ALTERAÇÕES HISTOPATOLÓGICAS NA EPIDERME DE Mugil

ALTERAÇÕES HISTOPATOLÓGICAS NA EPIDERME DE Mugil platanus
(MUGILIDAE) COMO RESULTADO DA AÇÃO DE BACTÉRIAS ENCONTRADAS
NO RIO TRAMANDAÍ – TRAMANDAÍ – RS.
Sérgio Luis Langer
Faculdade Cenecista de Osório, Rua 24 de maio, 141, CEP: 95520-000, Osório, RS, Brasil,
[email protected]
Vera Maria Ferrão Vargas
Laboratório de Biologia–FEPAM, Av. Salvador França, 1707, CEP: 90960-000, Porto Alegre, RS,
Brasil, [email protected]
Fábio Flores-Lopes
Bolsista do CNPq; Pós-Graduação em Biologia Animal, Departamento de Zoologia, Instituto de
Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Av. Bento Gonçalves, 9500, Prédio 43435,
Bloco IV, CEP: 90540-000, Porto Alegre, RS, Brasil, [email protected]
Luiz Roberto Malabarba
Pós-Graduação em Biologia Animal, Departamento de Zoologia, Instituto de Biociências,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Av. Bento Gonçalves, 9500, Prédio 43435, Bloco IV,
CEP: 90540-000, Porto Alegre, RS, Brasil, [email protected] e Museu de Ciências e Tecnologia,
Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Av. Ipiranga, 6681, Cx. P. 1429,
CEP 90619-900, Porto Alegre, RS, Brasil, [email protected]
Resumo
A manifestação de patologias infecciosas em populações de peixes costuma
ser incrementada em ambientes onde são lançados despejos orgânicos. Exemplares
da espécie Mugil platanus coletados em três pontos do rio tramandaí foram
utilizados para análise das anomalias e amostras de água foram realizadas durante
o período de um ano para verificação da presença de bactérias. A observação
macroscópica revelou ulcerações na região do pedúnculo caudal revestidas por uma
massa de tecido amorfo e esbranquiçado. A análise histopatológica mostrou a
presença de bactérias gram negativas, que provavelmente foram as responsáveis
pela alteração total da estrutura normal dos tecidos de revestimento do corpo. O
resultado da análise estatística não paramétrica para a concentração de amônia
mostrou uma variação significativa entre os três pontos amostrados bem como nas
comparações múltiplas entre os pontos dois a dois. O objetivo deste trabalho foi
descrever as lesões observadas na epiderme de exemplares de Mugil platanus e
testar sua correlação relacionada com a concentração de amônia.
Palavras-chave: Mugil platanus, alterações histopatológicas, Amônia.
Abstract
The manifestation of infectious pathologies in fishes usually increases in
environments where organic wastes are thrown. Specimens of Mugil platanus
collected in three points of the river Tramandaí and water samples were analyzed
2
during the period of one year. The macroscopic observation revealed ulcerations in
the area of the caudal peduncle covered with a mass of amorphous and whitish
tissues. The histopathologic analysis showed the presence of negative gram
bacteria, probably responsible for alterations of the normal structure of the epidermic
tissues. It was observed a statistical significant variation of the concentration of
ammonia among the three analyzed points as well as along comparisons between
each pair of points. The objective of this work was to describe of lesions observed in
the epidermis of specimens of Mugil platanus and to test it correlation relate with the
concentration of ammonia.
Word-key: Mugil platanus, histopatologic alterations, Ammonia.
INTRODUÇÃO
Distúrbios funcionais que ocorrem no peixe, além de influenciar as suas
características biológicas e aumentar a suscetibilidade para fatores ambientais
desfavoráveis, também prejudicam o próprio mecanismo de defesa do peixe, abrindo
caminhos para a ação de fatores secundários tais como doenças causadas por
parasitas ou agentes infecciosos (Mitrovic, 1970). Sabe-se ainda que a manifestação
de patologias infecciosas em populações de peixes costuma ser incrementada em
ambientes onde são lançados despejos orgânicos, os quais, determinam uma
elevada proliferação de vibriões e bactérias patogênicas (Mason, 1991; Robbins,
1996; Du Vivier, 1997). As bactérias são organismos que podem ter uma enorme
importância em piscicultura pelas doenças que provocam, as quais freqüentemente
têm um impacto econômico apreciável nas populações de peixes. As taxas de
mortalidade são por vezes muito elevadas, especialmente em situações de estresse
dos hospedeiros (Bruno, 1992).
Autores como Mason (1991) e Du Vivier (1997), tem relatado que entre os
fatores que promovem a ação bacteriana estão as proteínas de superfície
(envolvidas na aderência às células), as enzimas (que degradam as proteínas), e as
exotoxinas (que degeneram as células do hospedeiro provocando a síndrome da
pele escaldada). As bactérias, quando se alojam na pele, pulmões, ossos ou valvas
cardíacas, provocam inflamação piogênica, que é notável por sua capacidade de
destruição local (Robbins, 1996). Langer (2003) salientou que o sinergismo de certas
substâncias presentes no meio, como a amônia, podem intensificar o efeito
toxicológico e servir como fator de crescimento para determinadas populações
bacterianas.
Este trabalho teve como objetivo descrever as lesões observadas na epiderme
de exemplares de Mugil platanus provocadas provavelmente pela ação bacteriana e
relacionar a ocorrência dessas lesões com a variação da concentração de amônia
no meio ambiente.
MATERIAL E MÉTODOS
Para o presente estudo foram utilizados exemplares da espécie Mugil platanus
coletados em três pontos do rio tramandaí: o ponto 1 situa-se no município de
Tramandaí, a 20m da ponte Tramandaí-Imbé (limite intermunicipal), nos mini-platôs
de pesca, definido como ponto de descarte dos restos de pescado; Ponto 2:
Localizado no município de Imbé, a 15m da ponte, na margem esquerda, definida
como ponto de lançamento de efluentes sanitários; Ponto 3: Localizado também no
município de Imbé, a 6 km da ponte, na margem oposta à junção do rio com o canal
3
da lagoa do Imbé, com distanciamento mínimo de 600m desta margem,
caracterizado como ponto de referência sem influência de interferentes ambientais.
Amostras de água foram realizadas com vistas à análise de pH e concentração
de amônia presente no meio. Estas amostragens foram, em número de 10,
realizadas durante o ano de 2002, nos meses de janeiro a novembro, sendo que, no
mês de julho, em decorrência das condições meteorológicas adversas não foi
realizado trabalho de campo. Estas amostragens foram realizadas com os kits
LabconTest – pH Tropical e LabconTest – Amônia/ NH3/NH4 , e realizadas ainda em
campo. Uma coleta de água realizada no ponto 2 foi encaminhada ao Laboratório de
Análises Clínicas e Toxicológicas – TOXILAB, para análise da presença e
quantificação da(s) bactéria(s). Simultaneamente, uma segunda amostra de água
recolhida no mesmo ponto foi encaminhada ao Laboratório QUÍMIOAMBIENTAL a
fim de obter-se a tipologia específica das bactérias, aplicando-se, para isso, a
metodologia de Tubos Múltiplos, Fluorescência, Pour Plate, Spread Plate e
Bioquímica Clássica.
Em quatro períodos (jan-fev; mar-abr; mai-jun e out-nov) foram coletados,
aleatoriamente, de 40 a 50 exemplares da espécie Mugil platanus, utilizando-se uma
rede de arrasto de malha fina (0,5 cm) com 3m de comprimento por 1m de largura,
fixados imediatamente em formol a 10% e posteriormente examinados externamente
para o registro e análise da freqüência de anomalias. Ao longo dos períodos
analisados, foram considerados o número de peixes coletados em cada ponto,
definindo-se os sadios e anômalos (Tab. I).
A amostragem realizada em out-nov foi encaminhada ao Museu de Ciências e
Tecnologia da PUCRS para confirmação da espécie e verificação do tipo de
anomalias. Em seguida, o material foi enviado ao Laboratório de Ictiologia da
UFRGS para análise histológica. Para este procedimento os espécimes foram
descalcificados com ácido tricloroacético a 5% por um período de 12 horas. Foi
utilizada a técnica de desidratação em álcool etílico para impregnação e inclusão em
parafina, realizando-se os cortes em um micrótono com espessura entre seis e sete
micrômetros. Para visualização geral dos tecidos foi utilizada a técnica histológica de
rotina de Hematoxilina e Eosina (H&E) e para verificação da presença e tipos de
bactérias foi utilizado o Método de Gram.
As diferenças entre as variáveis pH e concentração de amônia nos diferentes
locais amostrados foram avaliados pela análise de variância não paramétrica de
Kruskal-Wallis para comparações múltiplas.
RESULTADOS
A estrutura de revestimento do corpo da espécie Mugil platanus é normalmente
formada por uma epiderme e uma derme. A epiderme é formada por um pequeno
número de camadas de tecido epitelial (geralmente de duas a cinco). Por entre este
tecido situam-se as escamas, que se encontram imbricadas e sobrepostas. Junto as
escamas observa-se um pouco de tecido conjuntivo frouxo e tecido muscular liso,
que tem a função de fazer com que a margem anterior da escama penetre dentro da
derme. Abaixo das escamas, ocorre uma camada de tecido conjuntivo denso e, logo
abaixo, uma espessa camada de melanina e cromatóforos, que dão a cor escura
aos indivíduos jovens. Depois desta camada de pigmentos é verificada a presença
de tecido muscular estriado esquelético.
A análise macroscópica dos indivíduos anômalos de Mugil platanus revelou
ulcerações na região do pedúnculo caudal revestidas por uma massa de tecido
4
amorfo, que apresentava uma coloração esbranquiçada. A análise histopatológica
destas ulcerações nos permitiu verificar a presença de bactérias gram negativas,
que provavelmente foram as responsáveis pela alteração total da estrutura normal
dos tecidos de revestimento do corpo. As bactérias observadas apresentavam uma
forma arredondada e estavam agrupadas em várias colônias que encontravam-se
espalhadas por toda a área afetada. O tecido epitelial praticamente desapareceu,
sendo possível observar-se apenas um tecido amorfo, células adiposas e de tecido
glandular. As escamas, tecido muscular liso e tecido conjuntivo praticamente não
são observados, em função de estarem quase que totalmente alterados. As fibras de
tecido muscular estriado esquelético também estavam bem alteradas na sua forma.
A análise laboratorial, realizada pelos métodos Colilert e contagem em placa,
da amostra de água recolhida no ponto 2 confirmou a presença de bactérias
heterotróficas em quantidades acima do limite aceitável. Pelo método de cultura “in
vitro” foi constatada a presença de Staphyllococus aureus na água. A metodologia
de Tubos Múltiplos, Fluorescência, Pour Plate, Spread Plate e Bioquímica Clássica
presenciou ainda, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa
e Microorganismos Mesófilos Totais Aeróbios.
Como pode ser observado na Tabela I o ponto 2 apresentou o maior número
de peixes com alterações teciduais, sendo observados 6 exemplares em out-nov, 5
em mar-abr, 4 em jan-fev e 3 em mai-jun. Já, no local 1 os valores foram mais
constantes, sendo observado 2 peixes afetados em jan-fev, mar-abr, out-nov, e 1
exemplar anômalo em mai-jun. No ponto 3, não foram observadas anomalias nos 4
períodos amostrados.
Tabela 1: Número de exemplares de Mugil platanus examinados por ponto de
coleta e por mês amostrado, e freqüência absoluta de exemplares
anômalos por amostra.
Ponto
1
Anômal
N°/
peixes
os
Período
JAN-FEV
MAR-ABR
MAI-JUN
OUT-NOV
Total
%
anômalos
50
50
40
36
176
2
2
1
2
7
4
Ponto
2
Anômal
n°/
peixes
os
50
50
40
36
176
4
5
3
6
18
10
Ponto
3
Anômal
N°/
peixes
os
50
50
40
36
176
0
0
0
0
0
0
Total
528
150
150
120
108
528
05
A análise das amostras de água, por 10 meses no período de janeiro à
novembro, evidenciou a presença de amônia nos locais 1 e 2, cujos valores
encontrados foram: Ponto 1 – 0,25 ppm (valor mínimo) e 0,28 ppm (valor máximo) e
Ponto 2 – 0,28 ppm (valor mínimo) e 0,83 ppm (valor máximo). Não foi comprovado
a presença de amônia no Ponto 3, considerado como ponto de referência (Tab. II).
5
Tab. II : Valores de pH e amônia nos diferentes pontos de amostragem durante
o período de estudo: Ponto 1 (Restos de pescado); Ponto 2
(Lançamento de efluentes); Ponto 3 (Área fora de ação); [NH3 ]
Concentração de amônia em ppm; Temperatura em °C; Período de
amostragem de referência.
Período
JAN
FEV
MAR
ABR
MAI
JUN
AGO
SET
OUT
NOV
PH
7,5
7,5
7,6
7,2
7,1
7,5
7,2
7,2
7,3
7,5
Ponto 1
[NH3]
0,28
0,28
0,25
0,27
0,27
0,28
0,25
0,27
0,25
0,25
T
28,0
28,0
24,0
20,0
18,0
14,0
16,0
25,0
24,0
24,0
PH
7,7
7,5
7,7
7,5
7,5
7,7
7,3
7,7
7,5
7,8
Ponto 2
[NH3]
0,75
0,75
0,28
0,30
0,30
0,30
0,75
0,75
0,77
0,83
T
28,0
28,0
24,0
20,0
18,0
14,0
16,0
25,0
24,0
24,0
pH
7,0
7,0
7,0
7,0
7,0
7,0
7,0
7,0
7,0
7,0
Ponto 3
[NH3]
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
T
28,0
28,0
24,0
20,0
18,0
14,0
16,0
25,0
24,0
24,0
Os valores de pH obtidos nos locais 1 e 2 apresentaram variação conforme as
condições ambientais diferenciadas sendo no ponto 1 de 7,1 à 7,6 e no ponto 2 de
7,3 à 7,8, com valores constantes de 7,0 no ponto 3 durante todo o período de
estudo (Tab. II). Nos períodos de amostragem, a temperatura ambiental anotada foi
de 14°C em junho (mínima) e 28°C em janeiro e fevereiro (máxima) (Tab. II).
Através da análise de variância não paramétrica de Kruskal-Wallis, a avaliação
dos valores de pH entre os três pontos indicam valores significativos (p=0,0001) bem
como nas comparações múltiplas não paramétricas entre os pontos 1 e 3
(p=0,0096), bem como nos pontos 2 e 3 (p=0,0001). Para os pontos 1 e 2 não foram
observadas diferenças significativas (p=0,1518). Portanto, os pontos 1 e 2
apresentam valores significativamente superiores ao ponto 3.
Utilizando-se o mesmo método de análise estatística para a concentração de
amônia, observa-se a ocorrência de variação significativa entre os três pontos
amostrados (p=0,0001), bem como nas comparações múltiplas não paramétricas
entre os pontos dois a dois, resultando em diferenças significativas para o ponto 1 e
ponto 3 (p=0,01), pontos 2 e 3 (p=0,01) bem como pontos 1 e 2 (p=0,03). Portanto,
os resultados mostram uma gradação significativa na concentração de amônia, com
valores diferenciados entre eles, sendo mais elevada no ponto 2, seguido pelo ponto
1 e não apresentando variação significativa no ponto 3 (Figura 1).
Variação de pH
Variação na concentração de NH3
8
0,9
7,8
0,8
0,7
0,6
7,6
Ponto 1
7,4
pH
Ponto 2
7,2
Ponto 3
7
6,8
[NH3]
0,5
0,4
Ponto 1
Ponto 2
0,3
0,2
0,1
período de amostragem
S
E
T
O
UT
NO
V
R
B
M
AI
JU
N
AG
O
A
AGO SET OUT NOV
M
AR
N
MAI JUN
JA
FEV MAR ABR
FE
JAN
V
0
6,6
Período de amostragem
Figura 1 - Variação do pH e da Concentração de amônia ([NH3]) nos
diferentes pontos durante o período de amostragem.
6
DISCUSSÃO E CONCLUSÕES
Os efeitos subletais dos contaminantes químicos lançados no ambiente são, de
acordo com Leikin (1998), extremamente prejudiciais, afetando de forma lenta e
geralmente despercebida funções que asseguram a renovação das populações de
peixes, como a maturação sexual e a sobrevivência de ovos e larvas. Não se
conhecem com exatidão os fenômenos fisiológicos que se passam nos peixes e
favorecem a invasão e proliferação das bactérias, mas estão certamente
relacionados com uma diminuição da capacidade do sistema imunitário dos
hospedeiros (Pavanelli et al., 1998).
Nesse contexto, existem bactérias designadas genericamente como
organismos patogênicos secundários ou invasores secundários, que apenas
manifestam sua capacidade patogênica quando condicionadas por um estado de
debilidade dos hospedeiros (Heo et al., 1990). Por outro lado, existem bactérias
chamadas de agentes patogênicos primários ou invasores primários, que têm a
capacidade de iniciar uma infecção por si próprias em hospedeiros sujeitos a
estresse pouco intenso (Bruno, 1986). As bactérias podem se apresentar associadas
a diversos fenômenos patogênicos, que costumam ser divididos em três principais
aspectos: resposta septicêmica, necrose do tegumento e músculo, provocando
ulceração, e resposta crônica proliferativa (Pavanelli et al., 1998). Os resultados do
presente trabalho indicam que a ação de bactérias patogênicas secundárias
características de caráter antrópico, em especial Staphyllococus aureus e
Pseudomonas aeruginosa, que foram observadas nas amostras de água, são os
prováveis agentes causadores das lesões teciduais observadas em exemplares da
espécie Mugil platanus. Verificou-se que as lesões teciduais são do tipo necrose do
tegumento e da musculatura na região do pedúnculo caudal e que variavam nos
diferentes pontos amostrados.
É relatado na literatura que a presença de bactérias de origem fecal, como
resultado de lançamento de efluentes domésticos sem tratamento prévio, podem
proliferar no ambiente e provocar lesões cutâneas em peixes. Sabe-se que a
manifestação de patologias infecciosas em populações de peixes costuma ser
incrementada em ambientes onde são lançados despejos orgânicos, os quais,
determinam uma elevada proliferação de vibriões e bactérias patogênicas (Mason,
1991; Robbins, 1996; Vivier, 1997).
No presente trabalho, foi observado uma maior freqüência de exemplares de
peixes da espécie Mugil platanus afetados provavelmente pela ação de bactérias
nos pontos 1 e 2. No ponto 2 foi observado uma maior freqüência de espécimes
afetados, uma vez que este ponto recebe uma maior influência de efluentes
sanitários, o que faz com que a concentração de amônia seja maior neste local. Em
função disto, sugere-se que a amônia sirva de suporte como fator de crescimento
destes organismos. Os resultados deste estudo mostraram uma relação significativa
entre a freqüência de indivíduos com alterações teciduais da epiderme e a variação
na concentração de amônia do ambiente. Em função disto, pode-se concluir que
deve estar ocorrendo uma alteração de influência antrópica induzida pela limpeza de
pescado e lançamento de efluentes sanitários.
A elevação do pH e da concentração de amônia nos locais 1 e 2 podem
ocasionar uma elevação da toxicidade da amônia com risco para a população de
peixes locais (Smart, 1978; Moreira, 1998). Através da aplicação da análise não
paramétrica de Kruskal-Wallis foi observado que a relação entre a variação de pH e
a freqüência de ocorrência de anomalias foi estatisticamente significativa nos pontos
7
1 e 2, não sendo obtido um resultado estatísticamente significativo no ponto 3.
Autores como Niesink (1996), tem salientado que, o aumento da temperatura
também eleva a toxicidade da amônia, evidenciando ser uma variável de efeito
sinérgico, o que não foi verificado neste trabalho (Tabela II). As concentrações mais
elevadas de amônia (Tabela II) podem estar favorecendo a proliferação bacteriana
(entre estas, Staphyllococus aureus e Pseudomonas aeruginosa), uma vez que se
constitui um fator de crescimento para estas populações bacterianas.
A distribuição espacial da população de Mugil platanus está restrita às regiões
medianas do estuário e a concentração destes peixes nessas áreas-refúgio aumenta
a vulnerabilidade à predação natural e do homem, reduzindo a disponibilidade de
alimento com repercussões sobre o crescimento e a fecundidade. Ainda é
importante destacar que, pelo fato dos alevinos desta espécie estarem sendo
afetados por bactérias e estarem desenvolvendo anomalias, estas ações podem vir
a comprometer seus hábitos de manutenção neste estuário. Nesse sentido, a
pesquisa realizada sugere que a presença da amônia na água possa estar
influenciando nas possíveis modificações organo-fisiológicas provocadas pela ação
de bactérias provenientes dos lançamentos de dejetos no ambiente, tendo nela um
dos fatores de crescimento destas populações.
Autores como Flores-Lopes (2000, 2001 e 2002) e Langer (2003) tem utilizado
a presença de lesões/anomalias em espécies de peixes como instrumento de
avaliação biológica da qualidade ambiental. Os resultados obtidos no presente
trabalho, observados em exemplares da espécie Mugil platanus, reforçam a
importância do uso de anomalias como indicadores de alterações e degradações
ambientais de origem antrópica que comprometem a qualidade dos ecossistemas,
servindo como ferramenta para um programa de monitoramento ambiental periódico
da região.
AGRADECIMENTOS
À Geógrafa Msc. em Ciências Ambientais, Lílian Waquil Ferraro, pela
configuração dos mapas. Aos alunos Felipe Antunes e Bernardo Duarte, da FACOSFACAD-MARQUÊS–CNEC / Osório-RS, pela participação auxiliar nas coletas. Ao
instituto de Toxicologia (INTOX) da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande
do Sul.
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