BACTÉRIAS ASSOCIADAS AO FEIJÃO CAUPI (Vigna unguiculata

BACTÉRIAS ASSOCIADAS AO FEIJÃO CAUPI
(Vigna unguiculata): ISOLAMENTO E
BIOPROSPECÇÃO DE BACTÉRIAS
METILOTRÓFICAS FACULTATIVAS
Pedro Avelino Maia de Andrade1, Fernando José Freire2, Júlia Kuklinsky-Sobral3, Michelangelo de Oliveira
Silva4, Diogo Paes da Costa5, Marisângela Viana Barbosa5, & Maria Camila de Barros Silva5
Introdução
O feijão caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp.],
também conhecido como feijão-de-corda ou feijão
macassar, é uma leguminosa de alto valor protéico (23
a 25% em média), além de ser fonte de carboidratos,
fibra alimentar, vitaminas e minerais, apresenta baixo
valor lipídico (2% em média) [1,2]. É uma cultura de
extremo valor para a população do Norte e Nordeste
brasileiro, principalmente por ser um dos principais
componentes da dieta alimentar da população de baixa
renda [1]. É uma cultura que responde bem às
condições ambientais e sociais oferecidas pela região,
tanto pelas altas temperaturas, baixa umidade e
precipitação, quanto ao baixo custo de produção e
manejo [1]. Contudo, apresenta baixa produtividade,
atribuída principalmente a restrições edafoclimáticas e
pouca utilização de tecnologias [3].
Neste contexto, diversas pesquisas buscam novas
alternativas que propiciem o aumento da produtividade
com sustentabilidade. Uma delas é a utilização de
microrganismos associados às plantas na produção
agrícola, pois os microrganismos desenvolvem relações
neutras e simbióticas com as plantas hospedeiras,
podendo inclusive contribuir para o crescimento, saúde
e desenvolvimento vegetal [4].
As bactérias pertencentes ao gênero bacteriano
Methylobacterium constituem um grupo de bactérias
metilotróficas facultativas pigmentadas de rosa (PinkPigmented Facultatively Methylotrophic Bacteria PPFMs), que se caracterizam pela capacidade de
crescer utilizando compostos com apenas um carbono,
como o metanol [5]. Apresenta distribuição em
diferentes nichos, mas quando em associação com os
vegetais pode contribuir com a indução de resistência
sistêmica [6], aceleração da germinação e o
crescimento vegetal, além de produzir sideróforos, fixar
nitrogênio atmosférico, e outros [7].
Diante do exposto, este trabalho teve o objetivo de
isolar bactérias endofíticas, de caule e raiz, e do rizoplano
de plantas de feijão caupi e selecionar bactérias
metilotróficas facultativas de pigmentação rosa (gênero
Methylobacterium -PPFMs) com capacidade de fixar
nitrogênio in vitro.
Material e métodos
A. Material vegetal
Foram utilizadas amostras de caules e raízes de plantas
de feijão caupi, cultivadas no município de Brejão, PE,
(latitude 901’47,29’’S e longitude 36034’’28,28’’O), na
safra de 2008. As amostras vegetais foram coletadas 45
dias após o plantio, sendo identificadas e levadas ao
Laboratório de Genética e Biotecnologia Microbiana
(LGBM) da Unidade Acadêmica de Garanhuns
(UAG/UFRPE) para processamento das análises.
B. Isolamento de bactérias
Após a coleta, as amostras vegetais foram lavadas em
água corrente e separadas em caule e raiz. Para o
isolamento de bactérias do rizoplano e endofíticas da folha
e da raiz, foi realizado de acordo com Kuklinsky-Sobral et
al. [8].
C. Seleção de bactérias metilotróficas facultativas de
pigmentação rosa
Isolados bacterianos que apresentaram colônias com
coloração rosa e borda lisa foram selecionadas. Estes
isolados foram purificados por esgotamento e colônias
isoladas foram submetidas ao crescimento em meio de
cultura MMS (Metanol e Sais Minerais) [1,2g/l K2HPO4 ;
0,05g/l CaCl2; 0,20g/l MgSO4.7H2O; 0,10g/l NaCl; 1,0mg/l
FeCl3.6H2O; 0,5g/l (NH4)2SO4; 5,0µg/l CuSO4.5H2O;
________________________
(1)
Aluno de Graduação em Agronomia da Unidade Acadêmica de Garanhuns, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Av. Bom Pastor, s/n, Boa
Vista, Garanhuns, PE, CEP 55296-901. E-mail: [email protected]
2. Professor Adjunto do Departamento de Agronomia, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Rua Dom Manuel de Medeiros, Dois Irmãos,
Recife, PE, CEP 52171-900.
3. Professora Adjunta da Unidade Acadêmica de Garanhuns, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Av. Bom Pastor, s/n, Boa Vista,
Garanhuns, PE, CEP 55296-901.
4. Doutorando do PPG em Ciência do Solo, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Rua Dom Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos, Recife,
PE, CEP 52171-900.
5. Alunos de Graduação em Agronomia da Unidade Acadêmica de Garanhuns, Universidade Federal Rural de Pernambuco. Av. Bom Pastor, s/n,
Boa Vista, Garanhuns, PE, CEP 55296-901.
Apoio financeiro: CNPq e FACEPE.
10,0µg/l MnSO4.5H2O; 10,0µg/l Na2MoO4.2H2O;
10,0µg/l H3BO3; 70,0µg ZnSO4.7H2O; 5,0ml/l de
metanol e 15,0g/l de agar; pH 7,0] [9]. As placas foram
incubadas a 28°C e avaliadas com 5, 10 e 15 dias.
D. Seleção de bactérias fixadoras de nitrogênio
A seleção de bactérias fixadoras de nitrogênio foi
realizada segundo Dobereiner et al. [10]. Para tanto, as
bactérias foram inoculadas em meio semi-sólido NFb
[5g/l da ácido málico; 0,5g/l de K2HPO4; 0,2g/l de
MgSO4.7H2O; 0,1g/l de NaCl; 0,01g/l de CaCl2.2H2O;
4ml/l de Fe.EDTA (solução 1,64%); 2ml/l de azul de
bromotimol (0,5 %); 2ml/l de solução de
micronutrientes (0,2g/l de Na2MoO4.2H2O; 0,235g/l de
MnSO4.H2O; 0,28g/l de H3BO3; 0,008g/l de
CuSO4.5H2O); 1,75g/l da agar; pH 6,8], incubadas a
28°C por 10 dias. Os experimentos foram realizados
em triplicatas e o resultado positivo foi caracterizado
pela presença de um halo de crescimento no interior do
meio de cultura.
Resultados e discussão
A. Isolamento de bactérias
A metodologia descrita permitiu o isolamento de
diferentes grupos bacterianos endofíticos, de caule e
raiz, e do rizoplano associados ao feijão caupi,
incluindo o grupo de Methylobacterium spp. Foram
observadas colônias, diferenciadas morfologicamente
em relação às cores das colônias (amarela, branca,
laranja, esverdeada e rosa), além de diferenciação na
textura e na forma das bordas das colônias, como pode
ser visto na Figura 1A. Esta diversidade de morfologia
reflete diferenças genéticas, como relatado por
Kuklinsky-Sobral et al. [8] com bactérias associadas à
soja.
A densidade populacional da comunidade
bacteriana endofítica, de folha e raiz, e do rizoplano
variou de 103 a 107 UFC/g de TVF em plantas de feijão
caupi. Foi possível observar interação entre a
colonização bacteriana os tecidos da planta hospedeira,
pois, a análise dos dados mostrou que a densidade
bacteriana
endofítica
diminui
na
direção
rizoplano>raiz>caule (Fig. 1B), sendo este perfil
também observado por outros autores [8, 11, 12].
B. Seleção de Bactérias Metilotróficas Facultativas
e Fixadoras de Nitrogênio
Dezenove bactérias de pigmentação rosa foram
selecionadas (18 do caule e 1 do rizoplano) e
cultivadas em meio MMS e todas apresentaram
crescimento, indicando estarem utilizando o metanol
como fonte carbono. Portanto, foram consideradas
metilotróficas facultativas [3].
Avaliando-se as dezenove estirpes de bactérias
oriundas do isolamento do feijão-caupi, que pertencem
ao grupo metilotróficas facultativas, quanto a fixação
de nitrogênio em meio semi-solido NFb, foi observado
que 5 estirpes (26%) foram capazes de crescer no meio
de cultura livre de nitrogênio. O crescimento foi
visualizado como uma fina película típica próxima à
superfície do meio, formando um menisco (Fig. 1C).
Os estudos sobre simbiose entre plantas leguminosas e
bactérias associadas geralmente são referentes a rizóbios,
sendo conhecidas por fixarem nitrogênio atmosférico em
nódulos. Contudo, Sy et al. [13] descreveram uma nova
espécie bacteriana, Methylobacterium nodulans, envolvida
na formação de nódulos e fixação de nitrogênio em
Crotalaria (leguminosa), sugerindo que outros gêneros
bacterianos podem apresentar um papel importante no
suprimento de N2 para estas plantas. Portanto, a presença
de bactérias metilotróficas facultativas de cor rosa em
plantas de feijão caupi necessitam de mais estudos para o
entendimento desta interação.
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Figura 1. A) Diversidade morfológica de bactérias associadas ao feijão caupi. As colônias de coloração rosa são representantes de
Methylobacterium spp. (setas); B) Densidade populacional total da comunidade bacteriana endofítica, de caule e raiz, e do rizoplano
de plantas de feijão caupi. As barras indicam o desvio padrão das médias resultantes da avaliação de 5 plantas (repetições); C)
Formação de halo de crescimento bacteriano em meio cultura NFb livre de N2.