ovaladas estão as enzimas envolvidas
na biossíntese de TAG: glicerol-3-fosfato aciltransferase (G3PAT), ácido
lisofosfatídico aciltransferase (LPAAT), ácido fosfatídico fosfatase (PAP),
diacilglicerol aciltransferase (DGAT), fosfolipídio: diacilglicerol aciltransferase
(PDAT) e colina fosfotransferase (CPT). ACP, proteína carreadora de acil; G3P, glicerol-3-fosfato; LPA, ácido lisofosfatídico; PA, ácido fosfatídico; DAG,
diacilglicerol; TAG, triacilglicerol; PC, fosfatidilcolina; LPC, lisofosfatidilcolina;
RE, retículo endoplasmático. Modificado de Cagliari et al. (2010).
24
Estudos indicam que na semente de mamona o ácido oleico (18:1) sofre
um processo de hidroxilação no RE, através da atividade da enzima hidroxilase
oleato (FAH 12), a qual adiciona um grupamento hidroxila (OH) no ácido oleico
produzindo ácido ricinoleico (C18:1-OH), seguindo a via de biossíntese de
ácidos graxos padrão (SOMERVILLE et al., 2000 apud CAGLIARI et al., 2010).
1.4 - O estresse abiótico em plantas: estresse hídrico e salino
Os estresses abióticos impostos pela seca, salinidade e temperaturas
extremas representam sérias ameaças ao desenvolvimento e produtividade de
diversas plantas cultivadas em todo o mundo (AHUJA et al., 2010 apud SAAD
et al., 2012). Constantemente, o termo estresse é utilizado para descrever as
respostas dos organismos submetidos aos fatores ambientais potencialmente
desfavoráveis à vida (PLAUT, 1995). A baixa disponibilidade de água, sem
dúvida é considerada um dos principais fatores que afetam a produtividade e o
desenvolvimento de espécies vegetais de interesse econômico (LUÍS, 2009).
Um grande número de processos fisiológicos, bioquímicos e moleculares é
alterado em resposta ao estresse hídrico, tanto a nível molecular, quanto ao
nível fisiológico do organismo (BHARGAVA; SAWANT, 2013).
O déficit hídrico reduz o crescimento das plantas, afetando vários
processos
fisiológicos
e
bioquímicos,
como
fotossíntese,
respiração,
translocação, a absorção de íons, carboidratos, metabolismo de nutrientes e
fatores de crescimento (JALEEL et al., 2008). O estresse hídrico pode também
elevar a razão raiz/parte aérea das plantas, devido ao aumento na
concentração do hormônio ácido abscísico (ABA), que permite o crescimento
do sistema radicular para aumentar a absorção de água, enquanto inibe o
crescimento da parte aérea, uma vez que o ABA sintetizado nas raízes é
transportado para as folhas onde induz o fechamento estomático e inibe o
crescimento da planta, atuando também na regulação da atividade de
aquaporinas, que contribuem para a manutenção de um status hídrico
favorável à planta, permitindo dessa forma, uma adaptação à condição de
estresse (WILKINSON; DAVIES, 2010).
De acordo com Jordan (1983) apud Batista (2012), o déficit hídrico pode
afetar a utilização de carboidratos, por alterar basicamente a eficiência com
25
que os fotoassimilados são convertidos para o desenvolvimento de partes
novas na planta. O déficit hídrico ocasiona mudanças na partição dos
carboidratos no interior da planta, condicionando as mesmas a apresentar
mecanismos de adaptação e resistência.
Com isso, as plantas tendem a lidar com o estresse hídrico por um
processo conhecido como ajuste osmótico, ou seja, com a inibição do
crescimento meristemático a mobilização de metabólitos é direcionada para a
síntese de compostos protetores, necessários para o ajustamento osmótico, no
qual as plantas diminuem o potencial osmótico celular pelo acúmulo de solutos,
pois a síntese de solutos compatíveis previne a perda de água pelas células,
sendo importante na manutenção do turgor (BHARGAVA; SAWANT, 2013).
Um grande número de compostos que desempenham papel fundamental
na manutenção do equilíbrio osmótico e na proteção das membranas são
sintetizados, dentre estes podemos citar aminoácidos, como a prolina,
compostos de amônio, como a glicina-betaína, açúcares, frutanos e sacarose,
íons inorgânicos, como potássio, dentre outros (DACOSTA; HUANG, 2006).
Esses compostos denominados osmoprotetores oferecem resistência contra a
seca e a desidratação celular (HOEKSTRA et al., 2001 apud MAHAJAN;
TUTEJA, 2005).
Além da escassez de água, a salinidade também tem sido relatada como
um grande problema na produção de culturas de importância econômica
(ARAGÃO et al., 2010; NEVO; CHEN, 2010). O alto índice de sais nos solos,
provocado pela seca, pela irrigação com águas salinas e drenagem insuficiente
(WILLADINO; CÂMARA, 2010), altera inicialmente a absorção de água e de
nutrientes pelas plantas, assim como, a permeabilidade das membranas. Estas
alterações acabam refletindo no balanço hídrico e nutricional, provocando
mudanças no metabolismo, hormonais, nas trocas gasosas e na produção de
EROS (Espécies Reativas de Oxigênio), e irão comprometer a expansão e
divisão celular, consequentemente, o crescimento da planta, levando a
aceleração da senescência foliar, resultando na morte da planta (PRISCO;
FILHO, 2010).
Na região Nordeste do Brasil, que é caracterizada pela irregularidade
pluviométrica e períodos de estiagem longos, as plantas oleaginosas
apresentam alto potencial de expansão, pois são tolerantes às condições de
26
seca, podendo-se citar como exemplo as plantas de amendoim, gergelim e
mamona (MONTEIRO, 2007). Esta região se destaca na produção de mamona,
sendo responsável por 97,5 % da área plantada com a cultura no país e por
94,8 % da produção nacional de sementes, a maior produção nacional se
concentra no estado da Bahia com 78 % (CONAB, 2007).
Segundo Pinto et al. (2008) o estudo do comportamento das
oleaginosas, como as mudanças em processos fisiológicos ocasionadas pela
deficiência hídrica, é de grande importância, pois serve de base para a escolha
de variedades mais resistentes à seca, uma vez que um dos fatores limitantes
para a produção vegetal no Nordeste brasileiro pode ser o estresse hídrico e as
altas temperaturas (MENDES et al., 2007).
A identificação e compreensão dos mecanismos de resistência à seca
são de fundamental importância no desenvolvimento de novas cultivares mais
resistentes à deficiência hídrica, as quais são essenciais para a manutenção da
produção agrícola brasileira. Todavia, torna-se necessária a compreensão de
que a resistência em plantas não é uma característica simples, é sim um
conjunto complexo de mecanismos que trabalham de forma integrada ou
isoladamente
para
evitar
ou
tolerar
períodos
de
deficiência
hídrica
(CASAGRANDE et al., 2001).
Portanto, é imprescindível para a produção de biodiesel no Brasil, a
compreensão dos efeitos e respostas das cultivares de mamona, frente às
condições desfavoráveis ao desenvolvimento desta planta, como a seca e a
salinidade dos solos na região Nordeste. Contribuindo assim, para o melhor
aproveitamento do potencial desta oleaginosa na obtenção de energias
renováveis, divisas e redução dos impactos ambientais causados pelos gases
oriundos da queima de combustíveis fósseis.
27
2 – OBJETIVOS
2.1 – Objetivo Geral
Contribuir para a compreensão das respostas das plantas de mamona a
estresses abióticos (salino e hídrico), que podem ou não levar a resistência, por
meio de análises morfofisiológicas e moleculares.
2.2 - Objetivos Específicos
•
Submeter plantas de mamona a diferentes tratamentos de estresse
salino e hídrico, com retomada da rega;
•
Avaliar parâmetros fisiológicos (conteúdo relativo de água, teor de
umidade e conteúdo de clorofilas) de plantas de mamona, cultivar BRS
Energia, submetidas a estresse salino;
•
Analisar histologicamente os efeitos dos tratamentos nas estruturas
vegetais de plantas submetidas a estresse hídrico e salino e de plantas
controle;
•
Construção de bibliotecas subtrativas de cDNA para estresse hídrico.;
28
3 - MATERIAL E MÉTODOS
3.1 - INDUÇÃO DE ESTRESSE HÍDRICO EM PLANTAS DE MAMONA
Com o objetivo de simular uma situação mais real do estresse causado
pela seca em plantas de mamona, um experimento de estresse hídrico foi
realizado em condições “de campo”, mas com controle de regas e crescimento
em baldes. Para isto, sementes de mamona cultivar BRS Energia (MILANI et
al., 2007), cedidas pela Embrapa Algodão (Campina Grande-PB), foram
semeadas em baldes plásticos furados na base, com capacidade para 5 litros,
contendo substrato composto por dois tipos de areia e húmus (2:2:3) e
adubados com fertilizante NPK (Nitrogênio, Fósforo e Potássio) na proporção
10:10:10 (1g/L) sólido comercial Murer. Foram semeadas três sementes por
balde e, 15 dias após a emergência, o desbaste foi realizado, deixando apenas
uma planta por recipiente, ou seja, a planta que apresentou maior crescimento
e estabelecimento mais efetivo. Desde a semeadura até o início dos
tratamentos de restrição hídrica, foi realizada irrigação diária em todos os
baldes, até o ponto de compensação do substrato. Com aproximadamente 90
dias após a germinação, as plantas de mamona iniciaram a frutificação, e neste
período foram estabelecidos os tratamentos de estresse hídrico, os quais
foram: restrição hídrica por 5, 10, 15 dias e 10 dias cíclico, no qual as plantas
sofrem estresse por 10 dias e nos 10 dias subsequentes são regadas
normalmente, para promover a recuperação. A metodologia do estresse hídrico
cíclico foi desenvolvida tomando como base os resultados obtidos por Pinto
(2008), onde plantas de mamonas foram submetidas a ciclos de deficiência
hídrica com um intervalo médio de 9 dias entre as irrigações. Este intervalo foi
determinado por ele com base na observação visual de murcha. Com base
nisso, nosso tratamento foi realizado com 10 dias. Para cada tratamento de
estresse hídrico existiram plantas controle que foram regadas diariamente.
As plantas adultas, com frutos desenvolvidos, submetidas aos
tratamentos de estresse hídrico, permaneceram em ambiente protegido de
chuvas durante todo o experimento. As plantas de todos os tratamentos e suas
plantas controle foram escolhidas de forma aleatória e foram demarcadas com
placas para facilitar o regime de regas, pois todas estavam agrupadas no
29
mesmo local e as plantas dos diferentes tratamentos estavam misturadas com
as plantas controle.
Após os tratamentos de restrição hídrica, as plantas tratadas e as
controle foram levadas para laboratório, onde foram analisadas contra
parâmetros fenológicos e fotografadas. Foram retiradas amostras de folhas,
raízes e frutos para análise histológica, extração de RNA e ensaios
enzimáticos.
30
Figura 5. Esquema representativo do experimento de estresse hídrico em
plantas de Ricinus communis L., BRS Energia. Representação dos
tratamentos de restrição hídrica por 5, 10, 15 dias e 10 dias cíclico e coleta das
amostras de folhas, frutos e raízes ao fim de cada tratamento para análises. É
importante ressaltar que para cada tratamento de restrição hídrica havia
também as plantas controle com rega normal.
31
3.1.1 – Delineamento experimental e análises estatísticas
Foi utilizado o delineamento experimental
do tipo inteiramente
casualizado com oito tratamentos, sendo quatro controle e quatro de estresse
hídrico por 5, 10, 15 dias e 10 dias cíclico. O número de repetições da unidade
experimental foi de cinco plantas por grupo, totalizando 40 plantas. As análises
estatísticas foram realizadas utilizando análise de variância (ANOVA) e as
diferenças foram localizadas pelo Teste de Tukey, com P< 0,05.
3.2 - ANÁLISE DE ÁREA FOLIAR E TEOR DE UMIDADE NA FOLHA
Ao final de cada tratamento a análise morfométrica foi feita retirando-se
a quinta folha expandida, a partir do ápice para a base, de cada planta com
auxílio de lâmina de bisturi. As folhas foram medidas com régua e a área foliar
foi calculada pela fórmula S = 0,1515 x (C + L) 2, em que C = comprimento da
folha e L = largura da folha (SEVERINO et al., 2004), conforme apresentado na
figura 6. As folhas foram fotografadas e desenhadas em folhas de papel A4,
devidamente identificadas.
Figura 6. Folha de Ricininus communis representando as medidas
lineares obtidas para o cálculo da área foliar. Representação da quinta folha
expandida, utilizada para medição, onde a linha laranja, na horizontal
corresponde à largura (L) e a linha azul, na vertical, ao comprimento (C).
32
Para determinação do teor de umidade das folhas tratadas e controle, as
mesmas folhas utilizadas para medição foram pesadas em balança de precisão
(Marte, UX4200H) para ser obtida a massa fresca em gramas, e após isso, as
folhas foram armazenadas individualmente em sacos de papel previamente
identificados e foram mantidas em estufa (Tecnal TE – 393/1) a 55 °C até
atingir massa constante e ser então pesadas novamente para obter os valores
de massa seca, seguindo a metodologia proposta por Salavick (1974) com
pequenas modificações, nas quais, os discos foram substituídos por folhas
inteiras. Após a obtenção dos valores de massa fresca e massa seca, os dados
foram aplicados na fórmula abaixo:
UMIDADE 
MF  MS
100
MF
Onde, MF é referente à massa fresca e MS refere-se à massa seca.
3.3 - ANÁLISE ANATÔMICA
Com o intuito de identificar possíveis alterações estruturais nos tecidos
de plantas submetidas ao estresse salino, foram coletadas amostras de folhas,
raízes e caules de plantas jovens que foram transferidas para sistema
hidropônico e submetidas a diferentes tratamentos de estresse salino e plantas
jovens, também em sistema hidropônico na condição controle (sem adição de
NaCl a solução nutritiva). As amostras foram fixadas em Paraformaldeído 4%
em tampão fosfato de potássio (0,2 M; pH 7,4).
Para a inclusão, os tecidos previamente infiltrados com parafina foram
montados em moldes de metal, com auxílio de pinça, contendo parafina líquida
para formar os blocos. Os blocos foram cortados, após duas horas de
resfriamento em congelador de geladeira a -18 °C, utilizando o micrótomo
rotativo (Leica RM 2125 RT), no qual foram feitos cortes de 10 µm de
espessura. Após os cortes, as amostras foram aderidas às lâminas por meio da
pescagem em banho-maria e as lâminas foram identificadas e levadas à estufa
com temperatura de 60 ºC por um período de 20 minutos.
33
Para a montagem e coloração das lâminas, foi necessário desparafinizar
o material, deixando as lâminas submersas em xilol durante 5 minutos, duas
vezes e, em seguida, hidratar em concentrações alcoólicas decrescentes
(álcool 100%, 90%, 80% e 70%), passando 5 minutos em cada concentração e
por fim, mais 5 minutos em água destilada. As lâminas foram postas para secar
em estufa à 60 ºC durante 2 horas, para então ser feita a coloração e
montagem das mesmas.
Os corantes utilizados para as lâminas foram escolhidos com o objetivo
de identificar regiões com maior concentração de lignina, dessa forma, foram
utilizados a Safranina e o Azul de toluidina. As lâminas, de caráter
semipermanente, foram montadas em lamínulas com o meio de montagem
sintético
Entellan
(Merck).
Estes
procedimentos
foram
realizados
no
Laboratório de Histologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte
(UFRN).
A análise das lâminas foi realizada em microscopia de campo claro,
utilizando o Microscópio Zeiss, ajustado pela iluminação de Köhler e as
fotografias foram feitas com auxílio do software StereoInvestigator, no Instituto
do Cérebro, UFRN.
3.4 - EXTRAÇÃO DE RNA
As amostras de sementes armazenadas em ultrafreezer -80 °C foram
pulverizadas em nitrogênio líquido, com auxílio de almofariz e pistilo, e o RNA
total foi extraído utilizando o TRI Reagent® da Ambion, seguindo as
orientações do fabricante. Foram realizadas corridas eletroforéticas em géis de
agarose a 2%, na presença de Brometo de Etídeo, para verificar a qualidade do
RNA extraído. A quantificação foi feita em espectrofotômetro NanoVue Plus
(GE Healthcare Life Sciences) a partir de alíquotas de 4 µL do RNA extraído de
cada amostra, com a densidade óptica de 260 ηm e 280 ηm, nas quais foram
consideras íntegras as amostras de RNA que obtiveram a razão 260/280 entre
1,8 e 2,0 ηg/µL.
Após a extração, todas as amostras foram tratadas com DNase
(Ambion) conforme as recomendações do fabricante para garantir que não
houvesse contaminação com DNA genômico.
34
3.5 - CONSTRUÇÃO DAS BIBLIOTECAS SUBTRATIVAS DE cDNA
A partir do RNA total extraído das sementes de mamona, que foram
submetidas à restrição hídrica e daquelas que foram regadas normalmente,
foram construídas duas bibliotecas subtrativas de cDNA. A biblioteca nomeada
de L1, foi composta pelos genes diferencialmente expressos em condição
controle para o tratamento de 10 dias sob estresse hídrico. Já a outra
biblioteca, chamada de L3, foi composta por aqueles genes que foram
diferencialmente expressos com condição de estresse hídrico por 10 dias.
Para a construção das bibliotecas subtrativas de cDNA de sementes
Ricinus communis, primeiro foi feita a síntese de cDNA de acordo com os
protocolos do Super SMARTTM PCR cDNA Syntesis Kit e Clontech PCRSelectTM cDNA Subtraction Kit, que utilizam o método de Reação em Cadeia da
Polimerase (PCR) para aumentar a quantidade de cDNA por nanogramas de
RNA total. Em seguida, os cDNAs provenientes de tecidos celulares que estão
sendo comparados foram digeridos com a enzima de restrição RsaI, após este
passo, o cDNA da condição teste foi dividido em duas alíquotas, às quais foram
ligadas o adaptadores 1 e 2R, conforme apresentado na figura 7. Os cDNAs
das condições teste e controle foram hibridizados e as sequências híbridas
foram removidas, desta forma, os cDNAs restantes (não-hibridizados)
constituíram os genes expressos unicamente nas condições que foram
analisadas. Por fim, estes cDNAs foram amplificados por PCR, enriquecendo a
população de genes diferencialmente expressos nas condições testadas. Ao
fim de cada etapa foram realizadas corridas eletroforéticas em gel de agarose
1,2 % para verificar a ligação dos cDNAs aos adaptadores, assim como, a
subtração e a amplificação subtrativa por PCR após a segunda hibridização.
35
Figura 7.
Etapas de construção da biblioteca subtrativa de cDNA.
(Retirado de FERREIRA, 2008).
3.5.1 - Ligação
Para a reação de ligação, foram utilizados 50-100 ng do produto de PCR
após a subtração das bibliotecas, 20U unidades de ligase, 1 X tampão de
ligação, 12,5 ng do vetor pGEM T-easy (Promega) e água ultrapura estéril para
chegar ao volume final de 20 µL. As ligações foram incubadas por um período
de 16 horas.
3.5.2 - Precipitação da ligação
Após o processo de ligação, com volume final de 20 µL, o produto foi
precipitado para que fosse retirado o excesso de sal proveniente da ligação.
36
Para isso, foram adicionados 1/10 do volume de glicogênio (20 mg/mL), 1/10
do volume de Acetato de Sódio a 3 M (pH 5,2) e dois volumes de Etanol
absoluto. Após uma hora de incubação em freezer a -20 ºC, as amostras foram
centrifugadas por 20 minutos (microcentrífuga Eppendorf 5417R) a 20.817 x g
e a 4 °C. Em seguida, o sobrenadante foi descartado e o precipitado foi lavado
com 200 µL de Etanol 70%, centrifugado por 5 minutos a 20.817 x g e com
temperatura de 4 °C. Por fim, o precipitado foi seco à temperatura ambiente e
ressuspendido em 12 µL de água ultrapura previamente esterilizada em
autoclave.
3.5.3 - Clonagem e transformação de bactérias
As bibliotecas construídas foram clonadas no vetor pGEM-Teasy da
Promega seguindo as especificações do fabricante. As ligações das bibliotecas
foram mantidas em freezer -20 ºC e foi retirada uma alíquota de 4 µL para a
transformação
em
55
µL
de
células
de
bactérias
Escherichia
coli
eletrocompetentes DH10B. Para a eletroporação foi utilizado o eletroporador
Multiporator® system (Eppendorf) e, em cubetas de 0,2 mm foi aplicado um
pulso de corrente elétrica de 1.900V por 5 ms. Após o pulso, as células foram
transferidas para tubo de centrífuga (15 mL) contendo 1 mL de meio líquido LB
(Luria-Bertani, composto por 10 g L-1 de Triptona, 10 g L-1 de NaCl e 5 g L-1 de
extrato de levedura) e foram mantidas a 37 ºC por 1 hora em agitação.
Passado este período, 100 µL das células foram espalhados em placas
contendo meio LB sólido (10 g L-1 de Triptona, 10 g L-1 de NaCl, 5 g L-1 de
extrato de levedura e 15 g L-1 de Ágar), acrescido de 100 µg/mL-1 Ampicilina e
por X-Gal (40 µg/mL-1), para selecionar as colônias que possuem o plasmídeo
com o inserto. As placas foram mantidas em estufa a 36 ºC durante 22 horas e,
em seguida, as colônias brancas de bactérias transformadas foram inoculadas
em placas de 96 poços, contendo 1 mL de meio Circle Grow, acrescido de
Ampicilina 100 µg/mL-1. Após 22 horas em shaker com temperatura de 37º C e
a 220 rpm, foram feitas extrações do DNA plasmidial em pequena escala
(minipreparação de plasmídeos) para sequenciamento.
37
3.5.4 - Extração do DNA plasmidial em pequena escala - Miniprep
O procedimento para as extrações de DNA plasmidial se iniciou com a
adição de 240 µL de GET às colônias crescidas em placas de 96 poços, o qual
é composto por glicose 20% filtrada, EDTA a 0,5 M pH 8,0, Tris-HCl a 1,0 M pH
7,4 e água ultra pura. Após isso, as placas foram seladas com adesivo e
agitadas durante dois minutos em agitador do tipo vórtex. Em seguida as
placas foram centrifugadas, em uma centrífuga Eppendorf 5804R, durante
quatro minutos a 2.630 x g, para que ocorresse a sedimentação das células. O
sobrenadante de cada poço foi descartado e as placas foram invertidas em
papel toalha por cinco minutos. Após esse tempo, foram adicionados 80 µL de
GET, a placa foi selada e agitada mais uma vez, para promover a
ressuspensão das células.
Foram adicionados 0,1 µg/mL de RNAse a cada poço de uma
microplaca de 250 µL de propileno de fundo redondo (tipo Elisa) e em seguida
foram transferidos 80 µL da suspensão de células para a microplaca contendo
RNAse. Além disso, foram adicionados também 80 µL de NaOH 0,2 M/ SDS
1% misturados com auxílio de vórtex; a placa foi selada com adesivo,
homogeneizada e deixada em repouso à temperatura ambiente por 10 minutos.
Decorridos os 10 minutos, a placa foi centrifugada por alguns
segundos. Após isso, foram adicionados a cada poço 80 µL de KOAc 3 M e
subsequentemente a placa foi selada, homogeneizada, incubada por 10
minutos à temperatura ambiente e, logo após, as placas foram colocadas em
estufa a 90 ºC por 30 minutos.
Imediatamente à retirada da estufa, as placas foram colocadas em gelo
picado por 10 minutos, em seguida, foram centrifugadas por 9 minutos a 2.630
x g e 20 ºC.
Todo o volume do sobrenadante foi filtrado em placas Millipore (MAGV
N22) durante centrifugação por 6 minutos a 2.630 x g e 20 ºC. Logo depois,
foram adicionados 100 µL de Isopropanol (Merck) ao sobrenadante, e então a
placa foi selada com adesivo, homogeneizada e centrifugada durante 30
minutos a 2.630 x g e 20 ºC.
Após a centrifugação, o sobrenadante das placas foi descartado e
adicionou-se 200 µL de Etanol 70% (Merck) e as placas foram centrifugadas
38
por 5 minutos, 2.630 x g a 20 ºC. Descartou-se o sobrenadante e as placas
foram invertidas em papel absorvente e levadas à centrífuga até chegar 1500 x
g a 20 ºC. Após a centrifugação, as placas foram postas para secar em
temperatura ambiente por 1 hora. Ao final, o DNA dos poços foi ressuspenso
em 60 µL de água ultra pura esterilizada em autoclave, as placas foram
seladas
e
deixadas
à
temperatura
ambiente
overnight,
para
então
posteriormente serem armazenadas em freezer -20 ºC.
Antes da extração plasmidial, foram feitas placas, de 96 poços, de
estoque das colônias crescidas, em glicerol 100%, as quais foram
armazenadas em ultrafreezer -80 ºC.
Após as minipreparações, foram feitas corridas eletroforéticas em géis
de agarose a 0,7 %, com o objetivo de confirmar a presença dos insertos nos
plasmídeos e, em seguida, a digestão com a enzima de restrição EcoRI.
3.5.5 - Reação de sequenciamento e precipitação de DNA
Para as reações de sequenciamento foram montadas placas de PCR de
96 poços utilizando 1 µL de DNA plasmidial (100-150 ng), 4 µL de ET Mix, 3,2
µM do primer T7 ou SP6 e água ultrapura para completar o volume final de 10
µL. As reações de PCR seguiram o perfil de termociclagem: 1 ciclo de 95 ºC
durante 2 segundos, 30 ciclos subdivididos em 20 segundos à 95 ºC, 15
segundos à 45 ºC e 1 minuto à 60 ºC.
Após as reações, a precipitação do DNA foi realizada, na qual é
adicionado a cada poço 1/10 do volume da reação de Acetato de Amônio 7,5 M
e 2,5 vezes o volume da reação de Etanol absoluto, então as placas foram
seladas e agitadas em vórtex. Passados 15 minutos à temperatura ambiente,
as placas foram centrifugadas por 25 minutos à 4 ºC e 2.630 x g. O
sobrenadante foi descartado e foi adicionado a cada poço 150 µL de Etanol
70%, as placas foram centrifugadas por 10 minutos à 4 ºC e 2.630 x g. Mais
uma vez, o sobrenadante foi descartado e as placas foram postas para pulsar
até chegar a 1.500 x g, invertidas e cobertas com papel absorvente.
Por fim, o precipitado foi ressuspenso em 10 µL de Loading buffer (GE
Healtcare Life Science), as placas foram agitadas em vórtex e mantidas então
39
overnight à -20 ºC para posterior injeção no aparelho de sequenciamento
MegaBACE (GE Healthcare).
3.6 - SEQUENCIAMENTO E BUSCA EM BANCO DE DADOS
Após a precipitação do produto da reação de sequenciamento, os
clones obtidos foram injetados no sequenciador MegaBACE 1000 (GE
Healthcare) com o kit recomendado pelo fabricante (GE Healthcare). As
sequências geradas foram examinadas para a presença do vetor de clonagem
com a ferramenta Vecscreen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/) e a
partir das sequências obtidas foram feitas buscas por similaridade na
plataforma do NCBI (National Center for Biotechnology information) utilizando a
ferramenta BlastX (MCGINNIS; MADDEN, 2004) ) com um valor de 10-5 de Evalue como parâmetro mínimo. Após a busca por similaridade, foi feita uma
análise
manual
visando
obter
informações
sobre
as
proteínas
que
apresentaram similaridade, utilizando a ferramenta UniProt, Universal Protein
Resource, (www.uniprot.org), o Gene Ontology (www.geneontology.org) e a
literatura científica da área.
40
4 – RESULTADOS
4.1 – Obtenção das plantas para tratamentos de estresse hídrico
Com aproximadamente 20 dias após o plantio, já havia ocorrido a
germinação e emergência de todas as plântulas. Na figura 8 estão
representadas as fases do desenvolvimento da mamona, desde a germinação
da semente e da plântula, a planta jovem e a planta adulta, com os frutos
desenvolvidos, que foi utilizada nos experimentos de estresse hídrico.
Figura 8. Fases do desenvolvimento da mamona. Representação
esquemática das fases do desenvolvimento da mamona, cultivar BRS Energia,
crescidas em casa de vegetação, desde a germinação da semente até a planta
adulta. Desenho ilustrado por Kellya Barreto.
41
4.2 – Tratamentos de estresse hídrico
A partir de observações morfológicas das plantas submetidas ao
estresse hídrico e das plantas com rega normal (controle), foi possível observar
que as plantas pertencentes aos tratamentos de 10 e 15 dias foram as que
mais sofreram modificações no padrão de desenvolvimento, como apresentado
na figura 9. Aos 5 dias de restrição hídrica, as plantas apresentaram murcha
das folhas e clorose nas folhas mais velhas, indicando a possível perda de
clorofila (figura 9). Aos 10 dias, os sintomas de murcha e clorose foram
acentuados. Já no tratamento de 15 dias de restrição hídrica ocorreu uma
senescência e a abscisão foliar, restando poucas ou nenhuma folha nessas
plantas. No entanto, no tratamento de 10 dias cíclico, onde as plantas tiveram a
rega retomada após 10 dias de restrição hídrica, foi possível observar uma
recuperação da planta, onde as folhas que apresentaram sintomas decorrentes
do estresse hídrico foram substituídas por folhas novas após a retomada da
rega (figura 9), indicado pela seta.
Figura 9. Plantas de Ricinus communis L., BRS Energia, submetidas a
diferentes períodos de estresse hídrico. A: Controle, com rega normal; B:
estresse hídrico de 5 dias; C: estresse hídrico de 10 dias; D: estresse hídrico
de 15 dias e E: estresse hídrico de 10 dias cíclico. Barra de 10 cm.
42
4.3 – Análise de área foliar e teor de umidade na folha
Considerando as alterações morfológicas observadas durante o
desenvolvimento das plantas de mamona sob condição de estresse hídrico, foi
realizada a análise da área foliar, para isto foi escolhida a quinta folha
expandida, do ápice para a base, de cada planta. Com base nas medidas
lineares obtidas nas folhas escolhidas (figura 6) foi calculada a área foliar e na
figura 10 estão dispostas as médias obtidas das plantas de mamona tratadas
por 10, 15 dias e 10 dias cíclicos e seus respectivos controles.
Figura 10. Área foliar das plantas de mamona, BRS Energia, submetidas a
estresse hídrico. Médias de área foliar de plantas controle e plantas
submetidas ao estresse hídrico por 10 dias, 15 dias e 10 dias cíclico. As
plantas representadas como tratadas correspondem às plantas submetidas ao
estresse hídrico nos diferentes dias. Barras simbolizam o desvio padrão. (*)
corresponde a diferença significativa no intervalo de confiança de 95% (P
<0,05) pelo Teste de Tukey.
Diante das médias apresentadas percebe-se a área foliar das plantas
tratadas por 10 dias e por 15 dias foi menor que seus controles, diferindo
significativamente dos mesmos. No entanto, a área foliar obtida do tratamento
de 10 dias cíclico foi a que mais se aproximou no seu controle, não
apresentando diferença significativa. Comparando as médias das plantas
tratadas, o tratamento de 15 dias obteve a menor média da área foliar, sendo
36,9 % menor que a área do tratamento de 10 dias cíclico. No tratamento de 10
dias houve uma diminuição de 10,3 % da área foliar, comparada ao tratamento
de 10 dias cíclico.
43
Quanto ao teor de umidade das folhas, podemos observar na figura 11 o
gráfico apresentando a porcentagem do teor de umidade obtido de folhas de
mamona, quinta folha expandida do ápice para a base, submetidas aos
tratamentos de estresse hídrico e seus respectivos controles.
De acordo com o gráfico, podemos apontar que apesar do aumento
gradativo do estresse hídrico, não houve diferença significativa no teor de
umidade da folha entre as plantas tratadas e os controles.
Figura 11. Teor de umidade em folhas de Mamona, BRS Energia. Médias
do percentual de umidade de plantas controle e plantas submetidas ao
estresse hídrico por 5 dias, 10 dias, 15 dias e 10 dias cíclico. As plantas
representadas como tratadas correspondem às plantas submetidas ao estresse
hídrico nos diferentes dias. Barras simbolizam o desvio padrão. (*) corresponde
a diferença significativa no intervalo de confiança de 95% (P <0,05) pelo Teste
de Tukey.
4.4 - Análise anatômica
Para visualizar os danos decorrentes dos tratamentos de estresse
hídrico nos tecidos das plantas de mamona, foi feita uma análise microscópica
de folhas e raízes de plantas tratadas e plantas controle, para comparação
estrutural e averiguação de possíveis alterações estruturais decorrentes do
estresse imposto.
As seções transversais de folhas de plantas de mamona submetidas ao
estresse hídrico e duas respectivas plantas controle foram coradas em Azul de
44
Toluidina a 0,05 % e Safranina a 1%, no entanto, optou-se por apresentar os
resultados daquelas coradas com Azul de Toluidina (figura 12), o qual cora
estruturas ácidas (ácidos nucleicos) e não ácidas, assim como compostos
fenólicos estruturais, como a lignina.
Podemos observar nas secções transversais da nervura mediana de
folhas de mamona uma epiderme (ep) uniestratificada com células de
tamanhos variados e a presença de cutícula (cut) sobrepondo a epiderme.
Abaixo da epiderme abaxial (ep ab) observamos uma camada de parênquima
esponjoso (pe), com células irregulares e espaços com várias dimensões, e
uma camada de parênquima paliçádico (pp), apresentando células compactas
(figura 12A).
Nas células próximas ao feixe vascular observamos a presença de
várias drusas (dr), compostas por cristais de oxalato de cálcio, que são produto
do metabolismo celular. Ao longo da nervura mediana observamos um feixe
semicircular formado por células do xilema (xi) e uma série de células do
floema (fl). As células do floema mostraram uma organização em cordões,
dispostas em vários estratos celulares, já as células do xilema, apresentam
disposição radial, com paredes espessas e maior afinidade pelo corante (figura
12A). Também é possível observar um grande número de células do
colênquima (col) mais superficiais, abaixo da epiderme, e do parênquima (pa),
mais próximas aos feixes vasculares.
Comparando-se
as
estruturas
foliares
de
plantas
de
mamona
submetidas a estresse hídrico e de plantas controle, pode-se observar uma
diminuição do tamanho da nervura mediana aos 10 e 15 dias de estresse
hídrico, assim como a diminuição do número de células do parênquima e uma
coloração mais forte nas células do colênquima, indicando o acúmulo de lignina
nesta região, onde também verificamos uma diminuição de células do xilema
(figuras 12C e 12D), indicado pelas setas.
Foi observada também, uma desorganização do parênquima paliçádico
(pp), que aumenta a partir dos 5 dias de restrição hídrica, assim como, o
aumento dos espaços entre as células do parênquima esponjoso (pe), indicado
pelas setas, (figuras 12B, 12C, 12D e 12E).
As drusas estão presentes em todas as folhas (tanto no controle quanto
no tratado), porém, aos 15 dias de estresse hídrico foi observado que estão em
45
menor quantidade. As folhas dos tratamentos de 10 dias e 10 dias cíclicos (12C
e 12E) apresentam uma quantidade de drusas semelhante ao controle (12A)
como indicado pelas setas.
46
Figura 12. Seções transversais de folhas de Mamona, BRS Energia.
Seções de 10 µm de folhas de plantas cultivadas sem restrição hídrica, controle
(A) e com restrição hídrica de 5 dias (B), 10 dias (C), 15 dias (D) e 10 dias
cíclicos (E) coradas em Azul de Toluidina 0,05%, aumento de 10x. Barra de
200 µm. col: colênquima; pa: parênquima; fl: floema; xi: xilema; dr: drusa; pe:
parênquima esponjoso; ep ab: epiderme abaxial; pp: parênquima paliçádico; ep
ad: epiderme adaxial; cut: cutícula.
47
48
Os cortes das raízes das plantas submetidas ao estresse e das plantas
controle foram corados com os mesmos corantes utilizados para os cortes das
folhas e também optou-se por apresentar as secções coradas em Azul de
Toluidina, na figura 13.
Ao analisar histologicamente as estruturas da raiz de uma planta
controle (figura 13A) verificamos a epiderme (ep) com células de tamanhos
irregulares. A região do córtex (cor), compreendida entre a epiderme e o
cilindro vascular (cv) apresenta-se constituída por várias camadas de células
parenquimáticas. É possível observar também, no interior da raiz, células
vasculares em conformação de estrela, com células de metaxilema (mx) ao
centro e protoxilema ao redor, indicado pela seta.
Ao compararmos as secções de raízes de plantas em condição controle
(figura 13A) e de plantas que passaram por restrição hídrica (figuras 13B, 13C,
13D e 13E), observamos que a região em formato de estrela (região central)
desapareceu em todas as raízes de plantas tratadas e houve um aumento do
número de células do xilema em todas as raízes de plantas que sofreram
restrição hídrica, assim como, um aumento do diâmetro dessas células,
indicado pelas setas.
Outra alteração observada foi a diminuição da região do cilindro vascular
(cv), em plantas que sofreram restrição hídrica por 15 dias e por 10 dias cíclico,
concomitantemente com o aumento da região do córtex (figuras 13D e 13E),
indicado pelas setas. O cilindro vascular é formado por tecidos vasculares e por
uma ou mais camadas de células não vasculares, denominadas periciclo, o
qual pode ser constituído de parênquima ou esclerênquima e é onde têm
origem as raízes laterais e parte do câmbio. (APPEZZATO-DA-GLÓRIA;
CARMELLO-GUERREIRO, 2006). Na raiz tratada por 10 dias cíclico,
observamos uma coloração menos intensa, quando comparada ao controle, na
região do córtex, indicando uma diminuição no acúmulo de lignina nesta região
(figura 13E).
As análises histológicas permitiram identificar alterações estruturais em
todos os tecidos de plantas que sofreram estresse por déficit hídrico como por
alta concentração salina na solução de cultivo, com respostas dependentes do
nível do estresse imposto.
49
Figura 13. Seções transversais de raízes de Mamona, BRS Energia.
Seções de 10 µm de raízes de plantas cultivadas sem restrição hídrica,
controle (A) e com restrição hídrica de 5 dias (B), 10 dias (C), 15 dias (D) e 10
dias cíclicos (E) coradas em Azul de Toluidina 0,05%, aumento de 10x. Barra
de 200 µm. ep: epiderme; cor: córtex; pc: periciclo; mx: metaxilema; px:
protoxilema; cv: cilindro vascular.
50
51
4.5 – Bibliotecas subtrativas de cDNA
Com o objetivo de identificar e quantificar sequências diferencialmente
expressas na condição de estresse hídrico por um período de 10 dias em
sementes de plantas de mamona foram construídas duas bibliotecas, L1 e L3,
que correspondem à condição controle e a condição de estresse hídrico por 10
dias, respectivamente.
Após a digestão com a enzima de restrição EcoRI e corrida eletroforética
em gel de agarose a 0,7 % foram observados fragmentos clonados com
variação entre 400 bp e 700 bp.
Foi obtido um total de 384 clones da biblioteca L1 e 288 clones da
biblioteca L3, viáveis para sequenciamento. As sequências obtidas, após a
limpeza de possíveis contaminantes pela ferramenta Vecscreen, foram
utilizadas para as buscas por similaridade no banco de dados do NCBI, pelo
BLASTx. Esta ferramenta permite excluir regiões onde apresentaram indícios
de contaminação fracos, moderados e fortes, como as regiões de vetor.
A busca por similaridade das sequências nucleotídicas das bibliotecas
resultou em 106 sequências para a biblioteca L3, estresse hídrico por 10 dias,
e 65 sequências para a biblioteca L1, condição controle.
Com as sequências identificadas, foi feito um agrupamento de acordo
com a classe funcional, para isso, a anotação funcional das sequências teve
como base a busca no banco de dados UniProt, Universal Protein Resource,
(http://www.uniprot.org), o Gene Ontology (www.geneontology.org) e a
literatura científica da área.
52
5. DISCUSSÃO
É de fundamental importância o estudo das respostas de plantas frente
às condições impostas pelo ambiente. Condições ambientais desfavoráveis ao
desenvolvimento vegetal provocam estresses abióticos, que por consequência
prejudicam a produção de diversas culturas economicamente importantes,
como a Mamona. Pelo fato da mamona ser produzida prioritariamente pela
região Nordeste do Brasil, onde são características as condições dos solos
salinizados e a baixa precipitação pluviométrica (GONDIM et al., 2010), este
trabalho objetivou contribuir para a compreensão das alterações decorrentes
dos estresses salino e hídrico em plantas de mamona, assim como, analisar
quais as modificações ocorridas após um período de estresse hídrico, seguido
do restabelecimento da condição hídrica normal.
Diferentes períodos de estresse hídrico impostos em plantas adultas de
mamona provocaram diferentes respostas das plantas, a nível molecular,
fisiológico, anatômico e bioquímico. A reidratação das plantas, realizada no
tratamento de 10 dias cíclico, permitiu analisar os efeitos durante a
recuperação das plantas após o estresse hídrico, o que é de grande
importância, pois alguns autores afirmam que embora se conheça muito sobre
o efeito do estresse hídrico nas plantas, muito pouco se conhece sobre os
efeitos da recuperação da perda de água após um período de estresse, o que é
comum acontecer no ambiente natural, onde a planta é submetida a períodos
intercalados de seca e precipitação (AWAL; IKEDA, 2002; ALVES; SETTER,
2004; PINTO et al., 2008; PINTO et al., 2014; ROSAS-ANDERSON et al.,
2014).
Em estudos recentes, o estresse hídrico tem sido classificado como:
moderado (até 7 dias de restrição hídrica), e severo (10 dias de restrição
hídrica), em soja (Guimarães-Dias et al., 2012). Para Baghalian et al. (2011) o
estresse severo se dá pela depleção de 70% e 90% de umidade no solo e o
estresse moderado por 50% de umidade no solo, trabalhando com Camomila.
Com base nisto, nossos tratamentos de estresse hídrico podem ser
classificados baseados na metodologia de Guimarães-Dias et al., 2012, em
moderado (5 dias) e severo (10 e 15 dias).
53
A redução da área foliar é uma resposta ao déficit hídrico comumente
observada. Neste trabalho uma redução gradativa da área foliar foi observada
à medida que o período de estresse hídrico aumentou, em contrapartida,
quando houve a reidratação após o estresse, a área foliar teve um aumento.
Este fato também foi observado em mandioca, onde a retomada da rega
promoveu o rápido retorno da expansão foliar, evidenciando a hipótese de que
durante o período de seca a planta minimiza o investimento de recursos na
acumulação de osmólitos e crescimento foliar, para que quando a precipitação
recomeçar existam recursos disponíveis para a recuperação do crescimento e
das atividades metabólicas (ALVES; SETTER, 2004). Esta observação é
corroborada por Vanková et al. (2012) que observou em tabaco uma maior
atividade metabólica em folhas que foram submetidas a estresse hídrico do que
em folhas de plantas com rega normal. Apesar de ter ocorrido uma diminuição
da área foliar, o teor de umidade na folha não apresentou alteração em
nenhum dos tratamentos, o alto nível de umidade foi mantido nas plantas,
sugerindo que a planta consegue restringir a perda de água. Este fato, de
manutenção da umidade também foi observado por Lima (2007) ao submeter
plantas de feijão caupi a estresse hídrico induzido por PEG. Faria (2010)
avaliando cultivares de mamona, observou que a cultivar BRS Energia é uma
das cultivares que apresenta o tecido foliar mais resistente ao déficit hídrico.
Em seringueira (Hevea brasiliensis), que é uma planta da mesma família
da mamona (Euphorbiaceae) Chen et al. (2010) verificaram que após a
reidratação a relação de água na folha pode ser recuperada rapidamente para
o nível de controle, permitindo que o sistema hidráulico da folha não limite a
transpiração e a completa recuperação do estresse hídrico. Este fato também
foi observado nos tratamentos de estresse salino, onde o teor de umidade e o
conteúdo relativo de água na folha se mantiveram iguais ao controle até a
concentração de 150 mM de NaCl.
O ajustamento osmótico, ou acúmulo de solutos compatíveis pela célula,
permite a manutenção da turgidez em potenciais hídricos mais baixos, como
em situações de estresse hídrico ou salino.
Microscopicamente
também
observamos
alterações
foliares,
principalmente nas nervuras, como a diminuição de células do sistema vascular
e o possível acúmulo de lignina, evidenciando uma proteção à dessecação.
54
Segundo Castro et al. (2009) a lignina é um metabólito secundário que
quando acumulada em paredes celulares pode provocar alteração na
espessura dos tecidos submetidos à estresse, características similares foram
observadas por Melo et al. (2011) em Jatropha curcas.
Outra característica importante observada foi a presença de drusas,
estruturas formadas por cristais de oxalato de cálcio, em menor quantidade aos
15 dias de estresse hídrico, o que é um indicativo de que durante o período de
estresse a planta está utilizando estes cristais no metabolismo, estas estruturas
podem constituir um reservatório para assegurar o suprimento de cálcio para
os processos metabólicos, no momento em que a absorção e a translocação
de cálcio são reduzidas segundo Hunsche et al. (2010).
Em raízes submetidas ao estresse hídrico o aumento do número e do
tamanho de células do xilema foi observado, concomitantemente, com o
aumento da região do córtex, onde em raízes do tratamento de 10 dias cíclico,
observamos também uma coloração menos intensa, indicando uma diminuição
no acúmulo de lignina nesta região. Já nas raízes submetidas ao estresse
salino, observamos um comportamento contrário nos maiores níveis de
concentração salina, onde as células do xilema diminuíram em número e
tamanho, já o acúmulo de lignina foi aparente na região do córtex e epiderme,
a qual se mostrou mais compactada na mais alta concentração de NaCl.
Outros autores também observaram o acúmulo de lignina em
concentrações acima de 150 mM de NaCl, Melo et al. (2011) em pinhão-manso
e Neves (2009) observou o acúmulo de lignina em soja, caracterizando uma
proteção mecânica em defesa contra a dessecação.
A severidade do estresse hídrico é diretamente proporcional à produção
de EROS, o que leva ao aumento da peroxidação de membranas lipídicas e
degradação de ácidos e proteínas (Farooq et al., 2009 apud Nazarli e Faraji,
2011). Segundo Bor et al. (2003) o estudo da relação entre o sistema
antioxidante em plantas e os estresses abióticos é muito importante, pois as
enzimas antioxidantes tem um dos principais papéis no mecanismo de
resistência em resposta à estresses do ambiente. Dentre as enzimas
pertencentes ao sistema de defesa antioxidante das plantas, podemos citar as
superóxido dismutases (SOD), as ascorbato peroxidases (APX), as catalases
(CAT), e ainda, as peroxidases de guaiacol (POX).
55
A lignificação observada nas folhas e raízes de plantas submetidas ao
estresse abiótico, por meio da microscopia óptica, pode estar diretamente
relacionada com o aumento de peroxidases, que atuam na remoção de EROS
nos níveis mais altos de estresse. A diminuição do cilindro vascular nas raízes
submetidas aos estresses é um indício da inibição do crescimento de raízes
laterais, e a atividade de POX também pode ser responsável por esta resposta.
Considerando as mudanças bioquímicas e morfológicas, nossos
resultados da expressão diferencial de genes mostram uma mudança no perfil
de expressão para condição de estresse hídrico. Segundo Kaufmann et al.,
2010 apud Causier et al., 2012, a expressão diferencial de genes é
fundamental para a capacidade dos organismos de responder aos estímulos do
ambiente e sustenta os processos de desenvolvimento e diferenciação.
Analisando as sequências de cDNA obtidas nas bibliotecas subtrativas,
observamos uma expressão diferencial das bibliotecas L1 (condição controle) e
L3 (estresse), onde na biblioteca L1 foram obtidos em maior quantidade cDNAs
relacionados à produção de energia da célula em forma de ATP, que é
produzido a partir de ADP e fosfato e relacionados à biossíntese de ácidos
graxos, fenilpropanóides, alcalóides e terpenóides e pela produção de
metabólitos de defesa (Mendonza, 2009).
Já para a biblioteca L3, ocorreu uma maior variedade de transcritos e a
expressão diferencial se deu pelos cDNAs relacionados à resposta à estímulo,
reserva de nutriente, estabilização de corpos lipídicos e cDNAs relacionados
ao desenvolvimento do embrião.
Com base nesses resultados, observamos que na condição de estresse
hídrico, este aumento do número de transcritos está diretamente relacionado à
defesa da planta à condição de seca, à maturação da semente e mobilização
de reservas, permitindo uma resistência da semente ao período de estresse.
Este resultado é corroborado por outros autores, que trabalhando com cevada
(Hordeum spontaneum) verificaram uma expressão diferencial de dois
genótipos selvagens de regiões diferentes, enquanto um genótipo adotou
estratégias de sobrevivência, o outro adotou estratégias de “crescimentosustentável” para lidar com condição de estresse hídrico, e essa resistência à
seca foi atribuída à expressão diferencial de Dehidrina, juntamente com o
56
ajustamento osmótico, a preservação do conteúdo relativo de água e ao
comprimento das raízes (NEVO; CHEN, 2010).
As Dehidrinas fazem parte do grande grupo de proteínas LEA (Late
Embryogenesis Abundant), que são consideradas proteínas altamente
hidrofílicas. Uma característica das Dehidrinas é o domínio conservado rico em
lisina, com 15 aminoácidos (EKKGIMDKIKEKLPG), denominado segmento K,
presente geralmente próximo ao C-terminal. Essas proteínas se acumulam no
final de embriogênese, e em quase todos os tecidos vegetativos durante
condições normais de crescimento e em resposta ao estresse que leva à
desidratação celular, como secas, baixa temperatura e salinidade (RORAT,
2006). Segundo Bhargava e Sawant, (2013), alguns dos genes que são
regulados positivamente em resposta ao estresse hídrico incluem os genes
envolvidos na síntese de osmólitos, genes que codificam proteínas LEA,
aquaporinas, moléculas de sinalização e fatores de transcrição.
Portanto, estes dados nos permitem inferir sobre como a mamona, em
condições de estresse hídrico e salino, modula suas características
moleculares
e
morfológicas
alterando
muitos
processos
metabólicos
interligados como: a atividade das enzimas antioxidantes, aumentando a
quantidade de algumas proteínas envolvidas com o ajustamento osmótico, com
o processo de mobilização de energia, com a maturação da semente. Estas
mudanças podem permitir que a planta e seus tecidos se tornem mais
resistentes a esses estresses. Por isso, é extremamente importante investigar
mais aprofundadamente as relações bioquímicas e morfológicas entre estes
diferentes estresses, para compreender como as variedades de plantas de
interesse econômico se aclimatam e quais os impactos dessa aclimatação na
produção de óleo.
57
Figura 14. Modelo de respostas das plantas de mamona aos estresses
hídrico e salino. Esquema apresentando as alterações observadas em plantas
de mamona, BRS Energia, em resposta às condições de estresse hídrico e
salino.
58
6. CONCLUSÃO
Diante dos resultados obtidos neste trabalho, podemos afirmar que a
mamona, BRS Energia, é uma planta que resiste ao estresse hídrico moderado
(5 dias) e ao estresse salino até 100 mM de NaCl evitando assim a perda de
água, mantendo o turgor celular e por meio das enzimas do sistema
antioxidante prevenindo os danos causados pelas EROs na célula. A mamona
possui várias estratégias de resistência à seca que visam a manutenção da
integridade celular e de processos vitais, como a expressão diferencial de
proteínas relacionadas à defesa e à reserva de nutrientes nas sementes, nas
quais o preenchimento com óleo parece ser acelerado com o estresse severo.
A sobrevivência da planta é assegurada durante o período de seca e o uso dos
recursos é limitando para serem utilizados na posterior recuperação pelo
aumento da disponibilidade hídrica, como observado nesta cultivar de mamona
após a retomada das regas. Dessa forma, este trabalho contribuiu ainda para
uma maior compreensão dos processos de recuperação após o estresse
hídrico.
59
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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peroxidation by abiotic stresses in leaves of Momordica charantia. Braz. J.
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