VARIABILIDADE GENÉTICA EM CANA-DE

VARIABILIDADE GENÉTICA EM CANA-DEAÇÚCAR BASEADA EM MARCADORES
MOLECULARES RAPD
João de Andrade Dutra Filho1; Marília Gabriela de Santa Costa2; Gerson Quirino Bastos3; Luciane Vilela Resende4;
Luiz José Oliveira Tavares de Melo5; Júlio da Silva Correa de Oliveira Andrade6; Soraya de Lima e Silva7

Introdução
Em cana-de-açúcar a variabilidade genética
disponível para seleção provém de cruzamentos
realizados entre genitores de interesse que já
apresentam um conjunto de genes relacionados a
caracteres tidos como importantes componentes de
produção [1].
Entre os cruzamentos mais utilizados pelos
melhoristas destacam-se os cruzamentos biparentais e
os policruzamentos, no primeiro dois genitores
conhecidos são selecionados e intercruzados, no
segundo um grande número de genitores são
selecionados e intercruzados, entretanto não se conhece
a fonte de origem do pólen [1].
De acordo com Ramalho et al.[2] o conhecimento da
variabilidade proveniente das diferenças genéticas,
permite ao melhorista conhecer o potencial da
população para seleção de bons genótipos.
Estabelecer quais genitores deverão ser cruzados é
uma das etapas mais importantes de um programa de
melhoramento, sobretudo quando se trata de genitores
divergentes, aumentando assim a possibilidade de
indivíduos desejáveis com excelente potencial
heterótico.
A divergência genética pode ser estimada com base
em descritores morfo-agronômicos, entretanto, se sabe
que os mesmos possuem a limitação de serem
facilmente influenciados pelo ambiente [3]. A
utilização de marcadores moleculares, para estimativa
da divergência genética, é altamente recomendável,
pois os mesmos apresentam a vantagem de não serem
influenciados pelo ambiente e podem estar ligados a
locos que determinam cacterísticas de interesse, além de
serem usados em qualquer estágio de desenvolvimento da
planta acelerando a obtenção de indivíduos desejáveis [4].
Com este trabalho objetivou-se avaliar a variabildade
genética em genótipos de cana-de-açúcar, por meio de
marcadores RAPD, e indicar os mais divergentes a serem
utilizados como genitores num programa de melhoramento
por hibridação.
Material e métodos
Os genótipos avaliados, identificados na Tabela 1, foram
provenientes da autofecundação das variedades comerciais
RB863129, RB867515 e RB 943365 selecionadas dentro
de uma população elite na Estação Experimental de Cana
de açúcar de Carpina da Universidade Federal Rural de
Pernambuco (EECAC/UFRPE). Os colmos desses
indivíduos foram cortados em mini-toletes e enviados ao
Departamento de Biologia da Universidade Federal de
Lavras (UFLA) para a caracterização molecular, onde
foram plantados em bandejas, em casa de vegetação e após
o brotamento foram coletadas folhas jovens para extração
de DNA.
A extração de DNA seguiu a metodologia CTAB
modificada para cana-de-açúcar [5]. Foram utilizados 12
marcadores RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
da Operon Technologies: OPN, OPAX, OPAW e OPAL.
As reações de amplificação tiveram uma concentração final
de 12,01µl, contendo: 4,49µl de água, 2,25µl de DNA
(10ng.ml-1), 0,66 de dNTP, 2,25µl (0,4mM) de um
oligonucleotídeo iniciador, 1,0µl de tampão de reação e 0,4
unidades da enzima Taq polimerase. Em seguida as
reações foram amplificadas em termociclador Eppendorf
________________
1. Primeiro Autor é Mestrando do Programa de Pós-Graduação em Agronomia, Melhoramento Genético de Plantas do Departamento de Agronomia,
Universidade Federal Rural de Pernambuco, Dois irmãos s/n, Recife, PE, CEP 52171-900. E-mail: [email protected]
2. Segundo Autor é Graduando em Agronomia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Dois irmãos s/n, Recife, PE, CEP 52171-900. E-mail:
3. Terceiro Autor é Professor Adjunto do Departamento de Agronomia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Dois irmãos s/n, Recife, PE,
CEP 52171-900. E-mail: [email protected]
4. Quarto Autor é Professor Associado do Departamento de Agricultura, Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG, CEP 37200-000. E-mail:
[email protected]
5. Quinto Autor é Pesquisador da Estação Experimental de Cana-de-açúcar do Carpina da Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, PE,
CEP 52171-900. E-mail: [email protected]
6. Sexto Autor é Mestrando do Programa de Pós-Graduação em Agronomia, Melhoramento Genético de Plantas do Departamento de Agronomia,
Universidade Federal Rural de Pernambuco, Dois irmãos s/n, Recife, PE, CEP 521-900. E-mail: [email protected]
7. Sétimo Autor é Graduando em Agronomia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Dois irmãos s/n, Recife, PE, CEP 52171-900. E-mail:
[email protected]
MasterCycler Gradiente 5331. Cada ciclo de
amplificação correspondeu a: desnaturação a 94ºC por
dois minutos, anelamento a 37ºC por 15 segundos e
elongação a 72º C, por um minuto. Após 40 ciclos,
procedeu-se a extensão final por dois minutos a 72°C.
Os produtos de amplificação foram separados em gel
de agarose a 1% imerso em tampão TBE (0,45 M de
tris-borato, 0,01M de EDTA pH 8,0) a 50 volts,
durante 6 horas. Decorrido este tempo os géis foram
tratados com solução de brometo de etídio a 0,5µg.ml-1
por vinte minutos, visualizados em transluminador de
luz ultravioleta e fotografados em câmara fotográfica
EDA – 290, da Kodak. Os dados provenientes da
análise molecular foram processados com o auxílio do
programa estatístico Genes [6].
Os fragmentos gerados pelas amplificações foram
analisados quanto à presença (1) ou ausência (0) de
bandas construindo-se assim uma matriz binária, para a
estimativa de dissimilaridade genética utilizou-se o
coeficiente de Jaccard, obtido por meio da expressão: a
/(a+b+c), e para elaboração do dendrograma utilizou-se
o método hierárquico do tipo UPGMA (Unweighted
Pair Group Method using Arithmetical Averages), [7].
Resultados e Discussão
Os iniciadores OPAX 02, OPAX 09, OPAX 10,
OPAX 11, OPAX 12, OPAX 16, OPAX 17, OPAX 18,
OPAX 19, OPAW 12, OPN 20 e OPAL 09 mostraramse eficientes na caracterização molecular dos genótipos
avaliados.
O dendrograma obtido pelo método UPGMA
(Figura 1) possibilitou a formação de dois grupos
distintos. O primeiro grupo formado pelos genótipos
11, 15, 4, 8, 5, 12, 9, 14, 1, 10, 7, 13 e 2 e o segundo
pelos genótipos 3 e 6. Observa-se ainda que o primeiro
grupo pode ser dividido em dois subgrupos. O
subgrupo 1.A formado pelos genótipos 11, 15, 4, 8, 5 e
12 e subgrupo 1.B formado pelos genótipos 9, 14, 1,
10, 7, 13 e 2.
Os genótipos 1 e 3 mostraram-se mais divergentes
tendo uma distância estimada e torno de 50601.84
(100%).
Divergência genética satisfatória pode ser observada
também entre os genótipos 1 e 4 cuja distância foi
estimada em 43229.85 (85%).
Para uma maior possibilidade de obtenção de
indivíduos desejáveis, o fitomelhorista deve direcionar
seu trabalho na exploração dos cruzamentos
envolvendo os genótipos 1, 10, 7, 13 e 2 com os
genotipos 3 e 6.
Deve-se salientar que apesar dos marcadores RAPD,
utilizados no presente trabalho, apresentarem
reprodutibilidade satisfatória, nas reações de
amplificação,
os
mesmos
apresentam
como
característica básica a dominância não sendo capazes
de distinguir os indivíduos homozigotos dos
heterozigotos [8].
Em se tratando da cana-de-açúcar que é uma espécie
que apresenta níveis diferentes de ploidia e múltiplos
alelos segregando num mesmo loco, a utilização de
marcadores co-dominantes, a exemplo dos microssatélites,
torna-se fundamental para distinção de indivíduos
homozigotos dos heterozigotos e assim estimar com maior
eficiência a divergência genética nos genótipos avaliados
gerando consequentemente maior consistência nos
resultados.
Agradecimentos
A Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE),
Estação Experimental de Cana-de-açúcar do Carpina
(EECAC), Usina São José, Rede Interuniversitária de
Desenvolvimento do Setor Sucroalcooleiro (RIDESA) pelo
apoio concedido e viabilização da pesquisa e ao Conselho
Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico
(CNPq) pela concessão da bolsa de estudos.
Referências
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
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[8]
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23-25.
Tabela 1. Genótipos avaliados na análise molecular por meio de marcadores RAPD.
GENÓTIPOS
6. RB943365
7. S2.1
8. S2.2
9. S2.3
10. S2.4
1. RB867515
2. S1.1
3. S1.2
4. S1.3
5. S1.4
11. RB863129
12. S3. 1
13. S3.2
14. S3.3
15. S3.4
Nota: S1.1 a S1.4 Indivíduos provenientes da autofecundação da variedade RB867515.
S2.1 a S2.4 Indivíduos provenientes da autofecundação da variedade RB943365.
S3.1 a S3.4 Indivíduos provenientes da autofecundação da variedade RB863129.
Tabela 2. Marcadores RAPD, com suas respectivas sequencias, utilizados na análise molecular em genótipos de canade-açúcar.
Oligonucleotídeos iniciadores
Sequencias
OPAL 09
TCGCTGGTGT
OPAN 20
GAGTCCTCAAC
OPAX 02
TTCCGCCACC
OPAX 09
GGTCTGGTTG
OPAX 11
GGAGCCTCAG
OPAX 12
TCGCCAGCCA
OPAX 16
CTCTGTTCGG
OPAX 17
GACACGGACC
OPAX 18
GACTAGGTGG
OPAX 19
TGGCAAGGCA
OPAW 12
TGGGCGAAAG
Figura 1 – Dendrograma representativo da divergência genética obtido pela método de agrupamento das médias das
distâncias (UPGMA), baseado no coeficiente de Jaccard, considerando doze marcadores RAPD em 15 genótipos de
cana-de-açúcar.