título do resumo - EAIC | UEPG - Universidade Estadual de Ponta

DIVERSIDADE DE RIZÓBIOS MICROSSIMBIONTES DE LEGUMINOSAS NATIVAS
DOS CAMPOS GERAIS.
Milena Serenato Klepa (PIBIC/CNPq/UEPG), Fabiane Paulitsch (PPG Biologia
Evolutiva/UEPG), Jesiane Stefania Batista da Silva (Orientadora), e-mail:
[email protected]
Universidade Estadual de Ponta Grossa/Departamento de Biologia Estrutural,
Molecular e Genética/Setor de Ciências Biológicas e da Saúde.
Microbiologia/Microbiologia aplicada.
Palavras-chave: Fixação Biológica de Nitrogênio, Diversidade de Rizóbios,
Diversidade
Resumo:
Encontrada em grande número de espécies nos Campos Gerais, a família Fabaceae
apresenta extrema relevância na fixação biológica de nitrogênio, através da simbiose
com rizóbios compatíveis, resultando em estruturas especializadas denominadas
nódulos. O presente trabalho objetivou realizar o primeiro levantamento de plantas
nodulíferas nativas da região e avaliar a diversidade de rizóbios isolados. A partir de
amostragens realizadas em áreas da região, constatou-se 8 espécies de Fabaceae
nodulíferas, dentre as quais 3 espécies tiveram o primeiro relato sobre nodulação.
Cento e nove rizóbios foram isolados e cultivados em YMA, possibilitando constatar
grandes variações morfofisiológicas, permitindo assim, inferir sobre a existência de
elevada diversidade fenotípica entre rizóbios nos solos da região. Pelo grande número
de isolados, estirpes de Mimosa gymnas foram selecionadas para análise da
diversidade genética. Uma elevada diversidade genotípica foi evidenciada no
dendrograma gerado com os perfis de BOX-PCR. O sequenciamento do gene 16S
rDNA permitiu corroborar que estirpes de Burkholdeira são as principais simbiontes de
Mimosa na América do Sul. Já a árvore filogenética construída com sequencias
parciais do gene nodC evidencia uma menor variabilidade do que a encontrada dentre
sequencias do 16S rDNA, provavelmente devido ao seu envolvimento com a
determinação da especificidade rizóbio-hospedeiro. Como se tratam de espécies
endêmicas de Fabaceae, o levantamento e caracterização realizados permitiram obter
dados de diversidade florística sobre um novo ponto de vista, além de relatar sobre
espécies nunca descritas como nodulíferas anteriormente, que podem representar
modelos para caracterização da evolução de beta-rizóbios.
Introdução
Localizada na porção centro-leste do Paraná, a região dos Campos Gerais
contempla uma conjugação de fatores ambientais, que garante a esta, particularidades
quanto às espécies vegetais (CARMO, 2006). Região onde se encontram alguns sítios
naturais já implementados como unidades de conservação (UCs), tais como: Parque
Estadual de Vila Velha, Parque Estadual do Guartelá e Parque Nacional dos Campos
Gerais. De acordo com levantamentos florísticos realizados nas referidas regiões, a
família Fabaceae é relatada por sua abundância e riqueza (CARMO, 2006; SILVA,
2014). Bactérias denominadas rizóbios estabelecem relação simbiótica específica com
espécies desta família, culminando na infecção via pelos radiculares e organogênese
de estruturas radiculares denominadas nódulos, no interior dos quais onde ocorre a
fixação biológica do nitrogênio (FBN) pelos rizóbios (SCHULTZE & KONDOROSI,
1998).
O conhecimento da capacidade nodulífera de leguminosas, bem como dos
grupos de microrganismos presentes nos solos da região, nos permitem compreender
alguns mecanismos relacionados com a capacidade de adaptação de determinadas
espécies de plantas, compreender dados de diversidade florística por um novo ponto
de vista, bem como fundamentar estratégias de recuperação da flora nativa em áreas
degradadas. Nesse sentido, o presente trabalho visou realizar a primeira descrição de
plantas nativas nodulíferas da região dos Campos Gerais, bem como caracterizar seus
microssimbiontes.
Materiais e métodos
Leguminosas nativas contendo nódulos radiculares foram acondicionadas em
sacos plásticos estéreis, mediante classificação taxonômica e emissão de comprovante
de registro para coleta de material biológico (nº 49603) e autorização para atividades
científicas (nº 49604), emitidas pelo ICMBio via SISBIO. Nódulos foram isolados da
planta hospedeira e desinfestados de acordo com Hungria & Araújo (1994). Em
seguida macerados em solução salina estéril e inoculados em placas de Petri contendo
meio sólido seletivo Yeast Mannitol (YM)+Vermelho Congo e incubadas à 28ºC. As
colônias de rizóbios isoladas foram caracterizadas fenotípicamente de acordo com
Hungria & Silva (2011). As estirpes isoladas estão mantidas em estoque em Agar
inclinado e criopreservadas em glicerol 50%, constituindo a “Coleção de culturas de
bactérias multifuncionais dos Campos Gerais”. Além disso, foram depositados na
“Coleção de Culturas de Microrganismos Multifuncionais” da Embrapa Soja (Londrina,
PR).
O DNA total dos isolados foi extraído com o kit miniPrep DNA genômico
bacteriano, conforme instruções do fabricante. Verificou-se a integridade e
concentração do DNA através de eletrofose em gel de agarose 1,0%. O DNA total de
estirpes selecionadas foi utilizado como molde para amplificação do gene 16S rDNA,
utilizando os iniciadores universais fD1 e rD1 (WEISBURG et al., 1991). Os produtos de
PCR, de aproximadamente 1500pb, foram purificados utilizando o Illustra GFX PCR
DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare).
O gene nodC das estirpes foi amplificado utilizando-se os primers nodCBurkF e
nodCBurkR (BOURNAUD et al., 2013). Os produtos de PCR foram purificados,
utilizando o kit Illustra GFX PCR DNA and Gel Band purification kit (GE Healthcare).
O sequenciamento foi realizado conforme descrito por Dall’Agnol et al., (2016). As
sequências dos genes 16S rDNA e nodC foram corrigidas e alinhadas utilizando os
softwares Bionumerics (Applied Mathematics, Kortrijk, Belgium, v. 7.6), Bioedit v. 7.2.5
e Geneious v.7.1 (Biomatters). As árvores filogenéticas foram construídas no programa
MEGA v. 6.1, com modelo de distância Tamura Nei, algoritmo Maximum Likelihood e
suporte estatístico (bootstrap) de 1000 repetições.
A reação de amplificação para análise BOX-PCR, foi realizada utilizando o primer
BOX-AIR (5’CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3’), seguindo as modificações de
Batista et al., (2007). A partir dos perfis obtidos, foram gerados dendrogramas,
utilizando o programa Bionumerics (Applied Mathematics, Kortrijk, Bélgica, v.4.6),
utilizando-se o algoritimo UPGMA para a análise do agrupamento e o coeficiente de
Jaccard com 3% de tolerância.
Resultados e Discussão
Dentre as espécies de plantas identificadas por especialistas do Herbário da
Universidade Estadual de Ponta Grossa (HUPG), algumas já haviam sido relatadas
como nodulíferas, tais como: Desmodium incanum, Zornia diphylla, Stylosanthes
hippocampoides, Chamaecrista ramosa e Mimosa lanata. No entanto, a ocorrência de
nódulos radiculares foi constatada pela primeira vez nas espécies M. micropteris, M.
paranapiacabae e M. gymnas; por esse motivo, as caracterizações foram
especialmente baseadas nos microssimbiontes das três espécies. A subfamília
Mimosoideae, mais precisamente o gênero Mimosa, representou maior número de
espécies, bem como de microssimbiontes isolados, sendo M. gymnas a espécie mais
representativa.
Foi encontrada uma grande diversidade quanto às características fenotípicas
entre os isolados das referidas espécies, sendo que algumas bactérias retiradas de
nódulos de uma mesma planta hospedeira apresentaram distintas características
morfológicas. Poucos isolados mantiveram a neutralidade do meio YMA enquanto a
grande maioria provocou acidificação, caracterizadas pela modificação da coloração do
meio para amarelo. Pode-se inferir que tal condição seja decorrente da capacidade
adaptativa de tais microrganismos às condições de pH ácido dos solos dos Campos
Gerais (CARMO, 2006). Maior parte dos rizóbios teve crescimento rápido ou
intermediário, formando colônias com produção de muco moderada e massas de
consistência viscosas ou gomosas. Houve uma grande variação na coloração das
colônias, assim como na forma, elevação, borda e superfície da colônia. Todos os
rizóbios apresentaram característica opaca em relação aos detalhes ópticos. Poucos
isolados foram classificados como gram-positivos; considerando que todos os rizóbios
são bactérias gram-negativas, os isolados que foram classificados como gram-positivos
foram descartados e considerados contaminantes.
Dentre os 35 isolados de M.gymnas, 21 foram utilizados para análise de
fingerprinting do BOX-PCR, sequenciamento do gene ribossomal 16S rDNA e do gene
de nodulação nodC. Os perfis genômicos obtidos por BOX-PCR revelaram o
agrupamento dos isolados em nove grupos, considerando um nível de similaridade de
até 70% (figura 1).
A partir das sequências obtidas pelo sequenciamento do gene 16S rDNA, nota-se
uma elevada diversidade entre os microssimbiontes de M. gymnas (figura 2). Tal
resultado corrobora a constatação de que estirpes de Burkholderia são os principais
simbiontes de mimosoídeas da América do Sul (BONTEMPS, et al., 2010). Os isolados
apresentaram similariedade com B. nodosa Br3470, simbionte de M. bimucronata, uma
leguminosa arbórea nativa do Brasil. Em contrapartida, as sequências parciais do gene
nodC, apresentaram baixa variabilidade entre os diferentes isolados (figura 3). De
acordo com Bournaud et al., (2013), a filogenia de genes de nodulação de espécies de
Burkholderia simbiontes de mimosoídeas é usualmente relatada como monofilética e
nossos resultados corroboram tal constatação. A maior similaridade do gene nodC foi
encontrada com a estirpe Burkholderia sp. JPY578, isolada de nódulo de M. blanchettii
endêmica de campos rupestres da Chapada Diamantina (dos REIS JR et al., 2010).
Conclusões
O primeiro relato da habilidade de nodulação em leguminosas nativas da região
dos Campos Gerais poderá contribuir como subsídio na manutenção biológica de áreas
com solo degradado, do mesmo modo que o conhecimento dos rizóbios simbiontes
destas conferem informações importantes relacionadas à evolução da interação plantamicrorganismo, bem como da diferenciação espacial na composição de populações
simbióticas. Os dados obtidos ainda são insuficientes para determinação da espécie
bacteriana, por isso serão utilizadas metodologias para classificar corretamente os
isolados e principalmente a possível constatação da existência de novas espécies
bacterianas. O presente trabalho abriu caminhos para estudos futuros de mesmo cunho
em outras leguminosas nativas dos Campos Gerais, assim como na melhor
compreensão de adaptações de espécies vegetais da família Fabaceae.
Agradecimentos
O desenvolvimento da pesquisa contou com apoio financeiro do Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), e apoio financeiro e
técnico-científico do Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva, Laboratório
de Biodiversidade e Herbário da Universidade Estadual de Ponta Grossa e Embrapa
Soja – Londrina/PR.
Referências
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