1 CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIAS PRODUTORAS

Anais do IX Seminário de Iniciação Científica, VI Jornada de Pesquisa e Pós-Graduação
e Semana Nacional de Ciência e Tecnologia
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS
19 a 21 de outubro de 2011
CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIAS PRODUTORAS DE ÁCIDO INDOLACÉTICO ASSOCIADAS A MILHO (Zea mays)
Patrícia da Silva Rocha (UEG)1
[email protected]
Tauana Marques Barroso (UEG)
Micael Rosa Parreira (UEG)
Miguel Fernando Saggin Figueiredo (UEG) 2
Marina Firmino da Silva (UEG)
Enderson Petrônio Brito Ferreira (EMBRAPA)
Claudia Cristina Garcia Martin-Didonet (UEG)
[email protected]
Introdução
O milho é um dos principais cereais utilizadas no mundo, e tem grande importância
social, econômica e cultural no Brasil. O Brasil produziu em 2011 cerca de 55,7 milhões de
toneladas de milho nas duas primeiras safras, apresentando taxas crescentes nesses últimos
anos (IBGE, 2011).
A pesar da sua alta produtividade, o milho possui uma elevada sensibilidade a
estresse, tanto de natureza biótica e abiótica, com isso o seu cultivo necessita ser
rigorosamente planejado e criteriosamente manejado, para que seja atingida a sua capacidade
produtiva (ANDRADE, 1995).
Nesse sentido, o manejo do solo e a exploração da biodiversidade dos sistemas
agrícolas vêm sendo utilizadas para melhorar a produção agrícola. Uma alternativa para o
aumento da produção, manejo do solo e qualidade ambiental, é a associação de culturas com
bactérias diazotróficas endofíticas nos cultivares de milho (ROSECH et al, 2007).
As bactérias diazotróficas endofíticas, além do potencial de fixar nitrogênio, podem
contribuir para o desenvolvimento da planta através da produção de fitohormônios. Estas
substâncias orgânicas são capazes de influenciar processos fisiológicos nas plantas, sendo
eficazes em pequenas concentrações (ROSECH et al., 2007; BALDANI et al., 1997;
BASHAN; HOLGUIN, 1997; OKON; VANDERLUYDEN, 1997). Essas bactérias têm sido
isoladas de várias espécies de gramíneas, e grande parte dessas bactérias diazotróficas tem
sido encontrada colonizando plantas de milho (REIS et al., 2000).
Já foram comprovados efeitos positivos decorrentes da produção de fitohormônios
que promovem incrementos no desenvolvimento das raízes, como aumento no comprimento,
volume e raízes laterais. Com este efeito, as raízes podem potencializar a aquisição de água e
nutrientes, favorecendo assim o desenvolvimento da planta (BALDANI et al., 1997; OKON;
LABANDERA-GONZALES, 1994). A produção de fitohormônios por bactérias é
considerada um dos fatores responsáveis pelo aumento no crescimento de plantas, como no
caso da inoculação de estirpes de Azozpirillum. Experimentos realizados com estirpes deste
gênero mostram o seu potencial em promover crescimento de plantas em diferentes solos e
condições climáticas (OKON; LABANDERA-GONZALES, 1994). O principal hormônio
produzido por estirpes de Azospirillum é uma auxina, o ácido 3-indolacético (AIA), além de
outros compostos indólicos (RADWAN, 2004).
1
Acadêmica bolsista PIBIC/CNPq ; 2 Acadêmico bolsista PBIC/UEG.
1
Anais do IX Seminário de Iniciação Científica, VI Jornada de Pesquisa e Pós-Graduação
e Semana Nacional de Ciência e Tecnologia
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS
19 a 21 de outubro de 2011
As bactérias produzem AIA por várias vias de síntese. O triptofano é um dos
precursores mais conhecidos, mais há outras vias de produção de AIA independentes deste
aminoácido (ZAKHAROVA, et al, 1999; KUSS, et al, 2007). Recentemente bactérias
promotoras do crescimento vegetal (BPCV) vêm sendo utilizada na formulação de
inoculantes para as plantas, sendo utilizadas como biofertilizantes. Estas bactérias quando
aplicadas nas sementes, na superfície das plantas, ou no solo, colonizam a rizosfera e/ou o
interior das plantas e promovem os efeitos de crescimento e até aumento na produtividade,
sendo assim fornecem indícios de que estas podem ser utilizadas na elaboração de
biofertilizantes ou bioinoculantes comerciais (ZEHNDER et al., 2001; ASGHAR et al., 2002;
VESSEY, 2003).
O objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de ácido indolacético em
rizobactérias isoladas de raízes de plantas de milho, colaborando para a seleção de bactérias
candidatas para serem utilizadas como bioinoculantes para teste em casa de vegetação e a
campo, desta cultura.
Materiais e Métodos
As bactérias utilizadas no presente trabalho foram obtidas da coleção do Laboratório
de Pesquisa de Farmácia, UnUCET- UEG, Anápolis – GO, sendo que todas foram isoladas da
raiz de milho (Zea mays). Foram escolhidas cinco isolados do gênero Azospirillum (L9, L11,
L15, L20 e L21) e uma estirpe padrão do gênero, a AbV5 de A. brasilense foi utilizada como
referência.
Durante os experimentos, foram realizados ensaios utilizando o principal precursor
de AIA, o triptofano Trp (500ug mL-1) no meio de cultura e outro sem este aminoácido.
Para a realização dos experimentos, foram realizados pré-cultivo das bactérias em
meio líquido (meio DYGS) por 72 horas antes do início do experimento. Os ensaios
consistiram de sistemas de cultivo em erlenmeyers (250 mL) com 150 mL de meio de cultura
(DYGS) e mantidos ao abrigo da luz com e sem triptofano. Foram inoculados 6 estirpes de
bactérias e um sistema foi utilizado como controle sem bactérias. Todos os ensaios foram
realizados em triplicatas perfazendo 19 sistemas para cada ensaio.
Os ensaios foram mantidos sob agitação (140rpm) constante por cinco dias e foram
coletados 4 alíquotas (2mL) em microtubos, por dia (8 horas, 12 horas, 16 horas e as 20
horas), totalizando 20 coletas por experimento. As alíquotas foram devidamente identificados
e congelados, para posterior análise. Para todas as alíquotas foram determinados as dosagens
de AIA e a determinação de densidade ótica.
A determinação da densidade ótica foi realizada por espectrofotometria com leitura da
absorbância em 600nm (D.O.600), sendo as médias dos dados utilizadas para a confecção das
curvas de crescimento bacteriano.
Para as dosagens de AIA utilizou-se o reagente de Salkowski, sendo que as amostras
foram centrifugadas e coletado 500uL do sobrenadante com adição de 500uL do reagente.
Após a adição do reagente a mistura foi homogeneizada e mantida ao abrigo da luz por 30
minutos com posterior leitura a 540nm em espectrofotômetro. Foi utilizado como referência
uma curva de AIA comercial (Sigma) nas concentrações de 1 a 40 ug. mL-1.
Resultados e Discussão
Pelos dados da densidade óptica pode-se estimar o crescimento das bactérias testadas
e obter uma curva de crescimento e mostraram oscilações características dependendo do
isolado testado. Os períodos de crescimento bacteriano podem se caracterizar por três fases: a
2
Anais do IX Seminário de Iniciação Científica, VI Jornada de Pesquisa e Pós-Graduação
e Semana Nacional de Ciência e Tecnologia
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS
19 a 21 de outubro de 2011
log, período de grande proliferação; fase estacionária, quando atinge o máximo de
crescimento; e a fase lag, período de diminuição de crescimento e morte celular (TORTORA
et al., 2000). Para a maioria das bactérias testadas não foi possível observar a fase lag
principalmente quando crescidas na presença de Trp.
A bactéria controle AbV5 (A. brasilense), apresentou lento crescimento na ausência
de Trp, atingindo máximo de crescimento somente com 48 de crescimento. Já na ausência de
Trp o crescimento na fase log é rápida e a fase estacionária já se inicia com 24 h de cultivo. O
pico de crescimento de estirpe controle AbV5, ficou em torno de 56 h de crescimento e
apresentou valores diferentes entre as curvas na presença e na ausência de Trp no meio de
cultivo, com valores maiores na presença de triptofano do que na ausência.
Os isolados L11, L15 e L20 apresentaram similaridade no crescimento sendo que
fase log termina com cerca de 24 h e inicia-se a fase estacionária. Foi possível detectar o
início da fase lag nas bactérias AbV5, L15 e L20, no período final de avaliação, na ausência
de Trp. Nos demais ensaios não foi possível observa a fase lag para as bactérias avaliadas. No
geral em todas as bactérias testadas os valores das leituras de D. O.600 sem triptofano foram
maiores do que das leituras com triptofano, podendo-se inferir que o triptofano, pode ter
influenciado negativamente para o crescimento destas bactérias. Foi possível observa a curva
de crescimento nas condições testadas, para todos os isolados, um crescimento característico
das bactérias em geral em meio de cultivo rico (TORTORA et al., 2000).
De modo geral a maioria das bactérias utilizadas neste trabalho produziram AIA, de
modo acumulativo exceto o isolado L9. A maior produção média foi observada no cultivo
com Trp para os isolados L11, L15 e L20, com cerca de 12 ugAIA mL-1, e a menor, sem
produção, para a bactéria L9. Na ausência de Trp a maior média de produção de todos os
períodos avaliados,foi para o isolado L11 (11 ugAIA mL-1). No caso da curva de produção de
AIA, a estirpe controle (Abv5) apresentou grande diferença entre as curvas com e sem
triptofano. O pico de produção com ausência de Trp ocorreu no final do período de avaliação
108h de 5,8 ugAIA mL-1, e na presença de Trp, a concentração de AIA foi quase o dobro da
quantidade obtido no ensaio anterior, e o pico de produção também foi observado com 108h
de cultivo (9,99 ugAIA mL-1). Foi observado para outras estirpes de A. brasilense (Sp245 e
Sp7), com cultivo em meio mínimo a ausência de produção de AIA na ausência de triptofano
(PEDRAZA et al., 2004). Como foi utilizado um meio rico que provavelmente pode
apresentar baixos níveis do aminoácido precursor, pode ser o fator responsável pela baixa
produção de AIA observada nesta condição, sendo possível afirmar que neste caso há uma
dependência do Trp na biossíntese de AIA. também para os isolados L11, L15 e L20, onde na
presença ou ausência os níveis de produção foram próximos nos dois ensaios, provavelmente
outras vias além da obtida por Trp pode estar sendo usada para produção de AIA mas em
níveis diferentes ou ainda estes podem possuir mais de uma via alternativa para síntese de
auxinas (ZAKHAROVA, et al, 1999; KUSS, 2007) .
Já para o isolado L21, a produção média de AIA foi de 2,5 a 4,2 ugAIA mL-1 na
presença e na ausência de Trp respectivamente. O maior conteúdo de AIA foi observado na
presença de AIA com 96 h de cultivo. Na ausência de triptofano para este isolado há uma
diminuição entre 96 e 100 h de cultivo, esta oscilação pode indicar que este isolado tenha
algumas das enzimas degradadoras de AIA, como proposto por Leveau & Lindow (2005). Os
autores propõem que o AIA possa ser utilizado como fonte de energia (LEVEAU &
LINDOW, 2005), o que pode também estar ocorrendo neste caso já que não há diminuição do
número de células detectadas pela D.O. 600.
Na presença Trp para o isolado L9, não foi observado produção de AIA . Já na
ausência foi observado produção ocorreu apenas com 24 h de produção com cerca de 16,5 ug
de AIA por mL de cultura.. As oscilações ou ainda o desaparecimento ou diminuição da
3
Anais do IX Seminário de Iniciação Científica, VI Jornada de Pesquisa e Pós-Graduação
e Semana Nacional de Ciência e Tecnologia
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS
19 a 21 de outubro de 2011
presença de AIA nas culturas pode ser explicado como já comentado pelo consumo deste
composto por bactérias. Para o isolado L9 foi obtida a menor média de produção de AIA na
presença de Trp (0,8 ug mL-1) e houve ausência de produção na presença de Trp.
Nas bactérias de um modo geral foi observado que a excreção de AIA se inicia com
cerca de 24 h, e o mesmo foi observado por Radwan (2004). Apenas com Abv5 (A.
brasilense) sem triptofano e L21 com triptofano o período de excreção foi um pouco mais
tarde.
O gênero escolhido para o presente trabalho é largamente estudado por sua interação
com plantas e por sintetizar AIA por diferentes vias, mas Kuss (2007) e outros autores
sugerem que 90% do AIA produzido por essas bactérias é sintetizado por uma via
independente de triptofano, visto que outros compostos podem ser metabolizados a auxina.
Neste estudo foi observado uma média de produção de AIA na ausência de Trp foi de 5,5 ug
mL-1 e a média de produção na presença de Trp obtida foi de 8,3 ug mL-1 e o que pode indicar
que na ausência de Trp, há a presença de vias alternativas da produção mas também que a
necessidade de adaptação metabólica não permite que os níveis da produção de AIA se
igualem.
Considerações finais
Todos os isolados foram capazes de produzir AIA em pelo menos uma das condições
de cultivo testada, sendo que podem ser consideradas bactérias promotoras de crescimento
vegetal.
A capacidade de produção de AIA das bactérias estudadas sob cultivo na ausência de
Trp, indica que estas bactérias podem possuir vias metabólicas alternativas de produção de
AIA.
Referências Bibliográficas
ANDRADE, F.H. Analysis of growth and yield of maize, sunflower and soybean grown at
Balcarce, Argentina. Field Crops Research, 41:1-12, 1995.
ASGHAR, H. N. et al. Relationship between in vitro production of auxins by rhizobacteria
and their growth-promoting activities in Brassica juncea L. Biology and Fertility of Soils, v.
35. p. 231-237, 2002.
BALDANI, J. I. et al. Recent advances in BFN with non-legume plants. Soil Biology and
Biochemistry, Oxford, v. 29, n. 5/6, p. 911-922, 1997.
BASHAN, Y.; HOLGUIN, G. Azospirillum-plant relationships: Environmental and
physiological advances (1990-1996). Canadian Journal of Microbiology, Ottawa, v. 43, n.
2, p. 103-121, 1997.
INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA (IBGE). Indicadores IBGE:
Estatística
da
produção
agrícola.
Disponível
em:
<http://www.ibge.gov.br/home/estatistica/indicadores/agropecuaria/lspa/lspa_201108comenta
rios.pdf >. Acesso em: 15/09/11.
KUSS, A. V.; KUSS, V. V.; LOVATO, T.; & FLÔRES, M. L. Fixação do nitrogênio e
produção de ácido indolacético in vitro por bactérias diazotróficas endofíticas. Pesq.
Agropec. Bras., Brasília, v. 42, n. 10, p. 1450-1465, out. 2007.
4
Anais do IX Seminário de Iniciação Científica, VI Jornada de Pesquisa e Pós-Graduação
e Semana Nacional de Ciência e Tecnologia
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS
19 a 21 de outubro de 2011
LEVEAU, J. H. J. ; LINDOW, S. E. Utilization of the Plant Hormone Indole-3-Acetic Acid
for Growth by Pseudomonas putida Strain 1290. App. Environ. Microbiol., vol.71, p. 2365–
2371, 2005.
OKON, Y.; LABANDERA-GONZALEZ, C. Agronomic application of Azospirillum: An
evaluation of 20 years worldwide field incubation. Soil Biology and Biochemistry, Oxford,
v. 26, n. 12, p. 1591-1601, 1994.
OKON, Y.; VANDERLEYDEN, J. Root-associated Azospirillum species can stimulate plants.
Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 63, n. 7, p. 366-370, 1997.
RADWAN, T., EL-S., EL-D.; MOHAMED, Z., K.; REIS, V. M. Efeito da inoculação de
Azospirillum e Herbaspirillum em plântulas de milho e arroz. Pesq. Agropec. Bras., Brasília,
v. 39, n. 10, p. 987-994, out. 2004.
RADWAN, T., EL-S., EL-D.; MOHAMED, Z., K.; REIS, V. M. Aeração e adição de seis na
produção de ácido indol acético por bactérias diazotróficas. Pesq. Agropec. Bras., Brasília, v.
40, n. 10, p. 997-1004, out. 2005.
REIS, V.M.; BALDANI, J.I.; BALDANI, V.L.D. & DOBEREINER, J. Biological dinitrogen
fixation in gramineae and palm trees. Crit. Rev. Plant Sci., v. 19, p. 227-247, 2000.
TORTORA, G. J.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Microbiologia. 6ª ed. Porto Alegre:Ed.
Artmed, 2000. 827p.
VESSEY, J. K. Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers. Plant and Soil,
Dordrecht, v. 255, n. 2, p. 571-586, 2003.
YAMADA, E.A.; ALVIM, I.D.; SANTUCCI, M.C.C.; SGARBIERI, V.C. Composição
centesimal e valor protéico de levedura residual da fermentação etanólica e de seus derivados.
Revista de Nutrição, v.16, p.423-432, 2003.
ZAKHAROVA, E. A. et al. Biosynthesis of indole-3acetic acid in Azospirillum brasilense
insights from quantum chemistry. European Journal of Biochemistry, v. 259, p. 572-576,
1999.
ZEHNDER, G. W. et al. Application to rhizobacteria for induced resistance. Eur. J. Plant
Pathol, v. 107, p. 39-50, 2001.
5