DIVERSIDADE DE BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS EM FRUTOS DE

ALEXANDER FRANCISCO PEREZ CORDERO
DIVERSIDADE DE BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS
EM FRUTOS DE CAFÉ
Tese apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das
exigências do Programa de Pósgraduação em Microbiologia Agrícola,
para obtenção do título de Doctor
Scientiae.
VIÇOSA
MINAS GERAIS - BRASIL
2008
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A minha querida esposa Liliana, por ser
grande no amor, forte na espera e
perseverante em seu coração. Aos dois
presentes
maiores,
nossos
filhos,
Andréa Carolina e Andrés Camilo. Aos
meus queridos pais Delimira, Luz Emilia
e Camilo Alfonso.
Dedico.
ii
AGRADECIMENTOS
A Deus, por seu amor permanente, por me ter proporcionado sabedoria
e perseverança para vencer os obstáculos, e pela presença insubstituível em
cada instante de minha vida.
À Universidade de Sucre, Colômbia, pelo apoio e oportunidade
oferecida, em especial ao senhor Reitor, Rafael Peralta Castro, pela confiança
depositada.
À Universidade Federal de Viçosa, pela aceitação, acolhida e
oportunidade para tornar possível a realização deste desejo pessoal.
Ao Departamento de Microbiologia, pela oportunidade de fazer brilhar
este meu grande sonho.
À querida mãe Delimira, pela vida; ao meu irmão Cristo Rafael, pelo,
incentivo, apoio e compreensão.
À Liliana, pela presença insubstituível em minha vida, pelo carinho,
companheirismo e amor, que foram indispensáveis a cada momento e
amenizaram as dificuldades e obstáculos encontrados na vida e caminho.
A meus segundos pais, Luz Emilia e Camilo Alfonso, pelo amor, apoio e
incentivo para a realização de meu desejo de obter a formação acadêmica
completa.
A meus amigos e irmãos incondicionais, Héctor Ricardo, Carmen Peluffo
e Janet Pava.
iii
À meu mestre, amigo incondicional e companheiro de trabalho na
Universidade de Sucre, Victor Peroza Coronado.
Ao Professor, mestre e amigo, Arnaldo Chaer Borges, por sua
orientação, paciência, compreensão, confiança e pela humildade que sempre
teve.
Aos meus co-orientadores, Célia Alencar de Moraes, Maurício Dutra
Costa e Marcos Rogério Tótola, pela amizade, ensinamento e contribuição na
condução do experimento e análises.
À Illycaffé S.p.a, meus agradecimentos por propiciar parte dos recursos
financeiros, pelo convênio Illycafè Funarbe UFV.
À Cássia Fernandes pela acolhida, colaboração e confiança quanto á
realização desse trabalho no laboratório L.B.B.M.A.
Às Professoras Maria Catarina, Elza e Maria Cristina, pela amizade e
estímulo durante o curso.
Aos amigos que sempre estarão em minha mente, Helson, Isabella,
Maurício, Thiago, Maike, Fernanda, Fabiane e Nilcéa, nossa secretaria.
A meus colegas de laboratório, Raul, Júlio, Ana Cristina, Daniela, Bruno,
Adriano e Paulo.
Aos demais professores do Departamento de Microbiologia, pelo
convívio agradável e pela contribuição em minha formação.
À Nilcéa, Laura e Rejane, pela amizade, confiança, apoio e compressão
dispensados.
Ao Danilo, Evandro, Toninho, Paulo, pela amizade e auxílio no dia-a-dia
da “bancada”, e aos demais funcionários do DMB.
Aos demais amigos do Departamento de Microbiologia.
A todas as pessoas que, de alguma forma, contribuíram para a
realização deste trabalho e para meu crescimento pessoal e profissional.
iv
BIOGRAFIA
ALEXANDER FRANCISCO PÉREZ CORDERO, filho de Delimira Maria
Cordero e Rafael Pérez, nasceu em Ciénaga de Ouro, Córdoba, Colômbia, no
dia 5 de janeiro de 1965.
Em 1991, graduou-se em Engenharia Agronômica pela Universidade
Nacional de Córdoba, Colômbia. Desde 1991 até a data de hoje trabalha como
professor na Universidade de Sucre, Colômbia.
Em dezembro de 1996, graduou-se como Especialista em Gerência da
Educação pela Universidade de Ciego de Ávila da República de Cuba.
Em setembro de 2003 concluiu seu mestrado em Ciências Biológicas,
área de Microbiologia, pela Universidade dos Andes, Colômbia.
Ingressou em 2005 no Doutorado em Microbiologia Agrícola na
Universidade Federal de Viçosa-Brasil, submetendo à tese a defesa em março
de 2008.
v
SUMÁRIO
Página
RESUMO ................................ ..............................................................
viii
ABSTRACT................................ ...........................................................
x
1. INTRODUÇÃO................................ ..................................................
1
2. REVISÃO DE LITERATURA .............................................................
3
3. MATERIAL E MÉTODOS................................ ..................................
19
3.1. Área de estudo ................................................................ ...........
3.2. Amostragem................................ ................................ ...............
3.3. Processamento das amostras................................ ....................
3.4. Isolamento e quantificação de bactérias totais e endofítica .......
3.5. Identificação dos isolados de bactérias endofíticas ...................
19
19
21
21
22
3.5.1. Identificação FAME/MIDI................................ ......................
3.5.2. Extração de DNA, amplificação, sequenciamento e análise
de seqüências de rDNA 16S ................................................
22
3.6. Diversidade genética de comunidades de bactérias nãocultiváveis ................................ ..................................................
3.6.1. Extração de DNA total de bactérias em frutos de café.........
3.6.2. Amplificação de rDNA 16S de Eubactérias e de grupos
específicos de bactéria ................................ ..........................
vi
23
25
26
27
Página
3.6.3. PCR e análise por eletroforese em gel com gradiente
desnaturante (DGGE)...........................................................
3.6.4. Análise da diversidade genética................................ ............
3.6.5. Análises estatísticas..............................................................
30
31
33
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................
34
4.1. Comunidades de bactérias totais e endofíticas isoladas de
fruto de café................................ ................................................
4.2. Composição de bactérias endofíticas cultiváveis .......................
4.3. Estrutura genética de comunidades de bactérias endofíticas ....
34
37
47
5. CONCLUSÕES ................................................................ .................
59
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................ ......................
61
APÊNDICE................................................................ ............................
75
APÊNDICE A ................................ ........................................................
76
vii
RESUMO
CORDERO, Alexander Francisco Perez, D. Sc., Universidade Federal de
Viçosa, março de 2008. Diversidade de bactérias endofíticas em frutos
de café. Orientador: Arnaldo Chaer Borges. Co-orientadores: Célia Alencar
de Moraes, Marcos Rogério Tótola e Maurício Dutra Costa.
O objetivo do presente trabalho foi estudar a diversidade de bactérias
endofíticas associadas aos frutos em quatro cultivares de Coffea arabica L., em
diferentes altitudes na Zona da Mata Norte, Minas Gerais, Brasil. As amostras
de frutos sadios, no estádio cereja, foram coletadas em lavouras de Catuaí
Amarelo, Catuaí Vermelho, Bourbon Amarelo e Bourbon Vermelho. O
isolamento e a quantificação de bactérias dos frutos foram realizados em meio
de cultura R2A, estabelecendo-se uma coleção de culturas de bactérias
endofíticas e epifíticas de frutos de café no Laboratório de Ecologia Microbiana
(LEM) do Departamento de Microbiologia com 381 isolados, dos quais 134 de
endofíticas. Entre essas foram identificados e descritos 48 morfotipos, que
constituíram o universo-base para o presente estudo. A identificação fenotípica
foi por características culturais e análises de ésteres metílicos de ácidos graxos
(FAME) pelo sistema de identificação Sherlock®(MIDI). O estudo das
endofíticas cultiváveis foi realizado com dados do seqüenciamento direto de
amplicons obtidos por PCR, enquanto que para o das não-cultiváveis foram
utilizados primer específicos para grupos de bactérias de três filos,
Proteobacteria classes, α, βe γ, Firmicutes e Actinobacteria, sendo os produtos
do Nested-PCR analisados por eletroforese em gel de gradiente desnaturante
(DGGE). Nas amostras de café cereja a altitudes entre 676 até 1.187 m, as
viii
densidades de endofíticas variaram, em UFC.fruto -1 , de 2,93 x 104 a 6,2 x 10 6
em Catuaí Amarelo; 7,6 x 104 a 6,0 x 106 em Catuaí Vermelho; 1,24 x 104 a
1,35 x 106 em Bourbon Amarelo e 4,6 x 10 4 a 2,69 x 106 em Bourbon Vermelho.
As médias de densidades populacionais de bactérias endofíticas, em relação a
cultivares e à altitude, diferiram (p<0,05) entre si. Os maiores valores das
médias a altitudes superiores a 1.000 m, em Catuaí Vermelho e Bourbon
Vermelho, diferiram (p<0,05) das de Catuaí, Amarelo e Vermelho à 676 m . A
correlação simples por Pearson mostrou relação positiva (p<0,05) entre as
contagens e altitude. As endofíticas cultiváveis foram identificadas com base no
perfil FAME/MIDI como sendo de isolados de Curtubacterium flaccumfaciens
betae/oortii (LEM CA16, LEM CV20, LEM CA25 e LEM CA28), Brevibacterium
epidermis/oidium (LEM BV41), Microbacterium barkeri (LEM CA26 e LEM
BV37),
Microbacterium
luteolum
(LEM
CA01),
Pectinobacterium
carotovorum/carotovorum (LEM CA30, LEM CV35, LEM BV38, LEM BA43 e
LEM BA45), Pseudomonas putida biótipo A (LEM BA47), Salmonella
typhymurium GC grupo B (LEM CV19), Staphylococcus simulans (LEM CV23)
e Bacillus sp. (LEM CV24). A análise filogenética com uso de seqüências de
rDNA 16S mostrou, para o isolado LEM CV24 uma maior identidade com
Bacillus
niacini
AJ21160.1,
enquanto
o
LEM
BV39
correspondeu
a
Enterobacter amnigenus EU340927.1, e os isolados LEM CA01 e BV37 a
Microbacterium sp. Das bactérias endofíticas associadas a cultivares de café,
P.
carotovorum/carotovorum,
S. typhymurium,
B.
epidermis/oidium,
S.
simulans, B. niacini e E. amnigenus, são relatadas pela primeira vez como
endofíticas em frutos de cafeeiros arábica. As análises de diversidade de
bactérias totais, endofíticas e epifíticas, por PCR-DGGE utilizando o primer
universal (F948GC/R1378), revelaram a presença de 80 unidades taxonômicas
operacionais (UTOs), enquanto a riqueza de endofíticas correspondeu a 64
UTOs. Entretanto, com a utilização de grupos de primer específicos, Nested–
PCR, a diversidade de bactérias endofíticas correspondeu a uma riqueza de
110 UTOS para o filo Firmicutes, 71 para γ-Proteobacteria e 50 UTOs para
Actinobacteria. A constatação da existência de diversidade de endofíticas em
C. arábica evidencia a urgência de estudos funcionais desta microbiota,
especialmente com relação a compostos precursores de aroma, sabor e
acidez, de interesse para produção comercial de cafés de qualidade superior.
ix
ABSTRACT
CORDERO, Alexander Francisco Perez, D Sc., Universidade Federal de
Viçosa,
March, 2008. Diversity of endophytic bacteria in coffee
cherries. Adviser: Arnaldo Chaer Borges. Co-Advisers: Célia Alencar de
Moraes, Marcos Rogério Tótola and Maurício Dutra Costa.
The objective of this work was to study the diversity of endophytic bacteria
in Coffea arabica L. cherries collected at different altitudes in the Zona da Mata
Norte, Minas Gerais State, Brazil. Samples of healthy ripe fruits were collected
in areas planted with Catuaí Amarelo, Catuaí Vermelho, Bourbon Amarelo, and
Bourbon Vermelho. The isolation and quantification of bacteria were done on
R2A medium, with the establishment of a culture collection of epiphytic and
endophytic bacteria containing 381 isolates. Among the total of isolates
obtained, 134 were endophytic. Forty-eight distinct morphotypes of endophytic
bacteria were identified, described, and further characterized in this study. The
phenotypic identification was done by analyzing cultural traits and the fatty acid
methyl ester profiles (FAME) by the Sherlock® (MIDI) identification system. The
study of the culturable endophytic bacteria was done based on the direct
sequencing of PCR amplicons, while non-culturable bacteria were analyzed
using specific primers for the bacterial groups corresponding to Proteobacteria,
α, β, and classes, Firmicutes, and Actinobacteria. Nested-PCR products were
analyzed by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). In the coffee
cherry samples from altitudes ranging from 676 to 1,187 m, the density of
x
endophytic bacteria varied, in CFU fruit-1, from 2.93 x 104 to 6.2 x 106 for Catuaí
Amarelo; from 7.6 x 104 to 6.0 x 10 8 for Catuaí Vermelho; from 1.24 x 104 to
1.35 x 106 for Bourbon Amarelo; and from 4.6 x 104 to 2.69 x 106 for Bourbon
Vermelho. Population density means of endophytic bacteria for the coffee
cultivars and sampling altitudes were statistically different (p < 0.05). The
largest values obtained for altitudes higher than 1,000 m, for Catuaí Vermelho
and Bourbon Vermelho, were statistically distinct (p < 0.05) from those for
Catuaí Vermelho and Catuaí Amarelo at 676 m. Pearson`s correlation showed
a positive relation (p<0.05) between bacterial counts and altitude. The
culturable endophytic bacteria were identified based on the FAME/MIDI profile
and corresponded to Curtubacterium flaccumfaciens betae/oortii (LEM CA16,
LEM CV20, LEM CA25, and LEM CA28), Brevibacterium epidermis/oidium
(LEM
BV41),
Microbacterium
Microbacterium
luteolum
barkeri (LEM
(LEMCA01),
CA26
and
Pectinobacterium
LEM
BV37),
carotovorum/
carotovorum (LEM CA30, LEM CV35, LEM BV38, LEM BA43, and LEM BA45 ),
Pseudomonas putida biotype A (LEM BA47), Salmonella typhymurium GC
group B (LEM CV19), Staphylococcus simulans (LEM CV23), and Bacillus sp.
(LEM CV24). Phylogenetic analyses using 16S rDNA sequences showed a
higher identity to Bacillus niacin AJ21160.1 for isolate LEM CV24, while LEM
BV 39 corresponded to Enterobacter amnigenus EU340927.1. The isolates
LEM CA01 and BV37 corresponded to Microbacterium sp. Among the
endophytic bacteria associated to coffee fruits, P. carotovorum/carotovorum, S.
typhymurium, B. epidermis/oidium, S. simulans, B. niacini, and E. amnigenus,
are reported for the first time as endophytic in C. arabica. The diversity analyses
of total bacteria (endophytic + epiphytic) by PCR-DGGE using universal primers
(F948GC/R1378), revealed 80 operational taxonomic units (OTU) in the coffee
cherries, while species richness of endophytic bacteria corresponded to
64 OTUs. The use of specific primers for the diversity of endophytic bacteria
during Nested-PCR revealed a richness of 110 OTUs for Firmicutes, 71 OTUs
for 
-Proteobacteria, and 50 OTUs for Actinobacteria. The existence of such
diversity of endophytic bacteria in C. arabica evidences the urgency for further
functional studies on the microbiota of coffee plants, and, especially, on the
precursor compounds that may be determinant to flavor and acidity, two traits
of great interest for the production of high quality coffee.
xi
1. INTRODUÇÃO
O café é considerado o segundo maior produto de exportação no mundo
após o petróleo, com faturamento anual correspondente a US $ 70 bilhões. É
produzido em mais de cinqüenta países, entre os quais cinco respondem por
aproximadamente 56 % da produção mundial: Brasil, Colômbia, Indonésia,
México e Vietnã. Nos países produtores e consumidores, aproximadamente,
17-20 milhões de famílias dependem deste produto para sua subsistência
(REZENDE et al., 2000; VEGA et al., 2008). O gênero Coffea faz parte da
família Rubiaceae, com mais de 10.000 espécies diferentes, dentre as quais
C. arabica L. e C. canephora Pierre ex Froehner são consideradas as de maior
importância econômica (AGUIAR, 2001). No Brasil, 82 % da produção
originam-se de lavouras formadas com cultivares da espécie C. arabica L. e o
restante de cultivares de C. canephora Pierre ex Froehner (MELO et al., 1998).
A crescente valorização da qualidade da bebida de C. arabica, traduzida
por características sensoriais de aroma, sabor e acidez, é fator determinante da
expansão da cafeicultura e dos investimentos em técnicas de processamento
pós-colheita no Brasil. O aroma é a característica mais complexa e interessante
do ponto de vista da elucidação da origem das substâncias nele envolvidas e,
por isso, tem sido alvo de estudos sistemáticos desde o inicio do século. São
mais de 800 os compostos voláteis envolvidos nessa característica, sendo
influenciada pela genética da planta, tipo de solo, exposição da lavoura em
relação ao sol nascente, localização geográfica, manejo da cultura e cuidados
1
no processamento pós-colheita (ALVES et al., 1999; ALVES et al., 2000;
LONGO e SANROMÁN, 2006).
As plantas podem ser consideradas como um microecossistema
complexo, constituído por diferentes nichos e uma vasta microbiota. Nesse
contexto, as bactérias podem ser consideradas como habitantes normais tanto
nas superfícies da planta como no interior dos tecidos da maioria dos vegetais,
onde podem estabelecer interações neutras, simbiônticas, parasíticas ou
antagônicas. As bactérias são denominadas como endofíticas quando habitam
o interior de órgãos ou tecidos da planta hospedeira sem causar dano aparente
e, epifíticas quando crescem e vivem sobre superfícies do vegetal.
Os mecanismos da interação bactéria-planta podem envolver fatores
bióticos, abióticos, fisiológicos e moleculares. Desta forma, os estudos sobre os
endofíticos têm ampliado os conhecimentos sobre o significado deles para as
plantas, como na fixação biológica de nitrogênio (JIMENEZ-SALGADO et al.,
1997; ESTRADA et al., 2002), produção de fitohormônios e antimicrobianos
(FROMMEL et al., 1991; BERG et al., 2005; TSAVKELOVA et al., 2007),
produção de sideróforos (Silva-Stenico et al., 2005), competição por nutrientes
(STURZ et al., 2000), indução de resistência sistemática no hospedeiro (Van
LOON et al., 1998; INIGUEZ et al., 2005) e síntese de metabólitos secundários
(TAN e ZOU, 2001).
A demonstração da presença de populações de endofíticos associadas
aos frutos de café (YAMADA, 1999) e a necessidade de elucidar o papel
funcional dessa microbiota, como produtoras de substâncias precursoras das
características sensoriais da bebida do café, são fatos que justificam o
aprofundamento dos estudos desse sistema biológico.
O objetivo geral do trabalho foi o de estudar a diversidade de bactérias
endofíticas associadas aos frutos em quatro cultivares de café (Coffea
arábica L.) em diferentes altitudes na Zona da Mata Norte, Minas Gerais, Brasil.
2
2. REVISÃO LITERATURA
O cafeeiro é uma Rubiaceae nativa em localidades do Sudoeste da
Etiópia, Sudeste do Sudão e Norte do Quênia, onde a altitude situa-se entre
1.000 e 3.000 m. A família compreende mais de 10.000 espécies agrupadas
em 630 gêneros (AGUIAR, 2001), embora somente a Coffea arabica L. e a
Coffea canephora Pierre ex Froehner têm importância na economia mundial.
Aproximadamente 70 % do café comercializado no mundo provêm dos
cultivares da C. arabica L., reconhecida pela qualidade potencial de sua bebida
(KY et al., 2001).
O café foi introduzido no Brasil por Francisco de Mello Palheta, em 1727,
trazido da Guiana Francesa e inicialmente plantado no Pará. Desse estado foi
para o Rio de Janeiro, São Paulo, sul de Minas Gerais, Paraná, Espírito Santo
e outras partes do país. A riqueza gerada pela cafeicultura é considerada como
a propulsora da urbanização e industrialização do país.
O café é um dos produtos agrícolas de maior importância na economia
mundial, sendo produzido em mais de cinqüenta países, entre os quais cinco
respondem por aproximadamente 56 % da produção mundial: Brasil, Colômbia,
Indonésia, México e Vietnã (GONÇALVES e SILVAROLLA , 2001; REZENDE et
al.; 2002). No Brasil, 82 % da produção originam-se de lavouras formadas com
cultivares da espécie C. arabica e o restante de cultivares de C. canephora
(MELO et al., 1998). Das cultivares de C. arabica destacam-se Mundo Novo, a
Catuaí e a Bourbon, Vermelho ou Amarelo, como de preferência pela
3
produtividade e excelência da qualidade da bebida. Atualmente a produção, de
café concentra-se em Minas Gerais, Espírito Santo, São Paulo, e Paraná, além
de áreas na Bahia e Rondônia (ANDRADE, 1994). A produção no estado de
Minas Gerais destaca-se no cenário brasileiro por representar cerca de 50 %
do total do café produzido, sendo a atividade da cadeia produtiva reconhecida
como de importância social, tanto por ser geradora de empregos e renda como
também por fixar o homem no meio rural (ANDRADE, 1994).
A base genética da maior parte dos cultivares comerciais de C. arabica
tem a origem no Yêmen em duas variedades botânicas distintas, C.arabica var.
arabica (usualmente denominada C. arabica var. typica Cramer) e C. arabica
var. Bourbon (B. Rodr.) Choussy (KRUG et al., 1939). A análise de diversidade
das bases genéticas de typica e Bourbon, avaliada pelo uso de marcadores
moleculares, polimorfismo em tamanho de fragmento amplificado (AFLP) e
seqüências simples repetidas (SSR), confirmam a origem como da Etiópia e a
disseminação a partir do Yêmen, no início do século XVIII (ANTHONY et al.,
2000; MALUF et al., 2005).
A cultivar Bourbon Vermelho foi introduzida no Brasil em 1852,
proveniente da Ilha Reunião, e a Bourbon Amarelo pode ser originada de
Bourbon Vermelho, por mutação, ou surgido em 1930 como produto da
recombinação, de cruzamento natural entre as cultivares Bourbon Vermelho e
Amarelo de Botucatu. A qualidade da bebida do café Bourbon Amarelo é
apreciada pelas suas características de aroma, sabor e acidez (AGUIAR,
2001).
A hibridação realizada em 1949 entre Caturra e Mundo Novo deu origem
às cultivares Catuaí Amarelo e Catuaí Vermelho, atualmente as mais utilizadas
em plantios comerciais no Brasil (MELO et al., 1998). Os dados dos
marcadores AFLP confirmam ser a Catuaí uma cultivar de origem híbrida
(MALUF et al., 2005). O nome Catuaí foi escolhido pelo seu significado em tupiguarani, ou seja, muito bom.
A crescente valorização da qualidade da bebida de C. arabica, traduzida
por características sensoriais de aroma, sabor e acidez, é fator determinante da
expansão da cafeicultura e dos investimentos em técnicas de processamento
pós-colheita no Brasil. O aroma é a característica mais complexa e interessante
para elucidação da origem das substâncias nele envolvidas e, por isso, têm
4
sido alvo de estudos sistemáticos desde o inicio do século. São mais de 800 os
compostos voláteis envolvidos nessa característica, sendo influenciada pela
genética da planta, tipo de solo, localização geográfica, o manejo da cultura,
exposição da lavoura ao sol e os cuidados no processamento pós-colheita
(ILLY e VIANI, 1996; BASTO, 1998; ALVES et al., 1999; ALVES et al., 2000;
FERNANDES et al., 2000; LONGO e SANROMÁN, 2006).
A composição química do grão verde de café é um indicador importante
para se avaliar a qualidade da bebida (MARTIN et al., 1998; KOSHIRO et al.,
2006). Entre os constituintes, a presença de ácidos clorogênicos, cafeína,
trigonelina, aminoácidos, polifenóis, entre outros, são considerados entre os
principais que influenciam a qualidade da bebida. Embora os estudos que se
referem a biossíntese, transporte e acumulação de compostos já tenham
demonstrado que a cafeína e a trigonelina são acumuladas na semente, sendo
a cafeína sintetizada na semente e a trigonelina transportada para a semente
após a síntese no pericárdio, a participação desses compostos na composição
da qualidade da bebida ainda não está suficientemente esclarecida (KOSHIRO
et al., 2006). A importante participação de microrganismos na produção de bioaromas em processos fermentativos tem sido demonstrada (JASSENS et al.,
2001). Nos últimos anos, os recursos analíticos disponíveis para estudos da
ecologia microbiana, acoplados aos fisiológicos e moleculares, ampliam as
possibilidades de avaliação da origem e do dimensionamento da produção de
bio-aroma em café.
Os cafés arábica são considerados como os de melhor qualidade, em
razão da presença dos maiores teores de carboidratos, lipídeos e trigonelina,
em comparação à robusta, considerados como de bebida neutra e com
maiores teores de cafeína e compostos fenólicos (ILLY e VIANI, 1995). A
presença de trigonelina, ácido 3,4-dicaffeoilquínicos e cafeína, constatada em
estudo de qualidade de bebida realizado no Brasil (FARAH et al., 2006), tem
correlação positiva com a qualidade da bebida. Em espécies de C. arabica, os
três compostos, trigonelina, cafeína e o ácido clorogênico, representam 16 %
do total dos compostos, enquanto a sacarose representa 9,2 % (KY et al.,
2001) e seus maiores teores são encontrados nos frutos no estádio
denominado cereja (PIMENTA, 1995). Maiores concentrações de açúcares no
grão cru permitem um aumento na participação destes compostos nas reações
5
do processo de torração. Substâncias voláteis são formadas a partir da
combinação dos açúcares com as proteínas, que são responsáveis, em grande
parte, pelo aroma do café (ILLY e VIANI, 1995). Isso é um indicativo de que a
disponibilidade deste substrato aumenta a produção destes compostos.
Em estudo sobre características químicas de 15 dos principais cultivares
de Coffea arabica, demonstrou-se a existência de diferenças significativas para
os teores de sacarose, proteína, ácido clorogênico, trigonelina e cafeína
(AGUIAR, 2001). Em publicação recente, detectou-se que os maiores valores
de açúcares presentes nos grãos crus corresponderam aos de Catuaí, Amarelo
e Vermelho, Bourbon Amarelo, entre outros (MENDONÇA et al., 2007). A
Catuaí, Amarelo e Vermelho, em trabalho anterior sobre avaliação da qualidade
de grãos crus e torrados de cultivares de C. arabica, destacou-se com valores
superiores de açúcares totais, em relação aos outros cultivares avaliados
(LOPES, 2000).
O sabor, aroma e acidez da bebida do café são características altamente
complexas, resultado da presença combinada de constituintes voláteis e não
voláteis,
entre
eles,
ácidos,
aldeídos,
cetonas,
açúcares,
proteínas,
aminoácidos, ácidos graxos e compostos fenólicos, além dos gerados pela
ação de enzimas em alguns destes constituintes (SARRAZIN et al., 2000).
Desses dois atributos, o aroma é o mais complexo por envolver mais de 800
compostos voláteis e um amplo arranjo de grupos funcionais (BASTOS et al.,
1998; ALVES et al., 1999; ALVES et al., 2000; SARRAZIN et al., 2000). A
característica de sabor da infusão do café torrado moído, preparada segundo
procedimento padrão e avaliada em teste de degustação, é o determinante da
classificação utilizada no Brasil (Tabela 1).
O maior conteúdo de compostos fenólicos no café de algumas cultivares
resulta em característica de adstringência. Um grande número de compostos
fenólicos tem sido identificado em café torrado e alguns deles são originados
do ácido clorogênico (MENEZES, 1994). O ácido clorogênico é hidrolisado a
ácidos caféico e quínico, cujos sabores são mais amargos e adstringentes que
outros ácidos, pois seu grupo cíclico é um fenol. Estes compostos,
principalmente os ácidos caféicos e clorogênicos, exercem ação protetora,
antioxidantes dos aldeídos (COSTA e CHAGAS, 1997). O ácido clorogênico é o
principal composto fenólico e representa 70 % dos fenóis encontrados em
6
Tabela 1 – Classificação oficial da bebida do café no Brasil
Classificação
Características
Estritamente mole
Sabor muito macio, ligeiramente doce, baixa acidez.
Apenas mole
Sabor macio, com ligeira adstringência
Mole
Sabor macio, ligeiramente doce
Duro
Sabor adstringente, gosto áspero, carência de doçura
Riado
Leve gosto de acido fenólico e iodofórmio
Rio
Gosto fortemente desagradável de ácido fenólico e
iodofórmio
Fonte: Franca et al. (2005) e Farah et al. (2006).
C. arabica (PEREIRA et al., 2003). Na torrefação, os compostos fenólicos são
gradualmente decompostos e resultam em voláteis do aroma, materiais
poliméricos (melanoidinas) e liberação de CO2.
A
demonstração
de
que
genótipo
e
ambiente
influenciam
significativamente a qualidade da bebida do café é inferida a partir dos
resultados de cultivo de cultivares de Catuaí e Bourbon em áreas de maior
altitude e sob sombreamento, uma vez que estas condições retardam a
maturação e favorecem o aumento da acidez e dos teores de açúcares nos
frutos (GUYOT et al, 1996; BUENAVENTURA e CASTAÑO, 2002; SYLVIA et
al., 2004). Os valores médios de cafeína, 0,92 % em Bourbon Vermelho e
1,53 % em Bourbon Amarelo, diferiram dos de Catuaí, 1,05 % no Vermelho e
1,02 % no Catuaí Amarelo (GUYOT et al., 1996).
A atividade de enzimas nos grãos de café pode ser usada para interferir
a qualidade da bebida. Pectinases, celulases e xilanase favorecem a
degradação de compostos importantes no processo fermentativo do café
(JONES e JONES, 1984). A maior atividade de polifenoloxidases (PFO) é
observada em cafés de melhor qualidade (AMORIM e SILVA, 1968), o que os
autores interpretaram como sendo em razão da menor ocorrência de
degradações das paredes celulares nestes cafés. A seqüência de eventos que
conduzem à baixa atividade da PFO inclui os danos na membrana, ativação
enzimática, oxidação de ácidos clorogênicos a quinonas e inibição enzimática
pela presença de quinonas (CARVALHO et al., 1994). As PFO e peroxidases
7
(PER) têm sido utilizadas no Brasil como indicadoras de qualidade da bebida
de café (AMORIM e SILVA, 1968; MAZZAFERA et al., 2002). Os autores
atribuem a deterioração da qualidade a esgotamento do ácido clorogênico, o
principal composto fenólico em semente de café. Contudo, esse assunto
continua sendo objeto de estudos (MAZZAFERA et al., 2002). A atividade de
PFO (AMORIM e SILVA, 1968; CARVALHO et al., 1994), o índice de coloração
dos grãos e a acidez titulável total têm sido propostos como índices objetivos
para se classificar os cafés quanto à qualidade da bebida superior. De acordo
com estes autores, a atividade das polifenoloxidases e o índice de coloração
aumentam, enquanto a acidez decresce, quando há melhoria da qualidade do
café.
A determinação da atividade de PFO e a construção de uma tabela de
classificação de qualidade da bebida do café com base nesses valores
concorreram para uma avaliação mais objetiva da qualidade da bebida,
complementando a “prova de xícara”. Cafés extrafinos (bebida estritamente
mole) atividade de PFO superior a 67,66 U.min-1.g-1 de amostra; café fino
(bebida mole e “apenas mole”) atividade de PFO de 62,99 a 67,66 U.min-1.g-1
de amostra; café aceitável (“bebida dura”) atividade PFO de 55,99 a
62,99 U.min -1 .g-1 de amostra e, não aceitável (“bebida riada” e “rio”), atividade
de PFO inferior a 55,99 U.min-1.g-1 de amostra (CARVALHO et al., 1994).
O estabelecimento de método objetivo para ser usado na classificação
da qualidade da bebida em substituição à “prova de xícara”, requer
conhecimentos mais específicos sobre a origem dos precursores daqueles
compostos que compõem o aroma, sabor e acidez, alguns provavelmente
originados por síntese microbiana (LONGO e SANROMÁ, 2006).
A mucilagem dos frutos de café está situada entre a polpa e o
pergaminho e representa 5 % do peso seco. A mucilagem é um sistema de
hidro-gel, composto de água, ácido péctico, pequenas quantidades de
arabinose, xilose e ramnose, açúcares redutores e ácidos orgânicos. Nela são
também
encontradas
enzimas
hidrolíticas
e
oxidativas,
como
as
pectinesterases, galacturonases, peroxidases e polifenoloxidases (WONG,
1995, LEITE, 1998). Na mucilagem dos frutos os principais constituintes são:
substâncias pécticas cerca de 30 %, 8 % de celulose e 18 % de substâncias
não-celulósicas (AVALLONE et al., 2000).
8
Os principais componentes da polpa e casca são carboidratos,
proteínas, fibras, ácidos, cafeínas, taninos, polifenóis e pectinas, sendo as
diferenças nas percentagens de cada um desses compostos dependentes da
cultivar, das condições de cultivo, tipo de solo, entre outras (PANDEY et al.,
2000).
Historicamente, desde a constatação da presença de micélio de
Fusarium em uma amostra de café classificado como ardido (KRUG, 1940a;
1941), a deterioração da qualidade do café tem sido relacionada com a
presença de microrganismos, em especial a presença de fungos.
O gosto de cebola na bebida de café não depende das condições de
cultivo, altitude, clima ou colheita, sendo em grande parte o resultado de
processo de fermentação (SOUZA et al., 1997). O ácido propiônico, produzido
durante a fermentação, é o responsável pelo indesejável gosto de cebola do
café após o preparo da infusão, sendo a quantidade desse ácido dependente
dos microrganismos presentes (MÔNACO, 1961). Também a produção de 2.46 tricloroanizole (TCA) está diretamente relacionada com a má qualidade da
bebida (PIMENTA, 2003). Outros estudos destacam a produção de compostos
toxigênicos produzidos por fungos, como aflatoxina e ocratoxina, que podem
contaminar o café (TANIWAKI et al., 2003; BATISTA, et al., 2003; MASOUD e
KALTOFT, 2006; VEGAS et al., 2006).
A abundância de microrganismos cultiváveis em frutos de café no
estádio cereja em fazendas do Sul de Minas situa-se em torno de 1,6 x 107 UFC
por fruto, sendo o grupo das bactérias o mais abundante, seguido por fungos
filamentosos e finalmente por leveduras (SILVA et al., 2001). A diversidade
nesse estudo é demonstrada em um universo de 754 isolados, dos quais 626
foram identificados como pertencentes a 44 gêneros e 64 espécies distintas,
incluindo gêneros de bactérias gram-positivas, gram-negativas, leveduras e
fungos filamentosos.
As primeiras evidências de que os micróbios endofíticos associam-se às
plantas, originam-se de observações em tecidos e folha fossilizados, o que
suporta a inferência de que a associação planta-endófito poderá ter ocorrido
junto com o aparecimento das primeiras plantas na terra (STROBEL, 2003,
HUA WEI et al., 2006). Como resultado dessa longa associação é possível que
alguns destes microrganismos endofíticos tenham adquirido sistema genético
9
para transferir informação da planta hospedeira a eles, ou vice-versa. Esse
seria um mecanismo rápido e seguro de adaptação a diversos ambientes e à
planta hospedeira, a exemplo de rotas bioquímicas que resultam em produção
de compostos químicos e metabólitos secundários nas plantas associadas a
endofíticos (STIERLE, et al., 1993; GERMAINE, et al., 2004).
O conceito de que endofíticos são microrganismos estabelecidos nos
tecidos internos da epiderme (KLOEPPER et al., 1992) é atualmente expresso
como a associação biológica em que os microrganismos colonizam tecidos
internos vivos das plantas, sem causar nenhum efeito negativo imediato ou
dano aparente à planta (BACON e WHITE, 2000).
As bactérias endofíticas são reconhecidas como as isoladas de tecidos
de planta desinfetados superficialmente ou, de seu interior, e que não causam
sintomas visíveis de doença na planta (HALLMANN et al., 1997; SAKIYAMA et
al., 2001). Estas bactérias são encontradas principalmente nos espaços
intercelulares dos tecidos e, com menor freqüência, intracelularmente e em
tecidos vasculares, sem causar sintomas de doenças (HUREK et al., 1994; Bell
et al., 1995). Bactérias endofíticas podem se tornar patogênicas sob certas
condições, inclusive em função do genótipo da planta (MISAGHI e
DONNDELINGER, 1990.). Estudos também mostram que as bactérias
endofíticas interagem com patôgenos (HUANG, 1991; BACON e HILTON,
1997; SESSITCH et al., 2002), promovem o crescimento em plantas
(FROMMEL et al., 1991), aumentam a resistência a doenças (CHANWAY
1998), contribuem para a fixação biológica do nitrogênio (JIMENEZ-SALGADO
et al. 1997; ESTRADA et al., 2002) e para a proteção contra patôgenos mediante
a produção e síntese de metabólicos secundários (BROOKS et al., 1995; BERG et
al., 2005; TAN e ZOU, 2001; LONG et al., 2003; SHIOMI et al., 2006).
Mais recentemente, isolados de bactérias endofíticas de Populus foram
caracterizadas quanto ao potencial para uso em processo de fitorremediação
(MOORE et al., 2006), a exemplo do uso da endofítica Burkholderia cepacia G4
que aumenta a tolerância das plantas ao tolueno (van der LELIE, 2005) e da
Methylobacterium populum sp nov. BJ001 como participante da biodegradação
de compostos, tais como: 2,4,6-trinitrotolueno (TNT), hexahydro-1,3,5-trinitro1,3,5-triazina (HMX) e octahidro-1,3,5-7-tetranitro-1,3,5-7-tetrazocine (RDX)
(VAN et al., 2004).
10
As discussões sobre a origem das bactérias endofíticas e a forma de
penetração, bem como sobre o mecanismo de colonização, consideram
hipóteses de que se originam de sementes, da rizosfera, do filoplano ou de
material utilizado para a propagação vegetativa (REINHOLD-HUREK e
HUREK, 1998). A penetração na planta pode ocorrer pelos estômatos,
ferimentos, áreas de emergência de raízes laterais, sendo que as endofíticas
podem produzir enzimas hidrolíticas capazes de degradar a parede celular dos
vegetais (McCULLY, 2002). Esta hipótese foi derivada da análise de dados que
demonstram a presença de enzimas celulíticas e pectinolíticas produzidas por
bactérias endofíticas, a exemplo de Azoarcus sp. (HUREK et al., 1994),
Azospirillum irakense (KHAMMAS
e KAISER, 1991) e Pseudomonas
fluorescens (QUADT-HALLMANN et al., 1997). A colonização e a distribuição
de bactérias endofíticas na planta podem ser influenciadas pela interação com
outros organismos associados à planta, a exemplo de nematóides parasitas, ou
por características próprias de seu hospedeiro (HIRANO e HUPPER, 2002).
A planta é um habitat dinâmico em que diversos fatores podem
influenciar a estrutura e a composição da comunidade bacteriana. Em culturas
in vitro de tomateiros, a colonização das bactérias endofíticas varia com as
alterações na densidade de inóculo, temperatura de cultivo e genótipo de
hospedeiro (PILLAY e NORWAK, 1997). As variações sazonais, o tipo de
tecido do vegetal (MOCALI et al., 2003), espécie e cultivares de hospedeiro e
interação com outros microrganismos benéficos (ARAÚJO et al., 2001) também
podem influenciar no padrão de colonização.
A densidade populacional de bactérias endofíticas é menor que a de
patogênicas e, pelo menos algumas delas, não induzem reposta de
hipersensibilidade e por isso não são reconhecidas pela planta (HALLMMAN et
al., 1997). Evolutivamente, os endofíticos aparecem como intermediários entre
bactérias saprófitas e as patogênicas de plantas. De modo geral, a microbiota
endofítica é de estrutura dinâmica e influenciada pelos fatores bióticos e
abióticos que também afetam o solo e a planta hospedeira (HALLMMAN et al.,
1997).
As bactérias endofíticas têm sido isoladas de plantas monocotiledôneas
e dicotiledôneas comerciais, em espécies de árvores florestais (Brooks et al.,
1994), frutíferas (WHITESIDES e SPOTTS, 1991; LACAVA et al., 2006),
11
plantas herbáceas como cana-de-açúcar (JACOBS et al., 1985), milho
(FISCHER et al., 1992) e orquídeas (TSAVKELOVA et al., 2007).
O estudo da ocorrência natural de bactérias diazotróficas produtoras de
ácido acético na rizosfera e nos tecidos de diferentes cultivares de plantas de
café evidenciou, por testes microbiológicos, bioquímicos e genéticos, que a
maioria dos isolados dessas bactérias eram de Acetobacter diazotrophicus,
sendo fortes as evidências de que alguns representavam novas espécies de
Acetobacter capazes de fixar biologicamente o nitrogênio atmosférico
(JIMENEZ - SALGADO et al., 1997).
Em frutos de café sadios, o isolamento de Klebsiella oxytoca endofítica
ensejou o estudo das características de seu crescimento em meio mínimo,
adicionado de pectina cítrica e a demonstração de que ela produz e conserva a
pectato-liase
intracelularmente
(GENARI,
1999).
As
características
do
crescimento e a síntese induzida de pectinase foram interpretadas como
indicação de que K. oxytoca potencialmente contribui para o processo
fermentativo em frutos de café. Embora produtora de pectato-liase, a endofítica
não causa dano à planta, deve possuir mecanismo regulatório para controlar a
síntese e a atividade da enzima. A demonstração de bactérias e leveduras em
sementes e polpa dos frutos de café, com a utilização de técnicas de
microscopia e imunológicas evidenciaram o predomínio de leveduras na porção
mais externa da polpa do fruto e a presença de bactérias nas sementes
(YAMADA, 1991)
Paenibacillus amylolyticus é outra espécie produtora de pectina-liase
também isolada do interior de frutos maduros de café (C. arabica), proveniente
da Zona da Mata do Estado de Minas Gerais (DE PAULA, 2001). Essa enzima
se acumula no meio de cultura após 24 horas de crescimento da bactéria em
meio mineral suplementado com extrato de levedura e pectina como única
fonte de carbono. Pectina-liases são mais comumente encontradas em fungos
e com menos freqüência em bactérias, portanto, o isolado da endofítica P.
amylolyticus pode se constituir em modelo para estudo da regulação metabólica
dessas enzimas (SAKIYAMA et al., 2001) e dos possíveis precursores de
compostos que influenciam a qualidade da bebida superior do café.
A colonização de explantes de C. arabica por bactérias endofíticas
isoladas
de
frutos
maduros,
comprovada
12
in
situ
pela
técnica
de
imunofluorescência
e
posterior
recuperação
das
bactérias
endofíticas
inoculadas, possibilitou a demonstração de que alguns isolados dessas
bactérias promoviam o crescimento em explantes de cultivares de C. arabica e
C. canephora (SAKIYAMA, 2001).
Espécies de bactérias endofíticas têm sido isoladas na Colômbia,
México e Hawaii, em folhas, ramos, raízes e partes do fruto de cafeeiros, sendo
a maior quantidade isolada de sementes, com predomínio dos gêneros:
Bacillus, Bulkholderia, Clavibacter, Pseudomonas, Escherichia, Micrococcus,
Pantoea, Serratia e Stenotrophomonas (VEGA et al., 2005).
Recentemente, foram isoladas bactérias endofíticas de folhas e ramos
de espécies de C. arabica L. e de C. robusta L. (SHIOMI et al., 2006). A
identificação dessas bactérias mostrou predominância das espécies de Bacillus
lentimorbus Dutky e Bacillus cereus Frank e Frank, as quais demonstraram
eficácia na inibição da germinação de urediniosporos de Hemileia vastatrix
Berk. e Br. raça 2, fungo causador da ferrugem do cafeeiro. A inibição
correspondeu a mais de 50 % da obtida no tratamento testemunha padrão
(fungicidas), uma indicação do potencial biotecnológico dessas bactérias para o
controle da ferrugem.
Os trabalhos que demonstram a presença de populações de endofíticos
associadas aos frutos de café referem-se apenas a microrganismos cultiváveis.
Naturalmente, a avaliação também dos não cultiváveis nesse sistema, fruto de
café-microbiota endofítica associada, é requisito para o estudo de diversidade
dos endofíticos e da contribuição funcional dessa microbiota, como produtora
de
substâncias
precursoras
das
que
também
contribuem
para
as
características sensoriais da bebida do café. Estes argumentos reforçam e
justificam a necessidade de estudos aprofundados sobre esse sistema biológico.
A diversidade de bactérias endofíticas representa apenas uma pequena
fração da diversidade total existente na natureza. Informações derivadas de
estudos comparativos apontam para o fato de que apenas uma pequena fração
dos microrganismos na natureza (entre 0,1 % a 10 %, dependendo do habitat)
é cultivável mediante o emprego de métodos microbiológicos convencionais
(RANJARD et al., 2000; GREEN e BOHANNAN, 2006).
Até recentemente, a maioria dos métodos em estudo da diversidade
microbiana baseava-se no crescimento em meio de cultura. Esses métodos
13
geram informações sobre grupos de microrganismos viáveis e cultiváveis
dentro da comunidade. Varias limitações estão associadas à cultura de
microrganismos que poderão influir na verdadeira diversidade microbiana na
comunidade, entre as quais a dificuldade em desalojar bactérias unidas a
partículas de solo e biofilme, seleção do meio de crescimento, condições de
crescimento, tais como: temperatura, luz, pH, interações negativas entre as
colônias de microrganismos e a presença de microrganismos com taxa de
crescimento rápido (KIRT et al., 2004).
Outro método para o estudo da diversidade microbiana dependente de
cultivo inclui o perfil fisiológico das comunidades microbianas, o qual é
determinado pela capacidade dessas comunidades em utilizarem diferentes
fontes de carbono in vitro. Essa metodologia foi desenvolvida inicialmente
utilizando microplacas BiologTM contendo 95 fontes diferentes de carbono, sal
de tetrazólio e um controle negativo. Atualmente, é comercializada a Ecoplate
BiologTM contendo 31 fonte de carbono diferentes das normalmente
encontradas no ambiente, um controle negativo e três repetições. Métodos que
determinam o perfil fisiológico têm sido utilizados para avaliar a diversidade
metabólica potencial de comunidades microbianas em diferentes ambientes.
Eles são seletivos para organismos cultiváveis que crescem em condições de
laboratório e favorecem os microorganismos de rápido crescimento (KIRK et
al., 2004).
A análise da diversidade e da estrutura de comunidades pode também
incluir a determinação de perfís da composição de lipídios extraídos de
amostras ambientais. A análise de ésteres metílicos de ácidos graxos (FAME)
consiste na esterificação dos lipídios extraídos da amostra, seguida da
separação e identificação por cromatografia gasosa. Os FAMEs são
identificados pelo tempo de retenção na coluna, comparativamente a tempo de
retenção dos padrões submetidos ao mesmo processo. A quantificação de
cada composto é feita com base na determinação das áreas dos picos
correspondente no cromatograma (TÓTOLA e CHAER, 2002, KIRK et al.,
2004). O sistema FAME/MIDI foi utilizado na identificação de 87 isolados de
bactérias endofíticas cultiváveis dos diferentes tecidos (folha, ramos, talos e
raízes) e frutos (casca, polpa, pedúnculo e sementes) de C. arabica, e
discriminou Bacillus, Burkholderia, Clavibacter, Curtobacterium, Escherichia,
14
Micrococcus, Pantoea, Pseudomonas, Serratia e Stenotrophomonas (VEGA et
al., 2005).
Os métodos mais recentes exploram características do rDNA que, juntos
com os da bioinformática e os de análises estatísticas, são ferramentas
valiosas para estudos de caracterização e estrutura das comunidades
microbianas em diferentes ambientes (NOCKER et al., 2007). Entre as técnicas
moleculares mais comumente empregadas encontram-se, entre outros:
clonagem e sequenciamento de rDNA 16S (ZINNIEL et al., 2002); hibridização
DNA-DNA (JIMENEZ-SALGADO et al., 1997); análise de restrição de DNA
ribossomal amplificado-ARDRA (MOCALI et al., 2003); análise de espaçador
intergênico ribossomal-RISA; eletroforese em gel de gradiente desnaturante
(DGGE) (GARBEVAet al., 2001, SESSITSCH et al., 2002, LAÇAVA et al., 2005).
Os benefícios que podem advir do melhor conhecimento da diversidade
de bactérias endofíticas associadas aos frutos de café incluem a compreensão
das funções exercidas por estes microorganismos e dos possíveis mecanismos
envolvidos na interação (KUKLINSKY-SOBRAL, 2003). A técnica de DGGE
tem sido aplicada para a análise de comunidades de bactérias em ambientes
complexos, tais como os de solo e rizosfera, na detecção de variações na
comunidade em presença de agroquímicos, estados nutricionais e fisiológicos
de plantas hospedeiras (YANG e CROWLEY, 2000) e no estudo de
comunidades de bactérias endofíticas associadas a plantas (GARBEVA et al.,
2001; SESSITSCH et al., 2002; LAÇAVA et al., 2005).
A clonagem e seqüenciamento de rDNA 16S (HEAD et al., 1998) é
considerado método apropriado para exploração da diversidade microbiana em
ambientes naturais. Esta técnica oferece alta resolução filogenética, permite a
geração de dados para a identificação de espécies ou a determinação de
similaridade com espécies conhecidas, mediante o uso de seqüências
depositadas em bancos de dados acreditados (NOCKER et al., 2007).
O seqüenciamento direto de amplicons é uma técnica cada vez mais
utilizada por dispensar a necessidade de clonagem e construção do banco
genômico, sendo as seqüências de DNA obtidas diretamente a partir de
pequenas quantidades de amostras ambientais. Bactérias endofíticas isoladas
de tecidos aéreos de quatro espécies de cultura agrícola e 27 espécies de
plantas de planície foram identificadas por meio de sequenciamento direto, e as
15
comparações com as seqüências registradas corresponderam a: Bacillus
subtilis, Corynebacterium glutamicum, Microbacterium smegmatis, Cellumonas
flavigena, Curtobacterium luteum e C. citreum, Clavibacter michiganensis e
varias espécies de Microbacterium (ZINNIEL et al., 2002). Basicamente, a
técnica consiste na extração de DNA, amplificação de rDNA 16S e eliminação
dos resíduos de primers e dNTPs por meio de técnicas de precipitação,
cromatografia de troca iônica, filtração em gel com o emprego de Kits e,
finalmente, o sequenciamento (RAO, 2007).
As bactérias estão indissoluvelmente associadas às plantas como
patogênicas, epifíticas, endofíticas, simbiônticas e antagonistas. Muitas formam
associações
intimas
com
as
plantas
e
formam
grupos
diversos
filogeneticamente, representados por espécies pertencentes aos principais
táxons. As bactérias associadas às plantas tipicamente intercambiam sinais
com seu hospedeiro e possuem diversos mecanismos para adaptação e
colonização (PRESTON et al., 1998). Aspectos importantes da diversidade de
bactérias no ecossistema são os diferentes processos que realizam, a
complexidade da interação e o número de níveis tróficos que as compõem. Nos
últimos anos, têm despertado interesse cada vez maior os aspectos relativos a
composição, estrutura e função de comunidades bacterianas e, em particular
nas unidades fundamentais das quais são compostas (WARD, 2006). Muitos
dos filos descritos para bactérias são conhecidos a partir de estudos culturais
em nível de laboratório, entretanto um número diverso deles são identificados
por meio de sequenciamento de rDNA 16S de bactérias coletadas de habitat
naturais. Até hoje encontram-se descritos 24 filos de bactérias, os quais exibem
enorme diversidade em têrmos de morfologia, fisiologia e história evolutiva
(TORSIVIK e OVREAS, 2002; GORRITY et al., 2004).
O
domínio Bactéria
compreende
uma variedade de indivíduos
patogênicos, assim como milhares de espécies não-patogênicas. Constitui um
grupo de microrganismos de ocorrência cosmopolita nos mais diversos habitat,
e apresenta enorme diversidade de vias metabólicas, reunindo organismos
especializados na utilização de compostos orgânicos e inorgânicos.
As bactérias gram-positivas enquadram-se em dois principais filos:
aquelas contendo baixo teor de GC (Firmicutes) e as de alto conteúdo de GC
(Actinobacteria). Tais termos referem-se à proporção de bases GC no DNA,
16
menor ou maior do que 50 %, respectivamente. O filo Firmicutes é composto
basicamente de 5 ordens, 29 famílias e 139 gêneros (Tabela 2), os quais
compreendem organismos heterogêneos, com atividade metabólica que inclui
vias homofermentativa, heterofermentativa e respiração, sendo alguns deles
microaerófilos, anaeróbios facultativos e anaeróbios estrito. Muitos destes
membros apresentam importância medicinal e industrial (GORRITY et al.,
2004, DWORKIN et al., 2006c). O filo Actinobacteria contem 4 ordens, 37
famílias e 137 gêneros (Tabela 2), compreendendo organismos microaerófilos,
anaeróbios obrigatórios e formadores de acido propiônico. Neste filo estão
indivíduos presentes em ambientes como água e solo, com importância para
medicina, veterinária, agrícultura e indústria (GORRITY et al., 2004; DWORKIN
et al., 2006c).
O último, filo Proteobacteria, contém indivíduos gram-negativos. Esse
corresponde ao maior grupo de bactérias, exibindo também uma maior
diversidade filogenética (Tabela 2). Proteobacteria contêm cinco classes, sendo
cada uma denominado pelas letras gregas, alfa, beta, gama, delta e epsilon (α,
β, γ, δ, ε
). A classe αestá representada por 140 gêneros e 425 espécies; β
possui 76 gêneros e 225 espécies; γcontém 181 gêneros e 755 espécies; δ57
gêneros e 165 espécies e, εpossui 6 gêneros e 49 espécies. Do ponto de vista
fisiológico, as proteobacterias podem ser fototróficas, quimiolitotróficas ou
quimiorganotróficas, possuindo grande diversidade de mecanismos geradores
de energia. Os indivíduos dentro deste filo apresentam ampla diversidade
metabólica e também são de grande importância ecológica em medicina,
veterinária, agricultura e indústria (GORRITY et al., 2004; DWORKIN et al.,
2006a).
As ferramentas para análises moleculares atualmente disponíveis
descortinam perspectivas novas para estudo em que se objetiva elucidar a
participação da microbiota endofítica na produção de moléculas precursoras do
conjunto de compostos que compõem o sabor, aroma e acidez da bebida do
café. A procura de genes estruturais ou reguladores do metabolismo de
substratos, ou precursores de produtos finais, compartilhados pelos simbiontes
constitui-se em um dos desafios atuais da pesquisa (GEROMEL et al., 2006;
LEROY et al., 2006).
17
Tabela 2 – Domínio Bactéria: filos, classes, ordens, famílias e números de
gêneros
Domínio
Número
Classe
Ordem
Família
Gênero
Bactéria
I
II
Arquificae
Themotogae
Filo
1
1
1
2
1
2
4
6
III
IV
Thermodesulfobacteria
Deinococcus-Thermus
1
1
1
1
1
1
2
1
V
VI
Chrysiogenetes
Chloroflexi
1
2
1
2
1
2
1
5
VII
VIII
Themomicrobia
Nitrospira
1
1
1
1
1
1
1
4
IX
X
Deferribacteres
Cyanobacteria
1
1
1
5
1
7
4
62
XI
XII
Chlorobi
Proteobacteria
2
5
2
29
2
48
9
515
XIII
XIV
Firmicutes
Actinobacteria
3
1
5
4
29
37
139
127
XV
XVI
Plantomycestes
Chlamydiae
1
1
2
1
2
1
5
4
XVII
XVIII
Spirochaetes
Fibrobacteria
1
1
1
1
3
1
13
1
XIX
XX
Acidobacteria
Bacteroidetes
1
3
1
1
1
4
2
20
XXI
XXII
Fusobacteria1
Verrucomicrobia
1
1
1
1
2
1
6
2
XXIII
XXIV
Dictyoglomi
Gemmatimonadetes
1
1
1
1
1
1
2
1
Fonte: Gorrity et al. (2004).
As bactérias endofíticas são também consideradas atualmente como
modelo de grande utilidade para o estudo de expressão gênica em seu nicho
natural (MARON et al., 2006). Contudo, questões básicas sobre a diversidade
microbiana existente em frutos de café, a estrutura dessa comunidade, a
similaridade do microbioma dos cafeeiros de espécies e cultivares distintas em
ambientes geograficamente definidos, devem ser objetos da pesquisa moderna
em qualidade da bebida superior do café.
18
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Área de estudo
A área de estudo está localizada no município de Araponga, cidade da
Zona da Mata Norte do estado de Minas Gerais, Brasil, em Marca Geográfica
compreendida entre as coordenadas 42°36’35” W a 42°22’48” W de longitude,
e 20°34’12” S a 20°46’48” S de latitude, que denomina o “Café das Montanhas
de Araponga”, segundo Portaria no 773, de 12 de maio de 2006 do Instituto
Mineiro de Agropecuária. A segunda área está localizada na Universidade
Federal de Viçosa (UFV) no município de Viçosa, Minas Gerais, Brasil,
compreendida entre as coordenadas 20°44’3,48”S a 42°50’57,4” W (Tabela 3).
3.2. Amostragem
Amostras de frutos sadios no estádio cereja da safra 2007 foram
coletadas de cultivares Catuaí Vermelho, Catuaí Amarelo, Bourbon Amarelo e
Bourbon Vermelho, em lavouras sombreadas com face voltada para o Norte no
Município de Araponga, e em lavoura sem sombreamento localizada no Campo
Experimental da UFV (Tabela 3).
19
Tabela 3 – Descrição das áreas de coleta
Cultivar
Localidade
S
W
Altitude
(m)
Face de
Exposição
AnoPadrão
CA
Campo Experimental DFT,
Vale/Aeroporto
20°44’3,38’’
42°50’57,2’’
CV
Campo Experimental DFT,
Vale/Aeroporto
20º44`3,48”
42º50`57,2”
676
W
1980
BA
Campo Experimental DFT,
Vale/Aeroporto
20º44`29,5”
42º50`47,4”
687
W
1989
BV
Campo Experimental DFT,
Vale/Aeroporto
20º44`29,5”
42º50`47,4”
687
W
1989
CA
Fazenda Itatiaia, Araponga,
Minas Gerais, Brasil
20º40`32,4”
42º34`13,6”
956
E
2004
CV
Fazenda Itatiaia, Araponga,
Minas Gerais, Brasil
20º40`32,4”
42º34`13,6”
956
E
2004
CA
Fazenda Serra do Boné, Minas
Gerais, Brasil
20º39`16,3”
42º27`32,0”
1013
SE
1996
CV
Fazenda Serra do Boné, Minas
Gerais, Brasil
20º39`16,3”
42º27`32,0”
1013
SE
1996
BV
Fazenda Santo Antônio, Minas
Gerais, Brasil
20º39´57,9”
42º30´45,4”
1062
N
1979
BA
Fazenda Santo Antônio, Minas
Gerais, Brasil
20º39´55,2”
42º30´44,2”
1067
N
1979
BV
Fazenda Santo Antônio, Minas
Gerais, Brasil
20º39´55,2”
42º30´44,2”
1067
N
1979
BA
Fazenda Santo Antônio, Minas
Gerais, Brasil
20º39´47,6”
42º27´28”
1101
N
1979
CA
Fazenda Serra do Boné, Minas
Gerais, Brasil
20°39’48,2’’
42°27’27,6’’
1187
SE
1996
CA
Fazenda Serra do Boné, Minas
Gerais, Brasil
20°39’48,2’’
42°27’27,6’’
1187
SE
1996
676
W
1980
A amostragem correspondeu à coleta individual de frutos sadios, com
pedúnculo e no estádio cereja, do terço médio de cafeeiros típicos da cultivar,
escolhidos durante o caminhamento pela lavoura, com registro das
coordenadas geográficas e altitude em aparelho de GPS, Garmin® modelo
Vista C. A amostra coletada foi de, aproximadamente, dois quilogramas de
fruto por cultivar em cada fazenda. As amostras foram colocadas em isopor
contendo gelo e transportadas para o Laboratório de Ecologia Microbiana
(LEM) do Departamento de Microbiologia da Universidade Federal de Viçosa
(DMB-UFV), no Instituto de Biotecnologia Aplicada à Agropecuária (BIOAGRO/
UFV). No LEM foram divididas em frações de 200 g e imediatamente
empacotadas a vácuo, sendo conservadas a -20 ºC para as análises de
bactérias totais e das endofíticas cultiváveis e não-cultiváveis.
20
3.3. Processamento das amostras
Dez frutos sadios e com pedúnculo, de cada uma das amostras, foram
individualmente colocados em 10 frascos erlenmeyer de 50 mL para a
desinfestação superficial por lavagem em água destilada e detergente neutro,
por 1 minuto, seguida de quatro enxágües em água destilada esterilizada. A
seguir, foram transferidos para novos frascos contendo água esterilizada, em
câmara de fluxo laminar VECO Plus Class III Tipo B III FL9210, para os
procedimentos de isolamento de bactérias totais e das endofíticas (SAKIYAMA
et al., 2001).
3.4. Isolamento e quantificação de bactérias totais e endofítica
A densidade de bactérias totais por fruto, em UFC.fruto-1, foi estimada
por contagem direta de colônias em placas. Durante a contagem foram
observadas e selecionadas as colônias que se distinguiam quanto à forma,
aspecto da superfície, cor e tamanho. Os morfotipos selecionados foram
purificados e mantidos em R2A (REASONER e GELRDREICH, 1985) para
análises posteriores. As culturas de bactérias isoladas foram catalogadas e
conservadas a -80 ºC em caldo R2A contendo 30 % de glicerol.
Para o isolamento de bactérias endofíticas, cada fruto foi submetido a
processo de esterilização superficial (SAKIYAMA et al., 2001). O processo
consistiu das seguintes etapas: duas lavagens do fruto em água destilada
esterilizada, seguida de agitação por 15 min em solução tampão fosfato de
potássio 0,05 mol L-1, pH 7,0; imersão por 1 min em álcool 70 %; agitação por
5 min em solução de hipoclorito de sódio 5 % e Tween 80 %; nova imersão por
1 min em álcool 70 % seguida de agitação por 15 min em solução tampão
fosfato de potássio 0,05 mol L-1, pH 7,0 e, finalmente, a lavagem por quatro
vezes em água destilada esterilizada. O processo foi repetido por duas vezes.
Para confirmar a esterilização da superfície do fruto, alíquota da água
destilada esterilizada da última lavagem foi espalhada em placa contendo o
meio de cultura R2A e incubada a 28 ºC por 72 horas. Em seguida, o fruto foi
transferido para tubo contendo caldo R2A e também incubado a 28 ºC por até
72 horas, para a certificação da inexistência de microrganismos na superfície
do fruto a ser utilizado para o isolamento de bactérias endofíticas cultiváveis.
21
Para quantificar o total de bactérias, epifíticas e endofíticas, cada fruto
desinfestado superficialmente foi colocado em tubo contendo 10 mL de solução
estéril de tampão fosfato de potássio 0,05 mM L-1, pH 7,0 e triturado em
homogeneizador do tipo Polytron™. A suspensão obtida foi filtrada através de
malha de gaze e o filtrado recolhido em tubo de ensaio estéril, seguindo-se o
preparo de diluições de 10-1 até 10-10 em solução tampão de fosfato de
potássio, em triplicata, ou seja, três replicas por amostra e por diluição.
Alíquotas de 100 μL foram transferidas para meio sólido R2A e espalhadas
com o uso de espátula de Drigalsky, seguindo-se a incubação das placas a
28 ºC por 72 horas (REASONER e GELRDREICH, 1985).
3.5. Identificação dos isolados de bactérias endofíticas
Os isolados de bactérias endofíticas foram agrupados por suas
características morfológicas, selecionando-se um isolado como o representativo
do grupo a ser submetido a processo de identificação por meio da análise de
ésteres metílicos de ácidos graxos totais das células e de análise das
seqüências parciais de rDNA 16S.
3.5.1. Identificação FAME/MIDI
A identificação com base no perfil de ésteres metílicos de ácidos graxos
(FAME) foi realizada em um cromatógrafo a gás HP, Series II, 5890, acoplado
a uma estação de trabalho da Dell™, pelo sistema de identificação Sherlock®
Microbial Identification System, Inc. Newark, DE, USA (MIDI), adotando-se o
protocolo da MIDI. Para essa identificação, cada isolado selecionado foi
transferido para o meio de cultura TSA (Trypticase Soy, 30 g.L-1, agar 15 g.L-1)
e mantido em incubação a 28 ºC por 24 horas.
Para a análise de FAME foi feita a remoção das células das colônias
isoladas do terceiro quadrante da placa com o auxílio de uma alça de
repicagem e a transferência para o fundo de um tubo de ensaio. As células
removidas foram submetidas à saponificação, por meio da adição de 1,0 mL de
reagente 1 (hidróxido de sódio 45 g, metanol 150 mL e água milli-Q 150 mL),
agitação em vórtex por 5 a 10 s, incubação em banho-maria a 100 ºC por
22
5 min, seguida de agitação e incubação novamente a 100 ºC por 25 min. Após
a saponificação, a suspensão foi submetida a processo de metilação dos
ácidos graxos, para a formação dos ésteres metílicos, mediante a adição de
2,0 mL de reagente 2 (ácido clorídrico 6,0 N, 325 mL e Metanol 275 mL),
agitação por 5 a 10 s e incubação em banho maria a 80 ºC por 10 min. A
seguir, foram adicionados 1,25 mL de reagente 3 (hexano 200 mL e éter metil
ter-butil 200 mL) e o volume total foi homogeneizado durante 10 min, por
inversão dos tubos. A fase aquosa foi descartada. À fase orgânica, contendo os
ésteres metílicos de ácidos graxos, foram adicionados 3,0 mL do reagente 4
(hidróxido de sódio 10,8 g e água milli-Q 900 mL), o volume total foi
homogeneizado por seguidas inversões do tubo durante 5 min e 2/3 da fase
aquosa final foram transferidos para o tubo em que a amostra foi levada para
injeção no cromatógrafo a gás.
3.5.2. Extração de DNA, amplificação, sequenciamento e análise de
seqüências de rDNA 16S
As culturas puras dos 48 i solados das bactérias endofíticas selecionadas
foram ativadas por cultivo em placas contendo meio sólido Luria-Bertani (LB)
(Bacto triptona 10 g, extrato de Levedura 5 g, NaCl 10 g, agar 15 g, água MilliQ até 1000 mL, pH 7,0) e incubadas a 28 ºC por 24 horas. Após esse tempo,
foram transferidas para tubos contendo 10 mL de caldo LB e novamente
incubadas por 24 horas a 28 ºC sob agitação a 150 rpm, em Controlled
Environment Incubator Shaker, New Brunswick Scientific Co, Inc. Edison, N.J,
USA, seguindo-se nova retirada de inóculo para cultivo em 30 mL de LB sob as
mesmas condições de incubação. A pureza das culturas foi verificada por
coloração de Gram.
O DNA total de isolados de bactérias foi extraído com o uso de protocolo
proposto por Marmur (1961), citado por Marmur et al. (1963), modificado no
LEM para a extração do DNA total das células de 32 dos isolados de bactérias
endofíticas gram-negativas, e modificado também para a extração do DNA
dos16 isolados de bactérias endofíticas gram-positivas.
O DNA precipitado foi lavado com etanol 70 %, secado a temperatura
ambiente e, finalmente, ressuspendido em 30 μL de TE (10 mmol.L-1 Tris-HCl,
23
pH 8,0). Ao eppendorf contendo o DNA extraído foi adicionada a RNase
(Sigma-Aldrich Co. USA) para fazer a concentração final de 50 μg.mL-1 e a
incubação em banho-maria foi a 37°C por 30 min. A verificação da presença do
DNA foi realizada em gel de agarose (Sigma-Aldrich Co. USA) 0,8 % em
tampão TAE (40 mM Tris-acetato e 1mM EDTA) e brometo de etídio (2 L.mL-1) .
Alíquotas de 3 L de DNA foram acrescidas de corante (0,25 % azul de
bromofenol; 0,25 % de xilenocianol e 15 % de ficol) para a aplicação no gel e a
eletroforese efetuada por 2 horas a 60 volts, utilizando-se de uma fonte Power
Pac Basic™ BIO-Rad. O DNA de fago clivado com a enzima de restrição de
HindIII (Promega) foi utilizado como padrão para a quantificação do DNA. O
perfil de bandas de DNA no gel foi visualizado no sistema de digitalização de
imagem Eagle Eye™ (Stratagene) e as imagens armazenadas em arquivos jpg.
A quantificação foi feita utilizando-se de marcadores de quantidade de DNA de
fago na concentração de 50 ng.L-1.
A amplificação de rDNA 16S foi realizada por meio da técnica de PCR
utilizando-se primer universal para eubactérias f27/R1492 (HEUR et al., 2001;
GELSOMINO et al., 2005). As misturas das reações em volume final de 25 μL
continham aproximadamente 20 ng de DNA molde, tampão (Promega), 1,8 mM
de MgCl2 , 210 nM de cada primer, 250 μM deoxirribonucleotídeos (dNTP’s),
0,02 U de Taq DNA polimerase (Promega). Em todas as reações foi utilizado
um controle negativo sem o DNA molde.
A reação de amplificação foi realizada em termociclador (Mastercycler
Gradient, Eppendorf-Germany), programado para realizar uma desnaturação
inicial a 94 ºC por 2 min, seguida por 30 ciclos de desnaturação a 94 ºC por 15
segundos, anelamento a 52 ºC e extensão por 10 min a 72 ºC por 1 min. As
últimas 20 etapas de extensão foram realizadas usando um incremento de
temperatura de 20 s por ciclo (BUNGE e LECHNER 2001). Os produtos
resultantes da reação de PCR foram avaliados por eletroforese em gel de
agarose (1,2 % p/v), em tampão TAE (40 mM Tris-acetato e 1 mM EDTA) e
brometo de etídio (2 L mL-1) (SAMBROOK et al., 1989). Alíquotas de 3 L de
DNA foram acrescidas de corante (0,25 % azul de bromofenol; 0,25 % de
xilenocianol e 15 % de ficol) para serem aplicadas no gel e submetidas à
eletroforese por 2 horas a 60 volts, utilizando-se uma fonte Power Pac Basic™
24
BIO-Rad. O DNA de fago com a enzima da restrição de HindIII (Promega) foi
utilizado como padrão para a quantificação de DNA obtido. O perfil de bandas
de DNA no gel foi visualizado no sistema de digitalização de imagem Eagle
Eye™ (Stratagene), em arquivo jpg. A quantificação foi feita utilizando-se de
marcadores de quantidade de DNA de fago na concentração de 25, 50, 75 e
100 ng.L-1 . Para visualizar o tamanho do fragmento amplificado, 3 μL do
marcador de tamanho DNA de fago , foi utilizado como referência.
Após a quantificação, os produtos de PCR foram purificados para o
seqüenciamento com o emprego de Kits ExoSAP-ITTM (GE Healthcare Life
Sciences), conforme protocolo do fabricante, a saber: a 5 μL de produto de
PCR foram adicionados 2 μL do produto; a mistura foi agitada levemente e
incubada a 37 ºC por 15 min, para inibição de resíduos de primer e dNTPs,
seguindo-se uma segunda etapa de incubação a 80 ºC por 15 min, para a
inativação de resíduos da ExoSap. Para o sequenciamento foram enviados
entre 75 e 100 ng.μL-1 dos produtos purificados de PCR, em 2 μL de água milliQ, juntamente com 25 μL por reação dos dois primers, forward e reverse, para
o processamento em Seqüenciador automático MegaBace ® 500 de 48
capilares (GE Healthcare). As identidades das seqüências de nucleotídeos
obtidas foram comparadas com as armazenadas no banco de dados do
National Center for Biotechnology Information (NCBI). O alinhamento das
bases foi realizado por meio do programa Clustal W e a análise e correção com
o programa MEGA 4.0® (TAMURA et al., 2007). As inferências filogenéticas
foram obtidas por método de distância e máxima parcimônia de Neighborjoining (SAITOU e NEI, 1987), com teste bootstrap (1.000 réplicas). As árvores
para as análises da filogenia das seqüências foram reconstruídas com o
programa MEGA 4.0®.
3.6. Diversidade genética de comunidades de bactérias não-cultiváveis
A diversidade genética de comunidades de bactérias endofíticas nãocultiváveis foi analisada a partir das imagens dos perfis de bandeamentos dos
amplicons nos géis de Eletroforese em Gel de Gradiente Desnaturante
(DGGE). A estrutura da comunidade de bactérias endofíticas nas diferentes
25
amostras foi avaliada com base nas variáveis: Riqueza, Índice de Diversidade
de Shannon-Weaver e Eqüitabilidade (DILLY et al., 2004; CAMPELO, 2004),
com dados gerados pelo software Gel Pro Analyser® 3.1 (Media Cybernetics
Inc., Maryland - USA).
3.6.1. Extração de DNA total de bactérias em frutos de café
Para a extração de DNA total de bactérias foram utilizados 8 frutos por
amostra, sendo todos previamente lavados em água milli-Q esterilizada, para a
eliminação de impurezas. Outros cinco frutos destinados à extração do DNA
total de endofíticos foram submetidos a processo de desinfestação superficial
(SAKIYAMA et al., 2001).
O protocolo para a extração de DNA de bactérias em frutos de café foi o
adaptado no LEM, com base no de Fungaro et al. (2004). Os frutos de café
foram macerados na presença de nitrogênio líquido, em almofariz, até a
obtenção de um pó fino. Esse pó fino foi transferido para tubo eppendorf
esterilizado e adicionado de 700 L de tampão de extração (4 % CTAB, 1,4 M
NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl, 1 % PVP), 4 L de -mercaptoetanol e
lisozima para uma concentração final de 150 μg.mL-1 , sendo a mistura
incubada por 1 horas a 37 ºC em banho-maria. O tubo foi transferido para outro
banho-maria a 65 ºC onde permaneceu por 20 minutos. A seguir, a mistura foi
mantida em temperatura ambiente por 10 min antes da adição de 700 μL
(1 volume) de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1, v/v), a suspensão no
eppendorf foi homogeneizada por seguidas inversões do tubo antes da
centrifugação, 5 min a 10.000 g em microcentrífuga JOUAN, modelo MR 23i. O
sobrenadante foi transferido para outro tubo e precipitado com 0,7 volumes de
isopropanol (armazenado em temperatura ambiente) e incubado a temperatura
ambiente por 2 horas. Após esse tempo, o tubo foi centrifugado por 5 min a
10.000 g e ao precipitado ressuspendido em 50 μL de água milli-Q esterilizada
foi adicionada a RNase (Sigma-Aldrich Co. USA) para fazer uma concentração
final de 20 μg mL-1 antes da nova incubação a 37 ºC por 1 hora. O DNA
extraído foi precipitado com a adição de 1/10 do volume da solução de NaCl
5 mM e de duas vezes o volume, com etanol absoluto. O precipitado de DNA
foi lavado com etanol 70 % e secado a temperatura ambiente para ser
26
analisado em gel de agarose (Sigma-Aldrich Co. USA) 0,8 % em tampão TAE
(40 mM Tris-acetato e 1mM EDTA) e brometo de etídio (2 L mL-1 ) . Alíquotas
de 3 L de DNA foram acrescidas de corante (0,25 % azul de bromofenol;
0,25 % de xilenocianol e 15 % de ficol) para serem aplicadas no gel e
submetidas à eletroforese por 2 horas a 60 volts utilizando-se uma fonte Power
Pac Basic™ BIO-Rad. DNA de fago (Promega) foi utilizado como padrão,
para a quantificação de DNA. O perfil de bandas de DNA no gel foi visualizado
no sistema de digitalização de imagem Eagle Eye™ (Stratagene), em arquivo
jpg. A quantificação foi feita utilizando-se de marcadores de DNA de fago na
concentração de 50 ng.L-1 .
3.6.2. Amplificação de rDNA 16S de Eubactérias e de grupos específicos
de bactéria
A amplificação de rDNA 16S de comunidades de bactérias endofíticas e
epifíticas, e a das endofíticas cultiváveis e não-cultiváveis, foi realizada por
PCR. O molde utilizado para as reações foi o DNA total extraído das amostras
de frutos de café, utilizando o protocolo em uso no LEM. A amplificação dos
fragmentos de rDNA 16S foram feitas com primer universal F984GC/R1378
(GELSOMINO et al., 2005) para estudo da estrutura das comunidades de
eubactérias (Tabela 4). As reações foram realizadas em tubos eppendorf de
100 μL em volume final de 25 μL, contendo tampão TAE (10 mM Tris-HCl,
10 mM KCl, pH 8,3), 3,75 mM de MgCl2, 200 μM de deoxirribonucleotídeos
(dNTP´s), 0,2 mM de cada primer, 0,25 μg mL-1 de albumina sérica bovina
(Invitrogen), 2 % (v/v) de formamida deionizada, 1,5 U de Taq DNA polimerase,
20 ng de DNA total e água milli-Q para completar o volume final. Em todas as
reações foi utilizado um controle negativo, sem o DNA molde. A PCR foi
realizada em termociclador PTC-100™ Programmable Thermal Controller (MJ
Research,
Inc.)
sob
as
seguintes
condições:
temperatura
inicial
de
desnaturação a 94 ºC por 5 min, seguida de 30 ciclos consistentes de 94 °C
por 1 min para a desnaturação, 1 min para o anelamento de primer na
temperatura adequada e 2 min a 72 °C para a extensão de primer. O ciclo foi
seguido por uma extensão final a 72 °C por 10 min e finalmente resfriamento a
27
Tabela 4 – Primers usados para amplificar fragmentos de genes rDNA 16S de
grupos específicos de bactérias
a
Primers
a
Posição de 16S rDNA
Seqüência (5´-3´)
b
Referências
F203α
α-proteobacteria
(174-203)
CCGCATAGCCCCTACGGGGGA
AAGTTTATCGCACAAGCGGTGGATGA
Gomes et al.
(2001)
F948β
β-proteobacteria
(931-948)
CGCACAAGCGGTGGATGA
Gelsomino et al.
(2006)
F243H
GC
Actinobacteria
(226-243)
CCGGGGCGCGCCCCGGGCGGG GCG
GGGGCACGGGGGG
Gomes et al.
(2001)
R1492
Bactéria
(1492-1513)
TACGG(C/T)TACCTTGTTACGACT T
Heuer et al.
(1997)
F984GC
Bactéria
(968-984)
CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGC
GGGGCGGGGGCACGGGGGGAACGCG
AAGAACCTTAC
Gelsomino et al.
(2006)
R1378
Bactéria
(1378-1401)
CGGTGTGTACAAGGCCCGGGA ACG
Heuer et al.
(1997)
BLS342F
Firmicutes
(342-402)
CAG CAG TAG GGA ATC TTC
Blackwood et al.
(2006)
1392R
Bactéria
(1392-1406)
ACGGGCGGTGTGTAC A
Blackwood et al.
(2006)
FD2
γ
-proteobacteria
(18-47)
AGAGTTTGATCATGGCTCAG
Weisburg et al.
(1991)
RP1
Bactéria
(1512-1406)
ACGGTTACCTTGTTACGCTT
Weisburg et al.
(1991)
b
F, primer foward; R, primer reverse, Posição no genoma de Escherichia coli.
4 °C. A verificação dos produtos da amplificação foi realizada por eletroforese
em gel de agarose (Sigma-Aldrich Co. USA) 1,2 %, em tampão TAE (40 mM
Tris-acetato e 1 mM EDTA) e brometo de etídio (2 L mL-1). Foram aplicados
5 μL de cada reação juntamente com o marcador de tamanho DNA de fago .
A amplificação de fragmentos de rDNA 16S para grupos específicos de
α e β-Proteobacteria foi realizada com o uso de primers específicos
F203α/R1492 e F948β/R1492 (GELSOMINO et al., 2005) (Tabela 4). A mistura
da reação em volume de 25 µL foi preparada com 5,0 µL de tampão (10 mM
Tris-HCl, 10 mM KCl, pH 8,3), 200 µM de cada dNTP, 3,75 mM de MgCl2 ,
0,2 µM de cada primer, 2 % de formamida, 1,0 µL de BSA, 5 U de DNA Taq
Polimerase (Promega), 1 µL de DNA equivalente a 20 ng e água Milli-Q, para
completar os 25 µL. Em todas as condições foi utilizado um controle negativo
sem DNA molde. A reação de amplificação foi realizada em termociclador PTC100™ Programmable Thermal Controller (MJ Research, Inc.) programado para
28
a desnaturação inicial a 94 °C por 5 min, seguida de 30 ciclos a 94 °C por
1 min, anelamento a 56 °C por 1 min para o primer (α-Proteobacteria), 61 °C por
1 min para primer (β-Proteobacteria) e extensão de primer a 72 °C por 2 min,
antes da extensão final a 72 °C por 10 min seguida de resfriamento a 4 °C.
Fragmentos de rDNA 16S para a análise do filo Actinobacteria foram
amplificados por meio do uso do primer F243H GC/R1492 (HEUR et al., 1997)
(Tabela 4). A mistura da reação foi preparada com Tampão (10 mM Tris-HCl,
10 mM KCl, pH 8,3), 0,2 mM de cada dNTP, 2,5 mM MgCl2 , 100 nM de cada
primer (F243/R1378), 5 % de Dimetil sulfoxido (v/v), 0,1 µg de BSA e 5 U/50 µL
de Tag polimerase, 1 µL de DNA equivalente a 20 ng, e água Milli-Q para
completar o volume final de 25 µL. Em todas as condições foi utilizado um
controle negativo sem DNA molde. A reação de amplificação foi realizada em
termociclador PTC-100™ Programmable Thermal Controller (MJ Research,
Inc.) programado para realizar desnaturação inicial a 94 °C por 5 min, seguida
de 30 ciclos de desnaturação a 94 °C por 5 min, anelamento a 63 °C por 1 min
e extensão de primers a 72 °C por 2 min, antes da extensão final a 72 °C por
10 min seguida de resfriamento a 4 °C.
A amplificação de rDNA 16S para grupos de bactérias do filo Firmicutes
foi realizada com o uso do primer BLS342F/1392R (BLACKWOOD et al., 2005)
(Tabela 4). A reação apresentou um volume final de 25 µL contendo 20 ng de
DNA molde, Tampão TAE (10 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, pH 8,3), 169 µM de
cada dNTP, 3,0 mM MgCL2, 0,1 µM de cada primer (BLS342F e 1392R), 5 %
de Dimetil sulfoxido (v/v), 0,1 µg.mL-1 de BSA e 0,025 U.50 µL -1 de Taq
polimerase, 1 µL de DNA equivalente a 20 ng e água Milli-Q até completar o
volume final. Em todas as condições foi utilizado um controle negativo sem
DNA molde. A reação de amplificação foi realizada em termociclador PTC100™ Programmable Thermal Controller (MJ Research, Inc.) programado para
realizar desnaturação inicial a 95 °C por 3 min, seguida de 30 ciclos de
desnaturação a 94 °C por 30 s, anelamento a 57 °C por 30 s e extensão de
primers a 72 °C por 90 s, antes da extensão final a 72 °C por 7 min. Seguida de
resfriamento a 4 °C.
A amplificação de fragmentos de rDNA 16S para grupos de bactérias
pertencentes a γ-Proteobacteria foi realizada por meio do uso de primer
FD2/RP1 (WEISBURG et al., 1991) (Tabela 4) . As reações apresentaram um
29
volume final de 25 μl contendo aproximadamente 20 ng de DNA molde, tampão
TAE (Promega), 1,8 mM de MgCl2, 210 nM de cada primer, 250 μM
deoxirribonucleotídeos (dNTP), 0,02 U da enzima Taq DNA polimerase
(Promega). Em todas as reações foi utilizado um controle negativo sem o DNA
molde. A reação de amplificação foi realizada em termociclador PTC-100™
Programmable Thermal Controller (MJ Research, Inc.) programado para
realizar uma desnaturação inicial a 94 ºC por 2 min, seguida por 30 ciclos de
desnaturação a 94 ºC por 15 s, anelamento a 52 ºC e extensão a 72 ºC por
1 min. As últimas 20 etapas de extensão foram realizadas usando um
incremento de temperatura de 20 s por ciclo (\BUNGE e LECHNER, 2001). Em
todas as condições foi utilizado controle negativo sem DNA molde.
3.6.3. PCR e análise por eletroforese em gel com gradiente desnaturante
(DGGE)
Os produtos de PCR obtidos em reação com grupos específicos de
primers foram usados como molde de DNA para uma segunda reação de
Nested-PCR,
mediante
o
uso
do
primer
universal
para
bactérias
F984GC/R1378. A reação de amplificação foi a já descrita para essa dupla de
primer e realizada em termociclador PTC-100™ Programmable Thermal
Controller (MJ Research, Inc.). A verificação dos produtos da amplificação foi
realizada por eletroforese em gel de agarose (Sigma-Aldrich Co. USA) 1,2 %,
em tampão TAE (40 mM Tris-acetato e 1 mM EDTA) e brometo de etídio
(2 L.mL-1). Foram aplicados 5 μL de cada reação juntamente com o marcador
de tamanho DNA de fago .
A análise por DGGE (MUYZER et al., 1993) foi realizada no sistema
“DCode
Universal Mutation Detection System” (BIO-Rad – Califórnia USA)
com as adaptações realizadas por Campelo (2004). Os produtos de NestedPCR foram aplicados juntamente com 20 L do tampão da amostra (azul de
bromofenol 0,05 %, xileno cianol 0,05 %, glicerol 70 % e TAE) diretamente no
gel de poliacrilamida vertical (acrilamida-bisacrilamida 37,5: 1) a 6 % (p/v). O
gradiente de uréia/formamida (40 a 58 %) foi o utilizado para as análises dos
fragmentos de genes rDNA 16S de Proteobacterias classes α, β e γ
30
(Gelsomino et al., 2005) e o gradiente de 30 a 60 % para Firmicutes e
Actinobacteria (HEUR et al., 2001).
O gradiente foi formado a partir da mistura de duas soluções estoque de
poliacrilamida com 100 % dos agentes desnaturantes, formamida deionizada
40 % e uréia 7 mol.L-1, e a outra a 0 %, sem os agentes desnaturantes. Além
dessas soluções foram utilizados 125 μL de persulfato de amônio – APS
(polimerizador), 16 μL de TEMED – N,N,N’,N’- tetrametiletileno diamino
(catalisador) e 50 μL do corante para visualização do gradiente (azul de
bromofenol 0,5 %, xilenocianol 0,5 % e TAE). O gradiente foi obtido com a
aplicação das soluções para formar o gradiente no gel por um sistema
dispensador (Modelo 475 Gradient Delivery System, BIO-Rad Califórnia, USA).
A eletroforese foi conduzida em temperatura de 60 ºC, 50 v durante 16 h,
seguindo-se a coloração desse gel com SYBR Green® I (Sigma-Aldrich Co.
USA) diluído em tampão TAE, por 20 min. A imagem do gel sob luz UV foi
capturada e digitalizada pelo Eagle Eye II (Stratagene – Califórnia, USA), em
arquivo padrão tiff.
Os produtos de Nested-PCR para cada grupo de bactérias foram
utilizados para a análise de comunidades de bactérias endofíticas mediante a
técnica de DGGE. Junto com as amostras no gel foram aplicados mistura dos
fragmentos de rDNA 16S amplificados com o primer F984GC/R1378, a partir
de DNA de isolados de bactérias referências, pertencentes aos filos
Proteobacteria, classes α, βe γe Firmicutes: Alcaligenes xylosoxydans ATCC
13138, Agrobacterium tumefaciens ATCC 12136, Bacillus cereus ATCC 14579,
Bacillus subtilis ATCC 23858, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas
aeruginosa
ATCC
27853,
Pseudomonas
fluorescens
Pseudomonas putida ATCC 15176 e Staphylococcus aureus
31
ATCC
13525,
auxílio do programa Gel Pro Analyser® 3.1 (Media Cybernetics Inc., MarylandUSA). Essas análises foram realizadas para o arquivo digital correspondente a
cada gel. Os ajustes básicos do programa foram os seguintes:
- largura da raia: 10 pixels;
- altura mínima de banda: 1 %;
- separação mínima de bandas: 0,5 % Rf;
- raias retilíneas;
- correção de “Background”: nenhuma; e
- raias contendo padrão (ões): nenhuma;
No programa, as bandas foram posicionadas e identificadas para
posteriores análises da estrutura de comunidades de bactérias endofíticas
presentes em cada umas das cultivares coletadas a diferentes altitudes. Essa
avaliação foi realizada com base nas variáveis de Riqueza (R), Índice de
Diversidade de Shannon-Weaver (H’) e Eqüitabilidade (E) (DILLY et al., 2004;
CAMPELO, 2004).
A variável R foi obtida com base em uma matriz binária, na qual a
ausência da banda correspondente a cada unidade taxonômica operacional
(UTO) foi codificada como zero (0) e, a presença como um (1). Para cada
amostra no gel obteve-se a freqüência de ocorrência de cada UTO pela
contagem do número total de bandas presentes no gel por amostra. O índice H’
foi calculado com base na abundância, expressa como densidade ótica da
banda na raia do gel, por meio da seguinte fórmula:
em que
2,3
H´ 

N log N ( ni log ni )
N
N = densidade ótica da raia, obtida pelo somatório das densidades
óticas das bandas da raia; e
ni = densidade ótica de cada banda, na raia.
Para o cálculo de E, empregou-se a seguinte fórmula:
H´
E 
log R
32
Os gráficos dos Índices de Diversidade e de Freqüência das UTOs das
diferentes amostras, em diferentes altitudes, foram construídos utilizando o
software Sigma Plot® (versão 8.0).
3.6.5. Análises estatísticas
A análise estatística foi feita por meio do programa SAEG (sistema para
análises estatísticas) versão 9.0. A densidade de bactérias endofíticas
expressa em UFC.fruto -1 foi transformada em log10 antes da análise de
variância. O teste de Scott-Knott foi aplicado para comparação entre as médias
para avaliar a relação entre densidade populacional, cultivares e as altitudes. O
teste de correlação simples de Pearson foi utilizado para comprovação da
relação positiva entre contagem em UFC.fruto-1 e Log10 de UFC.fruto-1 e,
também para relacionar as densidades populacionais de bactérias endofíticas
com altitudes.
33
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Comunidades de bactérias totais e endofíticas isoladas de fruto de
café
A eficácia do protocolo para a desinfestação superficial dos frutos de
café, para serem utilizados no estudo de bactérias endofíticas, cultiváveis e
não-cultiváveis, foi comprovada pela constatação da ausência de crescimento
microbiano em meio R2A (Tabela 1A, do Apêndice A) inoculado com a última
água de lavagem dos frutos e, também, no meio de cultura em que os frutos
desinfestados superficialmente foram incubados por 3 dias a 28 ºC. Somente
frutos em que se demonstrou a ausência de crescimento foram utilizados para
o isolamento dos endofíticos cultiváveis e a extração do DNA total de bactérias
endofíticas cultiváveis e não-cultiváveis.
A densidade populacional de bactérias endofíticas isoladas de frutos das
cultivares Catuaí em meio R2A variou de 2,93 x 10 4 a 6,20 x 10 6 UFC.fruto-1
(Catuaí Amarelo) e de 7,60 x 104 a 6,0 x 106 UFC.fruto-1 (Catuaí Vermelho),
enquanto em Bourbon correspondeu a 1,24 x 104 a 1,35 x 106 UFC.fruto-1
(Bourbon Amarelo) e 4,60 x 104 a 2,69 x 105 UFC.fruto-1 (Bourbon Vermelho).
Os valores de densidade populacional de bactérias endofíticas indígenas em
tecido da maioria das espécies vegetais situam-se em torno de 103 a 106 FC.g-1 de
tecido fresco (HALLMANN et al., 1997). As maiores densidades populacionais,
autóctones ou introduzidas, são normalmente observadas na raiz e na parte
inferior do caule, havendo decréscimo do caule até a folha de bactérias
34
endofíticas (LAMB et al., 1996). Os autores relatam valores de 103 e 105 UFC.g-1
de tecido fresco quando as bactérias são introduzidas, e não de ocorrência
natural. A abundância de microrganismos cultiváveis em fruto no estádio
cereja, em fazendas do Sul de Minas Gerais, foi relatada com um valor da
mediana em torno de 1,6 x 107 UFC por fruto, sendo as bactérias as mais
abundantes (SILVA et al., 2001). Em C. arabica, em três localidades de Minas
Gerais a população das endofíticas variou de 103 e 104 UFC.g-1 de frutos seco
(SAKIYAMA, 2001).
Os valores de densidade das bactérias endofíticas em frutos de café
diferem (p < 0,05) entre cultivares e também quanto à altitude em que se
situam. Quanto maior a altitude, maior a densidade tanto para Catuaí Vermelho
(1.187 m) quanto para Bourbon Vermelho (1.101 m), enquanto nas altitudes
inferiores a 1.000 m, os valores para essas mesmas cultivares são
consistentemente (p < 0,05) menores (Figura 1). Os dados nessa figura
demonstram a existência de diferenças (p < 0,05) entre a densidade de
bactérias das cultivares a uma mesma altitude, destacando-se como maior o
valor da Catuaí Vermelho. Pela análise de correlação simples por Pearson,
para densidade de endofíticas em frutos provenientes de altitudes distintas,
constata-se a existência de correlação (p < 0,01) entre essas duas variáveis,
densidade de bactérias e altitude. Ressalte-se que o componente ambiente
reflete na composição química dos frutos das cultivares, a exemplo dos teores
de açúcares nos fruto das variedades de Catuaí e Bourbon (GUYOT et al.,
1996; BUENAVENTURA e CASTAÑO, 2002; SYLVIA et al., 2004).
Pela consistência das diferenças em densidade de bactérias endofíticas,
como função de cultivares e altitude, é possível inferir que a densidade de
bactérias tenha reflexos na qualidade e quantidade de componentes dos frutos
que são precursores daqueles que compõe o aroma, sabor e acidez de um
café de qualidade superior. Os frutos de café provenientes das regiões com
maior altitude, processados adequadamente, têm características organolépticas
valorizadas pelo mercado.
Com relação à variável densidade de bactérias
totais, que inclui as epifíticas e endofíticas do fruto, as maiores médias
correspondentes a Catuaí Vermelho (1.013 m), Bourbon Vermelho (1.101 m),
Catuaí Amarelo (676 m) e Catuaí Vermelho (956 m), embora difiram (p < 0,05)
das obtidas para as mesmas cultivares em altitudes distintas (Figura 2),
35
Log10-UFC/fruto
6
a
b
b
5
b
b
b
c
c
c
c
BA
BV
BA
CA CV
CV
CA
687 m
a
1101 m
a
7
4
3
2
1
1013 m
676 m
1101 m
676 m
1187 m
Variedades
956 m
CA CV
956 m
BV
687 m
CA
1013 m
CV
1187 m
0
Coffea arabica L. cultivares
Figura 1 – Densidade populacional de bactéria endofíticas em frutos de Coffea
arabica L. Catuaí Amarelo (CA), Catuaí Vermelho (CV), Bourbon
Amarelo (BA) e Bourbon Vermelho (BV), a diferentes altitudes.
Médias com a mesma letra não são significativamente diferentes
pelo teste de Scott-Knott (p < 0,05).
a
a
a
b
b
b
b
b
b
CA CV
BV
BA
CA
CA
676 m
a
956 m
a
687 m
a
687 m
7
6
5
4
3
Variedades
1013m
BA
1013 m
1187 m
CV
1101 m
CA CV
956 m
BV
676 m
CV
1101 m
2
1
0
1187 m
Log10-UFC/fruto
8
Coffea arabica L. cultivares
Figura 2 – Densidade populacional de bactéria totais em frutos de Coffea
arabica L. Catuaí Amarelo (CA), Catuaí Vermelho (CV), Bourbon
Amarelo (BA) e Bourbon Vermelho (BV), a diferentes altitudes.
Medias com a mesma letra não são significativamente diferentes
pelo teste de Scott-Knott (p < 0,05).
36
possivelmente não tem relação direta com altitudes. A Catuaí Amarelo
apresenta as menores densidades em altitudes de 676 e de 956 m (Figura 2).
Na etapa de isolamento de bactérias foi constituída uma coleção com
381 culturas, das quais 134 de endofíticas, no Laboratório de Ecologia (LEM).
Nessa coleção
de endofíticas foram identificados, por características
morfológicas das colônias em meio R2A, 48 morfotipos de bactérias entre as
cultiváveis isoladas das quatro cultivares de C. arabica L. (Figura 3, Tabela 2A,
do Apêndice A). As 48 culturas desses morfotipos constituíram o universo-base
para a identificação FAME/MIDI) e seqüenciamento direto dos amplicons
obtidos por PCR.
Figura 3 – Aspectos orfológicos de bactérias endofíticas isoladas de frutos de
Coffea arabica L. A = placas de Petri contendo isolados de
comunidades das bactérias endofíticas em R2A; B = isolado de
bactérias endofíticas em meio R2A; C = isolados de bactérias
endofíticas em meio Luria-Bertani; D = isolados de bactérias
endofítica em meio triptona soja agar; e E = isolados de bactérias
endofíticas em meio agar nutritivo.
4.2. Composição de bactérias endofíticas cultiváveis
A identificação com base no perfil FAME, pelo sistema Sherlock ® (MIDI)
encontrou, na biblioteca de referência armazenada em banco de dados para
microrganismos aeróbios de amostras ambientais do sistema (TSBA 50 5.00),
perfil comparável para 17 dos 48 morfotipos selecionados, sendo 5 isolados de
37
Pectobacterium carotovorum-carotovorum (LEM CA30, LEM CV35, LEM BV38,
LEM BA43 e LEM BA45); 4 de Curtobacterium flaccumfaciens-betae/oortii
(LEM CA19, LEM CV20, LEM CA25 e LEM CA28); 2 de Microbacterium barkeri
(LEM CA26 e LEMBV37); Brevibacterium epidermidis/iodium (LEM BV41);
Bacillus GC grupo 22 (LEM CV24); Microbacterium luteolum (LEM CA01);
Pseudomonas putida biótipo A (LEM BA47); Staphylococcus simulans GC
subgrupo A (LEM CV23) e Salmonella typhimurium GC grupo B (LEM CV19). O
restante, em sua maioria, foi discriminado como possíveis exemplares de
enterobactérias, grupo para o qual o MIDI ainda não representa o método de
escolha.
A comunidade de bactérias endofíticas em frutos de cafeeiros está
composta basicamente por espécies dos filos Actinobacteria (47,05 %),
seguidas pelas de Proteobacteria, classe γ (41,17 %) e, uma menor
porcentagem de Firmicutes (11,76 %) (Tabela 5).
Tabela 5 – Identificação e distribuição taxonômica dos isolados identificadas
por FAME/MIDI
Isolado
Espécie identificada
Filiação
Taxonômica
LEM 30, LEM 35,
LEM38, LEM 43 e
LEM 45
Pectobacterium carotovorumcarotovorum
γ-Proteobacteria
CV, CA, BA (2)*,
BV
LEM 19, LEM 20,
LEM 25, LEM 28
Curtobacterium flacumfaciensbetae/oortii
Actinobacteria
CA (2)* CV (2)*
LEM 26, LEM 37
Microbacterium barkeri
Actinobacteria
CA, BV
LEM 47
Pseudomonas putida biótipo A
γ-Proteobacteria
BA
LEM 23
Staphylococcus simulans GC
subgrupo A
Firmicutes
CV
LEM 24
Bacillus GC subgrupo 22
Firmicutes
CV
LEM 41
Brevibacterium
epidermidis/iodium
Actinobacteria
BV
LEM 0 1
Microbacterium luteolum
Actinobacteria
CA
LEM 19
Salmonella typhimurium GC
grupo B
γ-Proteobacteria
CV
Variedade
* número da ocorrência do isolado na cultivar. CV = Catuaí Vermelho; CA = Catuaí Amarelo;
BV = Bourbon Vermelho; e BA: Bourbon Amarelo.
38
Os isolados LEM CA30, LEM CV35, LEM BV38, LEM BA43 e LEM BA45
identificados como P. carotovorum-carotovorum foram encontrados nas quatro
cultivares
de
café
em
altitudes
superiores
a
1.062 m,
enquanto
a
C. flacumfaciens-betae/oortii LEM CA19, LEM CV20, LEM CA25 e LEM CA28
em altitudes de 1013 até 1187 m apenas em Catuaí, Vermelho ou Amarelo.
M. barkeri (LEM CA26 e LEMBV37) é uma espécie que foi encontrada em duas
das quatro espécies amostradas, em lavouras acima de 1.000 m, LEM CA26 a
1.187 m e LEM BV37 em altitudes de 1.101 m. A presença desses isolados nos
frutos das lavouras de Catuaí e Bourbon, ambas situadas em altitudes superiores
a 1.000 m, foi interpretada como resultante da associação que se expressa em
função dos fatores de ambiente próprios de locais com maior altitude.
Em Bourbon e Catuaí foram também identificadas por FAME/MIDI
isolados de P. putida biótipo A (LEM BA47), Bacillus GC subgrupo 22 (LEM
CV24), S. simulans GC subgrupo A (LEM CV23), B. epidermidis/iodium (LEM
BV41) e S. typhimurium GC grupo B (LEM CV19). O isolado LEM CA01,
proveniente de frutos de Catuaí Amarelo, foi identificado como de M. luteolum,
uma espécie que produz um pigmento amarelo similar ao típico dos frutos
maduros dessa cultivar. Estariam os isolados dessa bactéria contribuindo para
a coloração dos frutos dessa variedade nas diferentes altitudes em que é
cultivada?
A análise do conjunto das espécies identificadas mostra que 94,0 % dos
isolados foram encontrados em altitudes superiores a 1.000 m (Figura 4A). No
teste de médias por Scott-Knott, as maiores densidades populacionais de
bactéria endofíticas associadas a frutos das quatro cultivares de C. arabica
estão relacionadas (p < 0,05) com as altitudes superiores a 1.000 m, sob as
condições analisadas. Ressalte-se que as de ocorrência em frutos da cultivares
Catuaí corresponderam a 34 % em Catuaí Vermelho e 30 %, a Amarelo,
enquanto em Bourbon a percentagem foi de 18 % para cada uma das
cultivares, Vermelho ou Amarelo (Figura 4B). É possível que sendo a Catuaí a
cultivares mais cultivada na região amostrada, as endofíticas identificadas já
reflitam a afinidade dessas bactérias a cultivares, como resultado da pressão
de seleção do ambiente e do exercido pelos compostos do próprio fruto, a
exemplo dos maiores teores de açúcares totais em Catuaí do que em Bourbon
(LOPES, 2000).
39
29%
6%
18%
676 m
1013 m
18%
29%
1062 m
1101 m
40
Staphyloco cc us
simulans B acillus GC grupo 22
Salmo nella
typhimurium
6%
6%
6%
Pecto bact erium
caro to vo rum
28 %
Pseudomo nas putida
6%
Brevibacterium
epidermidis
Curto bacterium
flacc umf aciens
6%
M icrobacterium
luteo lum
6%
M icro bact erium
barkeri
24 %
12 %
Figura 5 – Participação em (%) de espécies de bactérias endofíticas isoladas
de fruto de Coffea arabica L.
para catalase, produção leve de ácido na presença de xilose, raminose,
manose, maltose, inositol e com produção forte de ácido a partir de glicose e
frutose. Têm atividade assimilatória de ácido acético, pirúvico, D -láctico, láctico,
málico, succínico, fumárico, cítrico e glucônico (DWORKIN et al., 2006a). A
C. flaccumfaciens produz murcha vascular em diversas plantas (SMEATH et
al., 1998) e já foi referida como rizosférica promotora de crescimento (RAUPACH
e KLOEPPER, 1998) e endofítica de partes de cafeeiro amostrados no México,
Hawaii e Colômbia (VEGA et al., 2005), mas não em frutos. A versatilidade
metabólica dessa espécie pode ser de importância para o estudo da qualidade
da bebida superior do café.
Os três isolados de Microbacterium, M. barkeri LEM CA26 e LEM BV37
e M. luteolum LEM CA01 representam 18 % das espécies endofíticas
identificadas (Figura 5). Microbacterium está incluída como do filo de Bactéria
gram-positivas com alto conteúdo de G+C no DNA (69,0 – 75,4 mol %),
quimiorganotrófica, aeróbia, algumas espécies são fermentativas e outras
produzem ácidos em meio com peptona a partir de glicose e outros açúcares.
Muitas espécies produzem DNAase e são catalase-positivas. As bactérias
desse gênero requerem a vitamina B e alguns aminoácidos para seu
crescimento (SMEATH et al., 1998), sendo a M. barkeri já relatada como
endofítica em sementes de arroz (COTTYN et al., 2000).
41
As outras seis espécies identificadas por FAME/MIDI são pertencentes a
três filos, Proteobacteria classe γ, Actinobacteria e Firmicutes, 6 % de cada
espécie (Figura 5).
Pseudomonas compreende um grupo de aeróbias do filo Proteobacteria,
classe γ, capazes de utilizar compostos orgânicos e inorgânicos em diferentes
condições de ambiente, com hábito saprofítico no solo e água; são patôgenos
importantes de humanos, animais e plantas. Esse gênero é referenciado por
sua ubiqüidade, algumas espécies produzem metabólitos que estimulam o
crescimento de plantas ou inibem as pragas (DWORKIN et al., 2006a).
Pseudomonas putida biótipo A é endofítica em raízes de cenoura (SURRETE
et al., 2003) e polpa de fruto de café no México (VEGA et al., 2005).
Novamente, a ocorrência de isolados dessa espécie como endofítica em frutos
de café na zona da Mata Norte constitui fato novo e alerta para a necessidade
de se esclarecer o seu papel na associação, principalmente em razão da
versatilidade metabólica e plasticidade genética, já relatadas na literatura.
Em resumo, concluí-se pela necessidade de estudos mais específicos e
aprofundados para esclarecer o questionamento sobre a existência de
especificidade entre bactéria endofítica e cultivar de café, bem como da
contribuição destas como produtoras de compostos precursores daqueles que
compõem a qualidade da bebida superior do café.
Staphylococcus simulans GC subgrupo A LEM CV23 inclui-se entre as
do filo Firmicutes, com baixo conteúdo de G+C no DNA (33-40 mol %)
(DWORKIN et al., 2006b). As espécies que compõem o gênero são aeróbias e
anaeróbias que ocupam ampla variedade de nichos, onde exercem atividades
bioquímicas importantes no homem, em animais, no processamento de
alimentos e, inclusive, como rizosférica endofítica promotora de crescimento
em cenoura (SURRETTE et al., 2003; DWORKIN et al., 2006b). A constatação
de S. simulans LEM CV23 como endofítica em frutos de café se configura
como relato novo sobre nicho de ocorrência do gênero e espécie.
A identificação do isolado LEM BV41 como uma B. epidermidis/iodium
amplia o relato de nichos em que se encontra essa espécie do filo
Actinobacteria com alto conteúdo de G+C no DNA. Existem poucas
informações disponíveis sobre as seqüências de genes das espécies desse
gênero, embora existam seqüências no “European Molecular Biology
42
Laboratory (EMBL/GenBank)”, as espécies pertencentes a Brevibacterium em
sua maioria não são membros autênticos dentro do gênero. Muitas são de
habitats com alta concentração de sais (NAGATA et al., 2006), como na pele e
tecidos adjacentes a ela. Existem relatos de espécies produtoras de uma
diversidade de bacteriocinas e substâncias antimicrobianas que inibem o
crescimento de outras espécies, dentro do mesmo gênero e de outros grupos
de bactérias, tais como: Bacillus, Corynebacterium, Micrococcus e Listeria
(DWORKIN et al., 2006c). Espécies de Brevibacterium são utilizadas como
agentes de maturação de queijo e também em aplicações biotecnológicas e
processos
farmacológicos
(DWORKIN
et
al.,
2006c).
Brevibacterium
epidermidis/ioidium LEM BV41 é pela primeira vez relatada como bactéria
endofítica em fruto de café. Ela foi isolada de frutos provenientes de lavoura da
cultivar Bourbon Vermelho a 1.101 m de altitude.
Finalmente, a S. typhimurium GC grupo B LEM CV19 que também
pertencente ao filo Proteobacteria classe γe representa 6 % dos isolados
(Figura 5), tem a sua ocorrência demonstrada em frutos de café no estádio
cereja. A S. typhimurium é descrita como uma das entéricas que não produz
doença em plantas, porém associa-se ás de tomate em cultura hidropônica
(GUO et al., 2002). Espécies de Salmonella enterica têm sido relatadas como
endofíticas em cenoura, alfafa, tomate e rabanete (GUO et al., 2002; COOLEY
et al., 2003; ISLAME et al., 2004). Embora a ocorrência de S. typhimurium
como endofítica associada à casca de fruto de café no México já tenha sido
demonstrada (VEGA et al, 2005), a constatação em frutos cereja de Catuaí
Vermelho constitui-se em acréscimo sobre os nichos ocupados por essa espécie.
O seqüenciamento e análise de seqüências de rDNA 16S de isolados
para os quais não foram encontrados perfis comparáveis na biblioteca de
referência, armazenada em banco de dados para microrganismos aeróbios de
amostras ambientais do sistema (TSBA 50 5.00), complementaram as análises
da ocorrência de espécies cultiváveis em frutos de café no estádio cereja.
As árvores reconstruídas com dados de seqüências de bases de rDNA
16S mostraram grupos de bactérias pertencentes aos filos Proteobacteria
classe γ, Firmicutes e Actinobacteria, pelo método de distância e máxima
parcimônia de Neighbor-joining, com teste bootstrap (1000 réplicas), elas não
mostraram diferenças em topologia com o uso do programa MEGA 4.0®.
43
No que se refere às Firmicutes, a maioria dos isolados são agrupados no
mesmo ramo da classe Bacilli, ordem Bacillales, família Bacillaceae, com as
seqüências do isolado LEM CV46 no mesmo ramo de Bacillus niacini
AJ211160.1 (Figura 6). Isolado dessa espécie, B. niacini EM001, produz a
ofloxacina, um potente agente antimicrobiano para um amplo espectro de
espécies de bactérias patogênicas (HYUNG et al., 2004). As literaturas
relacionadas a essa bactéria e a endofíticas, associadas à rizosfera e tecidos
de plantas, não incluem essa espécie como endofítica. Dessa forma, os
resultados do sequenciamento e da identificação do isolado LEM CV46 como
um B. niacini associado a fruto de Coffea arabica L. no Brasil é fato relevante
para a pesquisa biotecnológica, pelo potencial como produtor de antimicrobianos
em frutos de café. A árvore reconstruída pelo método de máxima parcimônia de
Neighbor-joining (Figura 6) mostra os ramos suportados por altos valores de
bootstrap para os isolados, LEM BV02 obtido a 687 m de altitude; LEM BV4 a
1013 m; LEM CA08 a 1.062 m; LEM CA17 a 1.187 m; LEM BV24 a 1.067 m e
LEM BA27 a 1.067 m. Possivelmente, são todos da mesma espécie e
provavelmente as espécies não se distinguem por cultivares em altitudes
diferentes ou, ao contrário, cultivares distintas podem abrigar a mesma espécie
em altitudes similares, sob as condições geográficas e climáticas da área
amostrada.
82
LEM BV02
LEM BV04
LEM CA08
LEM CA17
LEM CV21
LEM BV24
89
LEM BA27
LEM CA31
LEM CV34
LEM CV46
Bacillus niacini AJ211160.1
Brevibacillus brevis EU327889.1
Bacillus drentrensisAJ542506.1
Bacillus endophyticus EU221417.1
Staphylococcus epidermis EF522128.1
Bacillus cereus EU365680.1
Bacillus mycoides EU221418.1
Bacillus acidocola AF547209.1
Bacillus sporothermodurans AF329476.1
Bacillus subtilis EU304956.1
Figura 6 – Árvore filogenética mostrando as relações de identidades de
isolados de bactérias endofíticas a microrganismos taxonomicamente similares ao filo Firmicutes baseadas nas seqüências de
rDNA 16S, construída pelo método de máxima parcimônia por NJ.
44
A reconstrução das relações entre treze dos isolados identificados como
Proteobacteria classe γmostra doze deles como de Enterobacteriaceae e uma
de Pseudomonadaceae (Figura 6). A LEM BV39 foi obtida de frutos coletados a
687 m e está possivelmente relacionada à E. amnigenus EU340927.1
(Figura 7). Esta espécie produz arylsulfato sulfotransferase, importante enzima
na transformação de compostos fenólicos tóxicos a não-tóxicos (AE-RAN et al.,
1999). Ela possui comprovada capacidade para integrar e expressar genes
similares aos seus, como os de Bacillus thuringienses subsp israelensis e
Bacillus sphaericus, para controle biológico (SUTIPA et al., 2003). Além disso,
produz heteropolímeros constituídos por D-glucose, D-galactose, D-manose e Lfucose
em
beterraba
armazenada,
e
outros
oligossacarídeos
que
desempenham papel de importância na interação micróbio-hospedeiro e em
numerosos eventos de sinalização (CESCUTTI et al., 2005). As cultivares de
Bourbon a uma mesma altitude abrigam bactérias similares desse filo, como
LEM BA03 e LEM BV05 ambas a 956 m.
88
LEM BA03
LEM BV05
LEM BV06
LEM CV07
LEM CA09
LEM BV10
LEM BA12
LEM CA14
LEM CA15
LEM CV22
LEM CA29
LEM BA32
Klebsiella oxytoca AB353045.1
Enterobacter hormaechei EU239367.1
Enterobacter asburiae EU301774.1
Enterobacter Cloacae DO202394.1
Klebsiella pneumoniae EF633998.1
LEM BV39
81
Enterobacter amnigenus EU340927.1
Pantoea ananatis EF178449.1
Pantoea agglomerans EU130700.1
Enterobacter agglomerans AF130952.1
Pseudomonas sp. DO832313.1
Pseudomonas putida AM930519.1
Figura 7 – Árvore filogenética mostrando as relações de identidade de isolados
de bactérias endofíticas a microrganismos taxonomicamente similares
ao filo Proteobacteria, classe γ, baseado nas seqüências de rDNA
16S, construída pelo método de máxima parcimônia por NJ.
45
A análise filogenética dos isolados de bactérias endofíticas mostra
identidades com as espécies: Klebsiella oxytoca AB353045.1, Enterobacter
hormaechei EU239367.1, E. asburiae EU301774.1, E. cloacae DO202394.1,
Pantoea ananatis EF178449.1, P. agglomerans EU130700.1 E. agglomerans
AF130952.1.
A
Klebsiella
oxytoca,
uma
das
espécies
da
família
Enterobacteriaceae, já foi isolada como endofíticas de frutos de café sadios
(GENARI, 1999). O autor demonstrou que ela produz e conserva a pectatoliase intracelularmente em meio mínimo adicionado de pectina cítrica. P.
agglomerans também foi já isolada de pedúnculo e sementes de frutos de café
coletados na Colômbia, México e Hawai. Os relatos demonstraram que várias
espécies da família da Enterobactereacea são bactérias endofíticas associadas
a cafeeiros Vega et al. (2005).
As relações de identidade de bactérias taxonomicamente incluídas como
Actinobacteria, com base nos dados do seqüenciamento de rDNA 16S, na
árvore reconstruída pelo método de máxima parcimônia por Neighbor-joining
mostra alto valor de bootstrap da LEM CA01 a 676 m e LEM CV37 a 1.187 m, e
origem comum a Microbacteriaceae (Figura 8). A hipótese de que espécies de
Catuaí distintas, localizadas a diferentes altitudes, provavelmente abrigam
espécies de Microbacterium não pode ser descartada.
Microbacterium trichothecenolyticum AB167383.1
Microbacterium flavescens Y17232.1
Microbacterium hominis AB004727.1
Microbacterium xylanilyticum AJ853908.1
Microbacterium takaoensis AB201047.1
LEM CA01
LEM CV37
Curtubacterium flaccumfaciens EU236756.1
Figura 8 – Árvore filogenética mostrando as relações de identidade de isolados
de bactérias endofíticas a microrganismos taxonomicamente
similares ao filo Actinobacteria baseados nas seqüências de rDNA
16S, construída pelo método de máxima parcimônia por NJ.
A análise da densidade de bactérias endofíticas cultiváveis por
FAME/MIDI, ao distinguir os principais grupos taxonômicos de bactérias
encontrados, mostrou também a identificação de aproximadamente 35,42 %
46
dos isolados como espécie. Ao mesmo tempo, por esta técnica 41,66 % não
foram discriminados a esse nível, porém com perfil de Enterobacteriaceae,
grupo para o qual o MIDI ainda não representa o método de escolha.
No seqüenciamento direto de rDNA 16S, foram encontradas similaridade
de identidade com seqüências depositados no GenBank suficientes para as
inferências filogenéticas das 28 seqüências que apresentavam identidade
maior do que 400 pb, para análise pelo Blast, ou seja, 58,33 % das seqüências
geradas foram aproveitadas. A análise completa de populações de endofíticas
muitas vezes requer a integração de identificações fenotípicas e genotípicas,
para a melhor interpretação da comunidade analisada.
4.3. Estrutura genética de comunidades de bactérias endofíticas
As análises pelos perfís eletroforéticos de fragmentos de rDNA 16S
amplificados, com emprego de primer universal, para o total de bactérias
endofíticas e epifíticas e para as endofíticas associadas aos fruto de café,
(Figuras 9 e 10) revelaram a presença de diversidade distinta entre as
endofíticas e o total de bactérias, nos géis de DGGE (Figuras 11 e 12). Assim,
foram 90 as Unidades Taxonômicas Operacionais (UTOs) identificadas nos
géis como total, endofíticas e epifíticas, 62 as UTOs das endofíticas, em frutos
das quatro cultivares de Coffea arabica L. (Figura 13).
A estimativa de Riqueza de espécies (R) evidencia o maior valor para as
UTOs de bactérias totais nos frutos de Bourbon Amarelo (amostra 3), de
lavoura em altitude de 687 m, seguida da detectada em Catuaí Amarelo a
676 m (amostra 1) (Figura 13). Em contraposição, o menor valor de R é o
observado para a amostra 8, de Catuaí Vermelho em 1.013 m de altitude. Na
Catuaí Vermelho, a altitude parece não influir no valor de R das bactérias
endofíticas, uma vez que tanto o maior quanto o menor valor de R foram das
amostras coletadas em altitude superior a 1.013 m (Figura 13). Embora os
resultados não tenham o tratamento estatístico desejável, por limitações
inerentes aos objetivos do estudo e procedimentos utilizados, infere-se que
provavelmente será confirmada a leitura de que os maiores valores de R para
comunidades de bactérias totais sejam os em altitudes menores, enquanto o
47
CV -1187 m
CA-1187 m
BA-1101 m
BA-1067 m
BV-1067 m
BA- 1062 m
CV -1013 m
CA-1013 m
CA- 956 m
CV -956 m
BV-687 m
BA- 687 m
CV -676 m
CA-676 m
Coffea arabica L. cultivares
CV-1187 m
CA-1187 m
BA-1101 m
BA-1067 m
BV-1067 m
BA-1062 m
CV-1013 m
CA-1013 m
CA-956 m
CV-956 m
BV-687 m
BA-687 m
CV -676 m
CA-676 m
Figura 9 – Eletroforese em gel de agarose a 1,2 % do produto de amplificação
por PCR de fragmento de rDNA 16S, com primer F984GC/R1378,
do total de bactérias presentes em frutos, endofíticas e epifíticas, de
4 cultivares de Coffea arabica L. em diferentes altitudes. M-100 pb
de DNA Ladder, B = branco; CA = Catuaí Amarelo; CV = Catuaí
Vermelho; BA = Bourbon Amarelo; e BV = Bourbon Vermelho.
Coffea arabica L. cultivares
Figura 10 – Eletroforese em gel de agarose a 1,2 % do produto de amplificação
por PCR de fragmento de rDNA 16S, com primer F984GC/R1378,
de bactérias endofíticas presentes em fruto de 4 cultivares de
Coffea arabica L. a diferentes altitudes. M-100 pb de DNA Ladder,
B = branco; CA = Catuaí Amarelo; CV = Catuaí Vermelho; BA =
Bourbon Amarelo; e BV = Bourbon Vermelho.
48
CV-1187 m
CA-1187 m
BA-1101 m
BA-1067 m
BA-1062 m
BV-1067 m
CA-1013 m
CA-956 m
CV -1013 m
BV- 687 m
CV -956 m
CV- 676 m
BA-687 m
CA- 676 m
CV-1187 m
CA-1187 m
BA-1101 m
BV-1067 m
BA-1067 m
BA-1062 m
CV -1013 m
CA-1013 m
CV -956 m
BV -687 m
BA-687 m
CV-676 m
CA-676 m
CA-956 m
CV -1187 m
CA-1187 m
BA-1067 m
BA-1101 m
BV -1067 m
BA-1062 m
CA-1013 m
CA-956 m
CV -1013 m
BV -687 m
CV-956 m
BA-687 m
CV-676 m
CA-676 m
CV -1187 m
CA-1187 m
BA-1101 m
BA-1067 m
BV-1067 m
BA-1062 m
CA-1013 m
CV-1013 m
CA-956 m
CV-956 m
BV -687 m
BA-687 m
CV -676 m
CA-676 m
Figura 11 – Perfis eletroforéticos de DDGE de seqüências de rDNA 16S,
amplificadas com primer universal F984GC/R1378, das bactérias
endofíticas presentes em frutos de 4 cultivares de Coffea arabica L.
coletadas a diferentes altitudes. A = imagem real; B = imagem
invertida; CA: Catuaí Amarelo; CV = Catuaí Vermelho; BA =
Bourbon Amarelo; e BV = Bourbon Vermelho.
Figura 12 – Perfis eletroforéticos de DDGE de seqüências de rDNA 16S,
amplificadas com primer universal F984GC/R1378, do total de
bactérias, endofíticas e epifíticas, presentes em frutos de 4
cultivares de Coffea arabica L. em diferentes altitudes. A = imagem
real; B = imagem invertida; CA = Catuaí Amarelo; CV = Catuaí
Vermelho; BA = Bourbon Amarelo; e BV = Bourbon Vermelho.
49
Riqueza (R)
14
nº de UTOs
12
10
8
6
4
2
0
1
2
3
4
5
6
7
50
8
9
10 11 12 13 14
maior número de UTOs de endofíticas venham a ser encontradas nas maiores
altitudes. Provavelmente, o efeito da altitude sobre espécies de bactérias em
frutos de cultivares de café será mais pronunciado em endofíticas cultiváveis e
não-cultiváveis.
O Índice de diversidade considerando, bactérias totais, é maior em
Bourbon Amarelo (amostra 3) e corresponde ao da altitude de 687 m, enquanto
o menor corresponde a Catuaí Vermelho (amostra 6) a 956 m (Figura 13).
Entretanto, para a comunidade bacteriana endofítica esse maior índice de
diversidade é o correspondente a Catuaí Vermelho (amostra 8) a 1.013 m, e o
menor a Catuaí Amarelo (amostra 1) a 676 m. Os valores mais altos de Índice
de Diversidade Shannon-Weaver (H´) mostram que o número de elementos
individuais, UTOs, encontram-se distribuídos de forma mais ampla entre as
espécies que constituem uma dada comunidade. Por este motivo, é possível
que as espécies que compõem a comunidade de endofíticas na Catuaí
Vermelho, a 1.013 m, apresente indivíduos de poucas espécies, contrastando,
na Catuaí Amarelo a comunidade de bactérias endofíticas provavelmente está
representada por muitas.
Eqüitabilidade é outro índice a indicar para eubactérias totais que os
valores mínimos foram encontrados para Catuaí Vermelho a altitude de 956 m
(amostra 6), enquanto na comunidade de eubactérias endofíticas esses valores
foram para Catuaí Amarelo a 676 m (amostra 1) e 1.189 m (amostra 1)
(Figura 13).
A utilização de grupos de primers específicos resultou na constatação da
existência, nos frutos de Bourbon e Catuaí, de bactérias pertencentes a γProteobacteria, Firmicutes e Actinobacteria. A eficiência na amplificação de
fragmentos de rDNA 16S para os diferentes primer foi demonstrada com o uso
de controles positivos, ou seja, o DNA extraído de culturas pura de:
Agrobacterium tumefaciens; ATCC12136 para α-Proteobactéria, Alcaligenes
xylosoxydans ATCC13138, para β-Proteobacteria; Pseudomonas putida
ATCC15175 para γ-Proteobacteria e Bacillus subtilis ATCC 23858 para
Firmicutes.
A amplificação de fragmento de rDNA 16S nas amostras com o uso dos
primers específicos, para α- proteobacteria e para β-Proteobacteria não
ocorreu para a comunidade de endofíticas. Referida amplificação foi obtida
51
para os controles positivo de cada grupo de bactéria e, por isso, asseguram a
eficiência destes iniciadores. A utilização de uma segunda estratégia para
verificar a eficiência destes grupos de primer, em que o DNA foi submetido a
novas reações de PCR, com os iniciadores a diferentes gradientes de
temperatura, de 40,8 até 55,8 ºC para α-Proteobacteria e 50,8 até 58,2 ºC, para
β-proteobacteria, e a um aumento na quantidade de DNA μL-1 na reação,
confirmou a ausência de amplificação de fragmentos de rDNA 16S para estes
grupos de bactérias. Desta forma, a confirmação de ausência de amplificação
nas duas estratégias foi interpretada como ausência das Proteobacteria, classe
alfa e classe beta, entre as bactérias endofíticas de frutos em cultivares de
Catuaí e Bourbon. A literatura sobre bactérias endofíticas em tecidos de
plantas considera como possível a presença de representantes de αProteobacteria como endofíticas associadas em rizosfera de arroz, banana,
cítricos, cenoura e café, entre outras (ROSENBLUETH e MARTINEZROMERO, 2006). Contudo, na literatura consultada inexiste relato de αProteobacterias endofíticas em frutos de café. É possível que a ausência de βProteobacteria associadas a frutos de café na zona da Mata Norte em Minas
Gerais se deva a condições prevalecentes na região, uma vez que já existem
relatos da presença de Burkholderia, uma β-proteobacteria, na Colômbia,
México e Hawaii (VEGA et al., 2005).
Os perfis de bandas de bactérias endofíticas em DGGE montram
resultados da ocorrência de membros pertencentes aos filos, Actinobacteria
(Figura 14), β-Proteobacteria (Figura 15) e Firmicutes (Figura 16), em frutos de
café das cultivares de Bourbon e Catuaí, coletados em várias altitudes.
O maior valor de R correspondeu a Firmicutes, seguido de γProteobacteria, com 84 UTOs, e as 50 representantes das Actinobacteria
(Figura 18).
A maior riqueza de espécie de Firmicutes foi em Bourbon Amarelo a
687 m (amostra 3), e a menor em Catuaí Amarelo a 676 m (amostra 2), contudo,
a ocorrência de γ-Proteobacteria foi observada na maioria das amostras,
excetuando-se em amostra correspondente a Catuaí Amarelo a 687 m (amostra
1). Os maiores valores de R são os de γ-Proteobacteria associadas à Catuaí
Vermelho a 1.187 m (amostra 14), seguido dos de Bourbon Vermelho e Amarelo
à 1.067 m (amostras 10 e 11). A menor representação de endofíticas incluídas
52
CV-1187 m
CA-1187 m
BA-1101 m
BV- 1067 m
BA-1067 m
BA-1062 m
CA-1013 m
CA-956 m
CV-1013 m
BV- 687 m
CV-956 m
CV- 676 m
BA-687 m
CA-676 m
CV-1187 m
CA-1187 m
BA- 1101 m
BV-1067 m
BA-1067 m
BA-1062 m
CV-1013 m
CA- 1013 m
CV-956 m
CA-956 m
BV-687 m
CV-676 m
BA-687 m
CA-676 m
Figura 14 – Perfis eletroforéticos de DDGE de seqüências de rDNA 16S
amplificadas inicialmente com primer BLS342F/1392R e
posteriormente com primer universal F984GC/R1378 por PCRNested do DNA de bactérias totais de fruto de 4 cultivares de
Coffea arabica L. coletadas em diferentes altitudes. A = imagem real;
e B = imagem invertida. Bactérias-referência: Alcaligenes xyloxidans
ATCC13138, Agrobacterium tumefaciens ATCC 12136, Bacillus
cereus ATCC 14579, Bacillus subtilis ATCC 23858, Escherichia coli
ATCC 29922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, P.
fluorescens ATCC 13525, P. putida ATCC 15176 e Staphylococcus
aureus ATCC 12692. CA = Catuaí Amarelo, CV = Catuaí Vermelho;
BA = Bourbon Amarelo; e BV= Bourbon Vermelho.
como Actinobacteria, ou mesmo a ausência como em Catuaí Vermelho a
676 m (amostra 2) e Bourbon Amarelo a 687 m (amostra 3), Catuaí Vermelho a
956 m (amostra 5), Catuaí Amarelo a 1.013 m (amostra 7) e Catuaí Vermelho a
1.013 m (amostra 8), pode não corresponder à verdadeira representatividade
de endofìticas desse filo em frutos de café, uma vez que outros autores, em
análises de comunidades de Actinobacteria, utilizando DGGE concluíram que o
primer F243 provavelmente não seja eficiente para todos os membros dentro
do filo Actinobacteria (HEUER et al., 1997). Os autores consideram que ainda
assim este iniciador poderá ser utilizado quando o objetivo é o conhecimento
inicial da estrutura da comunidade de Actinomycetes em amostras ambientais,
e por isso foi utilizado no presente estudo. O maior R deste grupo de bactérias
correspondeu a Catuaí Amarelo a 676 m (amostra 1) e o menor a Bourbon
Amarelo a 1.101 m (amostra 12).
53
CV-1187 m
BA-1101 m
CA-1187 m
BV-1067 m
BA- 1067 m
BA-1062 m
CA-1013 m
CA- 956 m
CV-1013 m
CV-956 m
BV-687 m
CV-676 m
BA-687 m
CA- 676 m
CV-1187 m
CA-1187 m
BA-1101 m
BV-1067 m
BA-1067 m
BA- 1062 m
CA-1013 m
CA-956 m
CV-1013 m
CV- 956 m
BV- 687 m
BA-687 m
CV-676 m
CA-676 m
Figura 15 – Perfis eletroforéticos de DDGE de seqüências de rDNA 16S
amplificadas inicialmente com primer FD2/R1492 e posteriormente
com primer universal F984GC/R1378 por PCR-Nested de DNA de
bactérias totais de fruto de 4 cultivares de Coffea arabica L.
coletadas em diferentes altitudes. A = imagem real; B = imagem
invertida. Bactérias-referência: Alcaligenes xyloxidans ATCC13138,
Agrobacterium tumefaciens ATCC 12136, Bacillus cereus ATCC
14579, Bacillus subtilis ATCC 23858, Escherichia coli ATCC
29922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Ps. Fluorescens
ATCC 13525, Ps. Putida ATCC 15176 e Staphylococcus aureus
ATCC 12692. CA = Catuaí Amarelo; CV = Catuaí Vermelho; BA =
Bourbon Amarelo; e BV = Bourbon Vermelho.
Em resumo, a ocorrência de um maior número de UTO´s para
representantes de γ-Proteobacteria em amostras de frutos coletados nas
maiores altitudes contrasta com a menor riqueza de Actinobacteria a essas
altitudes (Figura 18). Firmicutes mostram presença em todas as amostras, porém
com perfís de distribuição irregular nas diferentes altitudes analisadas, uma
provável indicação de melhor adaptação às diferentes altitudes das Firmicutes.
Para o índice de Diversidade de Shannon-Weaver (H`) a maior
diversidade de Firmicutes foi a Bourbon Amarelo a 687 m (amostra 3) , e a
menor em Catuaí Vermelho a 676 m (amostra 2). A maior diversidade de γProteobacteria corresponde a Bourbon Amarelo (amostra 10) e Vermelho
(amostra 11) a 1.067 m, enquanto Actinobacteria mostram maior diversidade
em Catuaí Amarelo a 676 m (amostra 1) e um valor menor em Bourbon
Amarelo a 1.101 m ( amostra 12) (Figura 17).
54
CV-1 187 m
CA-1 187 m
BA -110 1 m
B A-1 067 m
BV-1 067 m
B A-10 62 m
BV- 687 m
C A-9 56 m
C A-67 6 m
C V-118 7 m
CA -1 18 7 m
BA -10 67 m
BV-1 067 m
BA -11 01 m
BA-1 06 2 m
CA- 956 m
B V-68 7 m
CA-6 76 m
Figura 16 – Perfis eletroforéticos de DDGE de seqüências de rDNA 16S
amplificadas inicialmente com primer F243GC/R1378 e
posteriormente com primer universal F984GC/R1378 por PCRNested de DNA de bactérias totais de fruto de 4 cultivares de
Coffea arabica L. coletadas em diferentes altitudes. A = imagem
real; B = imagem invertida. Bactérias-referência: Alcaligenes
xyloxidans ATCC13138, Agrobacterium tumefaciens ATCC 12136,
Bacillus cereus ATCC 14579, Bacillus subtilis ATCC 23858,
Escherichia coli ATCC 29922, Pseudomonas aeruginosa ATCC
27853, Ps. Fluorescens ATCC 13525, Ps. Putida ATCC 15176 e
Staphylococcus aureus ATCC 12692. CA = Catuaí Amarelo; CV =
Catuaí Vermelho; BA = Bourbon Amarelo; e BV= Bourbon Vermelho.
Com relação à Eqüitabilidade (Figura 17) foram encontrados os maiores
valores para Catuaí Amarelo (amostra 1) a 676 m, Bourbon Vermelho (amostra
4) a 687 m e Catuaí Amarelo (amostra 13) a 1.187 m, para representantes de
Firmicutes. Entretanto, para γ-Proteobacteria corresponderam a Bourbon
Vermelho a 687 m (amostra 4), e Actinobacteria a Bourbon Amarelo a 1.101 m
(amostra 12) e Catuaí Amarelo (amostra 1) a 676 m.
A utilização de diferentes grupos de primers nas análises permitiu
melhor interpretação da estrutura das comunidades de bactéria endofíticas
associadas a frutos de café de cultivares coletadas a diferentes altitudes,
demonstrando que a diversidade compreende uma variabilidade intra e
interespecífica em determinado ambiente. A diversidade avaliada por DGGE
representa esta mesma variabilidade nas amostras analisadas. É sabido que a
quantificação da diversidade requer o agrupamento de elementos individuais,
55
Riqueza (R)
14
nº de UTOs
12
10
8
6
4
2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14
Índice de Diversidade de Shannon-We ave r (H`)
3
2,5
2
H` 1,5
1
0,5
0
1
2
3
4
5
6
7
56
8
9 10 11 12 13 14
cultivares de Coffea arabica L., não só é fundamental para a compreensão da
influência das condições do ambiente sobre ocorrência e diversidade de
bactérias epifíticas e endofíticas em fruto de café, mas também para a
determinação do possível papel funcional e aplicações biotecnológias dessa
comunidade na planta.
Este é o segundo trabalho realizado com bactérias endofíticas
cultiváveis associadas a frutos de café, com identificação fenotípica mediante
sistema FAME/MIDI. No entanto, é o primeiro relato onde se analisa a
diversidade de bactérias endofítica em quatro cultivares de C.arabica L. em
diferentes altitudes, integrando, resultados de sequenciamento dos isolados de
bactérias e a identificação da estrutura das comunidades endofíticas,
representadas em três filos de bactérias, γ-Proteobacteria, Firmicutes e
Actinobacteria utilizando Nested-PCR e DGGE.
Finalmente, no presente estudo de diversidade de bactérias endofíticas
e epifíticas em cultivares de Coffea arabica L. foi demonstrada a existência de
uma alta diversidade de bactérias endofíticas cultiváveis pertencentes aos três
filos γ-Proteobacteria, Firmicutes e Actinobacteria associadas aos frutos de
café no estádio cereja originados de diferentes condições de altitude da Zona
da Mata Norte, Minas Gerais e também que a densidade populacional de
bactérias totais e das endofíticas provavelmente são influenciadas por estas
variáveis.
A técnica de DGGE com uso de primer específicos para γProteobacteria, Firmicutes e Actinobacteria na análise de bactérias não
cultiváveis, demonstrou a presença de alta diversidade de endofíticas
representadas nestes grupos associados as quatro cultivares de Coffea
arábica L., onde possivelmente desenvolvem um papel fundamental, a ser
elucidados em futuro próximo.
58
5. CONCLUSÕES
Foram identificados e descritos 48 morfotipos de bactérias entre os 134
isolados de endofíticas do banco de cultura.
A densidade de bactérias endofíticas encontra-se na faixa de 104 a
106 UFC.fruto-1.
A altitude da lavoura influencia na densidade de bactérias endofíticas
nos frutos, como também a cultivar.
Foi constatada a existência de uma relação positiva entre densidades de
bactérias endofíticas e altitude.
As análises fenotípicas pelo FAME/MIDI revelaram que a comunidades
endofítica está composta por populações de Actinobacteria (47,05 %), γProteobacteria (41,17 %) e de Firmicutes com 11,76 %.
Pectobacterium
carotovorum/carotovorum
foi
isolada
nas
quatro
cultivares em altitudes superiores a 1.000 m, enquanto Curtobacterium
flaccumfaciens foi encontrada somente nas duas espécies de Catuaí nessa
mesma altitude.
A análise com uso de seqüências de rDNA 16S, mostrou que a
comunidades está formada por populações pertencentes a Firmicutes, família
Bacillaceae; γ-Proteobacteria, famílias Pseudomonadacae e Enterobacteriaceae;
e Actinobacteria, família Microbacteriacea.
As
ocorrências
Pectobacterium
de
Staphylococcus
carotovorum/carotovorum,
59
simulans,
Salmonella
Bacillus
niacini,
typhymurium,
Enterobacter amnigenus, Brevibacterium epidermidis/iodium, são pela primeira
vez relatada como bactérias endofíticas associadas aos frutos de cafeeiros nas
quatro cultivares de Coffea arabica L.
As análises de diversidade de bactérias totais, endofíticas e epifíticas,
por PCR-DGGE utilizando primer universal (F948GC/R1378), revelaram a
presença de 80 unidades taxonômicas operacionais (UTOs), enquanto a
riqueza de endofíticas correspondeu a 64 UTOs. Entretanto, com a utilização
de grupos de primers específicos, Nested-PCR, a diversidades de bactérias
endofíticas correspondeu a uma riqueza de 110 UTOs para o filo Firmicutes, 71
para γ-Proteobacteria e 50 UTOs para Actinobacteria.
A constatação da existência de diversidade de bactérias endofíticas em
C. arabica evidencia a urgências de estudos funcionais desta microbiota,
especialmente com relação a compostos precursores de aroma, sabor e
acidez, de interesse para a produção comercial de cafés de qualidade superior.
60
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74
APÊNDICE
75
APÊNDICE A
Tabela 1A – Composição de meio R2A
-1
Ingredientes
Concentração g.L
Extrato de Levedura
Peptona Protease
Casoaminoácido
Glicose
Amido solúvel
Piruvato de sódio
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,3
K2 HPO4
0,3
MgSO4. 7H 2O
Agar
Ajustar para pH: 7,2
0,05
15,0
Fonte: Reasoner e Geldreich, (1985).
Tabela 2A – Descrição das características morfológicas dos grupos de
bactérias endofíticas isolados em meio R2A de frutos de
76
Tabela 2A, Cont.
Isolado
Características morfológicas
LEM12
Colônia de tamanho grande com aspecto liso, cremoso, com borda irregular,
superfície côncava, coloração branca e crescimento a 24 horas
LEM13
Colônia de tamanho pequena com aspecto liso, cremoso, com borda irregular,
superfície côncava, coloração amarela e crescimento a 24 horas
LEM14
Colônia de tamanho mediana com aspecto liso, cremoso, com borda irregular,
superfície côncava, coloração bege e crescimento a 24 horas
LEM15
Colônia de tamanho mediana com aspecto liso, cremoso, com borda irregular,
superfície côncava, coloração braça com halos de mesma cor e crescimento a 24
horas
LEM16
Colônia de tamanho mediana com aspecto cremoso, com borda irregular,
superfície côncava, coloração bege e crescimento a 24 horas
LEM17
Colônia de tamanho pequeno com aspecto cremoso, com borda liso, superfície
côncava, coloração rosa e crescimento a 72 horas
LEM18
Colônia de tamanho mediana com aspecto cremoso, com borda liso, superfície
côncava, coloração amarelo e crescimento a 72 horas
LEM19
Colônia de tamanho mediana com aspecto cremoso, com borda irregular,
superfície côncava, coloração bege e crescimento a 24 horas
LEM20
Colônia de tamanho mediana com aspecto cremoso, com borda irregular,
superfície côncava, coloração amarelo e crescimento a 24 horas
LEM21
Colônia de tamanho pequena com aspecto cremoso, com borda irregular,
superfície côncava, coloração branca e crescimento a 24 horas
LEM22
Colônia de tamanho grande com aspecto cremoso, com borda irregular, superfície
côncava, coloração bege e crescimento a 24 horas
LEM23
Colônia de tamanho mediano com aspecto cremoso, com borda irregular,
superfície côncava, coloração bege e crescimento a 24 horas
LEM24
Colônia de tamanho pequena com aspecto cremoso, com borda irregular,
superfície côncava, coloração bege e crescimento a 24 horas
LEM25
Colônia de tamanho mediana com aspecto cremoso, com borda irregular,
superfície convexo, coloração bege e crescimento a 24 horas
LEM26
Colônia de tamanho mediana com aspecto cremoso, com borda, superfície
côncavo, coloração bege e crescimento a 24 horas
LEM27
Colônia de tamanho pequena com aspecto cremoso, com borda liso, superfície
côncavo, coloração bege e crescimento a 72 horas
LEM28
Colônia de tamanho pequena com aspecto cremoso, com borda irregular,
superfície côncavo, coloração bege e crescimento a 96 horas
LEM29
Colônia de tamanho pequena com aspecto cremoso, com borda lisa, superfície
côncavo, coloração braça e crescimento a 72 horas
LEM30
Colônia de tamanho pequena com aspecto cremoso, com borda irregular,
superfície côncavo, coloração rosa e crescimento a 96 horas
LEM31
Colônia de tamanho pequena com aspecto cremoso, com borda irregular,
superfície côncavo, coloração amarelo e crescimento a 96 horas
LEM32
Colônia de tamanho pequena com aspecto cremoso, com borda irregular,
superfície côncavo, coloração bege e crescimento a 120 horas
Continua...
77
Tabela 2A, Cont.
Isolado
Características morfológicas
LEM33
Colônia de tamanho mediana com aspecto cremoso, com borda irregular,
superfície côncavo, coloração amarelo e crescimento a 24 horas
LEM34
Colônia de tamanho pequena com aspecto cremoso, com borda irregular,
superfície côncavo, coloração bege e crescimento a 24 horas
LEM35
Colônia de tamanho mediana com aspecto cremoso, com borda irregular,
superfície côncavo, coloração rosa e crescimento a 96 horas
LEM36
Colônia de tamanho pequena com aspecto cremoso, com borda irregular,
superfície côncavo, coloração branca e crescimento a 120 horas
LEM37
Colônia de tamanho mediano com aspecto cremoso, com borda irregular,
superfície côncavo, coloração amarelo e crescimento a 24 horas
LEM38
Colônia de tamanho mediana com aspecto cremoso, com borda irregular,
superfície côncavo, coloração amarelo e crescimento a 24 horas
LEM39
Colônia de tamanho pequena com aspecto cremoso, com borda irregular,
superfície côncavo, coloração bege e crescimento a 24 horas
LEM40
Colônia de tamanho pequena com aspecto cremoso, com borda irregular,
superfície côncavo, coloração branca e crescimento a 24 horas
LEM41
Colônia de tamanho pequena com aspecto cremoso, com borda irregular,
superfície côncavo, coloração branca e crescimento a 120 horas
LEM42
Colônia de tamanho mediana com aspecto cremoso, com borda irregular,
superfície côncavo, coloração amarelo e crescimento a 120 horas
LEM43
Colônia de tamanho grande com aspecto cremoso, com borda irregular, superfície
côncavo, coloração amarelo e crescimento a 24 horas
LEM44
Colônia de tamanho grande com aspecto cremoso, com borda liso, superfície
côncavo, coloração amarelo e crescimento a 48 horas
LEM45
Colônia de tamanho pequeno com aspecto cremoso, com borda liso, superfície
côncavo, coloração bege e crescimento a 48 horas
LEM46
Colônia de tamanho mediano com aspecto cremoso, com borda liso, superfície
côncavo, coloração amarelo e crescimento a 72 horas
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Colônia de tamanho mediano com aspecto cremoso, com borda irregular,
superfície côncavo, coloração bege e crescimento a 72 horas
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Colônia de tamanho pequeno com aspecto cremoso, com borda irregular,
superfície côncavo, coloração amarelo e crescimento a 24 horas
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