IES – INSTITUTO DE EDUCAÇÃO DA SAÚDE FERNANDA APARECIDA TAVARES DANIELA VALÉRIO SILVA MICROBIOLOGIA ENDODÔNTICA – UMA REVISÃO DO PROCESSO BELO HORIZONTE 2011 Microbiologia Endodôntica – Uma Revisão do Processo FERNANDA APARECIDA TAVARES DANIELA VALÉRIO SILVA MICROBIOLOGIA ENDODÔNTICA – UMA REVISÃO DO PROCESSO MONOGRAFIA- ESPECIALIZAÇÃO EM ENDODONTIA ORIENTADOR: WARLEY LUCIANO FONSECA TAVARES BELO HORIZONTE 2011 RESUMO A ecologia microbiana se foca na inter-relação entre microorganismos e o meio onde vivem. Em um ecossistema em desenvolvimento, certas espécies denominadas organismos pioneiros são os primeiros colonizadores. Estas espécies geralmente são substituídas por outras após a modificação de seu habitat, fazendo com que o mesmo seja mais adequado ao desenvolvimento destas. As doenças infecciosas representam uma categoria de interações que envolvem um hospedeiro frente à microorganismos com potenciais colonizadores e patogênicos. m certas situações, tais microorganismos podem invadir locais normalmente estéreis do nosso organismo, como o tecido pulpar, tornando-se assim microorganismos oportunistas. As lesões traumáticas e as lesões cariosas são as principais vias de infecção do tecido pulpar. Uma vez reconhecida a presença de microorganismos e seus subprodutos nos túbulos dentinários, um processo imuno-inflamatório é arquitetado neste tecido. Existem vários mecanismos através dos quais os microorganismos se adaptam ao meio. A formação de biofilmes, modificação fisiológica, resposta ao stress, e a criação de subpopulações de células estão entre os mecanismos de adaptação usados pelas bactérias juntamente com vários mecanismos envolvendo trocas genéticas. A interação entre os componentes bacterianos e não bacterianos de um ecossistema levam à formação de uma estabilização onde formas microbianas e não microbianas coexistem com seu meio. Esta comunidade clímax se mantém relativamente estável e reflete uma situação dinâmica, onde células morrem e são substituídas. A diversidade bacteriana em qualquer ambiente é subestimada quando analisada por técnicas por meio de cultura. A aplicação de métodos genéticos moleculares na análise da diversidade bacteriana na cavidade oral tem revelado um spectro bacteriano maior do que antes apreciado. Existe então a possibilidade de espécies incultiváveis e ainda não caracterizadas que permanecem indetectáveis em estudos por métodos tradicionais de identificação e podem fazer parte de uma larga fração da microbiota oral que participa da etiologia de doenças orais, incluindo doenças periapicais. O objetivo deste estudo é fazer uma revisão da literatura de como ocorre a dinâmica das infecções endodônticas e de como os métodos de identificação molecular ajudam na avaliação das bactérias presentes nos sistemas de canais radiculares. ABSTRACT Microbial ecology focuses on the interrelationship between organisms and their environment. In a developing ecosystem, certain species known as pioneer organisms are the first colonizers. These species are often replaced by others after modification of its habitat, causing it to be more suitable to them. Infectious diseases represent a category of interactions involving a host against microorganisms with potential colonizers and pathogens. n certain situations, such microorganisms can invade normally sterile sites in our body, like the pulp tissue, thus becoming opportunistic microorganisms. Traumatic injuries and carious lesions are the main routes of infection of the pulp tissue. Once recognized the presence of microorganisms and their byproducts in the tubules, a process immunoinflammatory is architected in this tissue. There are several mechanisms by which microorganisms adapt to the environment. The formation of biofilms, modifying physiological response to stress, and the creation of subpopulations of cells are among the coping mechanisms used by bacteria with different mechanisms involving genetic exchanges. The interaction between bacterial and nonbacterial components of an ecosystem leads to the formation where a stabilization of microbial forms and microbial not coexist with his environment. This climax community remains relatively stable and reflects a dynamic situation, where cells die and are replaced. Bacterial diversity in any environment is underestimated when analyzed by using culture techniques. The application of molecular genetic methods in the analysis of bacterial diversity in the oral cavity has revealed a bacterial spectro higher than before enjoyed. There is then the possibility of species incultiváveis and not yet characterized in studies that remain undetectable by traditional methods of identification and may be part of a large fraction of the oral microbiota that participates in the etiology of oral diseases, including periapical diseases. The aim of this study is to review the literature on how the dynamics occurs endodontic infections and the methods of molecular identification assist in the evaluation of bacteria in root canals. Lista de Figuras Figura 1 – Preparação de um ápice radicular associado à infecção crônica observado com microscopia eletrônica de varredura. ....................................................................................................................15 Figura 2 - Exemplos de técnicas moleculares utilizadas no estudo de infecções endodônticas. ..........21 Figura 3 - Gráfico bilateral da contagem média (105) das 77 espécies em amostras não amplificadas (n=46) e amplificadas (n=66). ............................................................................................................25 Figura 4 - Prevalência de espécies encontradas em infecções endodônticas de dentes decíduos.......27 Sumário 1. Princípios da Ecologia Microbiana ............................................................................................. 7 2. Sucessão Microbiana ................................................................................................................. 8 3. Colonização e Infecção Endodôntica.......................................................................................... 9 4. Nutrição como um Fator Ecológico ...........................................................................................12 5. Mecanismos de Adaptação Bacteriana e a Formação de Biofilmes ..........................................14 6. A Comunidade Clímax...............................................................................................................18 7. A biologia Molecular na Identificação de Microorganismos nas Infecções Endodônticas .........19 8. Vantagens dos Métodos Moleculares Sobre os Outros Métodos de Identificação Microbiana 20 9. Infecções Endodônticas Primárias ...........................................................................................23 10. Infecções Endodônticas em Dentes Decíduos .......................................................................26 11. Infecções Refratárias ao Tratamento Endodôntico ...............................................................28 1. Princípios da Ecologia Microbiana A ecologia microbiana se foca na inter-relação entre microorganismos e o meio onde vivem. O ecossistema pode ser considerado uma peça chave neste processo, sendo constituído pelos microorganismos presentes em um determinado meio e pelos constituintes não microbianos dos arredores onde os mesmos se encontram. O ecossistema inclui o conglomerado de espécies e os constituintes orgânicos e inorgânicos característicos daquele determinado sítio, como por exemplo, o sistema de canais radiculares. Os organismos habitantes de um determinado sítio constituem uma comunidade. O conglomerado de organismos que constitui uma comunidade possui populações de espécies microbianas individuais. Como resultado, temos uma hierarquia que vai do ecossistema passando pela comunidade, pela população até que se chegue à célula individual. O habitat consiste do sítio onde uma população ou comunidade cresce, se reproduz, e sobrevive. O papel do organismo no habitat é o seu nicho. Desta forma o nicho não conota localização, mas sim função. Sendo assim, uma determinada espécie pode possuir um nicho em um habitat, e outro diferente em outro habitat (Alexander 1971). 7 2. Sucessão Microbiana Em um ecossistema em desenvolvimento, certas espécies denominadas organismos pioneiros são os primeiros colonizadores. Estas espécies geralmente são substituídas por outras após a modificação de seu habitat, fazendo com que o mesmo seja mais adequado ao desenvolvimento destas. Alguns fatores contribuintes da sucessão microbiana são: • Provisão por uma comunidade de nutrientes que conferem uma vantagem ecológica para as espécies da próxima fase de sucessão. • A produção por uma população de um constituinte presente em quantidade insuficiente para garantir a sobrevivência de uma população anterior. • Alteração na concentração de nutrientes orgânicos. • Modificação de substratos heterógenos, como os tecidos do hospedeiro. • Efeito auto-intoxicante. • Eliminação física de organismos. 8 3. Colonização e Infecção Endodôntica As superfícies protetoras do corpo humano como a pele, mucosas e esmalte dentário são altamente colonizadas por microorganismos. Estima-se que o número médio de células bacterianas supera em 10 vezes o número de células humanas em nosso corpo (1013, S 1014 células). Os microorganismos não patogênicos compõem a microflora do hospedeiro. A mesma não possui meramente uma relação passiva com o hospedeiro, mas contribui direta e indiretamente para o desenvolvimento normal da fisiologia, nutrição e sistema de defesa do corpo humano (Marsh, 2000a; McFarland, 2000; Rosebury, 1962). Como exemplo, a interrupção da microflora por antibióticos pode resultar em deficiências de absorção ou no metabolismo de vitaminas, em super crescimento de bactérias resistentes ou colonização por espécies exógenas (e mesmo patogênicas) devido à perda de resistência de colonização (Lacey et al., 1983; Sanders & Sanders, 1984; Woodman et al., 1985). A composição da microflora residente é característica para habitats distintos como a boca, pele, intestino, etc., apesar da contínua transferência de organismos entre estes sítios, (Tannock, 1995). Uma vez estabelecida, a microflora residente de cada sítio permanece relativamente estável por tempos. Tal estabilidade (que tem sido nomeada homeostase microbiana) resulta não por indiferenças biológicas entre o hospedeiro e a microflora, mas sim de um equilíbrio dinâmico que surge de numerosas relações intermicrobianas e hospedeiro-microbianas (Alexander, 1971; Marsh, 1989). Mudanças no habitat ou nos meios podem pertubar tal equilíbrio. Recentemente, a “hipótese da placa ecológica” surgiu nos conceitos clássicos de infectologia para explicar a etiologia de cáries e doença periodontal. Tal hipótese sugere que organismos associados com a doença podem também estar presentes em sítios sadios, porém em níveis muito baixos para representar uma ameaça clínica. Em outras palavras, a doença é produzida como um resultado de mudanças nas condições locais do meio que irão alterar o equilíbrio da flora residente (Marsh, 1994,1997). A relação entre o meio e a comunidade microbiana não é unidirecional. Apesar das propriedades do meio ditarem quais microorganismos podem ocupar um determinado sítio, o metabolismo da comunidade microbiana pode modificar as propriedades físico-químicas 9 dos tecidos (Alexander, 1971). Sendo assim, as condições do meio se modificam durante o desenvolvimento da placa dental com o metabolismo dos colonizadores iniciais anaeróbios facultativos, diminuindo a concentração de oxigênio e produzindo dióxido de carbono e hidrogênio. Tal modificação reduz o potencial de óxido-redução e cria um ambiente mais propício ao desenvolvimento de colonizadores tardios, que são em sua maioria anaeróbios estritos. Similarmente, o meio bucal também irá variar em saúde e doença. Com a progressão da lesão cariosa, acontece sua penetração em tecido dentinário. As fontes nutricionais sofrerão alteração e as condições locais ficarão mais ácidas e anaeróbias devido à acumulação de produtos do metabolismo bacteriano. As doenças infecciosas representam uma categoria de interações que envolvem um hospedeiro frente à microorganismos com potenciais colonizadores e patogênicos (Socransky & Hafffajee, 2005). Em certas situações, tais microorganismos podem invadir locais normalmente estéreis do nosso organismo, como o tecido pulpar, tornando-se assim microorganismos oportunistas (Henderson & Wilson, 1998). O grau de patogenicidade de tais microorganismos é denominado virulência, que é a capacidade de um microrganismo produzir formas graves da doença. Relaciona-se com a produção de toxinas e à sua capacidade de multiplicação no organismo parasitado. As lesões traumáticas e as lesões cariosas são as principais vias de infecção do tecido pulpar. Uma vez reconhecida a presença de microorganismos e seus subprodutos nos túbulos dentinários, um processo imuno-inflamatório é arquitetado neste tecido. As espécies bacterianas que inicialmente penetram o tecido dentinário são as anaeróbias facultativas, como aquelas pertencentes aos gêneros Streptococcus, Staphylococcus, Lactobacillus e microrganismos filamentosos (SIQUEIRA Jr., 2001). Dependendo do grau e intensidade da invasão bacteriana e do processo inflamatório, o tecido pulpar pode se tornar necrótico, propiciando assim a invasão do espaço pulpar pelos microorganismos. Na dinâmica de uma infecção endodôntica, anaeróbios estritos são invasores secundários. Nos estágios iniciais, bactérias anaeróbias facultativas são a maioria. Em, aproximadamente, sete dias após o estabelecimento da infecção, 50% da microbiota já é composta de anaeróbios obrigatórios. Em três meses, a proporção desses anaeróbios pode chegar a 85% e, em seis meses, 90% (FABRICIUS, 1982). 10 Oxigênio e produtos oxigenados exercem papel importante como determinantes ecológicos no desenvolvimento de proporções específicas da microflora de canais radiculares (Loesche 1968, 1983; Carlsson et al 1977). O consumo de oxigênio e a produção de dióxido de carbono e hidrogênio juntos com a diminuição do potencial de óxido-redução pelas espécies colonizadoras pioneiras favorecem o desenvolvimento de microorganismos anaeóbios. 11 4. Nutrição como um Fator Ecológico A disponibilidade e o tipo de nutrientes são importantes no estabelecimento do crescimento bacteriano. Os nutrientes podem ser derivados da cavidade oral, tecido conjuntivo em degradação, conteúdos dos túbulos dentinários, ou do fluido seroso periapical. Nutrientes exógenos, como carboidratos fermentáveis, afetam a ecologia microbiana na parte coronal de um tecido pulpar exposto promovendo o crescimento de microrganismos que primariamente obtém energia da fermentação de carboidratos. Proteínas endógenas e glicoproteínas são os principais nutrientes no canal principal, o que determina o crescimento de microorganismos anaeróbios capazes de fermentar aminoácidos e peptídeos. A sucessão de anaeróbios estritos sobre anaeróbios facultativos com o tempo é mais provável devido à mudanças na disponibilidade de nutrientes assim como uma redução na disponibilidade de oxigênio(Fabricius 1982). Anaeróbios facultativos dominados pelo gênero streptococci crescem bem em anaerobiose, entretanto, sua fonte primária de energia são os carboidratos. Uma redução na disponibilidade de carboidratos nos canais radiculares acontece quando não há comunicação direta com a cavidade oral, o que severamente limita a oportunidade de crescimento de anaeróbios facultativos. O crescimento de populações bacterianas mistas dependem da cadeia alimentar, onde o metabolismo de uma espécie supre nutrientes essenciais ao crescimento de outros membros da população. (Grenier D, Mayrand, 1986). Cocos anaeróbios produtores de pigmento negro (Prevotella e Porphyromonas) são exemplos de bactérias que possuem requerimentos nutricionais muito específicos. Os mesmos são dependentes de vitamina K e hemina. A vitamina K pode ser produzida por outras bactérias (Gibbons et al 1964). A hemina se torna disponível quando a hemoglobina é quebrada, porém algumas bactérias podem produzi-la. Uma grande quantidade de interações são reconhecidas entre bactérias orais, o que pode também influenciar as associações microbianas no sistema de canais radiculares (Carlsson 1990; Sundqvist 1992 a,b). Após a degradação do tecido pulpar, uma fonte sustentável de proteínas é desenvolvida, uma vez que as bactérias induzem uma inflamação periapical que resulta no influxo de um exsudato seroso para o interior dos canais. Tal fluido é rico em proteínas e 12 glicoproteínas, e os microorganismos dominantes neste estágio da infecção são aqueles com capacidade proteolítica ou mantém um sinergismo com aqueles que podem utilizar tal substrato como fonte de energia. 13 5. Mecanismos de Adaptação Bacteriana e a Formação de Biofilmes Existem vários mecanismos através dos quais os microorganismos se adaptam ao meio. A formação de biofilmes (Costerton et al 1987), modificação fisiológica (Drenkard et al 2002), resposta ao stress (Svensäter et al 2000), e a criação de subpopulações de células (Lewis 2005) estão entre os mecanismos de adaptação usados pelas bactérias juntamente com vários mecanismos envolvendo trocas genéticas (Sedgley et al 2004). A exploração destes mecanismos podem nos ajudar a entender a sobrevivência bacteriana em meios extremamente limitados, como o encontrado nos canais radiculares. Uma das mais relevantes características de adaptação de bactérias orais é a adesão em superfícies que leva à formação de placas ou biofilmes, que tem a função não só de ajudar sua retenção na cavidade oral, mas também de aumentar sua capacidade de sobrevivência (Bowden, 1998). A união entre os microrganismos acontece através de expopolissacarídeos extracelulares que configuram uma união extremamente forte entre as bactérias, aumentando assim seu gura de virulência (Svensäter and Bergenholtz, 2004). Interessantemente, esta habilidade de formar comunidades em biofilmes complexos não é perdida quando microorganismos orais colonizam outros sítios no corpo humano. Por exemplo, espécies como Streptococcus oralis e S. gordonii, foram encontradas na formação de biofilmes no endocárdio e válvulas cardíacas, sendo assim considerados como principais agentes etiológicos da endocardite bacteriana (Presterl et al 2005, Scheld et al 1995). Similarmente, microorganismos orais são capazes de colonizar canais radiculares através da aderência às paredes dentinárias como demonstrado em microfotografias de um ápice radicular associado a uma infecção crônica tiradas com microscópio eletrônico de varredura (Fig. 1) (Chavez de la Paz 2007). 14 Figura 1 – Preparação de um ápice radicular associado à infecção crônica observado com microscopia eletrônica de varredura. Sobrevista em (a) com magnificação de 80x demonstra um canal radicular acessório (seta). Magnificação de 400x em (b) demonstra uma parede do canal acessório evidenciando um biofilme bacteriano, uma secção é demarcada para maior magnificação. Imagens (c) e (d) demonstram a secção demarcada em magnificação de 3000x. Acúmulos de células bacterianas aderidas à parede do canal são observados. Figura retirada de Chavez de La Paz. Redefining the Persistent Infection in Root Canals: Possible Role of Biofilm Communities J Endod 2007; 33:652– 662. Agregações de microorganismos podem ser vistas aderidas às paredes internas de canais acessórios sob alta magnificação, demonstrando assim a retenção de comunidades em biofilme mesmo após o tratamento endodôntico. Biofilmes se formam quando bactérias planctônicas em sua fase livre natural são depositadas sobre uma superfície contendo um condicionamento orgânico de matriz polimérica ou um “filme condicionante”. Neste processo dinâmico, vários outros organismos co-aderem à superfície, se desenvolvem e multiplicam. Com o tempo, algumas células passam a se destacar do biofilme (Bowden et al 1979, Brecx et al 1983, Gilbert et al 1993, Lee et al 1996, Svensäter and Bergenholtz 2004). 15 A formação do biofilme em canais radiculares, como hipotetizado por Svensäter e Bergenholtz (2004), é provavelmente inicializada pouco após a primeira invasão da câmara pulpar por microorganismos orais planctônicos após rompimento tecidual. Neste ponto, o tecido em degeneração e o processo inflamatório desenvolvido proveniente da região periapical, podem prover o veículo fluido necessário à invasão de microorganismos planctônicos, fazendo com que os mesmos tenham condições de se multiplicar e continuar o processo de aderência às paredes radiculares. Interessantemente, bactérias foram observadas se destacando das superfícies internas dos canais e ocasionalmente se misturando no fluido inflamatório per se (Nair et al 2005). Tal observação poderia explicar como o processo inflamatório serve como uma fonte fluida de microorganismos que se destacaram e colonizaram outros sítios inacessíveis do sistema de canais radiculares. Sendo assim, quando biofilmes são formados em superfícies localizadas além do alcance de instrumentos endodônticos , irrigantes, e medicações intracanal, proteínas derivadas do hospedeiro provenientes do tecido pulpar em degeneração e substâncias adesivas produuzidas pelos microorganismos irão promover os pré-requisitos básicos para a sobrevivência bacteriana. Biofilmes em canais radiculares foram confirmados através de exames de dentes extraídos com lesões periapicais. Por exemplo, quando secções de dentes foram examinadas com microscopia eletrônica de varredura, densos agregados de cocos e bastonetes embebidos na matriz extracelular foram encontrados ao longo das paredes dentinárias (Nair et al 1987). Dessa forma, o conceito de biofilme à microbiologia endodôntica é considerado como um passo importante no entendimento de infecções de canais radiculares, especialmente aquelas refratárias ao tratamento endodôntico, uma vez que microorganismos em forma de biofilme são mais protegidos frente às mudanças ambientais e aos antimicrobianos (Gilbert et al 1997). Além da proteção física gerada pela matriz extracelular (Branda et al 2005) uma proteção adicional é gerada pelas mudanças fisiológicas iniciadas pelas bactérias após sua adesão à superfície (Costerton et al 1987, Fletcher 1991, Goodman 1995). Tais mudanças fenotípicas pelas bactérias em biofilme usualmente resultam no aumento de resistência aos agentes antimicrobianos, em alguns casos numa razão 1000 vezes maior do que aqueles microorganismos que sobrevivem em forma planctônica (Gilbert et al 1997, Johnson et al 2002). Evidências existem demonstrando 16 que biofilmes orais são mais resistentes à clorexidina, amina fluorida, amoxicilina, doxiciclina e metronidazol que células planctônicas (Larsen 2001,Shani et al 2000). 17 6. A Comunidade Clímax A interação entre os componentes bacterianos e não bacterianos de um ecossistema levam à formação de uma estabilização onde formas microbianas e não microbianas coexistem com seu meio. Esta comunidade clímax se mantém relativamente estável e reflete uma situação dinâmica, onde células morrem e são substituídas. O clímax pode ser modificado de tempos em tempos devido a forças exógenas, além de poder ser irreversivelmente alterado pela realização do tratamento endodôntico (Socransky & Hafffajee, 2005). Hipoteticamente, todas as espécies microbianas presentes no SCR infectado podem ser consideradas patogênicas, pois são capazes de induzir inflamação nos tecidos periapicais (Tani Ishii et al., 1994). Nesse aspecto, parece que algumas associações microbianas são claramente mais virulentas que outras, estando as espécies dos gêneros Prevotella, Porphyromonas e Peptostreptococcus fortemente associadas à destruição óssea periapical (Griffe et al., 1980; van Winkelhoff et al., 1985; Dahlén et al, 1987; Sundqvist et al.,1989; Yamasaki et al., 1992; Baumgartner et al. 1992). A capacidade de agredir o hospedeiro pode se relacionar à habilidade de determinados microrganismos de lesar as células diretamente através das enzimas e toxinas por eles produzidas ou pela indução de reações imunológicas de hipersensibilidade ou de imunosupressão (Shenker & Datar, 1995; Jiang et al., 1999; Kurita-Ochiai et al., 2000; Sheikhi et al., 2000, Jewett et al., 2000; Ribeiro Sobrinho et al., 2005; Silva et al., 2007). Atualmente, temos encontrado muitos estudos comprovando a presença de fungos, como Candida Albicans. Estes microrganismos têm sido relacionados á infecções persistentes, mas podem aparecer em canais que não foram submetidos ao tratamento endodôntico (Bezerra da Silva et al, 2000). 18 7. A biologia Molecular na Identificação de Microorganismos nas Infecções Endodônticas A diversidade bacteriana em qualquer ambiente é subestimada quando analisada por técnicas que utilizam meio de cultura (Munson et al. 2002, Papapanou 2002). Canais radiculares infectados possuem um máximo de 10-12 espécies quando analisados essas técnicas (Sundqvist 1976, Gomes et al. 2004), enquanto este nível aumenta para 42-51 espécies em estudos que utilizam métodos de biologia molecular (Siqueira et al. 2000, Brito et al. 2007, Tavares et al 2011). A aplicação de métodos genéticos moleculares na análise da diversidade bacteriana na cavidade oral tem revelado um spectro bacteriano maior do que antes apreciado. De maneira geral, mais de 700 espécies bacterianas diferentes, pertencentes a 11 divisões (ou filos) do domínio Bacteria foram detectados na cavidade oral de humanos. Cerca de 50% destas bactérias são conhecidas somente pela sequência genética 16S rRNA (23), Tal fato emerge a interessante possibilidade de espécies incultiváveis e ainda não caracterizadas que permanecem indetectáveis em estudos por métodos tradicionais de identificação. As mesmas podem fazer parte de uma larga fração da microbiota oral que participa da etiologia de doenças orais, incluindo doenças periapicais. 19 8. Vantagens dos Métodos Moleculares Sobre os Outros Métodos de Identificação Microbiana a) Detecção não somente de microorganismos cultiváveis, mas também daqueles que são considerados incultiváveis ou fastidiosos. b) Maior especificidade e identificação acurada de cepas microbianas com comportamentos fenotípicos ambíguos, incluindo cepas convergentes ou divergentes. c) Detecção de espécies microbianas diretamente das amostras clínicas, sem a necessidade de cultivo. d) Maior sensibilidade. e) Maior rapidez. f) Diagnóstico rápido, o que é particularmente uma vantagem em casos de doenças com risco de morte ou doenças causadas por microrganismos de crescimento lento. g) Não necessitam de controles cuidadosos durante a coleta e o transporte anaeróbio. h) Podem ser utilizados durante tratamento antimicrobiano. i) Quando um número grande de espécies precisa ser analisado, principalmente em estudos epidemiológicos, as amostras podem ser guardadas e analisadas de uma só vez. A aplicabilidade de métodos moleculares não é efetiva somente na detecção de bactérias incultiváveis, mas também na identificação mais confiável de diversas espécies bacterianas, particularmente aqueles que necessitam de nutrientes específicos e são consequentemente difíceis de crescer em meios de cultura. Várias espécies bacterianas fastidiosas somente recentemente foram reportadas em infecções endodônticas através da biologia molecular. Dentre as mesmas se incluem Tannerella forsythia (6, 34), várias espécies Treponema s, , Prevotella tannerae, Filifactor alocis, Dialister pneumosintes, Haemophilus aphrophilus, Eubacterium infirmum, e Centipeda periodontii, todos reconhecidos como patógenos periodontais. Existe uma plethora de métodos moleculares para o estudo de microorganismos e a escolha por uma técnica específica depende dos objetivos do estudo (Fig. 2). A Reação de cadeia da polimerase (PCR) seguida do seqüenciamento genético pode ser utilizada para investigar a diversidade microbiana de um meio. A estrutura da comunidade microbiana pode ser analisada por técnicas de impressão como a eletroforese em gel por gradiente de 20 desnaturação (DGGE) e polimorfismo de comprimento do fragmento por restrição terminal (T-RFLP). A hibridização por fluorescência in situ (FISH) pode medir a abundância de espécies a prover informação da distribuição espacial nos tecidos. Dentre outras aplicações, os micro e macro ensaios de hibridização DNA-DNA, PCR espécie-específica, nested PCR, Multiplex PCR, e real- time PCR são técnicas que podem ser utilizadas para avaliar um grande número de amostras clínicas frente a várias espécies alvo. Figura 2 - Exemplos de técnicas moleculares utilizadas no estudo de infecções endodônticas. A amplificação por PCR de regiões da seqüência genética 16s do rRNA conservadas, seguidas de clonagem e seqüenciamento dos produtos do PCR, tem sido amplamente utilizada no estudo da diversidade bacteriana em diversos tecidos humanos. Entretanto, a técnica de clonagem é demorada e possui alto custo, sendo virtualmente impraticável para a análise de múltiplas amostras em investigações epidemiológicas. O Checkerboard DNA–DNA hybridization é uma técnica molecular que permite a identificação de uma grande variedade de espécies bacterianas de várias amostras clínicas 21 utilizando apenas uma única membrana de nylon. Esta técnica tem sido utilizada com sucesso no estudo da microbiota da saliva (Sachdeo et al. 2008), na placa supragengival (Haffajee et al. 2008), placa subgengival (Haffajee et al. 2008, Teles et al. 2008), tecidos moles orais (Mager et al. 2003, Sachdeo et al. 2008), dentaduras (Sachdeo et al. 2008), implantes (Gerber et al. 2006) e infecções endodônticas (Siqueira et al. 2000, Brito et al. 2007, Sassone et al.2007, 2008, Tavares et al 2011). O nível de detecção do Checkerboard DNA–DNA hybridization está entre 104 e 107 células bacterianas em cada amostra. O conteúdo bacteriano das amostras presentes em infecções endodônticas pode estar abaixo deste limite de identificação. Desta forma, uma técnica de amplificação chamada multiple displacement amplification (MDA) pode ser utilizada para atingir tais limites de identificação (Dean et al. 2002, Brito et al. 2007, Teles et al. 2007). O MDA pode amplificar todo o DNA presente em amostras de biofilmes orais com o mínimo de viés (Dean et al. 2002, Hawkins et al. 2002, Yan et al. 2004). Amostras menores que 1 ng podem ser amplificadas de 1.000 a 10.000 vezes, fazendo com que esta técnica seja utilizada com efetividade quando associada ao Checkerboard DNA–DNA hybridization em infecções endodônticas (Brito et al. 2007, Teles et al. 2007, Tavares et al 2011). 22 9. Infecções Endodônticas Primárias Siqueira et al 2000 avaliou a microbiota de infecções endodônticas primárias utilizando a técnica do checkerboard DNA-DNA hybridization para 42 espécies bacterianas. As amostras foram coletadas de 26 dentes unirradiculares com lesões periapicais assintomáticas. O número de espécies encontradas por canal variou de 1 a 17 (média 4,7). As espécies mais prevalentes encontradas foram: T. forsythia (42% dos casos), Haemophilus aphrophilus (19%), Porphyromonas gingivalis (19%), Corynebacterium matruchotii (15%), Treponema denticola (15%), Capnocytophaga gingivalis (12%), e Streptococcus intermedius (12%). As bactérias do “complexo vermelho” (T. forsythia, P. gingivalis, and T.denticola), que são frequentemente associadas a doenças periodontais severas, foram encontradas em dois casos. Da Silva et al. (24) através do checkerboard, avaliaram a presença de 40 espécies bacterianas em canais de 30 dentes com lesões periapicais assintomáticas. Trinta e cinco espécies foram detectadas ao todo, com um número de espécies por canal variando de 5 a 31. As mesmas amostras foram analisadas por meio de cultura, onde 42 microorganismos foram encontrados ao todo. O número de espécies encontradas por canal através do meio de cultura variou de 0 a 6. T. forsythia, Campylobacter showae, Fusobacterium naviforme, e Actinobacillus actinomycetemcomitans estiveram presentes em mais de 90% dos canais. Outros microorganismos periodontopatogênicos como P. gingivalis (60%), Campylobacter rectus (80%), Prevotella intermedia (50%), Selenomonas noxia (60%), Peptostreptococcus micros (70%), Treponema socranskii (70%), e T. denticola (40%) também foram encontrados. Os microorganismos pertencentes ao “complexo vermelho” estiveram presentes em 40% dos canais. O P. endodontalis foi detectado em 30% dos canais. Siqueira et al 2001 avaliou, pela técnica do Checkerboard, espécies bacterianas presentes em abscessos de origem endodôntica. O número de espécies encontradas variou de 1 a 33 (média 5,9). As espécies mais prevalentes foram: T. forsythia (30% dos casos); P. gingivalis (30%); Streptococcus constellatus (26%), P. intermedia (22%), Prevotella nigrescens (22%), Fusobacterium periodonticum (19%), Fusobacterium nucleatum ss nucleatum (19%), 23 Eikenella corrodens (19%), P. endodontalis (15%), Actinomyces gerencseriae (15%), e Neisseria mucosa (15%). Através da associação das técnicas do MDA e Checkerboard, Brito et al 2007 avaliou a microbiota de 66 amostras de dentes com infecção endodôntica. Amostras não amplificadas e amplificadas pelo MDA foram analisadas pela técnica do Checkerboard. As espécies mais comumente encontradas em níveis >104 foram Prevotella tannerae e Acinetobacter baumannii em frequências entre 89-100%. O número médio de espécies encontrados por dente em níveis >104 foi 51,2 em amostras amplificadas, enquanto em amostras não amplificadas o número médio foi 14,5. (Figura 3) 24 Figura 3 - Gráfico bilateral da contagem média (105) das 77 espécies em amostras não amplificadas (n=46) e amplificadas (n=66). 25 10. Infecções Endodônticas em Dentes Decíduos Vários estudos avaliaram a microbiota associada a infecções endodônticas em adultos (Sundqvist 1976, Baumgartner & Falkler 1991, Siqueira et al. 2000, Lana et al. 2001, Rolph et al. 2001, Munson et al. 2002, de Souza et al. 2005, Brito et al. 2007, Sassone et al. 2007, 2008). Entretanto, poucos estudos se propuseram a avaliar a microbiota endodôntica em dentes decíduos. Recentemente, Tavares et al 2011 avaliaram, através do MDA e do Checkerboard, a presença de 83 espécies bacterianas em infecções de dentes primários. Foram avaliados 32 dentes apresentando necrose pulpar. O número médio de espécies encontradas por dente em contagem >194 foi 19. Aggregatibacter (Haemophilus) aphrophilus e Helicobacter pylori não foram detectados em nenhuma das amostras. A figura 4 demonstra a porcentagem média das 81 espécies encontradas. A espécies mais prevalentes foram Prevotella intermedia, encontradas em 96.9% das amostras, seguida pela Neisseria mucosa (65.2%), Prevotella nigrescens (56.2%), Tannerella forsythia (56.2%), Prevotella denticola (53.1%) e Fusobacterium nucleatum ss vincentii (50.0%). As espécies menos prevalentes foram Enterococcus faecalis (3.2%) e Eikenella corrodens (3.1%). 26 Figura 4 - Prevalência de espécies encontradas em infecções endodônticas de dentes decíduos. 27 11. Infecções Refratárias ao Tratamento Endodôntico Estudos que investigam microorganismos remanescentes em canais pós preparo mecânicoquímico e medicação intracanal podem identificar aqueles microorganismos que tem o poder de influenciar o prognóstico do tratamento, participando assim da etiologia de infecções refratárias. Mesmo quando o tratamento não é bem sucedido na remoção por completo da infecção, a maioria dos microorganismos são eliminados e o meio sofre um desequilíbrio. Para que microorganismos sobrevivam, os mesmos devem resistir aos procedimentos de desinfecção do canal e rapidamente se adaptarem ao novo ambiente com características completamente modificadas pelo tratamento endodôntico. Bactérias encontradas em amostras póstratamento endodôntico são remanescentes de uma infecção inicial, tendo resistido aos efeitos dos instrumentos, irrigantes, e da medicação intracanal. As mesmas ainda podem ter sido introduzidas nos canais por quebra da cadeia asséptica por parte do operador ou por infiltração da restauração temporária. Microorganismos encontrados em amostras pósobturação são altamente adaptados ao novo ambiente em que se encontram. Infecções persistentes podem ser responsáveis por problemas clínicos como exsudação persistente, sintomatologia dolorosa, exacerbações entre consultas, e persistência de lesão mesmo após o tratamento. Estudos através de meios de cultura observaram que tais infecções eram associadas a uma ou duas espécies. Bactérias Gram-positivas facultativas, particularmente Enterococcus faecalis, são as predominantes. Fungos também foram encontrados em frequências relativamente altas quando comparados às infecções primárias. Poucos estudos utilizaram a biologia molecular na identificação de microorganismos em lesões refratárias ao tratamento endodôntico. Através do uso do PCR, Rolph et al. observaram que cinco casos de insucesso produziram clones relacionados aos gêneros Capnocytophaga, Mogibacterium, Cytophaga, Dialister, Peptostreptococcus, Eubacterium, Prevotella, Fusobacterium, Propionibacterium, Gemella, Selenomonas, Solobacterium, Streptococcus, e Veillonella e dois clones representando bactérias incultiváveis. Várias espécies microbianas foram encontradas em casos de insucesso pela 28 técnica do PCR, além de confirmar o E. faecalis como a espécie mais encontrada. Tal espécie foi encontrada em 77% dos casos . Quatro espécies anaeróbias fastidiosas —P. alactolyticus, P. propionicum, F. alocis e D. pneumosintes—estiveram presentes em pelo menos metade dos casos.Todas as amostras possuíam pelo menos uma das seguintes espécies grampositivas; E. faecalis, P. alactolyticus, eP. Propionicum .A Candida albicans foi encontrada em 9% dos casos. O número médio de espécies encontrados em casos bem obturados foi 3 (variação de 1 a 5), enquanto que os casos com obturação deficiente possuíam em média cinco espécies (variando de 2 a 11). Em outro trabalho, Roças et al. avaliou através de PCR a ocorrência de nove patógenos em canais obturados associados com lesão perirradicular em pacientes Sul-Coreanos. Quatorze canais obturados com presença de lesão perirradicular foram selecionados. Microorganismos estiveram presentes em todos os casos como revelado pela amplificação genômica. Os microorganismos mais encontrados foram E. faecalis (64%), seguidos pelo Streptococcus spp. (21%) e T. forsythia (14%). 29 12. Conclusões A sobrevivência de microorganismos em canais radiculares após o tratamento é baseada na capacidade individual de certas células em se adaptarem ao meio como um consórcio. O estudo de mecanismos adaptativos usados por microorganismos para sobreviver em meios inóspitos, com limitação de nutrientes associado ao efeito antibacteriano de medicamentos, é importante para o nosso entendimento sobre infecções endodônticas persistentes. A habilidade de organismos em tais infecções de formar biofilmes pode ser vista como o mecanismo de adaptação mais importante utilizado por bactérias para sobreviver às mudanças ambientais causadas pelos protocolos de tratamento. Sendo assim, uma vez que todos os microorganismos orais são capazes de formar biofilmes, e que essas comunidades superfície-associadas existem em canais radiculares, é possível aplicar o conceito de biofilme ao tratamento clínico; ou seja, esforços não devem ser direcionados especificamente para organismos individuais, mas para um grupo de microorganismos bem adaptados que certamente possuem resistência a uma variedade de agentes antimicrobianos. Indubitavelmente, o uso bem direcionado dos métodos de biologia molecular irão gerar informações adicionais valiosas na identificação e entendimento dos fatores causais associados a doenças periapicais. O conhecimento sobre as infecções endodônticas passou a ficar mais acurado após a introdução da biologia molecular, uma vez que as mesmas trouxeram maior sensibilidade e especificidade aos exames. Em adição, os métodos moleculares tem o potencial de gerar diagnósticos mais rápidos e direcionar terapias antimicrobianas como uma realidade. Sendo assim, o futuro reserva vários desafios, enquanto o conhecimento tem o potencial de gerar novas estratégias para que sejam atingidos índices mais altos de sucesso na terapia endodôntica. 30 13. Referências Bibliográficas • A. P. Ribeiro-Sobrinho,1 F. L. A. Rabelo,2 C. B. O. Figueiredo,1 J. I. Alvarez-Leite,2 J. R. Nicoli,3 M. Uzeda4 and L. Q. Vieira. Bacteria recovered from dental pulp induce apoptosis of lymph node cells. Journal of Medical Microbiology (2005), • Alexander M. Microbial ecology. New York: John Wiley & Sons, 1971. • BAUMGARTNER, J. C. et al. Serum IgG reactive with oral anaerobic microorganisms associated with infections of endodontic origin. Oral Microbiol. Immunol., v. 7, n. 2, p. 106-110, 1992. • Bezerra da Silva LA, Perassi, FT, Ito IY, Yamashita JC, Bonifácio, KC, Filho, MT, A Presença de Fungos nas infecções endodônticas. Revista da Universidade Metodista de Piracicaba, 2000; 15:65-6. • Bowden GH, Ellwood DC, Hamilton IR (1979). Microbial ecology of the oral cavity. In: Advances in microbial ecology. Alexander M, editor. New York: Plenum Press • Bowden GH, Ellwood DC, Hamilton IR. Microbial ecology of the oral cavity. In: Alexander M, ed. Advances in microbial ecology. New York: Plenum. 1979: 135–217. • Bowden GH, Hamilton IR. Survival of oral bacteria. Crit Rev Oral Biol Med 1998;9:5485. • Branda SS, Vik S, Friedman L, Kolter R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol 2005;13:20–6. • Brecx M, Theilade J, Attstrom R. An ultrastructural quantitative study of the significance of microbial multiplication during early dental plaque growth. J Periodontal Res 1983;18:177– 86. • Brecx, M., Theilade, J. and AttstroÈm, R. (1983) An ultrastructural quantitative study of the signi®cance of microbial multiplication during early dental plaque growth. Journal of Periodontal Research 18, • CARLSSON J, FRÖLANDER F, SUNDQVIST G (1977) Oxygen tolerance of anaerobic bacteria isolated from necrotic dental pulps. Acta Odontologica Scandinavia • Carlsson J, Frölander F, Sundqvist G. Oxygen tolerance of anaerobic bacteria isolated from necrotic dental pulps. Acta Odont Scand 1977;35:139-145. 31 • Carlsson J. Microbiology of plaque associated periodontal disease. In: Lindhe J, ed. Textbook of clinical periodontology.Copenhagen: Munksgaard, 1990:129-152. • Carlsson J. Microbiology of plaque associated periodontal disease. In: Lindhe J., ed. Textbook of Clinical Periodontology. Copenhagen, Denmark: Munksgaard. 1990; • CHAVEZ DE PAZ, L. E. 2007. Redefining the persistent infection in root canals: possible role of biofilm communities. J Endod, • Costerton JW, Cheng KJ, Geesey GG, et al. Bacterial biofilms in nature and disease. Annu Rev Microbiol 1987;41:435– 64. • Costerton JW, Cheng KJ, Geesey GG, et al. Bacterial biofilms in nature and disease. Annu Rev Microbiol 1987;41:435– 64. • Costerton JW, Cheng KJ, Geesey GG, Ladd TI, Nickel JC, Dasgupta M, Marrie TJ (1987) Bacterial biofilms in nature and disease. Ann Rev Microbiol 41:435–64 • Costerton JW, Cheng KJ, Geesey GG, Ladd TI,Nickel JC, Dasgupta M, Marrie TJ (1987) Bacterial biofilms in nature and disease • Dahlen G, Fabricius L, Holm SE, M0ller A (1987). Interactions within a collection of eight bacterial strains isolated from a monkey dental root canal. Oral Microbiol Immunol 2:164-170. • Dean FB, Hosono S, Fang L, Wu X, Faruqi AF, Bray-Ward P, Sun Z, Zong Q, Du Y, Du J, Driscoll M, Song W, Kingsmore SF, Egholm M, Lasken RS. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 2002: 99: 5261-6. • Drenkard E, Ausubel FM. Pseudomonas biofilm formation and antibiotic resistance are linked to phenotypic variation. Nature 2002;416:740 –3. • Drenkard, E., and Ausubel, F.M. (2002) Pseudomonas biofilm formation and antibiotic resistance are linked to phenotypic variation. Nature • Fabricius L, Dahlén G, Öhman AE, Möller ÅJR. Predominant indigenous oral bacteria isolated from infected root canals after varied times of closure. Scand J Dent Res 1982;90:134-144. • Fabricius L., Dahle´n G., Ohman A.E., Möller A JR. Predominant indigenous oral bacteria isolated from infected root canals after varied times of closure. Scand J Dent Res. 1982. 32 • Fletcher M. The physiological activity of bacteria attached to solid surfaces. Adv Microbiol Physiol 1991;32:53– 85. • Gerber J, Wenaweser D, Heitz-Mayfield L, Lang NP, Persson GR. Comparison of bacterial plaque samples from titanium implant and tooth surfaces by different methods. 2006; 17: 1-7. • Gibbons R.J., Engle L.P. Vitamin K compounds in bacteria that are obligate anaerobes. Science 1964; • Gibbons RJ, Engle LP. Vitamin K compounds in bacteria that are obligate anaerobes. Science 1964;146:1307-1309 • Gilbert P, Das J, Foley I. Biofilm susceptibility to antimicrobials. Adv Dent Res 1997;11:160 –7. • Gilbert P, Evans DJ, Brown MR. Formation and dispersal of bacterial biofilms in vivo and in situ. J Appl Bacteriol 1993;74 Suppl:67S–78S • Gilbert, P., Das, J. and Foley, I. 1997. Biofilm susceptibility to antimicrobials. Advances in Dental Research ; • Gilbert, P., Evans, D.J. and Brown, M.R.W. (1993) Formation and dispersal of bacterial biofilms in vivo and in situ. J. Appl. Bacteriol. • GOMES, B. P.; PINHEIRO, E. T.; GADE-NETO, C. R.; SOUZA, E. L.; FERRAZ, C. C.; ZAIA, A. A.; TEIXEIRA, F. B.; SOUZA-FILHO, F. J. Microbiological examination on infected dental roots canals. Oral Microbiol Immunol, v. 19, p.71-6, 2004. • Goodman AE, Marshall KC. Genetic responses of bacteria at surfaces. In: Costerton JW, Lappin-Scott HM, eds. Microbial biofilms. Cambridge, UK: CambridgeUniversity Press, 1995:80 –95. • Grenier D, Mayrand D. Nutritional relationships between oral bacteria. Infect Immun 1986;53:616-620. • Grenier D., Mayrand D. Nutritional relationships between oral bacteria. Infect Immun. 1986; • GRIFFEE, M.B.; PATTERSONS, S.; MILLER, C.H.; KAFRAWY, A. H.; NEWTON, C.W. The relationship of Bacteroides melaninogenicus associated with pulpal necrosis. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol., v.50, n.5, p.457-461, Nov. 1980 33 • Haffajee AD, Patel M, Socransky SS. Microbiological changes associated with four different periodontal therapies for the treatment of chronic periodontitis. Oral Microbiol Immunol. 2008;23(2):148–57. • Hawkins JM, Moore PA. Local anesthesia: advances in agents and techniques. Dent Clinic North AM 2002,46(4):719-32 • Henderson B, Wilson M. Commensal communism and the oral cavity. J Dent Res 77: 1674, 1998. • JEWETT, A.; WYATT, R.H.; HO, L.; TRI, N.H.; YIPING, W.H.; GENHONG, C.; WENYUAN, S. induction of apoptotic cell death in peripheral blood mononuclear and polymorphonuclear cells by oral bacterium, Fusobacterium nucleatum. Infection and immunity, v.68, n.4, p.1893-1898, 2000. • Johnson SA, Goddard PA, Iliffe C, et al. Comparative susceptibility of resident and transient hand bacteria to para-chloro-meta-xylenol and triclosan. J Appl Microbiol 2002;93:336–44. • Johnson, J. R., Kuskowski, M. A., O'Bryan, T. T. & Maslow, J. N. (2002). Epidemiological correlates of virulence genotype and phylogenetic background among Escherichia coli blood isolates from adults with diverse-source bacteremia. J Infect Dis 185, 1439–1447. • Kurita-Ochiai T, Ochiai K, Fukushima K. Butyric-acid-induced apoptosis in murine thymocytes and splenic T- and Bcells occurs in the absence of p53. J Dent Res 2000;79:1948-1954. • Lacey, E. P., L. Real, J. Antonovics, and D. G. Heckel. 1983.Variance models in the study of life histories. American Naturalist • Larsen T. Susceptibility of Porphyromonas gingivalis in biofilms to amoxicillin, doxycycline and metronidazole. Oral Microbiol Immunol 2002;17:267–71. • Lee SF, Li YH, Bowden GH (1996). Detachment of Streptococcus mutans biofilm cells by an endogenous enzymatic activity. Infect Immun • Lee SF, Li YH, Bowden GH. Detachment of Streptococcus mutans biofilm cells by an endogenous enzymatic activity. Infect Immun 1996;64:1035– 8. • Lewis K. 2005. Persister cells and the riddle of biofilm survival. Biochemistry 34 • Lewis K. Persister cells and the riddle of biofilm survival. Biochemistry (Mosc) 2005;70:267–74. • Loesche WJ, Gusberti F, Mettraux G, Higgins T, et al. Relationship between oxygen tension and subgingival bacterial flora in untreated human periodontal pockets. Infect Immun 1983 • Loesche WJ, Gusberti F, Mettraux G, Higgins T, Syed S. Relationship between oxygen tension and subgingival bacterial flora in untreated human periodontal pockets. Infect Immun 1983;42:659-667. • Loesche WJ. Importance of nutrition in gingival crevice microbial ecology. Periodontics 1968;6:245-249. • Loesche WJ. Importance of nutrition in gingival crevice microbial ecology. Periodontics 1968: • Mager DL, Haffajee AD, Socransky SS. Effects of periodontitis and smoking on the microbiota of oral mucous membranes and saliva in systemically healthy subjects. J Clin Periodontol. 2003; 30(12):1031-7. • Marsh PD, Bradshaw DJ. Physiological approaches to the control of oral biofilms. Adv Dent Res 1997;11:176–85. • Marsh PD, Bradshaw DJ. Physiological approaches to the control of oral biofilms. Adv Dent Res. 1997; • Marsh PD. Microbial ecology of dental plaque and its significance in health and disease. Adv Dent Res 1994;8:263–71. • Marsh PD. Microbial ecology of dental plaque and its significance in health and disease. Adv Dent Res. 1994 • MARSH, P.D. Host defenses and microbial homeostasis: role of microbial interactions. J Dent Res, v.68, 1989. • Munson MA, Pitt-Ford T, Chong B, Weightman A, Wade WG. Molecular and cultural analysis of the microflora associated with endodontic infections. J Dent Res. 2002 • Nair P. Light and electron microscopic studies on root canal flora and periapicallesions. J Endod 1987;13:29 –39 • Nair PN, Henry S, Cano V, Vera J. Microbial status of apical root canal system of human mandibular first molars with primary apical periodontitis after “one-visit” 35 endodontic treatment. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2005;99:231–52. • Nair PNR, Henry S, Cano V, Vera J. Microbial status of apical root canal system of human mandibular first molars with primary apical periodontitis after one-visitendodontic treatment. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2005 • Papapanou, P.N.; Teanpaisan, R.; Obiechina, N.S.; Pithpornchaiyakul, W.; Pongpaisal, S.; Pisuithanakan, S.; Baelum, V.; Fejerskov, O.; Dahlen,G. Periodontal microbiota and clinical periodontal status in a rural sample in southern Thailand. Eur. J. Oral Sci., 110, 345-352, 2002. • Presterl E, Grisold AJ, Reichmann S, Hirschl AM, Georgopoulos A & Graninger W (2005) Viridans streptococci in endocarditis and neutropenic sepsis: biofilm formation and effects of antibiotics. • Presterl E, Grisold AJ, Reichmann S, Hirschl AM, Georgopoulos A, Graninger W. Viridans streptococci in endocarditis and neutropenic sepsis: biofilm formation and effects of antibiotics. J Antimicrob Chemother 2005;55:45–50. • Rosebury T (1962). Microorganisms indigenous to man. New York: McGraw-Hill Co. • Sachdeo, A.; Haffajee, A. D. & Socransky, S. S. (2008). Biofilms in the Edentulous Oral Cavity. Journal of Prosthodontics; 17: 348-356. • SASSONE,L.M.,et. al.Evaluation of the microbiota of primary endodontic infections using checkboard DNA-DNA hybridization. Oral Microbiol Immunol.,v.22,p.390397,2007. • Scheld MW, Sande MA. Endocarditis and intravascular infections. In: Mandell GL, Douglas RG, Dolin R, eds. Principles and practice of infectious diseases, 4th ed. New York: Churchill Livingstone, 1995:740–83. • Scheld WM, Sande MA. Endocarditis and intravascular infections. In: Mandell, Douglas, Bennett's. Principies and practice of infectious diseases. 4a ed. Churchill Livingstone Inc. 1995 • Sedgley C, Lennan SL, Clewell A. Prevalence, phenotype and genotype of oral enterococci. Oral Microbiol Immunol. 2004 • Sedgley CM, Clewell DB. Bacterial plasmids in the oral and endodontic microflora. Endod Topics 2004;9:37–51. 36 • Shani S, Friedman M, Steinberg D. The anticariogenic effect of amine fluorides on Streptococcus sobrinus and glucosyltransferase in biofilms. Caries Res 2000; 34:260 – 7. • Shani S, Friedman M, Steinberg D: The anticariogenic effect of amine fluorides on Streptococcus sobrinus and glucosyltransferase in biofilms. Caries Res 2000; • Siqueira JF Jr, Roças IN, Souto R, Uzeda M, Colombo AP. Checkerboard DNA-DNA hybridization analysis of endodontic infections. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2000;89:744–8. • Siqueira JF Jr, Roças IN, Souto R, Uzeda M, Colombo AP. Microbiological evaluation of acute periradicular abscesses by DNA-DNA hybridization. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2001;92:451–7. • SIQUEIRA JR., J. F. Aetiology of root canal treatment failure: why well-treated teeth can fail. Int Endod J, v. 34, 2001 • SIQUEIRA, J. F. et al. Bacterial Leakage in Coronally Unsealed Root Canals Obturated with 3 Different Techniques. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod., St. Louis, v. 90, n. 5, p. 647-650, Nov. 2000. • Socransky SS, Haffajee AD. Peridontal microbial ecology. Peridontol 2000 2005; • Sundqvist G. Associations between microbial species in dental root canal infections. Oral Microbiol Immunol 1992;7:257-262. • Sundqvist G. Associations between microbial species in dental root canal infections. Oral Microbiol Immunol. 1992(a) • SUNDQVIST G. Bacteriological studies of necrotic dental pulps. 1976. Dissertation. Umea, Sweden: University of Umea, 1976. • Sundqvist G. Ecology of the root canal flora. J Endod 1992;18:427-430. • Sundqvist G. Ecology of the root canal flora. J Endod. 1992: 18: 427–430. (b) • SUNDQVIST, G.; JOHANSSON, E.; SJÖGREN, U. Prevalence of black-pigmented Bacteroides species in root canal infections. J Endod, v. 15, p. 3-19, 1989 • Svensäter G, Bergenholtz G. Biofilms in endodontic infections. Endod Topics 2004;9:27–36.. • Svensäter G, Bergenholtz G. Biofilms in endodontic infections. Endod Top. 2004 37 • Svensäter G, Sjögreen B, Hamilton IR (2000) Multiple stress responses in Streptococcus mutans and the induction of general and stress-specific proteins. Microbiology • Svensäter G, Sjögren B, Hamilton IR. Multiple stress responses in Streptococcus mutans and the induction of general and stress-specific proteins. Microbiology 2000;146:107–17. • TANI-ISHII, N.; WANG, C. Y.; STASHENKO, A. Changes in root canal microbiota during the development of rat periapical lesions. Oral Microbiology and Immunology, v. 9, p. 129 – 135, 1994. • Tannock GW (1995) Normal Microflora. An Introduction to Microbes Inhabiting the Human Body. Chapman and Hall, London • Tavares WL, Teles RP, Massara ML, Ribeiro Sobrinho AP, Haffajee AD, Socransky SS, Neves de Brito LC. Microbiota of deciduous endodontic infections analysed by MDA and Checkerboard DNA-DNA hybridization.. Int Endod J. 2011 Mar;44(3):225-35. • TELES, R. P. et al. Disease progression in periodontally healthy and maintenance subjects. J Periodontol, v.79, n.5, May, p.784-94. 2008. • van Winkelhoff AJ, Carlee AW, de Graaff J (1985). Bacteroides endodontalis and other black-pigmented Bacteroides species in odontogenic abscesses. Infect Immun • Woodman A J, Vidic J, Newman H N, Marsh P D 1985 Effect of repeated high dose prophylaxis with amoxycillin on the resident oral flora of adult volunteers. Journal of Medical Microbiology 38