Documentário Científico – Resistência das bactérias

Documentário Científico – Resistência das
bactérias aos antibióticos
Somos a equipa Cenaea da Escola Secundária do Entroncamento.
Foi-nos sugerida a inscrição neste projecto pela nossa professora
de Biologia e directora de turma Marta Azevedo, a quem desde já
agradecemos toda a ajuda disponibilizada.
Depois da realização do protocolo experimental, decidimos
apresentar as nossas conclusões em suporte escrito em forma de
entrevista. Como entrevistadora, Mafalda Barrela, sendo a equipa
de biólogos entrevistada constituída pela Dra. Rita Barata, Dr.
Nuno Vítor e Dr. Jorge Santos.
Mafalda – Boa tarde, bem-vindos a mais um “No coração da ciência”. Hoje os
especialistas convidados são biólogos que investigaram o crescimento de uma
colónia de bactérias à luz de evolução. Este foi um trabalho realizado no âmbito
da comemoração dos 200 anos do nascimento de Charles Darwin e do 150º
aniversário da publicação da famosa “Origem das espécies”. Comigo tenho,
portanto, a Dra. Rita Barata, o Dr. Nuno Vítor e o Dr. Jorge Santos. Bem-vindos.
Digam-me, o que vos levou a realizar esta experiência?
Dr.Jorge – Pensámos que seria interessante verificar o crescimento de uma
população de bactérias e observar de que modo o meio em que se desenvolviam
condicionava as condições da sua evolução. Utilizámos as bactérias Escherichia coli e
o factor que variou foi o seu desenvolvimento num meio com ou sem antibiótico
ampicilina.
Mafalda – Mas o antibiótico não vai eliminar as bactérias todas?
Dr.Rita – Não, existe sempre uma
estirpe resistente resultante de uma
mutação ocasional. No caso da E.coli,
em cada milhão de bactérias surge
uma mutação resistente. Obviamente,
tudo isto precede a alteração no meio.
Após a experiência, verificar-se-á que
as bactérias não resistentes ao
antibiótico não se irão reproduzir, ao
contrário da estirpe resistente.
Dr.Nuno – É a chamada “selecção
natural”, ou seja, a selecção dos mais aptos dentro de uma mesma espécie. Foi um
conceito primeiramente introduzido por Darwin.
Mafalda – Isso não será prejudicial para a nossa saúde? Ao seleccionarmos as
bactérias mais resistentes, não estaremos a prejudicar-nos?
Dr.Nuno – De facto. Aliás, é esse o grande problema dos antibióticos. Por isso é
absolutamente indispensável tomá-los até ao fim para que as bactérias fiquem
completamente eliminadas do nosso organismo e não haja a possibilidade de
aparecimento de bactérias resistentes. O mesmo se passa com os herbicidas e
adubos químicos. Há a tentativa de eliminar as ervas daninhas, mas existem mutações
que conferem resistência podendo as ervas chegar à idade adulta e reproduzir-se.
Mafalda – Muito bem. Passemos então à investigação propriamente dita. Dr. Rita,
quer falar-nos um pouco das dificuldades que encontraram neste projecto?
Dra.Rita – Não foi fácil, não. Para começar, o protocolo estipulado era um pouco
incongruente e surgiram dificuldades na sua interpretação. Houve também a questão
do material necessário e do “timing”…
Dr.Jorge – Mas no fim tudo se conseguiu resolver. Tubos de ensaio, suportes,
varetas, pipetas, balões, placas de petri, conta-gotas, incontáveis! Houve a questão
também da triptona, necessária à preparação do meio LB que não nos foi
disponibilizada. Tivemos que encontrar outra alternativa. Foi uma entre outras
situações que comprometeram o sucesso da experiência.
Mafalda – E como se realizou todo o procedimento?
Dr.Nuno - Bem, tivemos que esterilizar todo o material a temperaturas de 180ºC numa
estufa para evitar contaminações de outras colónias de bactérias. Depois preparámos
o meio Luria-Bertani para permitir o crescimento e manutenção das bactérias. Aqui em
vez de triptona utilizámos pepsina, que tem o mesmo efeito. Para além disso,
utilizámos extracto de leveduras e cloreto de sódio. Colocámos também parte do LB
em tubos de ensaio. Seguidamente, preparámos a solução–tampão PBS que
distribuímos por tubos de ensaio em doses de 9mL.
Dra.Rita – É importante notar que este foi um processo moroso porque os 9mL tinham
que ser certos, nem mais mL nem menos.
Dr.Nuno – Exactamente, porque iriam ser utilizados para diluições. Uma falha nas
doses de PBS iria afectar logo a concentração da solução. Mas antes disso,
preparámos ainda placas de petri com agar, que é uma espécie de gelatina, onde
iríamos colocar as bactérias nos passos seguintes. As placas diferiam no facto de
terem ou não ampicilina.
Dr.Jorge – Tivemos alguns problemas na preparação do agar porque, inicialmente, a
quantidade de agar que utilizámos na preparação não permitiu a sua solidificação,
pelo que foi necessário repetir e adicionar mais agar.
Dr.Nuno – Finalmente, preparámos a cultura-mãe, a partir de uma colónia de E.coli
que juntámos num balão erlenmeyer com LB e levámos a incubar.
Mafalda – E foram estes os primeiros passos. O que se seguiu?
Rita – Preparar uma placa de controlo
com ampicilina e bactérias. Transferimos
1mL da cultura-mãe para um tubo PBS, e
desse para outro e assim sucessivamente
ao longo de quatro tubos de modo a diluir
e ficar com diferentes concentrações.
Seguidamente colocámos 3 gotas, da
cultura-mãe, ou de um dos quatro tubos,
em cada divisão diferente da placa de
agar com ampicilina. Cada placa estava
dividida em 5. Depois juntámos uma
porção de cultura-mãe a um tubo com LB e a outro tubo juntámos cultura-mãe e
ampicilina. Esperámos 2 dias, deixando tempo para incubar.
Dr.Jorge – Entretanto surgiu um problema. Deveríamos contar o número de colónias
de bactérias resistentes na cultura, e deveriam ser muitas. Ao contrário do esperado,
não encontrámos quaisquer bactérias! Provavelmente, devido a um qualquer erro no
procedimento, não temos explicação certa. Tivemos que repetir toda a última parte do
procedimento com um outro lote de bactérias E.coli.
Dr.Nuno – E desta vez conseguimos fazer a contagem!
Dr.Jorge – De seguida, tornámos a repetir o processo de diluição de 1 mL de cultura
em tubos de ensaio, mas desta vez eram 8. Retirámos gotas dos 5 mais diluídos e
colocámos 3 gotas de cada um em cada divisão de uma placa de agar sem ampicilina.
Repetimos o processo utilizado na preparação da placa de controlo para preparar
outra placa. Por fim, preparámos uma outra placa com ampicilina adicionando-lhe
gotas da cultura e dos 4 tubos PBS mais diluídos. Incubámos durante dois dias, e
estava pronto para a contagem!
Mafalda - Ou seja, as conclusões.
Dra.Rita – Exactamente.
Mafalda – E foram as esperadas?
Dra.Rita – Diferiram um pouco do esperado na teoria, provavelmente devido a todos
os contratempos, mas foram muito próximas. Na placa mãe, o local onde deitámos
gotas provenientes directamente da cultura continha demasiadas colónias para ser
possível contá-las. Nas divisões onde colocámos gotas com a cultura mais diluída não
existiam sequer bactérias. Nas três placas com diluições iguais (as dos 8 tubos)
verificámos resultados muito idênticos, apesar da existência ou não de antibiótico. As
divisões com cultura menos diluída continham mais bactérias que as restantes e nas
duas divisões com culturas mais diluídas não existiam quaisquer vestígios de
bactérias. A placa com ampicilina com preparação idêntica à da placa mãe obteve
resultados muito idênticos a esta, tal como esperávamos.
Dr.Nuno – Através destes resultados podemos constatar que a cultura-mãe continha,
apesar de uma frequência obviamente baixa, bactérias mutantes resistentes ao
antibiótico. Verificamos isso porque na placa com antibiótico, a frequência de bactérias
resistentes é muito mais elevada. Verificamos também um número mais elevado em
culturas com ampicilina do que culturas sem ela devido à chamada selecção natural,
pelo que conseguimos atingir o objectivo da experiência.
Mafalda – E comparando a situação evolutiva das bactérias com a dos animais e
plantas, quais são as suas diferenças e semelhanças?
Dr.Jorge – As bactérias não apresentam variabilidade genética numa população, e as
poucas alterações no seu fundo genético ocorrem devido a mutações. Assim, qualquer
mudança no ambiente altera profundamente a forma como esta se comporta, ao
contrário das plantas e animais que beneficiam de reprodução sexuada. No entanto, a
selecção natural processa-se da mesma forma: apenas os mais aptos sobrevivem e
conseguem reproduzir-se.
Dr.Nuno – Só para concluir, há dois factos a sublinhar: a diferença no tamanho das
colónias permite-nos afirmar que as colónias de bactérias resistentes são maiores que
as colónias de bactérias não resistentes. Além disso, é também interessante verificar
que as placas com ampicilina são menos “turvas” que as placas sem, ou seja, contêm
menos colónias. Podemos deduzir então que apesar de não matar as bactérias
resistentes, o antibiótico sem dúvida atrasa a sua reprodução.
Dra.Rita – Em suma, todo este procedimento veio comprovar a teoria evolutiva
proposta por Darwin que é caracterizada pela selecção natural. Apenas nós temos
mais conhecimentos acerca da existência dos genes em cromossomas e a maneira
como eles se manifestam. A diversidade dos seres vivos tem como fonte primária as
mutações e como fonte mais próxima a recombinação génica.
Mafalda – Bem, penso que podemos dar por concluída a entrevista, obrigada
pela vossa presença. E boas investigações!
Jorge Santos
Mafalda Barrela
Nuno Vítor
Rita Barata