pesquisa de bactérias com determinação do - evz - ppgca

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
PESQUISA DE BACTÉRIAS COM DETERMINAÇÃO DO PERFIL DE
SENSIBILIDADE EM VÍSCERAS COMESTÍVEIS DE FRANGO DE
CORTE, PENAS E CAMAS DE AVIÁRIOS
Fernando Augusto Fernandes Corrêa
Orientadora: Profª. Drª. Maria Auxiliadora Andrade
GOIÂNIA
2013
ii
iii
FERNANDO AUGUSTO FERNANDES CORRÊA
PESQUISA DE BACTÉRIAS COM DETERMINAÇÃO DO PERFIL DE
SENSIBILIDADE EM VÍSCERAS COMESTÍVEIS DE FRANGO DE CORTE,
PENAS E CAMAS DE AVIÁRIOS
Dissertação apresentada para obtenção do grau
de Mestre em Ciência Animal junto à Escola de
Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de
Goiás.
Área de Concentração:
Sanidade Animal, Higiene e Tecnologia de Alimento
Orientadora:
Profª. Drª Maria Auxiliadora Andrade
Comitê de Orientação:
Profª. Drª. Valéria de Sá Jayme
Prof. Dr. Edmar Soares Nicolau
GOIÂNIA
2013
iv
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação na (CIP)
GPT/BC/UFG
C824
p
Corrêa, Fernando Augusto Fernandes.
Pesquisa de bactérias com determinação do perfil
de sensibilidade em vísceras comestíveis de frango de
corte, penas e camas de aviários [manuscrito] /
Fernando Augusto Fernandes Corrêa. - 2013.
xi, 48 f. : il.
Orientadora: Profª. Drª. Maria Auxiliadora Andrade;
Co-orientadore: Profª. Drª. Valéria de Sá Jayme; Prof.
Dr. Edmar Soares Nicolau.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de
Goiás, Escola de Veterinária e Zootecnia, 2013.
Bibliografia.
1. Frango de corte – Bactérias 2. Víceras de frango
– Fisiopatologia 3. Camas de aviários – Bactérias I.
Título.
CDU: 636.52/.58:561.23
v
vi
Dedico este trabalho
Aos meus pais, Maria Divina Fernandes da Silva e Laerte de
Deus Corrêa (in memoriam).
Pois a vida passa, mas os princípios e os ensinamentos
ficam e perpetuam.
vii
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus, que me deu vida, saúde e força para
realizar este mestrado, mesmo com todas as turbulações que ocorreram no
decorrer deste.
Em especial à minha mãe, que me deu todo suporte e apoio nessa jornada,
que sempre estava pronta para ouvir e dar seus conselhos, amparo e carinho.
Como já disse Garretty “O amor de mãe é o combustível que capacita um ser
humano comum a fazer o impossível”.
À minha orientadora Profª Dra. Maria Auxiliadora Andrade pela amizade,
paciência, apoio, pela orientação no desenvolvimento desse projeto e por ter
aceitado me orientar, mesmo faltando menos de oito meses para o termino do
tempo regular.
Ao meu co-orientador e amigo Prof. Dr. Edmar Soares Nicolau por ter me
orientado no início do mestrado, e entender que a minha mudança de área de
atuação seria o melhor para minha carreira profissional e acadêmica.
À minha co-orientadora Profª Dra. Valéria de Sá Jayme por sua meiguice e
ternura ao tratar o próximo, sempre com um sorriso no rosto.
À Cinthia Lorena Rezende e Maria Eduarda Lemes Paniago, estagiárias
deste projeto, pela ajuda, dedicação e momentos de descontração e palhaçada.
À Janaina Costa Feistel e Alessandra Arnez, por estarem ao meu lado
desde o início da faculdade, onde sempre estudamos, curtimos, trabalhamos, e
publicamos juntos. A distância não irá mudar minha amizade, respeito e carinho a
vocês.
À Juliana Carvalho e ao Fabrício Pereira, meus amigos e companheiros de
serviço e viagens para Goiatuba, que eu passo mais tempo do que com a minha
própria família.
Aos meus amigos Marcos Paulo e Tassio Mozart, por serem pessoas
extremamente sensatas, sempre prontos para dar apoio e compartilhar o
conhecimento.
À Lucilene Correia, que mesmo não estando junto dela, foi uma pessoa
super importante em minha vida, sempre sendo compreensiva, carinhosa e me
apoiando nos momentos onde o melhor conselho era um abraço e carinho.
viii
Às pessoas importantes como a Aline Pedrosa, Gabriela Santiago, Pedro
Resende, João Paulo, Jalily Helou, Senhor Adair, tais amizades irei manter por
toda minha vida, pois são pessoas sensacionais.
Aos técnicos do laboratório de microbiologia, por propiciarem a execução
dos trabalhos, ao realizarem a limpeza e esterilização dos materiais que foram
utilizados, funcionários estes de extrema importância em todos os trabalhos
realizados neste laboratório.
À todos os Professores do Programa de Pós-Graduação da Escola de
Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás o meu respeito.
À Coordenação de Pós-Graduação, à Escola de Veterinária e Zootecnia
E a todos aqueles que direta ou indiretamente compartilharam do dia-a-dia,
o meu agradecimento.
OBRIGADO!
ix
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................. 01
2. OBJETIVOS ..................................................................................................... 04
2.1. Geral.............................................................................................................. 04
2.2. Específicos .................................................................................................... 04
3. REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................... 05
3.1 Cama de frango.............................................................................................. 05
3.2 Pseudomonas spp. ......................................................................................... 06
3.3. Escherichia coli ............................................................................................ 07
3.4 Salmonella sp. ................................................................................................ 10
3.5 Staphylococcus spp. ...................................................................................... 11
3.6 Resistência a antimicrobianos ........................................................................ 14
4. MATERIAL E METODOS ................................................................................ 16
4.1. Local do experimento .................................................................................... 16
4.2. Coleta das amostras de cama de aviário ...................................................... 16
4.3. Coleta de amostras no frigorífico................................................................... 16
4.4. Processamento das amostras ....................................................................... 19
4.5. Análises estatísticas ...................................................................................... 20
5. RESULTADOS ................................................................................................. 21
6. DISCUSSÃO .................................................................................................... 26
7. CONCLUSÕES ................................................................................................ 36
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 37
x
RESUMO
O trabalho teve como objetivo investigar a presença de bactérias (Escherichia coli,
Staphylococcus coagulase positiva, Pseudomonas spp. e Salmonella sp.) em
vísceras comestíveis, penas e cama de frango. Bem como relacionar a presença
destas bactérias em diferentes escores de alterações macroscópicas e determinar
o perfil de sensibilidade de E. coli e Staphylococcus a antimicrobianos de
importância em medicina veterinária. Para isso foram coletados 13 amostras de
cama de aviário diretamente nos galpões. No abatedouro frigorífico foram
coletados 12 lotes de penas, diretamente na depenadeira, 12 lotes de coração e
fígado, na linha de inspeção, totalizando 740 amostras de coração e 740 amostras
de fígado. Foram estabelecidos três escores de lesões para o coração e seis para
o fígado. A partir destas amostras foi realizado o isolamento das bactérias E. coli,
Staphylococcus coagulase positiva, Pseudomonas spp e Salmonela sp.. Os
positivos para E. coli e Staphylococcus foram submetidos ao teste de
sensibilidade aos seguintes antimicrobianos: ciprofloxacina (5 mg), ceftiofur (25
mg), clorafenicol (30 mg), eritromicina (15 mg), tetraciclina (30 mg),
Sulfametoxazol-Trimetroprim (25 mg), enrofloxacina (5 µg), oxacilina (1 mg) e
gentamicina (10 mg). Além destes para E. coli também foi utilizado colistina (20
mg) e para Staphylococcus coagulase positiva bacitracina (10 µg). Em nenhuma
amostra analisada foi identificado Salmonella sp.. Foram encontrados em
corações, 33,1%, 6,6% e 28,2% de E. coli, Staphylococcus coagulase positiva e
Pseudomonas spp. respectivamente. Em fígados 45,4%, 8,0% e 23,1% de E. coli,
Staphylococcus coagulase positiva e Pseudomonas spp. respectivamente. Para
penas os resultados encontrados foram de 29,2%, 16,7% e 35,8% de E. coli,
Staphylococcus coagulase positiva e Pseudomonas spp. respectivamente. Nas
amostras de cama de frango não ocorreu isolamento de Staphylococcus, os
isolados de E. coli e Pseudomonas spp. foram 92,3% e 7,7% respectivamente. No
teste de sensibilidade a antimicrobianos nas amostras de E. coli e Staphylococcus
coagulase positiva, as bactérias apresentaram a seguinte porcentagem de
suscetibilidade aos antimicrobianos respectivamente: ciprofloxacina (36,7% e
58,8%), ceftiofur (8,1% e 64,7%), clorafenicol (81,0% e 76,5%), eritromicina (2,9%
e 41,2%), tetraciclina (30,9% e 41,2%), Sulfametoxazol-Trimetroprim (43,8% e
82,3%), enrofloxacina (18,6% e 47,1%), oxacilina (3,8% e 47,1%) e gentamicina
(37,1% e 64,7%). Para os isolados de E. coli submetidos ao teste de sensibilidade
à colistina 96,7% foram sensíveis. E para os isolados de Staphylococcus
submetidos ao teste de sensibilidade a bacitracina, nenhuma amostra foi
suscetível a este antimicrobiano.
Palavras chave: antimicrobianos, bactérias, cama de frango, coração, fígado e
sensibilidade.
xi
ABSTRACT
Therefore the study aimed to investigate the presence of these bacteria in edible
offal, feathers and poultry litter. Relate the presence of these bacteria in different
scores macroscopic changes and determine the sensitivity of E. coli and
Staphylococcus antimicrobials of importance in veterinary medicine. For it was
collected 13 samples of manure directly in the sheds, abattoir were collected in 12
lots of feathers, plucking directly into 12 lots of heart and liver, the inspection line,
totaling 740 samples 740 samples of heart and liver. We established three scores
for injuries to the heart and six for the liver. From these samples was carried out
the isolation of the bacteria E. coli, coagulase positive Staphylococcus,
Pseudomonas spp. and Salmonella sp.. Positive for E. coli and Staphylococcus co
were tested for sensitivity to the following antibiotics: ciprofloxacin (5 mg), ceftiofur
(25 mg), chloramphenicol (30 mg), erythromycin (15 mg) , tetracycline (30 mg) ,
trimethoprim-sulfamethoxazole (25 mg) , enrofloxacin (5 mg), oxacillin (1 mg) and
gentamycin (10 mg). In addition to those for E. coli was also used colistin (20 mg)
and Staphylococcus coagulase positive bacitracin (10 mg). In any sample
analyzed was identified Salmonella sp. were found in hearts, 33.1%, 6.6% and
28.2% of E. coli, coagulase positive Staphylococcus and Pseudomonas spp.
respectively. In livers 45.4%, 8.0% and 23.1% of E. coli, coagulase positive
Staphylococcus and Pseudomonas spp. respectively. To feather the results were
29.2%, 16.7% and 35.8% of E. coli, coagulase positive Staphylococcus and
Pseudomonas spp. respectively. In the samples of poultry litter was not isolating
Staphylococcus isolates of E. coli and Pseudomonas spp. were 92.3% and 7.7%
respectively. In antimicrobial susceptibility testing on samples of E. coli and
Staphylococcus coagulase positive bacteria showed the following percentage of
antimicrobial susceptibility respectively: ciprofloxacin (36.7% and 58.8%), ceftiofur
(8.1% and 64.7%), chloramphenicol (81.0% and 76.5%), erythromycin (2.9% and
41.2%), tetracycline (30.9% and 41.2%), Trimethoprim -sulfamethoxazole (43.8%
and 82.3%), enrofloxacin (18.6% and 47.1%), oxacillin (3.8% and 47.1%) and
gentamicin (37.1% and 64.7%). For isolates of E. coli tested for sensitivity to
colistin 96.7% were sensitive. And for Staphylococcus tested for sensitivity to
bacitracin, no specimens were susceptible to this antimicrobial agent.
Keyswords: antimicrobial, bacteria, chicken litter, heart, liver and sensitivity.
1
1. INTRODUÇÃO
O sistema de produção de aves tem como enfoque produzir carnes e ovos
com qualidade, segurança e de forma ética do ponto de vista do bem-estar animal
e impacto ambiental.
As exportações brasileiras despontaram nos anos de 1970 e, com isso,
cresceu o investimento em tecnologia de abate e processamento. Na década de
1990, o Brasil se consolidou como um dos principais produtores de carne de aves
processadas no mundo. Em 2005 devido a gripe aviária, nosso país passou a
abastecer o mercado mundial, até então sob domínio da Tailândia. Foi nessa
ocasião que o Brasil assumiu o primeiro lugar entre os exportadores de carne de
ave (SAVAGLIA, 2009; ABUJAMRA, 2010).
Goiás no ano de 2011 abateu 318,8 milhões de cabeças de frango, em
2012 houve um aumento de 1,1% no abate, com isso o estado de Goiás abateu
322,2 milhões de cabeças de frango. O estado que mais abateu frangos em 2012
foi o estado do Paraná com 1,45 bilhões de cabeças, seguido de Santa Catarina,
887,3 milhões, e Rio Grande do Sul, 728,7 milhões. Ao todo foram
disponibilizados no mercado 11,5 milhões de toneladas de carne de frango (IBGE,
2013).
Para a obtenção higiênica de uma carne de qualidade é necessário que
todos os processos de produção e beneficiamento sejam seguidos dentro da
legislação específica que regulamenta a atividade. Acrescenta-se também que o
status sanitário e ambiental da avicultura brasileira tem uma importância
estratégica para preservar a saúde pública e dos plantéis avícolas.
Para regulamentar e padronizar o procedimento de abate avícola, em
novembro de 1998 o Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA)
aprovou o Regulamento Técnico da Inspeção Tecnológica e Higiênico-Sanitária
de Carne de Aves pela da Portaria 210/1998. Rotineiramente, nos frigoríficos
ocorre a condenação de carnes e vísceras impróprias para o consumo. Este
procedimento visa zelar pela saúde pública, uma vez que a carne de frango e
seus subprodutos, assim como todos os produtos de origem animal, são
potenciais fontes veiculadoras de agentes infecciosos para a cadeia alimentar do
homem (BARCELOS et al., 2006).
2
O ambiente onde as aves são alojadas até o abate podem influenciar no
seu padrão de saúde, afetando diretamente na saúde pública. A cama de frango
pode abrigar várias espécies de bactérias, inclusive patogênicas, no entanto isso
pode ser evitado quando esta é tratada de forma adequada, proporcionando um
ambiente desfavorável para a multiplicação bacteriana (DAVIS et al., 2002).
Os microrganismos veiculados por produtos de origem animal podem ser
provenientes de sua microbiota da pele, de vias respiratórias e do trato
gastrintestinal. Microrganismos como Escherichia coli, Pseudomonas spp.,
Staphylococcus
spp.,
Klebsiella
spp.,
Salmonella
sp.,
Citrobacter
spp.,
Micrococcus spp., Streptococcus spp., Bacillus spp. e Campylobacter spp. têm
sido isolados em carne de frangos de corte e alguns podem ser fontes de infecção
para o ser humano, possuem implicações para a segurança dos alimentos e no
tempo de prateleira do produto (FREITAS et al., 2004).
Dentre os microrganismos responsáveis por doenças em seres humanos e
em animal, destacam-se E. coli, o qual pertence à família Enterobacteriaceae e é
responsável por significativa incidência de processos mórbidos (SAVIOLLI, 2010).
Entretanto isolados de E. coli em lesões de frangos possuem semelhanças
genéticas com E. coli causadores de enfermidades em humanos e podem
constituir risco à saúde do consumidor (ANDRADE, 2005).
Assim como E. coli, Salmonella também estão amplamente distribuídas na
natureza e têm o homem e os animais como reservatórios (JAY, 2005). No
contexto da saúde/produção animal, o gênero Salmonella pode causar doenças
em animais, acarretando diminuições na produção, e ainda podem impactar a
saúde humana por causarem toxinfecção alimentar.
Outro microrganismo, Pseudomonas spp., considerado um patógeno
oportunista, está presente no meio ambiente, na água e no solo, em algumas
superfícies ou substratos formando biofilmes. Pertence à microbiota normal da
superfície de plantas, pele do homem e animais e causam infecções em
organismos imunodeprimidos (MAIA et al., 2009), além de ser o principal
deteriorante de carne refrigerada.
Assim como Pseudomonas spp.,Staphylococcus spp. existem no meio
ambiente, na água, no leite, nos alimentos mal processados ou equipamentos de
processamento de alimentos, na pele de seres humanos e animais. O homem é o
3
principal reservatório para Staphylococcus spp., incluindo Staphylococcus aureus.
Mesmo pertencendo à microbiota normal das mucosas e pele, S. aureus é um dos
mais importantes patógenos para humanos. Este microrganismo tem predileção
ao colonizar as mucosas orais e nasais, além de estar presente em outros locais
como a região perineal, pele e cabelo na maioria dos indivíduos saudáveis
(FORSYTHE, 2005).
Os principais alimentos relacionados às intoxicações causados por toxinas
de S. aureus, são os que necessitam de manipulação, como carnes e derivados,
produtos de ovos, saladas como as de atum, galinha, batata e macarrão, produtos
de panificação como cremes, tortas de creme, sanduíches e leite ou produtos
lácteos (BRASIL, 2009a).
Devido a grande variedade de patógenos que acometem os animais de
produção, e a possibilidade de causarem surtos de toxinfecções alimentares no
homem, existe ainda a preocupação destes produtos introduzirem na cadeia
alimentar estirpes resistentes a antibióticos. Assim os alimentos de origem animal,
como carne de aves, representarem potenciais veículos de transmissão de
microrganismos resistentes para o homem (LEMOS, 2010).
Muitos antimicrobianos possuem utilização controlada, em medicina
veterinária, alguns não podem ser utilizados como promotores de crescimento ou
tem o uso totalmente restrito. Medidas tomadas pelo Ministério da Agricultura
Pecuária e Abastecimento para tentar reduzir a resistência destes e a transmissão
de resistência a bactérias que podem afetar os seres humanos (BRASIL, 2009).
Diante do exposto, o presente trabalho tem como objetivos investigar a
presença de bactérias potencialmente patogênicas e deteriorantes em vísceras
comestíveis, penas e cama de frango, bem como o perfil de resistência dos
isolados de E. coli e Staphylococcus coagulase positivos aos antimicrobianos
mais utilizados em medicina veterinária.
4
2. OBJETIVOS
2.1 Geral
Investigar a presença de bactérias potencialmente patogênicas e
deteriorantes em vísceras comestíveis, penas e cama de frango.
2.2 Específicos
-Investigar
a
presença
de
Salmonella,
E.
coli,
Pseudomonas
e
Staphylococcus em coração e fígado, com diferentes escores de alterações
macroscópicas;
-Investigar a presença das mesmas bactérias em penas e camas;
-Relacionar a presença das bactérias identificadas no coração e fígado
com as bactérias das penas e cama;
- Determinar o perfil de sensibilidade de E. coli e Staphylococcus aos
antimicrobianos mais utilizados em medicina veterinária.
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3. REVISAO DE LITERATURA
3.1 Cama de frango
A cama de frango é caracterizada como todo material distribuído sobre o
piso de galpões, com uma espessura de cinco a 10 cm e serve de leito às aves.
Ela apresenta-se como um componente muito importante na epidemiologia de
algumas doenças, pois recebe todas as excreções das aves, podendo possuir
altas cargas microbiana e parasitária (PAGANINI, 2004). A cama se constitui na
mistura das excretas (fezes e urina) com o material utilizado como substrato, este
visa receber e absorver a umidade das dejeções, das penas e descamações da
pele das aves, restos de alimentos e água, sendo estes últimos provenientes dos
comedouros e bebedouros (ROLL et al., 2008; SAGULA, 2012).
O manejo e a escolha do material a ser utilizado para recobrir o piso dos
galpões, deverão proporcionar ainda um adequado controle do nível de umidade,
redução de produção de pó e amônia, não expor as aves a agentes transmissores
de doenças e ainda prevenir a proliferação de insetos (SANTOS, 2009).
A cama de aviário com 22% de umidade impede o desenvolvimento de
Salmonella sp., E. coli, Listeria, Campylobacter ou Staphylococcus spp.
(FERREIRA et al., 2004; PRA et al., 2009). Esse material é considerado um bom
substrato para a multiplicação bacteriana, a cama de maravalha possui
composição média de 14% de proteína bruta, 17 a 24% de fibra bruta, 58 a 65%
de matéria seca, com um pH entre 6,0 a 9,0 na presença do frango e uma
temperatura variando de 20 e 32°C dentro do galpão (ANGELO et al., 1997;
JEFFREY, 2001; PRA et al., 2009).
A microbiota da cama é extremamente variada devido ao contínuo aporte
de material fecal, secreções e descamações das aves durante o ciclo de criação e
também pela presença de fungos e bactérias do ambiente. Com isso, a carga
microbiana assemelha-se à composição do conteúdo do íleo dos frangos,
entretanto, possui menor quantidade de bactérias que o trato digestivo destes
pode ocorrer aumento deste número quando a cama é reutilizada, e quando a
umidade e o pH favorecerem o crescimento de microrganismos (REHBEGER,
2002; LU et al., 2003; SANTOS, 2009).
6
As principais bactérias da cama de frango são mesófilas aeróbias e
microaerófilas. As bactérias Gram-positivas mais encontradas são os lactobacilos,
enquanto que as Gram-negativas são representadas por Escherichia coli,
Salmonella sp. e Campylobacter spp. (NANDI et al., 2004). KWAK et al. (2005)
encontraram em seus estudos 31 diferentes gêneros de bactérias em cama de
aviário,
sendo
82%
Gram-positivas,
principalmente
Lactobacillus
sp.
e
Salinococcus sp. e em menor quantidade Clostridium sp.,Staphylococcus spp. e
Bordetella sp..
3.2 Pseudomonas spp.
Pseudomonas spp. são bacilos Gram negativos de 0,5 a 1,0 X 1 a 5 µm,
móveis aeróbios obrigatórios, oxidase e catalase positivas, não formadores de
esporos. Possui intensa atividade metabólica, degradando proteínas, gorduras,
carboidratos e outros substratos. Causam infecções oportunistas em diferentes
espécies de animais (QUINN et al., 2005; ZAVASCKI, et al., 2008).
São microrganismos que se caracterizam pela produção de pigmentos
difusíveis, causando alterações nas características químicas e sensoriais,
representando o grupo mais frequente em alimentos frescos, tanto de origem
animal quanto vegetal. A presença de Pseudomonas spp. em altos níveis no final
do processamento ocasiona a redução da vida de prateleira mesmo em produtos
refrigerados, pois são microrganismos psicrotróficos. Produzem muco na
superfície dos produtos, além de odores e sabores desagradáveis, sendo, de
grande importância para a indústria de alimentos (QUINN et al., 2005; MAIA et al.,
2009). Sendo assim considerado um dos principais responsáveis pela
deterioração da carne in natura (ALCANTARA et al., 2012).
O principal representante do gênero é Pseudomonas aeruginosa. As
linhagens patogênicas são produtoras de toxinas e enzimas que promovem
invasão celular, mediada por fímbrias e lesões teciduais. Após alojar-se nos sítios
de ligação, a colonização e a replicação são auxiliadas pelas propriedades
antifagocitárias da exoenzima S, pela camada limosa extracelular e pelos
lipopolissacarídeos da membrana externa (ARAKAWA et al, 2000; QUINN et al.,
2005; SOUZA et al., 2006).
7
Outra característica das Pseudomonas é a capacidade de formar biofilmes,
que consiste em colônias de bactérias inseridas em uma matriz polímera de
polissacarídeos, DNA extracelular e proteínas, produzidas pelas próprias
bactérias. Esses biofilmes induzem a fixação das bactérias a uma superfície,
propiciando um ambiente ideal para o desenvolvimento, troca de material genético
entre as bactérias e funciona ainda como forma de proteção que permite aos
microrganismos sobreviverem em ambientes adversos, protegendo contra o
sistema de imune do hospedeiro e dificultando a difusão de antibióticos e
desinfetantes (LINCONPAN & TRABULSI, 2008).
Pseudomonas spp. possui multirresistência conhecida, principalmente pela
produção de beta-lactamases plasmideais e cromossômicas, em muitos casos
esse patógeno é resistente a todos os antibióticos atualmente disponíveis, exceto
as polimixinas (ZAVASCKI et al., 2007). Mesmo assim eventualmente são
relatados casos de resistência a esta classe de antibióticos, devido a algumas
alterações da membrana externa da bactéria (BONOMO & SZABO, 2006).
Sua resistência a diferentes antimicrobianos pode ser intrínseca, devido à
baixa permeabilidade de sua membrana e a formação de biofilme, ou adquirida
pela associação, no solo, com microrganismos naturalmente produtores de
antibióticos. Devido à sua presença em uma multiplicidade de ambientes, pode
carrear plasmídios e genes que lhe conferem multirresistência (MAIA et al., 2009;
LAMBERT et al., 2011). As mínimas necessidades nutricionais e a resistência as
diversas condições físicas, incluindo capacidade de se multiplicar mesmo em
baixas temperaturas, com grande concentrações de corantes e sais possibilita
sua presença em diversos ambientes e propicia sua participação como agente
oportunista (PIRNAY et al., 2005; MAIA et al., 2009).
3.3 Escherichia coli
O gênero Escherichia pertencente à família Enterobacteriaceae, composto
por diferentes espécies, Escherichia coli, Escherichia blattae, Escherichia
fergusonii, Escherichia hermanii e Escherichia vulneris. No entanto, a principal
espécie de importância é E. coli (CAMPOS & TRABULSI, 2002). E. coli é um
bastonete curto, Gram-negativo, não esporulado, medindo entre 1,1 a 1,5 μm por
8
2 a 6 μm, a maioria é móvel, devido a existência de flagelos peritríqueos
(BARNES et al. 2003; OLIVEIRA et al., 2004; QUINN et al., 2005). É uma das
principais constituintes da microbiota intestinal de animais, faz parte do grupo de
coliformes fecais (coliformes a 45 ºC) e é considerada indicador de contaminação
fecal e eventual presença de bactérias patogênicas em alimentos (OLIVEIRA et
al., 2004).
Vários fatores contribuem para sua disseminação no meio ambiente pois é
excretada nas fezes e pode sobreviver nas partículas fecais, poeira e água por
semanas ou meses, tem habilidade de crescer rapidamente e usa uma grande
variedade de materiais como nutrientes (ANDRADE, 2005; SAVIOLLI, 2010).
O trato respiratório superior, nas aves, é a principal porta de entrada na
infecção por E. coli, ocorrendo a colonização e multiplicação do agente na
traquéia, com posterior disseminação para os sacos aéreos e tecidos adjacentes.
A infecção por Escherichia coli pode ocorrer no incubátorio ou nos galpões.
A patogenia da infecção por E. coli ocorre após a adesão da bactéria ao
sítio de ligação no órgão, ocorre uma resposta inflamatória aguda, que faz a
permeabilidade vascular aumentar e ocorrer acumulo de fluidos e proteínas nos
tecidos. As membranas serosas dos órgãos tornam-se edemaciadas. O exsudato
acumula e eventualmente é formado uma massa caseosa, firme, seca, amarela e
irregular. Esse exsudato caseoso consiste em um granuloma heterofílico
contendo variável número de colônias de E. coli cercado por células
multinucleadas gigantes e macrófagos (BARNES et al., 2003).
As
principais
lesões
encontradas
são:
aerossaculite,
pericardite,
perihepatite, pleoropneumonia e peritonite. A evolução da doença é rápida e
frequentemente resulta em septicemia, causando alta mortalidade. Aves que
sobrevivem podem apresentar outras lesões menos frequentes que incluem:
hepatite, salpingite, panoftalmite, meningoencefalite, celulite, osteomielite e
sinovite (BARNES et al., 2003, ABUJAMRA, 2010).
E. coli podem ser agrupadas de acordo com seus mecanismos de
patogenicidade, em patótipos que estão frequentemente associados à doença em
animais: as ETEC (E. coli enterotoxigênicas), EPEC (enteropatogênica), STEC (E.
coli produtoras de toxina de Shiga), EIEC (E.coli enteroinvasivas), UPEC
(uropatogênicos), NMEC (meningite neonatal), REDEC (enteropatogênicos de
9
coelhos) e APEC (E. coli patogênicas para aves) (BARNES et al., 2003; KNÖBL,
et al., 2006; BERCHIERI JUNIOR, et al., 2009).
A patogenicidade de E. coli se manifesta por um mecanismo multifatorial e
complexo que envolve vários fatores de virulência e variam com o sorotipo
(KUHNERT et al., 2000; ROCHA, 2008).
Estes fatores de virulência fazem parte do corpo bacteriano que é
composto de estruturas antigênicas que contribuem para a determinação dos
sorogrupos de E. coli, essa determinação é realizada por meio de anti-soros e
baseada na classificação, que Kauffmann realizou em 1947, dos antígenos
somáticos (Ӧhne – “O”), capsulares (Kapsel – “K”), flagelares (Hauch – “H”) e
fimbriais (Fimbriae – “F”/P) (CAMPOS & TRABULSI, 2002; ROCHA, 2008).
Acredita-se que as fímbrias P podem estar envolvidas na transformação de
linhagens avirulentas em linhagens virulentas de E. coli e a colonização de órgãos
internos como fígado, coração e o desenvolvimento de septicemias são
dependentes da expressão de adesinas manose resistentes como as fímbrias P.
(ASSIS & SANTOS, 2001; CAMPOS et al., 2005).
Dentre os patótipos de E. coli em avicultura destaca-se o APEC, que
determina infecções, localizadas ou sistêmicas, os quais tem sido isolados em
aves de produção e são considerados patogênicos apenas para aves,
apresentam um baixo risco de afetar o homem ou outros animais (BARNES et al.,
2003; BARCELOS, 2005).
A colibacilose é uma das mais comuns e principais doenças na avicultura
industrial moderna. O aparecimento da colibacilose é o resultado da interação da
bactéria com o hospedeiro e com meio ambiente, sendo que só amostras
patogênicas possuem capacidade de causar a doença. E. coli do grupo APECs
podem ser encontrados nas fezes e na cama dos aviários e têm sido associados
a infecções extra-intestinais (ASSIS & SANTOS, 2001; BARCELOS, 2005).
Na produção de frango de corte é utilizado antimicrobianos para tentar
controlar e minimizar os danos associados a colibacilose aviária. Devido ao amplo
uso destes, é comum o aparecimento de linhagens resistentes a diversos
antibióticos, causando graves consequências à industria avícola e a saúde
pública, por causa da transferência horizontal de genes plasmídeais ou
10
cromossômicos a microrganismos comensais ou patogênicos (BARROS et al.,
2012).
3.4 Salmonella sp.
Salmonellae são bastonetes Gram negativos pertencentes à família
Enterobacteriaceae, medindo de 0,7 a 1,5 µm por 2,5 a 5 µm, não formadores de
esporos, anaeróbio facultativo, móveis em sua grande maioria, com flagelos
peritríquios, excetuando os sorovares Salmonella Pullorum e Salmonella
Gallinarum. Multiplicam-se em temperaturas de 5oC a 46oC, entretanto, a
temperatura ótima é de 35ºC a 37 oC. Crescem bem em pH entre 3,8 a 9,5, sendo
7 o pH ideal. Atividade de água (Aw) mínima para crescimento é de 0,94 (SILVA
et al., 2007).
A nomenclatura do gênero tem particularidades, pois, embora alguns
considerem os sorovares como se cada um fosse uma espécie, as salmonelas
foram agrupadas em apenas duas espécies, levando-se em consideração a
hibridização de DNA e nas características eletroforéticas com enzimas multilocus.
Salmonella enterica e Salmonella bongori foram divididos em seis subespécies:
salamae, arizone, diarizone, houtenae, indica (JAY, 2005).
A identificação do gênero é definida de acordo com suas características
bioquímicas, sorológicas e antigênicas. Sendo a divisão de seus sorovares
baseada na composição de seus antígenos de superfície, que são os antígenos
somáticos “O”, flagelares “H” e capsulares “Vi”, este último encontrado somente
nos sorovares Salmonella enterica ser. Dublin, Salmonella. enterica ser. Typhi e
Salmonella enterica ser. Paratyphi C. Taxonomia definida conforme proposto pelo
esquema White-Kauffmann Le-Minor (GRIMONT & WEILL, 2007; SILVA et al.,
2007).
Com elevada capacidade de difusão, tanto por transmissão vertical, quanto
horizontal, e a colonização do trato gastrintestinal das aves por este agente, pode
ocorrer no momento do abate sua incorporação ao produto final, oferecendo risco
ao consumidor (CARDOSO & TESSARI, 2008).
Diante do grande risco de contaminação, outro ponto que desfavorece o
tratamento é a resistência a antimicrobianos e particularmente a resistência
11
múltipla a quatro ou mais drogas,o que se observou em Salmonella enterica ser.
Typhimurium em meados dos anos 60, apresentando aumento significativo na
década de 90 com o aumento do uso de antibióticos tanto no tratamento quanto
seu uso como promotores de crescimento (THRELFALL, 2002).
O controle deste microrganismo no período de pré abate e durante o abate
são fundamentais, pois é um dos principais microrganismos relacionados a surtos
de doenças veiculadas por alimentos, WELKER et al. (2010) analisaram 186
surtos de doenças veiculadas por alimentos, Salmonella sp. foi o principal
microrganismo identificado (37%), em carnes de origem avícola.
Para a eliminação destes microrganismos nos alimentos a temperatura é
um bom método, pois quando submetidas à temperatura superior a 55ºC por um
período de uma hora ou a 60ºC por 15 a 20 minutos são destruídos (GAMA,
2001).
3.5 Staphylococcus spp.
Alexander Ogston, em 1880, utilizou a palavra grega staphylo, para
designar o gênero, devido a formação semelhante a um cacho de uva (BOTH
2007). Staphylococcus spp. são cocos Gram-positivos, imóveis, não formam
esporos, são catalase-positivos e tendem a formar agrupamentos semelhantes a
cachos de uva (MARTINS, 2002). Fazem parte da família Micrococcaceae que
apresenta 29 espécies e apenas três a quatro espécies apresentam potencial
patogênico para aves, sendo mais a patogênica Staphylococcus aureus
(FERREIRA & FERREIRA, 2000, BARCELOS, 2005).
São microrganismos mesófilos, temperatura de multiplicação entre 7 e
47,8º C, podem produzir enterotoxinas termorresistentes a temperaturas entre 10
e 46º C, com temperatura ótima entre 40 e 45º C. O pH ideal para
desenvolvimento varia entre 7 a 7,5, mas é possível a multiplicação em alimentos
com pH variando entre 4,2 e 9,3 (SANTANA et al., 2010).
Outra característica deste grupo de microrganismos é a capacidade de
sobreviver e se multiplicar em uma concentração de cloreto de sódio de até 15%
e a produção de enterotoxina acontece em concentrações de sal de até 10%,
sendo considerado assim um microrganismo halofílico (SANTANA et al., 2010).
12
Quanto à atividade de água (aw) Staphylococcus spp. são os únicos capazes de
se multiplicarem em alimentos com valores de atividade de água inferiores ao
normalmente considerados mínimos para outras bactérias halófilas, podendo se
multiplicar em alimentos com aw de 0,86 (FRANCO & LANDGRAF, 2005,
SANTANA et al., 2010).
Devido sua relativa resistência esses microrganismos estão amplamente
presentes no meio ambiente, colonizam as superfícies e mucosas de mamíferos e
aves. A dessecação pode se manter viável por longos períodos em fômites e são
destruídos à 60 ºC entre 43 segundos até oito minutos (STROHL et al., 2003,
BARCELOS, 2005).
A capacidade do Staphylococcus produzir coagulase, uma enzima
extracelular, é uma das provas mais utilizadas para caracterizar as cepas
produtoras de enterotoxinas, embora a relação entre a produção da coagulase e a
de enterotoxinas não seja absoluta (ORDEN et al., 1992; WONG & BERGDOLL,
2002). S. aureus produzem enterotoxinas que são identificadas e caracterizadas
em A, B, C (C1, C2 e C3), D e E (FERREIRA & FERREIRA, 2000). Outras
espécies de estafilococus também podem produzir enterotoxinas, porém surtos de
intoxicação alimentar estão relacionados somente a S. aureus enterotoxigênicos
(ZOLI et al., 2002). Algumas outras enterotoxinas foram descobertas, como as G,
H, I, J, K, L, M, N, O, P, Q, R e U, porém o envolvimento destas com surtos de
intoxicações alimentares ainda não estão bem esclarecidos (JORGENSEN et al.,
2005, SANTANA 2010).
Em animais, Staphylococcus spp.está associado a lesões purulentas da
pele que ocasionalmente, podem tornar-se sistêmicas (JONES et al., 2000). Em
aves comerciais Staphylococcus spp., incluindo Staphylococcus aureus, é causa
de diversas enfermidades, desde uma septicemia aguda à osteomielite
(SKEELES, 1997). Como as aves podem ser reservatórios dessa bactéria, estas
podem representar um potencial significativo nos surtos de intoxicações por S.
aureus enterotoxigênicos (FERREIRA &FERREIRA, 2000, BARCELOS 2005).
A frequência de colonização de S. aureus varia acentuadamente em aves,
alguns
plantéis
não
apresentam
S.
aureus
detectável;
em
outros,
aproximadamente 30% das aves apresentam fígados e articulações dos jarretes
infectados (FRASER, 1997, BARCELOS, 2005). Estudos de AWAN &
13
MATSUMOTO (1998), mostraram que dentre 79 isolados de Staphylococcus, 30
foram obtidos dos fígados das aves e os 49 restantes, de articulações e sangue.
Quando Staphylococcus atingem o fígado, este pode apresentar-se
tumefeito, congesto e esverdeado (FRASER, 1997). O órgão pode apresentar
pontos esbranquiçados de tamanhos variados, desde 1 a 4 mm com
hepatomegalia e necrose focal. Esses mesmos focos necróticos também podem
ser encontrados no tecido esplênico (FERREIRA & FERREIRA, 2000).
A evolução e a disseminação de microrganismos resistentes aos
antibióticos são os resultados da pressão seletiva imposta pelo homem, seja pela
prescrição necessária dessas drogas ou pelo uso incorreto em tratamentos sem
diagnóstico
estabelecido,
automedicação,
desperdício
de
restos
de
antimicrobianos no meio ambiente e emprego desses fármacos como fatores de
crescimento em animais de produção (TAVARES, 2000; FREITAS et al., 2004;
CARDOSO et al., 2006). Além disso, é possível que os resíduos de antibióticos
em produtos animais possam ser veiculados a pessoas que os consumam,
produzindo efeitos de toxicidade ou reações alérgicas em indivíduos previamente
sensibilizados, além de favorecer o aparecimento de bactérias resistentes
(FREITAS et al., 2004).
A resistência das bactérias pode ser natural, ou intrínseca, resistência
adquirida e resistência induzida. A resistência natural é um caráter hereditário,
compõe a herança genética cromossômica deste microrganismo e é transmitida
às células filhas de forma vertical (TAVARES, 2001).
Já a resistência adquirida, trata-se de uma nova propriedade que surge nas
espécies de bactérias, que em determinado momento passam a não responder a
ação de drogas que antes eram efetivas contra o restante da população. Devido a
alterações no cromossomo bacteriano ou em elementos extra cromossomais,
ocorre modificações na estrutura ou no funcionamento da célula bacteriana,
decorrentes da modificação destes fatores genéticos (TAVARES, 2001). O
desenvolvimento de resistência por certas bactérias patogênicas é mais rápido
que a capacidade da indústria para produzir novas drogas (FREITAS et al., 2004).
14
3.6 Resistência a antimicrobianos
O processo resistência das bactérias aos antimicrobianos pode ser dado de
acordo com o grupo de antibiótico envolvido. Em exemplo, a resistência das
bactérias à oxacilina e aos demais beta-lactâmicos é caracterizado pela
expressão de uma proteína ligante de penicilina modificada extremamente
funcional, mas com afinidade reduzida por beta-lactâmicos, conferindo a bactéria
a capacidade de sintetizar a parede celular mesmo na presença da meticilina
(beta-lactâmico sintético resistente a ação das beta-lactamases) (ITO et al.,
2003).
Já para os macrolídeos, DAUREL & LECLERCQ (2008) relatam que é
frequente a resistência, de Staphylococcus aureus, a eritromicina. Essa
resistência é devido a produção de metilase, enzima trasferase que transfere metil
de um grupo doador para um receptor, sendo responsável pela modificação
ribossômica deste antibiótico.
Estes mesmos autores também afirmam que a resistência às quinolonas,
está relacionada a mutações na topo-isomerase, responsável pela replicação e
empacotamento do DNA, que é o local alvo deste antibiótico. Pois o método de
ação da ciprofloxacina é a inibição da replicação de DNA bacteriano, isso ocorre
pois elas inibem a DNA girase, afetando a replicação, transcrição e reparo gênico
(SANTANA et al., 2011).
Entretanto a resistência às quinolonas, como a ciprofloxacina, geralmente
não é associada à transferência gênica, mas à expressão de uma capacidade
própria da bactéria em desenvolver resistência quando exposta a um ambiente
hostil com pressão seletiva (SILVA et al., 2008; VIEIRA et al., 2010).
A enrofloxacina é um quimioterápico, do grupo das flouroquinolonas
derivados do ácido quinoloncarboxílico, que também tem como mecanismo de
ação a inibição da replicação do DNA bacteriano pela sua ação sobre as enzimas
topoisomerases tipo II bacterianas, a DNA girase e a topoisomerase IV
(SANTANA et al., 2011).
Alguns antibióticos são direcionados ao tratamento contra um grupo de
bactérias em específico, é o caso da colistina, no tratamento de bactérias Gram –
negativas. Este é um agente antimicrobiano polipeptídico, descoberto em 1940,
15
constituído por uma mistura complexa de polimixinas que tornou-se a terapia de
primeira linha para infecções graves causadas por algumas bactérias Gramnegativas, pois promove uma desestabilização da membrana externa das
bactérias (DOCOBO-PEREZ et al., 2012; KEMPF et al., 2013).
O processo de resistência a este antibiótico se dá pela modificação da
camada de lipopolissacarídeo da bactéria, reduzindo assim a afinidade desta
pelas polimixinas (KEMPF et al., 2013).
Para evitar e reduzir a resistência e a presença de resíduos de
antimicrobianos em produtos de origem animal o Ministério da Agricultura
Pecuária e Abastecimento, estabelece normas de utilização e a proibição de
alguns princípios ativos. Nesse sentido proibiu a utilização, manipulação,
comercialização e importação de qualquer produto ou medicamento para uso
veterinário que possua cloranfenicol como princípio ativo (BRASIL, 2003).
No Brasil é proibido o uso de tetraciclina como promotores de
crescimento, visando evitar resíduos na carne comercializada e reduzir as taxas
de resistências (BRASIL, 2009b) pois, a resistência a tetraciclina, frequentemente,
é mediada por plasmídeos, que apresentam uma ampla variedade de
determinantes genéticos e carreiam genes de resistência entre as bactérias
(SAYAH et al., 2005).
A utilização de cefalosporinas, como o ceftiofur, também tem a utilização
restrita como antibiótico, sendo vedada a utilização deste como aditivo
zootécnicos ou melhoradores de desempenho (BRASIL, 2009b). Ceftiofur é uma
cefalosporina de 3ª geração que possui como método de ação a inibição da
síntese da parede celular bacteriana (SANTANA et al., 2011).
Já a resistência a ceftiofur pode ser dada pela presença de plasmídeos
carreadores de genes de E. coli espectro-estendido cefalosporinas. As bactérias
que possuem plasmídeos com esse fator, podem transmitir resistência a
cefalosporinas a outras espécies de bactérias e dentro da mesma espécie de
acordo com (SHAHADA et al., 2012, SEIFFERT et al., 2013). Cada grupo de
antimicrobiano
possui
características
particulares,
microrganismo possui mecanismo próprio de resistência.
assim
como
cada
16
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Local do experimento:
O experimento foi realizado entre os meses de dezembro de 2012 a julho
de 2013, em propriedades que produzem frangos de corte, situados na região sul
e sudeste do estado de Goiás, em um matadouro-frigorífico, localizado na cidade
de Goiatuba (GO), e no laboratório de bacteriologia do Departamento de Medicina
Veterinária da Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de
Goiás (DMV/EVZ/UFG).
4.2 Coleta das amostras da cama de aviário
Foram coletadas 13 amostras de cama de aviário, diretamente nos
criatórios das aves, no dia do carregamento dos frangos para o frigorífico.
Para compor cada amostra foi realizado um mapa do galpão com a
marcação dos pontos de coleta os quais foram dispostos equidistantes entre as
linhas dos bebedouros e comedouros. Foram marcados cinco pontos, fazendo
com que fossem coletadas amostras ao longo de todo o galpão de maneira
uniforme. A amostra final foi composta por no mínimo 500 g de cama de aviário
de cada galpão, as quais foram acondicionadas em sacos plásticos, mantidos sob
refrigeração em
caixas isotérmicas
e
encaminhados
ao laboratório
de
bacteriologia (DMV/EVZ/UFG).
4.3 Coleta de amostras no frigorífico
No abatedouro frigorífico, onde se processou a coleta de amostras, existem
duas depenadeiras automáticas, com capacidade para depenar 12 animais por
ciclo, localizadas imediatamente após o tanque de escaldagem com água a
temperatura de aproximadamente 62 ºC.
Cada lote foi caracterizado pelo grupo de animais de um produtor em um
determinado dia. Por lote, foram coletadas 10 amostras de pool de penas,
aleatoriamente, sendo cada amostra representada pela capacidade de cada
17
depenadeira. Entre as coletas, foi respeitada a passagem de um lote pela
depenadeira, para se obter uma maior variedade amostral, foram coletados 12
lotes.
Foram coletadas amostras de coração e fígado de 12 lotes, sob inspeção
estadual diretamente na linha de inspeção. Coletou-se 1480 amostras, sendo 740
de fígado e 740 de coração. Para realizar a coleta de fígado e de coração foi
estabelecido escores pelas alterações macroscopicas.
Para o coração, foram estabelecidos três escores (Figura 01): 1) normal:
coloração castanha, aspecto firme sem manchas esbranquiçadas na superfície; 2)
pericardite: lesões focais no pericárdio, sem acúmulo de fibrina, 3) pericardite com
aderência/fibrina: aderência do pericárdio visceral ao pericárdio parietal, com
acúmulo de fibrina sobre a superfície do órgão.
FIGURA 01: A – Coração sem alterações macroscópicas; B – Coração com
lesões de pericardite; C – Coração com pericardite e aderência de
pericárdio, fígado também apresenta perihepatite; D –
Hemopericárido.
18
Para o fígado foram considerados seis escores (Figura 02): 1) normal:
coloração castanho-avermelhado, com bordas finas e sem alterações superficiais;
2) amarelo/gorduroso: fígados amarelados de consistência flácida, geralmente
aumentados de tamanho; 3) congesto/hemorrágico: fígado congestos com
superfície irregular e/ou com pontos de hemorragias; 4) focos de necroses:
nodulações endurecidas, puntiformes e difusamente distribuídas no parênquima
hepático; 5) esverdeado/enegrecido: coloração escura, verde e enegrecida; 6)
perihepatite: aumentado, presença de fibrina sobre a cápsula hepática.
FIGURA 02. A – Fígado normal; B – Fígado amarelado e gorduroso; C – Fígado
congesto; D – Fígado com nodulações endurecidas distribuídas no
parênquima; E – Fígado esverdeado também com nodulações; F –
Fígado com perihepatite.
19
As vísceras sem lesões macroscópicas aparentes, coletadas na linha de
inspeção, foram agrupadas aleatoriamente em pools de cinco órgãos totalizando
120 amostras de fígado e 120 de coração. E as amostras com escores definidos
foram processadas individualmente no total de 620 fígados e 620 corações,
totalizando 740 amostras processadas de cada vísceras.
Imediatamente após a coleta as amostras foram acondicionadas em caixa
de isopor contendo gelo e encaminhadas ao laboratório e processadas em até 24
horas.
4.4 Processamento das amostras
Após a identificação dos escores do fígado e coração lesionados e cada
pool de órgãos foi macerado, e uma alíquota de 1,0 g foi transferida 9 mL de água
peptonada a 1% e incubadas por 18 a 24 horas a 37º C.
As penas, assim como as camas eram homogeneizadas nas embalagens
plásticas e retirado com uma pinça esterilizada uma porção de 2,5g de cada
amostra e transferidas para 22,5 mL de água peptonada, a 1% e incubadas por
18 a 24horas a 3 7ºC.
Em seqüência uma fração de 1,0 mL da água peptonada foi transferida
para 9mL de caldo selenito-cistina e 9mL de caldo cérebro coração (BHI), e 0,1
mL, caldo Rappaport Vassiliadis os quais foram incubados em estufa a 37 ºC por
18-24 horas.
Com o auxilio da alça de níquel cromo foi retirada alíquotas dos caldos
Rappaport Vassiliadis e caldo selenito cistina as quais foram estriadas por
esgotamento nos ágares xylose lysine tergitol 4 (XLT4) e ágar verde brilhante
(VB). Do BHI alíquotas foram repicadas em ágar Mac Conkey e ágar manitol
salgado e colocadas em uma estufa a 37 ºC por 18- 24 horas.
Após este período, de cada meio utilizado, foram selecionadas três
unidades formadoras de colônias (UFCs) com características morfotinturiais
compatíveis com Salmonella, E.coli, Pseudomonas e Staphylococcus transferidas
para no ágar tríplice açúcar ferro (TSI), os quais foram incubados a 37 ºC por 1824 horas.
20
Os tubos de TSI com crescimento característico de Pseudomonas, E. coli e
Salmonella foram submetidos a uma série de provas bioquímicas: produção de
urease, de indol, de H2S, prova do vermelho de metila, prova de motilidade, citrato
de Simmons, do malonato. A prova de lisina descarboxilase foi acrescentada para
Salmonella e a utilização de glicose, lactose para E.coli.
Para a identificação de Staphylococcus foram realizados os testes de
coloração pelo método de Gram, prova da catalase, teste oxidação e fermentação
(OF) e da coagulase.
Para a realização do teste de sensibilidade aos antibimicrobianos foi
utilizado o método estabelecido por NCCLS (2011) a partir dos isolados de
Staphylococcus coagulase positiva e Escherichia coli, num total 17 e 210
respectivamente, foram submetidos ao teste de sensibilidade. Foram utilizados
discos impregnados com os seguintes antimicrobianos: ciprofloxacina (5 mg),
ceftiofur (25 mg), clorafenicol (30 mg), eritromicina (15 mg), tetraciclina (30 mg),
Sulfametoxazol-Trimetroprim (25 mg), enrofloxacina (5 µg), oxacilina (1 mg) e
gentamicina (10 mg). Além destes, para E. coli também foi utilizado colistina (20
mg) e para Staphylococcus coagulase positiva bacitracina (10 µg). Foram
escolhidos estes pois são importantes na medicina veterinária e em saúde
publica.
4.5 Análises estatísticas
Além de análise estatística descritiva foram realizados os teste de quiquadrado, regressão logística e Odd Ratio (SAMPAIO, 2010), utilizando o
software R® (2013), estes testes foram utilizados para determinar a relação entre
os microrganismos encontrados nas penas com os achados nas vísceras,
correlacionar as alterações nas vísceras com os agentes isolados e a relação
entre os isolados das lesões dos fígados com as lesões dos corações.
21
5. RESULTADOS
Conforme observado na Tabela 1, Salmonella sp. estavam ausentes nas
amostras de coração, fígado, penas e cama.
Das amostras de corações analisadas 245/740 (33,1%) foram positivas
para Escherichia coli; 49/740 (6,6%), para Staphylococcus coagulase positiva;
209/740 (28,2%) para Pseudomonas spp..
Para os fígados analisados 262/740 (35,4%,) foram positivos para
Escherichia coli; 50/740 (8,0%), para Staphylococcus coagulase positiva e
171/740 (23,1%) para Pseudomonas spp..
Do total de 120 amostras de penas de frango 35/120 (29,2%) foram
positivas para E. coli; 20/120 (16,7%), para Staphylococcus coagulase positiva e
43/120 (35,8%) para Pseudomonas spp..
Do total das 13 amostras de cama de frango analisadas Escherichia coli foi
detectada em 92,3% (12/13) das amostras; Pseudomonas spp. em uma amostra
(1/13) 7,7% e Staphylococcus coagulase positiva e Salmonella sp.não foram
identificados.
TABELA 1- Resultados bacteriológicos de amostras de coração, fígado, pena e
cama de frango
Staphylococcus Pseudomonas Salmonella
Amostra
E. coli
CP
spp.
sp.
209/740
Coração 245/740 (33,1%) 49/740 (6,6%)
(28,2%)A
0/740 (0%)
171/740
Fígado
262/740 (45,4%) 59/740 (8,0%)
(23,1%)A
0/740 (0%)
B
Pena
35/120 (29,2%)
20/120 (16,7%)
43/120 (35,8%) 0/120 (0%)
Cama
12/13 (92,3%)
0/13 (0%)
1/13 (7,7%)
0/13 (0%)
Legenda: Staphylococcus CP: Staphylococcus coagulase positivo; Letras
diferentes na mesma coluna indicam diferença significativa (< 0,05)
Para verificar se existe relação entre os microrganismos encontrados nas
penas com os encontrados nas vísceras, foi utilizado o teste de Fisher. Tanto para
o coração e o fígado, apenas Pseudomonas spp. obtiveram p < 0,05, mostrando
que quanto mais isolados de Pseudomonas spp. nas penas, maior possibilidade
desta bactéria estar presente nas vísceras.
22
Como pode ser visualizado na Tabela 2, das 120 amostras de corações
com escore normal 50 foram positivas para E. coli (41,7%), 3 (2,5%)
para
Staphylococcus coagulase positiva e 41 (34,2%) para Pseudomonas spp..
Das 594 amostras identificadas com escore de pericardite em 182 (30,6%)
foram isoladas E. coli, em 45 (7,6%) Staphylococcus coagulase positiva e 162
(27,3%) foram positivas para Pseudomonas spp..
Foram identificados 26 corações de frango com pericardite fibrinosa,
fibrino-purulenta e com aderências (escore:aderência/fibrina), destes 13 tiveram
isolamento de E. coli, correspondendo a 50%, ao pesquisar Staphylococcus
coagulase positiva foi encontrada 1 amostra positiva (3,8%) e 6 amostras
positivas para Pseudomonas spp.totalizando 23,1%.
TABELA 2- Ocorrência de E. coli, Staphylococcus coagulase positiva,
Pseudomonas spp. e em amostras de coração de acordo com o escore
Staphylococcus
Pseudomonas
Escore
E. coli
CP
spp.
Normal
50/120 (41,8%)
3/120 (2,5%)
41/120 (34,2%)
Pericardite
182/594 (30,6%) 45/594 (7,6%)
162/594 (27,3%)
Aderencia/Fibrinoso 13/26 (50,0%)
1/26 (3,8%)
6/26 (23,1%)
Legenda: Staphylococcus CP: Staphylococcus coagulase positivo
Foi utilizada para verificar a chance das bactérias pesquisadas causar
lesões no coração, por regressão logística, o modelo matemático encontrado para
as variáveis é representado pela seguinte fórmula:
O valor de p encontrado para todas as variáveis foi menor que 0,05, com
isso pode-se concluir que ao isolar alguma das bactéria no coração, existe maior
chance desse órgão possuir lesão.
Ao analisar as razões de chances (Odd ratio), foi visto que corações com
Staphylococcus coagulase positiva possuem 3,58 vezes mais chances de possuir
lesões que os corações normais.
Foi utilizado regressão logística para comparar os microrganismos isolados
com o tipo de lesão em cada víscera, foi observado que E. coli causa mais lesões
de pericardite, do que as outras bactérias.
23
Como pode ser visualizado na Tabela 3, as 120 amostras de fígados
considerados aparentemente normais, sem alterações macroscópicas (escore
normal)
32/120
(26,3%)
foram
positivas
E.
coli;
11/120
(9,2%)
para
Staphylococcus coagulase positiva e 27/120 (22,5%) para Pseudomonas spp..
Das 249 amostras de fígados com cor amarelada e aspecto gorduroso
(escore: amarelo/gorduroso) 104/294 (35,4%) foram positivos para E. coli; 35/294
(11,9%) para Staphylococcus coagulase positiva e 62/294 (21,1%) isolados de
Pseudomonas spp..
Das 245 amostras de fígados congestos e/ou hemorrágicos (escore:
congesto/hemorrágico), 83/245 (33,9%) foram positivos para E.coli; 9/245 (3,7%)
para Staphylococcus e coagulase positiva 67/245 (27,3%) para Pseudomonas
spp..
As amostras de fígados, 24 amostras, que apresentaram com lesões
granulomatosa, necrose puntiforme (escore: necrose puntiforme) 13/24 (54,2%)
foram positivas para E. coli; 2/24 (8,3%) para Staphylococcus coagulase positiva
e 4/24 16,7% para Pseudomonas spp..
Das 740 amostras de fígados coletados 29 apresentaram aspecto
esverdeado (escore: esverdeado) 11/29 foram positivas para E. coli (37,9%), 1/29
(3,4%) para Staphylococcus coagulase positiva e 6/29 (20,7%) foram positivas
para Pseudomonas spp..
Das 740 amostras de fígados coletados 28 apresentaram perihepatite
(escore: perihepatite) e 19/28 (67,9%) amostras foram positivas para E. coli; 1/28
(3,6%)
para
Staphylococcus
coagulase
positiva
e
5/28
(17,9%)
para
Pseudomonas spp..
TABELA 3- Ocorrência de E. coli, Staphylococcus coagulase positiva,
Pseudomonas spp. e em amostras de fígado de frango de acordo com o escore
Staphylococcus
Pseudomonas
Escore
E. coli
CP
spp.
a
a
Normal
32/120 (26,7%) 11/120 (9,2%)
27/120 (22,5%) B
104/294
Amarelo/Gordu.
(35,4%)b
35/294 (11,9%)b
62/294 (21,1%) B
b
b
Congesto/Hemo. 83/245 (33,9%) 9/245 (3,7%)
67/245 (27,3%) B
Necrose Puntif.
13/24 (54,2%)b
2/24 (8,3%)b
4/24 (16,7%) B
Esverdeado
11/29 (37,9%)b
1/29 (3,4%)b
6/29 (20,7%) B
Perihepatite
19/28 (67,9%)b
1/28 (3,6%)b
5/28 (17,9%) B
Legenda: Staphylococcus CP: Staphylococcus coagulase positivo; A:
Resultados significativos, B: Resultados não significativos;
24
Já para os fígados, na regressão logística, o modelo encontrado foi:
Apenas E. coli obteve p = 0,0298, indicando que fígados positivos para E.
coli apresentam mais chances de estarem lesionados, ao comparar-se com os
outros microrganismos.
Ao aplicar o teste de Qui-quadrado nos dados obtidos observou–se
diferenças entre a proporção de E. coli em fígados lesionados e corações
lesionados (p= 0,01517), com isso há evidência que E. coli pode causar mais
danos ao fígado que ao coração,
Os fígados que foram positivos para E. coli possuem 62% mais chances de
apresentarem lesões, comparado aos fígados normais.
Para o fígado, também utilizando regressão logística, foi observado que
fígados
congestos
tinham
mais
chances
de
serem
contaminados
por
Staphylococcus coagulase positiva.
Além da identificação dos agentes foi realizado o teste de sensibilidade
aos antimicrobianos de 210 amostras de Escherichia coli e 17 amostras
Staphylococcus coagulase positiva (Tabela 4).
Do total das 210 colônias de E. coli que foram submetidas ao teste de
sensibilidade a antibióticos, 14 foram de amostras de camas de frango, 85 foram
originadas de corações, 86 de fígados e 25 amostras foram das penas.
Das cepas analisadas, 56/210 (26,7%) de E. coli e 8/17 (47,1%) de
Staphylococcus
coagulase
antimicrobianos testados.
positiva
foram
resistentes
a
pelo
menos
5
25
TABELA 4- Resultados do teste de resistência aos antimicrobianos de 210
amostras de E. coli e 17 Staphylococcus coagulase positivo isolados de diferentes
categorias de amostras
E. coli
Antibióticos
S
Staphylococcus CP
%
R
%
Antibióticos
S
%
R
%
Ceftiofur
17
8,1
193
91,9
Ceftiofur
11
64,7
6
35,3
Ciprofloxacina
77
36,7
133
63,3
Ciprofloxacina
10
58,8
7
41,2
170
81
40
19
Clorafenicol
13
76,5
4
23,5
39
18,6
171
81,4
Enrofloxacina
8
47,1
9
52,9
Eritromicina
6
2,9
204
97,1
Eritromicina
7
41,2
10
58,8
Gentamicina
78
37,1
132
62,9
Gentamicina
11
64,7
6
35,3
8
3,8
202
96,2
Oxaciclina
8
47,1
9
52,9
Sulfatrimetopim
92
43,8
118
56,2
Sulfatrimetopim 14
82,3
3
17,7
Tetraciclina
65
30,9
145
69,1
Tetraciclina
41,2
10
58,8
Clorafenicol
Enrofloxacina
Oxaciclina
7
Colistina
203 96,7
7
3,3
Bacitracina
0
0 17 100,0
Legenda: Staphylococcus CP: Staphylococcus coagulase positivo S.:
Sensíveis, R.: Resistentes.
26
6. DISCUSSÃO
A ausência de Salmonella em vísceras comestíveis, camas e penas
analisadas sugere que as medidas e estratégias de controle tem sido implantadas
e difundidas adequadamente em diversas agroindústrias, o que tem contribuído
com a produção de um alimento de qualidade e seguro, sem riscos para o
consumidor. DAVIS et al. (2002) também não conseguiram isolar Salmonella sp. a
partir de suabes de arrasto e cloacal realizados nos galpões e nos frangos,
respectivamente, assim como GONÇALVES et al. (2013) que avaliaram 102
amostras de cama de frango, bem como amostras de diversos pontos de
abatedouros no nordeste do estado de São Paulo.
Por outro lado estes resultados são diferentes dos obtidos por MARIN &
LAINEZ (2009) ao analisarem excretas em pintos recém alojados e aos 14 dias de
criação, sendo observado 50,5% e 34,5% de positividade para Salmonella,
respectivamente. Resultados obtidos por REZENDE et al. (2008) também
mostraram que em 37 análises realizadas em corações normais, dois (5,41%),
foram positivos na pesquisa de Salmonella sp..
Já Pseudomonas spp. foi identificada em todas as categorias de amostras,
uma vez que este microrganismo pode compor a microbiota intestinal e cutânea,
além de estar amplamente distribuído na natureza. Estes resultados se respaldam
nas afirmações de OLIVEIRA (2010), o qual considera que a carga microbiana
das carcaças de frango, vísceras e seus derivados têm como origem a microbiota
das aves vivas e, ainda afirma que o patógeno pode ser incorporado ao alimento
durante as etapas do abate e processamento. Além disso, neste estudo, a análise
estatística dos resultados aponta que quanto mais Pseudomonas nas penas,
maior a possibilidade dela ser detectada nas vísceras.
Outros fatores que devem ser considerados para explicar a alta frequência
de isolamento de Pseudomonas, inclusive em vísceras aparentemente normais,
podem ser as medidas higiênico-sanitárias deficientes dos manipuladores e dos
equipamentos, presença do agente na água, nas penas e, ainda pela formação de
biofilmes em depenadeiras sendo estas considerações respaldadas por MAIA et
al. ( 2009).
27
Observa-se ainda que o isolamento de Pseudomonas em vísceras
aparentemente normais se revela relevante pois, este microrganismo exerce ação
deteriorante em carne e derivados cárneos. Mesmo em condição de refrigeração,
ocorre a ação das enzimas que alteram a qualidade do produto (ALCANTARA et
al., 2012). Mesmo considerando esses aspectos a frequência de isolamentos foi
inferior aos resultados de MAIA et al. (2009) que detectaram 55,5% dos fígados,
adquiridos de estabelecimentos comerciais, contaminados com Pseudomonas
aeruginosa.
Poucos são os estudos que relacionam a incidência de Staphylococcus
spp. em vísceras de frango, comumente na literatura é citado que foi isolado a
partir das vísceras, porém, não enfatizam as lesões causadas, nem a frequência
de isolamento. O local mais relatado da presença e lesão deste microrganismo é
nas articulações e em lesões cutâneas. MONECKE et al., (2013), ao fazer a
genotipagem de Staphylococcus aureus isolados de aves doentes, comentam que
os isolados foram obtidos a partir de fígados, corações, articulações e pulmões
em necropsias de casos de infecção invasiva.
A presença de Staphylococcus coagulase positiva nas vísceras, o
isolamento nos corações foi baixa, 6,6%, no entanto a análise estatística,
utilizando a regressão logística indicou que os corações têm grandes chances de
serem lesionados por este agente. Segundo PETON & LOIR (2013) lesões no
coração devido a presença de Staphylococcus coagulase positiva raramente são
relatadas em frango de corte, pois a vida destes animais é curta o que dificulta a
evolução da infecção.
Neste trabalho a presença deste agente em corações (2,5%) e fígados
(9,2%) sem lesões aparentes, confirma os estudos de PETON & LOIR (2013) que
afirmam que S. aureus podem ser encontrados em portadores sãos.
Mas obteve-se 7,6% (45/594) de Staphylococcus em casos de pericardite e
3,8% (1/26) de pericardite com aderência e fibrinosa, o que pode ser respaldado
em SKEELES (1997) o qual afirmou que Staphylococcus aureus coagulase
positiva, principal agente de infecções estafilocócicas, ocorre em
menor
frequência, no coração. Podendo também induzir infecções que vão desde
doenças cutâneas superficiais a profundas e septicemia.
28
A detecção de 8,0% de Staphylococcus coagulase positiva nos fígados,
também foi diferente dos resultados obtidos por AWAN & MATSUMOTO (1998),
que encontraram valores bem superiores. Estes pesquisadores avaliaram a
presença de bactérias em fígados, sangue e articulações de frangos de corte com
seis semanas e, em 37,9% dos fígados foram isolados Staphylococcus coagulase
positiva. BARCELOS et al. (2006) também encontraram neste mesmo órgão,
porcentagens maiores que a da presente esta pesquisa, 24%.
BORGES (2006) encontrou 25,87% de fígados com coloração esverdeada,
e sugeriu que esta coloração se deve a proliferação dos ductos biliares e a
retenção de biliverdina pela infecção de Staphylococcus aureus, porém
Staphylococcus coagulase positivo neste trabalho foi identificado apenas a 3,4%
dos fígados.
A instalação deste microrganismo em sítios do coração e do fígado pode
ocorrer a partir de feridas contaminadas, septicemia secundária a infecção na
pele ou mucosa, ou após a contaminação de umbigos não cicatrizados, pois
depende da porta de entrada e da condição da ave portadora, pois fatores como
traumas, estresse, imunossupressão, fome, infecções virais podem comprometer
os
mecanismos
de
defesa
inatos
e
contribuir
para
a
proliferação
desencadeamento da inflamação e infecção (WOBESER & KOST, 1992; PETON
& LOIR, 2013).
NAGASE et al., (2002) estimaram que aproximadamente 90% das aves
carreiam este microrganismo. A presença deste agente é mais notada quando é
feita a pesquisa na carcaça ou em superfícies corporais. MARTINS (2012)
pesquisou Staphylococcus coagulase positivo em carcaças de frango congeladas
e resfriadas, e o isolou em 66,7% das carcaças analisadas, utilizando o mesmo
meio de cultura do presente trabalho, ágar manitol salgado. E ao analisar carne
de aves, AKBAR & ANAL (2013) isolaram em 18,18% das amostras S. aureus.
Mesmo com uma baixa frequência observada nesta pesquisa, é importante
ressaltar que a maioria das cepas, isoladas de infecções de aves, de
Staphylococcus inclui cepas de origem humana o que possibilita e facilita a
difusão da bactéria entre as duas espécies, fato que mostra-se importante como
potencial ameaça à saúde pública, inclusive pela possibilidade de veicular cepas
resistentes a antibióticos para a cadeia alimentar do homem (SMYTH et al., 2009;
29
SHEPHEARD et al., 2013). Além disso, BRASIL (2012) relatou que a
contaminação por linhagens de Staphylococcus representa um problema para a
saúde pública, devido ao risco de causar intoxicações alimentares pela ingestão
de toxinas nos alimentos. BRASIL (2009a) mostraram que Staphylococcus spp.
foi responsável por 20,5% dos casos de surtos alimentares ocorridos no Brasil de
1999 a 2009.
Segundo BERCHIERI JUNIOR et al. (2009) o fígado normal é marromavermelhado, com superfície lisa e recoberto por cápsula de tecido conectivo.
Quando este apresenta-se amarelo e gorduroso é devido a lipidose hepática, que
é o acúmulo visível de triglicérides na forma de glóbulos redondos no citoplasma,
decorrente de diversos fatores como a gliconeogênese desencadeada por
estímulos que aumentam subclinicamente a demanda por energia, ou ser
causado por deficiências marginais ou pelo acúmulo de gorduras (vacúolos)
devido ao comprometimento do metabolismo dos ácidos graxos induzido por
endotoxinas bacterianas, tetracloreto de carbono, álcool ou de fatores que
interferem com o metabolismo e a necessidade das gorduras, por exemplo
estresse por calor.
Portanto pode não estar diretamente relacionada com E. coli ou
Staphylococcus (BERCHIERI JUNIOR et al., 2009), como verificou-se neste
experimento, em que somente 35,4% e 11,9% dos fígados com esteatose
apresentavam-se infectados por E. coli e Staphylococcus coagulase positiva,
respectivamente.
Ressalta-se que era esperada uma frequência maior de Staphylococcus
coagulase positiva nas amostras de cama de frango, 0% (0/13) e pena 16,7%
(20/120), pois Staphylococcus compõe a microbiota da pele e o contato direto
entre a ave no galpão e a cama proporcionaria difusão deste agente da ave para
a cama (DELAZARI, 2001; MENDES, 2001). A baixa detecção de Staphylococcus
nas penas pode ser justificado pela temperatura da água da depenadeira que se
situa em torno de 62 ºC, e esses microrganismos são destruídos à 60 ºC entre 43
segundos a oito minutos (STROHL et al., 2003, BARCELOS, 2005).
Na análise estatística revelou que E. coli, dentre os agentes estudados,
tem maiores chances de causar lesões no fígado (p <0,05) que no coração.
30
Neste estudo, este microrganismo foi isolado em 33,11% dos corações e
em 45,41% dos fígados aparentemente normais e lesionados. ALONSO et al.
(2012) ao pesquisar E. coli em vísceras de aves identificaram E. coli entero
patogênica em 43% dos miúdos analisados. Dados semelhantes foram
encontrados por SILVA et al. (2012), em 45,5% de fígados oriundos de um
abatedouro.
Nos estudos de SILVA et al. (2012) dos 45,5% de E. coli isoladas, 63,3%
foram provenientes de fígados sem alterações macroscópicas, os valores
encontrados por estes autores diferem dos observados nesta pesquisa, onde
apenas 26,7% dos isolados de E. coli foram provenientes de fígados sem lesões.
Esses achados sugerem que além do aspecto macroscópico é importante ter um
monitoramento microbiológico na indústria de alimentos e na produção de frango.
Enquanto
no
presente
trabalho
35,4%
dos
fígados
com
escore
amarelo/gorduroso, 38,0% dos esverdeados e 54,2% dos fígados com necrose
puntiforme apresentavam esta bactéria, no trabalho de SILVA et al. (2012) dos 27
isolados, 14,8% apresentavam aspecto amarelo/gorduroso e 11,1% esverdeado e
com focos necróticos.
No presente trabalho aproximadamente 5% dos fígados (29/620) foram
caracterizados como esverdeados. Destes 38% foram positivos para E. coli e
3,4% para Staphylococcus coagulase positiva. BARCELOS et al. (2006) mostram
em seu trabalho que em 21,11% dos fígados apresentaram com cor esverdeada.
Neste trabalho foram encontrados lesões tanto em fígado quanto em
coração, lesões características de infecções por E. coli, de acordo com
BERCHIERI JÚNIOR et al. (2009) como 26/740 (3,5%) de corações com
pericardite do tipo fibrinosa, fibrino-purulenta e com aderência de pericárdio,
destas 50% foram positivas para E. coli. Já em fígados as lesões de perihepatite
representaram 28/740 (3,8%) do total de fígados e lesões de granulomas
indicando zonas de necrose representaram e 24/740 (3,3%). Destes 67,9% e
54,2% foram positivos para E. coli respectivamente.
Nos corações com pericardite por E. coli, inicialmente o pericárdio
apresenta opacidade, seguida de espessamento e acúmulo de exsudato fibrino a
fibrino-purulento que recobre todo o saco pericárdico, sinais mencionados por
BERCHIERI JÚNIOR et al. (2009).
31
O índice de E. coli na cama de frango, 92,3%, já era esperado pois,
conforme explicado por LU et al. (2003) a microbiota da cama é bastante
semelhante à composição do conteúdo do íleo dos frangos, devido contínuo
aporte de material fecal, secreções e descamações das aves durante o ciclo de
criação.
As bactérias pesquisadas neste estudo foram submetidas ao teste de
sensibilidade a antibióticos com exceção da Pseudomonas spp. pois a
multirresistência deste microrganismo é conhecida, em muitos casos esse
patógeno é resistente a todos os antibióticos atualmente disponíveis (ZAVASCKI
et al., 2007).
Neste experimento 47,1% e 3,8% dos isolados de Staphylococcus
coagulase positiva e E. coli, respectivamente, foram sensíveis a oxacilina.
Resultados diferentes em relação a Staphylococcus foram observados por
AKBAR & ANAL (2013) e FREITAS et al. (2004)
que encontraram,
respectivamente, 92,11% e 62,2% de bactérias sensíveis. No entanto outros
pesquisadores BABA et al., (2010), BENDALI et al., (2011) e OLIVEIRA et al.,
(2012) não identificaram nenhum Staphylococcus aureus sensível a este
antibiótico e DAUREL & LECLERCQ (2008) encontraram aproximadamente 20%
dos isolados de Staphylococcus aureus foram sensíveis as penicilinas como a
oxacilina. Esta baixa sensibilidade pode ocorrer pois, estas bactérias podem
produzir penicilinase, além de poder expressar uma proteína ligante de penicilina
com afinidade reduzida a beta-lactâmicos, resultando em resistência (ITO et al.,
2003).
Das amostras de Staphylococcus coagulase positiva analisadas neste
experimento 64,7%, foram sensíveis a gentamicina. Dos experimentos de
AARESTRUP et al. (2000), BABA et al. (2010) e BENDALI et al., (2011) todas as
cepas de Staphylococcus foram sensíveis a gentamicina. FREITAS et al. (2004) e
AKBAR & ANAL (2013) encontraram 15,6% e 13,15%, respectivamente, de S.
aureus resistentes à gentamicina.
No presente estudo das amostras isoladas de E. coli, 37,1% foram
sensíveis à gentamicina. No entanto, FURTULA et al. (2010) encontraram níveis
de sensibilidade maiores ao princípio ativo, aproximadamente 70% das amostras
de E. coli foram suscetíveis. Contudo MANTILLA & FRANCO (2012) ao
32
analisarem carne de frango encontraram resistência ainda maior, onde apenas
6,2% foram sensíveis a gentamicina.
Neste experimento 58,8% e 41,2% dos Staphylococcus coagulase positiva
foram sensíveis a ciprofloxacina e a eritromicina respectivamente. Para E. coli,
36% foram sensíveis a ciprofloxacina neste trabalho. AKBAR & ANAL (2013)
encontraram alta sensibilidade a ciproflaxina (92,1%) e FREITAS et al (2004)
obtiveram sensibilidade de 61,1%, valores próximos aos encontrados no presente
experimento (58,82%). Por outro lado, todas as cepas estudadas por BENDALI et
al., 2011 foram sensíveis a eritromicina e ciprofloxacina.
DAUREL & LECLERCQ (2008) também relatam que é frequente a
resistência de Staphylococcus aureus aos macrolídeos como a eritromicina,
dados que justificam a baixa sensibilidade (41,18%) encontrada neste
experimento, podendo ser atribuída a produção de metilase. FREITAS et al.
(2004) também encontraram baixa sensibilidade a este antibiótico, em 25,6% das
cepas analisadas. GRAHAM et al. (2009) encontraram sensibilidade de 43% a
eritromicina.
Enquanto nesse trabalho 36% das amostras de E. coli foram sensíveis a
ciprofloxacina, CAMPOS et al., (2006) encontraram alta sensibilidade das cepas
de E. coli a este antimicrobiano, tendo 96% de E. coli suscetíveis. Essa
resistência pode ser devido a possibilidade de mutação da enzima topoisomerase (DAUREL & LECLERQ, 2008). Essa resistência geralmente não é
associada à transferência gênica (SILVA et al., 2008; VIEIRA et al., 2010).
Neste estudo foi obtido 41,18% de amostras de Staphylococcus coagulase
positiva sensíveis a tetraciclina, dados que se aproximam dos resultados de
AARESTRUP et al. (2000) e AKBAR & ANAL (2013) que encontraram 43,4% e
44,73%, respectivamente, de cepas sensíveis do agente. GRAHAM et al. (2009)
encontraram 70% de Staphylococcus sensíveis a tetraciclina em amostras de
cama de frango.
No caso de E. coli, neste experimento foram encontradas 31% de E. coli
sensíveis a tetraciclina. Já MONTAZ & JAMSHIDI (2012) encontraram resultados
próximos a 76,82% e FURTULA et al. (2010) obtiveram de 80 a 95% de E. coli
resistentes a este antibiótico. Importante salientar que no Brasil é proibido o uso
de tetraciclina como promotores de crescimento (BRASIL, 2009b).
33
No presente, estudo nenhuma das cepas de Staphylococcus isoladas
foram sensíveis a bacitracina, resultado semelhante ao encontrado no
experimento de AARESTRUP et al. (2000) onde a bacitracina não inibiu os
isolados de S. aureus. Já FREITAS et al. (2004) obteve 62,2% desses
microrganismos sensíveis a este antibiótico. A resistência a este produto, de
acordo com FURLAN et al. (2002) e SANTOS et al. (2008), talvez possa ser
atribuída a utilização deste como promotor de crescimento em avicultura.
Entretanto QUINN et al. (2005) afirmam que Staphylococcus sp são resistentes a
bacitracina.
Neste estudo 76,74% de amostras de Staphylococcus coagulase positiva
foram sensíveis a cloranfenicol, resultados que se assemelham aos obtidos por
AKBAR & ANAL (2013) que obtiveram uma taxa de 78,95% de S. aureus
suscetíveis. FREITAS et al. (2004) observaram que 86,7% das cepas de
Staphylococcus sp. foram sensíveis. Já nos experimentos de AARESTRUP et al.,
(2000), BABA et al. (2010) e SASIDHARAN et al. (2011) não encontraram cepas
de S. aureus resistentes a cloranfenicol.
No presente estudo foi encontrado 80,9% de E. coli sensíveis a
cloranfenicol. Já MANTILLA & FRANCO (2012) e MONTAZ & JAMSHIDI (2012)
encontraram 40,8% e 73,17%, respectivamente, de E. coli resistentes. A baixa
taxa de resistência a este antibiótico pode ser explicada devido este medicamento
ser proibido para uso na medicina veterinária (BRASIL, 2003), no entanto ainda é
necessário estabelecer critérios legais e fazer cumprir as leis para evitar a
prescrição e utilização destes antibióticos.
Ao analisar neste experimento a suscetibilidade de Staphylococcus
coagulase positiva à enrofloxacina foi encontrado 47,06% de microrganismos
sensíveis. Dados próximos foram obtidos por FREITAS et al. (2004) que
obtiveram uma taxa de 58,9% de sensibilidade. MEDEIROS et al. (2009)
obtiveram resultados bem próximos em dois grupos de amostras do seu
experimento com 55,6% e 50% de sensibilidade, no entanto em outro grupo de
amostras obteve uma sensibilidade substancialmente mais alta, de 92%.
E. coli frente a enrofloxacina, apresentou somente 18,57% dos isolados
sensíveis, entretanto o resultado ainda foi superior ao descrito por BARROS
34
BARROS et al. (2012), que não observaram suscetibilidade para o antimicrobiano
em nenhuma das amostras.
Neste estudo Staphylococcus coagulase positiva apresentou sensibilidade
de 64,70% para ceftiofur, frequência bem mais alta que a observada por LOSITO
et al. (2005), de 10,2%, em amostras oriundas de pombos.
Isolados de E. coli apresentaram baixa suscetibilidade (8,1%) a ceftiofur
neste experimento, resultado que pode ser explicado pela presença de
plasmídeos carreadores de genes de E. coli espectro-estendido cefalosporinas.
As bactérias que possuem plasmídeos com esse fator, podem transmitir
resistência a cefalosporinas a outras espécies de bactérias e dentro da mesma
espécie de acordo com (SHAHADA et al., 2012, SEIFFERT et al., 2013).
FURTULA et al. (2010) encontraram índice de sensibilidade bastante superior
(60%) de E. coli de cama de frango.
Colistina é apontada para prevenir infecções por E. coli. Neste estudo este
antibiótico apresentou uma baixa resistência, atingindo a sensibilidade de 96,67%,
de acordo com KEMPF et al. (2013) em pesquisa realizada a partir de
associações, trabalhos e monitoramento, sobre os índices de resistência a este
antibiótico encontraram resultados semelhantes aos deste trabalho: no ano de
2011 na Suécia, de 181 amostras de E. coli provenientes de aves, todas foram
sensíveis; na Dinamarca no ano de 2009, de 150 amostras de E. coli, 4% foram
resistentes e no ano de 2011 neste mesmo país, de 140 amostras de E. coli
também oriundas de frango, 3% foram resistentes.
Neste estudo 52,9% das colônias de Staphylococcus coagulase positiva e
73,3% do total de E. coli, foram resistentes a no mínimo 6 antibióticos testados.
STEFANI & GOGLIO (2010) relatam que o uso generalizado de antibióticos
acelera a virulência de S. aureus, adquirindo assim genes de resistência a
múltiplos antibióticos, tornando estes microrganismos capazes de sobreviverem a
quase todas as famílias de antibióticos.
De forma geral pode-se dizer que os mecanismos de resistência das
bactérias tem alto grau de complexidade, com isso, a escolha de drogas
apropriadas tanto para a realização do teste de suscetibilidade, quanto para a
terapia antimicrobiana, torna-se cada vez mais difícil, visto que a utilização de
antimicrobianos errados pode tanto favorecer o aumento da taxa de resistência,
35
quanto aumentar a taxa de morbidade e/ou mortalidade da população que foi
tratada com o antibiótico errado (VIEIRA et al., 2010).
A alta frequência de resistência para Staphylococcus coagulase positiva e
E. coli aos antimicrobianos foi detectada tanto nas bactérias isoladas do meio
ambiente quanto de vísceras aparentemente normais como das com lesões. A
resistência aos antimicrobianos pode ser atribuída a resistência natural a uma ou
mais classes de antibióticos, ou a bactéria adquiriu resistência, por mutação ou
conjugação, por aquisição de genes de resistência de outros microrganismos
(QUINN et al., 2005; LI et al., 2010).
36
7. CONCLUSÕES
Conclui-se que; Salmonella sp. não foi detectada em nenhuma amostra de
fígado e coração, independente do escore de lesão, bem como em penas e
camas de aviário.
Pseudomonas spp. foram identificadas em todas as categorias de
amostras, tanto vísceras com e sem lesões macroscópicas.
A presença de Staphylococcus coagulase positiva em vísceras foi baixa,
também foi baixo o isolamento deste em cama de frango e em penas
E. coli, dentre os agentes estudados, tem mais chances de causar lesões
no fígado. E foi amplamente isolada na cama de frango.
Tanto isolados de E. coli quanto Staphylococcus coagulase positiva,
apresentaram resistência a maioria dos antimicrobianos testados.
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