Influência do Fluido Folicular na Competência Oocitária

UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC
CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E HUMANAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOCIÊNCIA
Glaucia Pereira Alves
INFLUÊNCIA DO FLUIDO FOLICULAR NA COMPETÊNCIA OOCITÁRIA:
IDENTIFICAÇÃO DE FATORES ENVOLVIDOS NA QUALIDADE OOCITÁRIA E
CINÉTICA DE DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO
Santo André-SP
2016
Glaucia Pereira Alves
INFLUÊNCIA DO FLUIDO FOLICULAR NA COMPETÊNCIA OOCITÁRIA:
IDENTIFICAÇÃO DE FATORES ENVOLVIDOS NA QUALIDADE OOCITÁRIA E
CINÉTICA DE DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Biotecnociências da Universidade
Federal do ABC, como requisito final para
obtenção do título de mestre em Biotecnociências.
Área de Concentração: Biotecnologia
Orientadora: Prof°.Dra. Marcella Pecora Milazzotto
Santo André-SP
2016
Este exemplar foi revisado e alterado em relação a versão
original, de acordo com as observações levantadas pela banca
no dia da defesa, sob responsabilidade única do autor e com a
anuência de seu orientador.
Santo André,____de_________________de 20___.
Assinatura do autor: ____________________________________
Assinatura do orientador:________________________________
“Ostras felizes não fazem pérolas… Pessoas
felizes não sentem a necessidade de criar. O
ato criador, seja na ciência ou na arte, surge
sempre de uma dor. Não é preciso ser uma dor
doída… Por vezes a dor aparece como aquela
coceira que tem o nome de curiosidade.”
Rubens Alves
AGRADECIMENTOS
Á Deus pela saúde e por ter me mantido no caminho todas as vezes que pensei em
desistir.
À minha orientadora Profª. Dra. Marcella Milazzotto pela confiança, amizade,
paciência, puxões de orelha, compreensão e credibilidade dispensados ao longo do período de
mestrado. Foi um período muito importante de crescimento e amadurecimento pessoal.
Aos meus pais, irmãos, sobrinhos e todos familiares pela compreensão por minha
ausência durante toda essa longa jornada.
Aos meus tios (Wanderley e Vera Lúcia) e primas (Carol e Bárbara) pelo apoio em
todos os momentos. Sem vocês esta etapa não poderia ser vencida. Muito obrigada.
Ás meninas do laboratório 502-3, Karine, Mayra, Fernanda, Carol, Juliana, pela
amizade e convívio agradável.
Ao meu grupo de pesquisa Érika, Jéssica, Camila, Roberta, Aline e em especial a
Kelly que teve a paciência de me ensinar e me ajudou no árduo trabalho de produção das
amostras, sem a qual não seria possível a execução.
Às amigas Silvia e Graziele pela amizade, pelo apoio, pelos momentos de
descontração e muitas risadas. Também pelas longas conversas que tanto amenizavam a
distância de casa.
Às amigas de república Hellen e Rebecca pelo convívio, pela amizade e por tudo que
passamos juntas.
Agradeço a Universidade Federal do ABC pela oportunidade de realização da pósgraduação em Biotecnociência.
À FAPESP pelo apoio financeiro que possibilitou a realização desse trabalho.
A todos que não foram aqui mencionados, mas que direta ou indiretamente
contribuíram para esta pesquisa.
Os meus sinceros agradecimentos.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AngII
AngiotensinaII
AngII AT1
Receptor de AngiotensinaII tipo1
AngII AT2
Receptor de AngiotensinaII tipo2
ATP
Adenosina trifosfato
BLL
Blastocisto lento
BLR
Blastocisto rápido
CIV
Cultivo in vitro
CL
Clivados
CLL
Clivados lentos
CLR
Clivados rápidos
CLBL
Clivados que chegaram a blastocistos
CLNBL
Clivados que não chegaram a blastocistos
CLNBLL
Clivados que não chegaram a blastocistos lentos
CLNBLR
Clivados que não chegaram a blastocistos rápidos
COCs
Complexos cumulus oophorus
CO2
Dióxido de Carbono
DNA
Ácido desoxirribonucleico
EGF
Fator de crescimento epidermal
EFG-R
Receptor do fator de crescimento epidermal
FF
Fluido folicular
FIV
Fecundação in vitro
FSH
Hormônio folículo estimulante
FSH-R
Receptor de hormônio folículo estimulante
GSH
Glutationa
GVBD
Quebra da vesícula germinativa
HBP
Via biossintética hexosamina
hCG
Gonadotrofina coriônica
IETS
International Embryo Transfer Society
LH
Hormônio luteinizante
LH-R
Receptor de hormônio luteinizante
MIV
Maturação in vitro
NADPH
Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato
NCL
Não clivados
PIV
Produção in vitro
PKA
Proteína quinase A
PPP
Via das pentoses fosfato
PRPP
Fosforibosilpirofosfato
P450arom
Aromatase
P450scc
Cholesterol side-chain cleavage
RNA
Ácido ribonucléico
RNAm
RNA mensageiro
ROS
Espécies reativas de oxigênio
SFB
Soro fetal bovino
SOF
Synthetic Oviductal Fluid
TCA
Ciclo do ácido tricarboxílico
3βHSD
3β- desidrogenase
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Biossíntese de estradiol a partir de colesterol
8
Figura 2: Esquema representativo do modelo de duas células: célula da teca e célula da granulosa.
Nas células da teca o colesterol é transportado pela StAR para dentro da matriz mitocondrial onde
é convertido a pregnenolona pela enzima side chain cleavage (P450scc) que em seguida é
convertida a androgênios (androstenediona). Os androgênios da teca difundem-se para as células
da granulosa, onde são convertidos pela aromatase (P450arom) em estradiol. A síntese de 10
P450arom é estimulada via núcleo (seta vermelha) por AngII AT2 e também através de FSH/FSHR via AMPc/PKA que é produto da oxidação de glicose e piruvato. A síntese de FSH-R é
estimulada via núcleo por EGF/EGF-R , e este estímulo induz aumento do antro, proliferação e
diferenciação das células da granulosa.
Figura 3: Esquema representativo do mapa de localização dos oócitos em uma placa de MIV. Cada placa de
MIV contém cinco gotas de meio de maturação. Em cada gota foram feitos cinco poços e em cada 17
poço foi alocado um oócito proveniente de um folículo pré identificado. O liquido folicular
referente a este oócito foi congelado até o momento da análise.
Figura 4: Produção embrionária A) Índice de clivagem total (CLT) e clivados rápidos (CLR) e lentos
(CLL), B) Índice de blastocistos do grupo rápido (BLR), grupo lento (BLL) e blastocistos totais
23
(BLT) em relação aos oócito clivados totais e C) Índice de blastocistos em relação aos embriões
clivados por grupo – CLBLR – blastocistos rápidos/ CLBLL blastocistos lentos.
Figura 5: Concentração de glicose referente ao fluido folicular que derivaram: A) Não Clivados(NCL) e
Clivados(CL), B)Clivados Rápidos(CLR) e Clivados Lentos(CLL), C)Não Blastocistos(NBL) e
Blastocistos(BL), D) Clivados Não Blastocistos(CLNBL) e Clivados Blastocistos(CLBL) e E) 24
Blastocistos Rápidos e Blastocistos Lentos.** Indica grupo com tendência a ter maior
concentração.
Figura 6: Concentração de colesterol referente ao fluido folicular que derivaram: A) Não Clivados (NCL) e
Clivados (CL), B) Clivados Rápidos (CLR) e Clivados Lentos (CLL), C) Não Blastocistos (NBL)
e Blastocistos (BL), D) Clivados Não Blastocistos (CLNBL) e Clivados Blastocistos (CLBL) e E) 25
Blastocistos Rápidos e Blastocistos Lentos. *Indica grupo com maior concentração do metabólito.
Figura 7: Concentração de piruvato referente ao fluido folicular que derivaram:: A) Não Clivados(NCL) e
Clivados(CL), B)Clivados Rápidos(CLR) e Clivados Lentos(CLL), C)Não Blastocistos(NBL) e
Blastocistos(BL), D) Clivados Não Blastocistos(CLNBL) e Clivados Blastocistos(CLBL) e E) 26
Blastocistos Rápidos e Blastocistos Lentos. *Indica grupo com maior concentração do
metabólito.**Indica grupo com tendência a ter maior concentração do metabólito.
Figura 8: Concentração de estradiol referente ao fluido folicular que derivaram: A) Não Clivados(NCL) e
Clivados(CL), B)Clivados Rápidos(CLR) e Clivados Lentos(CLL), C)Não Blastocistos(NBL) e 27
Blastocistos(BL), D) Clivados Não Blastocistos(CLNBL) e Clivados Blastocistos(CLBL) e E)
Blastocistos Rápidos e Blastocistos Lentos. *Indica grupo com maior concentração do metabólito
Figura 9: Expressão relativa do gene FSHR em células da granulosa que derivaram os grupos: A) Não
clivados (NCL) e clivados (CL), B) clivados rápidos CLR e clivados lentos (CLL), C) não
28
blastocistos (NBL) e blastocistos (BL), D) clivados não blastocistos (CLNBL) e clivados
blastocistos (CLBL) e E) blastocistos rápidos (BLR) e blastocistos lentos (BLL). *Indica maior
expressão relativa do gene.
Figura 10: Expressão relativa do gene CYP19A em células da granulosa que derivaram os grupos: A) Não
clivados (NCL) e clivados (CL), B) clivados rápidos CLR e clivados lentos (CLL), C) não
blastocistos (NBL) e blastocistos (BL), D) clivados não blastocistos (CLNBL) e clivados
blastocistos (CLBL) e E) blastocistos rápidos (BLR) e blastocistos lentos (BLL). *Indica maior 29
expressão relativa do gene.
Figura 11: Expressão relativa de RNAm para receptores de angiotensina II do tipo 2 (AT2) em células da
granulosa que derivaram os grupos: : A) Não clivados (NCL) e clivados (CL), B) clivados
rápidos CLR e clivados lentos (CLL), C) não blastocistos (NBL) e blastocistos (BL), D) clivados
não blastocistos (CLNBL) e clivados blastocistos (CLBL) e E) blastocistos rápidos (BLR) e
30
blastocistos lentos (BLL). *Indica maior expressão relativa do gene.
Figura 12: Expressão relativa de RNAm para receptores de EGF em células da granulosa que derivaram os
grupos: A) Não clivados (NCL) e clivados (CL), B) clivados rápidos CLR e clivados lentos
(CLL), C) não blastocistos (NBL) e blastocistos (BL), D) clivados não blastocistos (CLNBL) e
clivados blastocistos (CLBL) e E) blastocistos rápidos (BLR) e blastocistos lentos (BLL). *Indica
31
maior expressão relativa do gene.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Moléculas que foram avaliadas neste projeto e sistema de avaliação
19
Tabela 2: Dados utilizados na padronização dos kits de quantificação das moléculas
19
que foram avaliadas.
Tabela 3: Genes avaliados e seus respectivos códigos no fabricante e no GenBank.
21
Tabela 4: Correlação das moléculas do fluido folicular que derivaram embriões Não
32
Clivados.
Tabela 5: Correlação das moléculas do fluido folicular que derivaram embriões
33
Clivados.
Tabela 6: Correlação das moléculas do fluido folicular que derivaram Clivados
33
Rápidos
Tabela 7: Correlação das moléculas do fluido folicular que derivaram Clivados
34
Lentos
Tabela 8: Correlação das moléculas do fluido folicular que derivaram Não
34
Blastocistos
Tabela 9: Correlação das moléculas do fluido folicular que derivaram Blastocistos
Tabela 10: Correlação das moléculas do fluido folicular que derivaram Clivados não
35
35
Blastocistos
Tabela 11: Correlação das moléculas do fluido folicular que derivaram Clivados
36
Blastocistos
Tabela 12: Correlação das moléculas do fluido folicular que derivaram Blastocistos
36
Lentos
Tabela 13: Correlação das moléculas do fluido folicular que derivaram Blastocistos
Rápidos
37
Sumário
1.
Revisão de Literatura .......................................................................................... 5
2.
Objetivo .............................................................................................................. 15
3.
Metodologia ....................................................................................................... .16
3.1 Local dos procedimentos .................................................................................... .16
3.2 Procedimento experimental para PIV de embriões bovinos .................................. 16
3.2.1 Coleta e maturação in vitro de oócitos ............................................................. .16
3.2.2 Fecundação e cultivo in vitro ........................................................................... .17
3.3 Análise da produção e morfocinética embrionária .............................................. .18
3.4 Análise dos componentes do fluido folicular ...................................................... .18
3.5 Análise de expressão gênica das células da granulosa ......................................... .20
3.6 Análise estatística ............................................................................................... .21
4.
Resultados ........................................................................................................ .23
4.1 Desenvolvimento embrionário ............................................................................ .23
4.2 Análises dos componentes do fluido folicular ...................................................... 23
4.3 Análises da expressão gênica das células da granulosa ........................................ 27
4.4 Correlação entre moléculas do fluido folicular ..................................................... 32
5.
Discussão ............................................................................................................ 38
6.
Conclusão .......................................................................................................... .42
7.
Referências ........................................................................................................ .43
ANEXO .................................................................................................................... .51
INFLUÊNCIA DO FLUIDO FOLICULAR NA COMPETÊNCIA OOCITÁRIA: IDENTIFICAÇÃO DE
FATORES ENVOLVIDOS NA QUALIDADE OOCITÁRIA E CINÉTICA DE DESENVOLVIMENTO
EMBRIONÁRIO
Resumo
A maturação de oócitos in vitro é amplamente utilizada para produção de embriões e tenta
mimetizar as condições fisiológicas foliculares, permitindo a capacitação oocitária. No
entanto, as condições foliculares a que os oócitos estão submetidos previamente a aspiração
podem ser responsáveis por diferenças que serão refletidas no fenótipo embrionário. O
objetivo deste trabalho foi quantificar marcadores metabólicos no fluido folicular (FF) e
transcritos das células da granulosa (CG) de bovinos envolvidos na capacitação do oócito e
sua relação com a competência embrionária (avaliada pela cinética e desenvolvimento a
blastocisto). Para isso, foram aspirados individualmente complexo cumulus-oocito (COCs) e
respectivos FFs e CG de folículos de 7-8mm de ovários de abatedouro comercial. As
moléculas de glicose, colesterol, estradiol e piruvato foram quantificadas nos FFs por
fluorimetria e os transcritos de receptor de FSH (FSH-R), receptor de angiotensina II
(AngIIAT2), receptor de EGF (EGF-R) e aromatase (CYP19A) foram quantificados nas CG
por RT-PCR. Os COCs foram fecundados e cultivados individualmente in vitro e os índices
de clivagem e cinética embrionária foram avaliados as 40hpi e índices de blastocistos as
186hpi. Posteriormente os dados de desenvolvimento embrionário foram analisados em
função dos dados dos respectivos FF e CG. Foram realizadas as seguintes comparações: não
clivados x clivados (NCL x CL), clivados rápidos (> 4 células as 40hpi) x clivados lentos (< 4
células as 40hpi) (CLR x CLL), desenvolvimento a blastocisto x bloqueado (BL x NBL),
clivados que se desenvolveram a blastocisto x clivados bloqueados (CLBL x CLNBL) e
blastocistos derivados do grupo rápido x derivados do grupo lento (BLR x BLL). Os dados
foram analisados pelo programa SAS System for Windows pelo teste t de Student, e o nível de
significância de 5%. Não houve diferença entre os índices de CLR e CLL (19,2±3,8% e
25,1±3,8%, respectivamente). Da mesma forma, nenhum dos metabólitos e transcritos
analisados foram distintos entre CLR x CLL, tampouco NCL x CL, a exceção do FSHR, que
foi menos expresso CL, BL e CLBL quando comparados a NCL, NBL e CLNBL. O índice de
BL foi (27,3±3,9%) e maior índice de blastocisto foi para BLR do que BLL (18,5±2,7% e
8,8±2,5%, respectivamente). BL e CLBL apresentaram maior quantidade de piruvato e
colesterol, aumento de CYP19 e, no caso de CLBL, ainda maiores níveis de ANGII e EGF-R
1
quando comparados a NBL e CLNBL. Em relação a cinética de desenvolvimento, CLR e
BLR apresentaram aumento de ANGII e estradiol. Além disso, BLR ainda apresentaram
diminuição de CYP19 e EGF-R, sugerindo uma alta atividade esteroidogênica mais
relacionada à secreção do que com a síntese de esteroides, provavelmente por um efeito
negativo do estradiol no controle da expressão destes genes. Os dados deste estudo permitem
concluir que o status folicular tem relação direta com a habilidade do oócito a se desenvolver
a blastocisto. Além disso, o aumento da disponibilidade de substrato energético e da
capacidade esteroidogênica parece influenciar positivamente a capacitação oocitária. Da
mesma forma, embriões de cinética distinta parecem ser derivados de folículos com atividade
esteroidogênica distinta.
Palavras-chave: fluido folicular, células da granulosa, biomarcadores, capacidade
esteroidogênica, capacitação oocitária.
2
FOLLICULAR FLUID INFLUENCE IN THE OOCYTE COMPETENCE: IDENTIFICATION OF
FACTORS INVOLVED IN OOCYTE QUALITY AND EMBRYONIC DEVELOPMENT OF KINECT
Abstract
Follicular conditions established prior to aspiration for in vitro maturation may be responsible
for differences that will reflect in the embryonic phenotype. In this work, cumulus-oocyte
complex (COCs) and their respective follicular fluid (FF) were individually aspirated from
slaughterhouse ovaries. Metabolic biomarkers as glucose, pyruvate, cholesterol and estradiol
were quantified in FF by fluorimetry. Specific granulosa cells (GC) transcripts related to
oocyte capacitation and steroidogenic capacity such as aromatase (CYP19A), FSH (FSH-r),
angiotensin II (ANGII AT2) and EGF (EGF-r) receptors were quantified by RT-PCR. Bovine
embryos were produced in vitro following conventional protocols. Embryos were cultured
individually and divided into: Fast (> 4 cells at 40 hpi) and Slow (< 4 cells at 40hpi).
Blastocyst rates and embryonic competence (evaluated through developmental kinetics and
blastocysts rates) were assessed at 186hpi. Embryonic development data was analyzed in
function of FF and GC results by comparing: non-cleaved vs. cleaved (NCL x CL), fast vs.
slow (CLF x CLS), development to blastocyst x blocked (BL x NBL), cleaved that reached
blastocyst stage vs. cleaved that blocked (CLBL x CLNBL) and blastocysts originated from
fast vs. slow (BLF x BLS). Embryonic development, quantification of metabolites and
transcripts were compared by Student t test using SAS for Windows considering α=5%.
Cleavage rates were not different between fast and slow embryos (19.2±3.8% and 25.1±3.8%,
respectively). Except for FSH-r, that was less expressed in CL, BL and CLBL than their
respective counterparts NCL, NBL and CLNBL, all the other metabolites and transcripts did
not present any differences. Total blastocyst rate was 27.3±3.9%, being 18.5±2.7% from BLF
and 8.8±2.5% from BLL groups. BL and CLBL presented higher amounts of pyruvate and
cholesterol, and an increased expression of CYP19 when compared to NBL and CLNBL,
respectively. Also, CLBL presented higher levels of ANGII AT2 and EGF-r than CLNBL,
suggesting that BL and CLBL derived follicles have a greater steroidogenic capacity.
Regarding developmental kinetics, CLR and BLR presented an increase in ANGII AT2 and
estradiol and diminished levels of CYP19 and EGF-R, suggesting an elevated secretion of
steroids. Therefore, BLL, with increased expression of CYP19 and EGF-r under lower levels
of estradiol and ANGII AT2 are preferably directed to the synthesis than secretion of this
hormone. In summary, our results show that follicular status is directly related to the oocytes
3
ability to develop to blastocyst. In addition, the increased availability of energy substrates and
steroidogenic capacity appears to positively influence the oocyte capacitation. Likewise,
embryos with distinct developmental kinetics seem to originate from follicles with distinct
steroidogenic activity.
Keywords: follicular fluid, granulosa cells, biomarkes, steroidogenic capacity, oocyte
capacitation
4
1. Revisão de literatura
A pecuária bovina é um dos setores mais importantes do agronegócio brasileiro e
consequentemente da economia nacional, sendo responsável pela arrecadação de 30% do PIB
nacional (MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, 2014). O Brasil possui o maior rebanho
comercial de bovinos e é referência mundial na produção de embriões tanto in vivo, quanto in
vitro (INTERNATIONAL EMBRYO TRANSFER SOCIETY –IETS 2012 ). O número total
de embriões bovinos transferidos produzidos in vitro (PIV) em todo o mundo em 2013 foi de
517.587 sendo o Brasil responsável por 366.451 (70,8%) deste montante (PERRY, 2013).
Sendo assim, a PIV de embriões bovinos é importante tanto comercialmente quanto para
pesquisa. Comercialmente, a técnica se propõe a melhorar a produção de embriões com
finalidade de ampliar o potencial reprodutor de touros de alto valor comercial, bem como as
fêmeas de várias idades e estados fisiológico-reprodutivos distintos. Na pesquisa, atua como
mecanismo no auxilio de outras novas biotecnologias na área de reprodução animal, sendo
utilizada em estudos da fisiologia da maturação e fecundação dos oócitos, capacitação
espermática, cultivo de embriões, clonagem, sexagem de espermatozoides, preservação de
oócitos e embriões, entre outras (GONÇALVES ET AL. 2008). No entanto, apesar de
amplamente difundida, a PIV ainda não chega ao máximo de sua eficiência, tornando o estudo
de cada uma das suas etapas de fundamental importância.
As etapas da produção in vitro de embriões consistem em maturação (MIV),
fecundação (FIV) e cultivo (CIV) que dependem largamente da qualidade e competência dos
gametas. Dentre estas etapas, a maturação é referida como o conjunto de processos que
ocorrem a partir da fase de vesícula germinativa para a conclusão da segunda divisão meiótica
com a formação do primeiro corpúsculo polar (HYTTER ET AL., 1997). Durante a
maturação, os oócitos sofrem várias alterações nucleares e citoplasmáticas que os equipam
com toda a maquinaria celular necessária para permitir a entrada do espermatozoide, e
consequente sucesso da fecundação e do desenvolvimento embrionário inicial (HYTTER ET
AL., 1997). Dessa forma, o objetivo primordial da MIV é tentar mimetizar ao máximo o
microambiente folicular in vivo permitindo o adequado desenvolvimento do oócito.
In vivo, ao termino do período de crescimento e anterior ao período de maturação, os
oócitos passam por um período chamado de capacitação ou pré-maturação, que é muito
importante para o desenvolvimento completo de sua competência (HYTTEL ET AL., 1997).
Durante esse período específico ocorrem modificações ultraestruturais e moleculares no
5
oócito importantes para a retomada da meiose (maturação final) e desenvolvimento pósfecundação. É nesta etapa de maturação que ocorrem mudanças nucleares e citoplasmáticas
essenciais que influenciam na qualidade do futuro embrião. As mudanças nucleares incluem
quebra da vesícula germinativa (GBVD), desaparecimento do nucléolo, condensação da
cromatina, extrusão do primeiro corpúsculo polar e formação do segundo fuso meiótico
(MEINECKE ET AL., 2001). As mudanças citoplasmáticas abrangem síntese de proteínas,
modificações moleculares, redistribuição das organelas intracelulares e maturação dos
mecanismos de liberação do Ca2+ (FERREIRA ET AL., 2009). Estas modificações fazem o
oócito progredir do estádio inicial em que estão bloqueados, diplóteno da prófase I da
primeira divisão meiótica para o estádio de metáfase II (MINGOTI ET AL., 1995). Estes
processos vêm sendo estudados juntamente com os mecanismos envolvido na regulação da
maturação de oócitos e desenvolvimento embrionário.
Sabe-se que a remoção do oócito do meio folicular, uma prática feita para obtenção de
oócitos para a MIV, resulta na retomada espontânea da meiose nos oócitos, interrompendo o
período de capacitação que tenta ser retomado in vitro (HYTTEL ET AL., 1997). Dessa
forma, acredita-se que as condições a que estes oócitos foram submetidos até o momento da
aspiração folicular podem ser responsáveis por diferenças que serão refletidas posteriormente
no fenótipo embrionário visto que, após a remoção do oócito do folículo ovariano para a PIV
todos são submetidos às mesmas condições ambientais no laboratório. Por essa razão, a
investigação dos componentes presentes no ambiente folicular é sugerida para esclarecer
quais seriam as moléculas fundamentais para capacitação do oócito e consequente aumento da
competência embrionária.
Diversas moléculas são descritas como importantes para o processo de maturação,
sendo uma delas o colesterol. O colesterol é um importante precursor da esteroidogênese
ovariana que ocorre pela interação das duas células que compõem o folículo ovariano, células
da teca e da granulosa. Intracelular, o colesterol pode ter múltiplos destinos como ser
incorporado em membranas celulares determinando sua fluidez, pode ser esterificado e
armazenado, além de ser subtrato para síntese de esteroides (GÉVRY ET AL., 2005). Deste
modo, quantidades substanciais de colesterol precisam ser transportadas para as células
foliculares e, por fim, para o oócito. Em estudos realizados por PFEIFER ET AL. (2009),
foram avaliados os níveis de colesterol sérico e relacionados com a qualidade dos oócitos. Foi
verificado que os animais com níveis de colesterol superior a 50 mg/dl apresentaram um
6
maior número de folículos aptos à punção folicular e consequentemente melhor qualidade
oocitária provavelmente devido a maior capacidade esteroidogênica em nível folicular.
A via de biossíntese de estradiol nos folículos ovariano é conhecida como o modelo de
duas células, sendo as células da granulosa responsável pela produção de estrógenos e as da
teca pelos andrógenos. (HILLIER ET AL., 1994). O LH estimula a biossíntese de andrógenos,
principalmente, Androstenediona (BERGH ET AL., 1993) que é um precursor da biossíntese
de estradiol, nas células da teca, que expressam o receptor de LH. A partir de células da teca,
andrógenos atravessam a membrana basal para as células da granulosa vizinhas, que
expressam o receptor de FSH. Caracteristicamente, a granulosa não contém vasos, assim toda
sua produção de esteroides é limitada aos precursores que recebe, portanto, recebendo
somente andrógenos da teca não pode produzir nada mais do que estrógenos. E nas células da
granulosa a Androstenediona é catalisada a estradiol pela P450Arom sob o estimulo de FSH
(HILLIER ET AL., 1994). Sendo assim, as células da teca não sintetizar estrógenos, uma vez
que não expressam P450arom (HILLIER ET AL., 1994). As células da granulosa por sua vez,
não são capazes de produzir andrógenos, uma vez que não expressam P450c17 que é uma
enzima conversora de pregnenolona em andrógenos. No entanto, ambos os tipos de células
expressam P450scc (HILLIER ET AL., 1994) (Figuras 1 e 2).
7
Figura 1: Biossíntese de estradiol a partir de colesterol. (Adaptado de NAUFAL ET. AL., 2013)
A enzima aromatase, também conhecida como P450arom, é um membro da
superfamília de enzimas do citocromo p450, sendo um produto do gene CYP19. Este gene é
transcrito em células da granulosa no ovário, estando ausente nas células da teca (BAO E
GARVERICK, 1998). A P450arom pode ainda ser produzida na placenta, no tecido adiposo e
na pele (LIMA-VERDE ET AL., 2011). Em todos estes locais de produção, os precursores de
esteroides servem como substrato para a aromatase, sendo sintetizados por diferentes células
no organismo. A atividade esteroidogênica da P450arom em folículos pré-antrais bem como
as ações de esteroides sobre o crescimento folicular pré-antral também têm sido amplamente
estudadas. A atividade ovariana da P450arom é evidente nos folículos pré-antrais pois são
capazes de produzir estradiol já no início do seu desenvolvimento no estágio de folículo
primordial (OLIVEIRA ET AL. 2011). O crescimento do folículo pré-antral é, portanto,
8
caracterizado pelo aumento da atividade da P450arom e síntese de andrógenos, que culmina
na produção de estrogênio folicular. O folículo pré-ovulatório tem os maiores níveis de
estradiol intrafoliculares, principalmente devido ao tamanho da população de células da
granulosa e a sua capacidade para promover a aromatização dos androgênios (DRUMMOND,
2006).
O estradiol age através de dois tipos de receptores de estrogênio: o receptor de
estrogênio alfa (ERα) e o receptor de estrogênio beta (ERβ) (NOKELAINEN, 2000). Nas
células da granulosa, expressam-se principalmente o ERβ responsável pela modulação da
ação do FSH e estimulação do crescimento folicular induzido pelo estradiol. O ERα está
presente, predominantemente, nas células da teca dos ovários (NOKELAINEN, 2000).
Observa-se que tanto o estradiol quanto os andrógenos, são importantes para o
desenvolvimento normal do folículo ovariano. A produção local de progesterona, juntamente
com a ação do LH, é essencial para a ovulação. Assim sendo, observa-se a importância do
estudo das vias de sinalização fisiológica na produção de esteroides ovarianos, para melhor
compreender sua relação com a competência embrionária. O estradiol pode estar envolvido no
mecanismo de desvio folicular pois o folículo dominante produz e o libera, aparentemente, no
momento aproximado de desvio e ao longo da sua fase de crescimento. Desvio começa
quando o futuro folículo dominante é de 8,5 mm de diâmetro (GINTHER ET AL., 1997). As
concentrações de estradiol e de fluido folicular do maior folículo são elevadas quando o seu
diâmetro médio é de 8-9 mm. GUINTHER ET AL.(1997) mediu as concentrações de estradiol
em fluido folicular de bovinos em diversos tamanhos variando de 6 mm a 12 mm de diâmetro.
Folículos pequenos (6,7-6,9mm de diâmetro) possuíam em media 42 ng/mL de estradiol,
folículos médios (7-8,8mm) possuíam de 110- 313ng/mL e folículos grandes (8,9-12mm) >
544ng/mL. Sendo assim, as concentrações de estradiol aumentam de acordo com o
crescimento folicular. Segundo BEKER ET AL. (2002), durante a MIV de oócitos de bovino,
a presença de estradiol aumenta a velocidade de maturação na presença de FSH.
9
Figura 2: Esquema representativo do modelo de duas células: célula da teca e célula da granulosa.
Nas células da teca o colesterol é transportado pela StAR para dentro da matriz mitocondrial onde é
convertido a pregnenolona pela enzima side chain cleavage (P450scc) que em seguida é convertida a
androgênios (androstenediona). Os androgênios da teca difundem-se para as células da granulosa,
onde são convertidos pela aromatase (P450arom) em estradiol. A síntese de P450arom é estimulada
via núcleo (seta vermelha) por AngII AT2 e também através de FSH/FSH-R via AMPc/PKA que é
produto da oxidação de glicose e piruvato. A síntese de FSH-R é estimulada via núcleo por EGF/EGFR, e este estímulo induz aumento do antro, proliferação e diferenciação das células da granulosa.
Nos primeiros estágios da foliculogênese as células da granulosa já expressam
receptores de FSH (FSH-R). O FSH-R é uma proteína transmembrânica pertencente à família
de receptores acoplados à proteína G, caracterizado por sete hélices hidrofóbicas inseridas na
membrana plasmática e domínios intracelulares e extracelulares. Após a ativação do receptor
pela interação hormonal do FSH com o domínio extracelular inicia-se a cascata de eventos
que conduz finalmente para os efeitos biológicos específicos da gonadotropina (SIMONI ET
AL., 1997). O FSH induz aumento no número de células da granulosa, acarretando a
formação do antro folicular e a maior produção da aromatase. Assim, mutações inativadoras
no gene do receptor do FSH são caracterizadas pela baixa produção de estrógeno e
infertilidade em virtude da ausência de maturação folicular, como na falência ovariana
prematura (KOHEK ET AL., 2001). Em estudo realizado por BAO E COLABORADORES
(1997), verificou-se que a expressão de RNAm para FSH-R nas células da granulosa foi
10
superior no folículo dominante quando comparado aos recrutados obtidos no dia dois da onda
de crescimento folicular. Assim, pode-se especular que essa maior disponibilidade de FSH-R
pode ser importante na divergência, uma vez que possibilitaria que esses folículos
selecionados continuassem respondendo ao FSH mesmo quando este está em baixas
concentrações, mantendo a alta produção de estradiol.
Em um folículo dominante, o FSH no fluido folicular induz atividade de P450arom
que metaboliza substrato andrógeno ao estradiol. Nesses folículos, o estradiol e
androstenediona acumulam-se em concentrações muito elevadas no fluido folicular. Um
ponto importante é que o estradiol produzido pelo folículo dominante inibe o aumento
secundário de FSH por um mecanismo de feedback negativo e isso acredita-se reduzir os
níveis de FSH que chegam nos folículos não dominantes levando-os a atresia (FORTUNE ET
AL., 2004).
Outro receptor importante para esteroidogênese é o receptor de fator de crescimento
epidermal (EGF-R). O EGF-R é uma glicoproteína transmembrânica com um domínio ligante
extracelular, um domínio lipofílico transmembranar e um domínio intracelular com atividade
de tirosina-quinase intrínseca (ULLRICH E SCHLESSINGER, 1990). A síntese de transcritos
de EGF-R foi identificada no oócito e nas células da granulosa de folículos iniciais e em
estádios mais avançados de desenvolvimento, em diferentes espécies como ratas,
camundongos fêmeas, porcas, cabras, mulheres e vacas (CELESTINO ET AL., 2012).
Estudos realizados in vitro mostraram que o EGF pode promover a ativação folicular em
ovinos (ANDRADE ET AL., 2005) e estimular a proliferação das células da granulosa de
suínos (MORBECK ET AL., 1993). O EGF aumenta o diâmetro folicular em suínos (MAO
ET AL., 2004), promove o crescimento de oócitos em folículos primários de caprinos (SILVA
ET AL., 2004) e regula a expressão da conexina 43 em suínos e coelhos, essenciais para o
estabelecimento das junções gap (BOLAMBA ET AL., 2002; Kennedy et al., 2003). Além
disso, o EGF parece agir localmente no ovário controlando a expressão de receptores para
FSH e LH (LUCIANO ET AL., 1994; HATTORI ET AL., 1995). A importância do EGF na
fase antral também é observada na maturação e na ovulação, como foi observado em
camundongo fêmea, em que uma mutação no receptor EGFR com baixa atividade quinase
leva a um comprometimento desses processos (HSIEH ET AL., 2007).
Outro hormônio envolvido no crescimento folicular e com a esteroidogênese é a
Angiotensina II (AngII) (NIELSEN ET AL.,1994; ACOSTA ET AL., 2000; GIOMETTI ET
AL., 2005). A AngiotensinaII (AngII) é um hormônio ativo no sistema renina-angiotensina,
11
com ação bastante conhecida em vasoconstrição arterial, angiogênese e síntese de aldosterona
(PAUL ET AL., 2006). Seu papel na regulação ovariana ainda não é claro, mas tem sido
estudado devido a presença de seus receptores nas células foliculares de várias espécies
(HUSAIN ET AL., 1987; YOSHIMURA ET AL., 1994; ACOSTA ET AL., 2000;
AGUILERA ET AL., 1989). A Ang II age através de receptores que são classificados em
dois tipos: AGTR1 (AT1) que é conhecido em vasoconstrição arterial, angiogênese e secreção
de aldosterona; AGTR2 (AT2), relacionado principalmente com a indução de apoptose e a
mediação de funções reprodutivas (CHIU ET AL., 1989; WHITEBREAD ET AL., 1989).
Em folículos pré-antrais de suínos, a AngII tem importante ação na formação do antro,
proliferação celular e secreção de esteroides (SHUTTELEWORTH ET AL., 2002). Já in
vitro, a AngII atua como um intermediário na ovulação induzida por gonadotrofinas em
coelhas, ratas e vacas (KUO ET AL., 1991; YOSHIMURA ET AL., 1992; PETERSON ET
AL., KOTANI ET AL., 1999; FERREIRA ET AL., 2007). Em bovinos a presença de
receptores para AngII nas células foliculares e o aumento nas concentrações de AngII no
fluido folicular após a liberação pré-ovulatória de gonadotrofinas sugerem uma uma atividade
biológica desse peptídeo também nessa espécie. A AngII participa da maturação nuclear de
oócitos bovinos (GIOMETTI ET AL., 2005) e a aplicação de bloqueadores dos receptores de
AngII em bovinos resulta no bloqueio da ovulação nessa espécie (FERREIRA ET AL., 2007).
Além do controle hormonal, o processo de maturação oocitária também é dependente
de substratos energéticos indispensáveis para o crescimento folicular, síntese de proteínas e
proliferação celular. Dentre estes substratos, a glicose tem sido relatada como uma importante
molécula estimulando o aumento da glicólise no oócito (IWATA ET AL., 2004). Grande
parte da glicose captada pelo complexo cumulus-oócito é convertida em piruvato ou lactato
através da glicólise. Esses substratos podem ser facilmente oxidados pelo oócito para a
energia na forma de ATP (DOWNS & UTECHT, 1999, KHURANA & NIEMAN, 2000,
CETICA ET AL, 2002). Uma proporção de glicose pode também pode ser convertida durante
a MIV em glucosamina, um substrato que junto com FSH estimula a síntese de matriz
extracelular e expansão do cumulus (SUTTON-MCDOWALL ET AL., 2004). A maturação
induzida pelo FSH parece estimular enzimas que aumentam o metabolismo da glicose e a
quebra da vesícula germinativa (CHAVES ET AL., 2010). No entanto, o metabolismo da
glicose é dependente tanto da tensão de oxigênio utilizada para o cultivo como da
concentração de espécie reativas de oxigênio no oócito. Oócitos bovinos precisam de baixas
concentrações de glicose para diminuir as espécies reativas de oxigênio, aumentar a
12
concentração de glutationa (GSH) e assim manter a sua competência para o desenvolvimento
(HASHIMOTO AT AL., 2000). Em estudos realizados por ORSI ET AL.(2005) traçaram os
perfis fisiológicos nas concentrações de glicose e piruvato em fluido folicular bovino de
folículos dominantes (7,49-11,52mm de diâmetro) e não dominantes (5,30-7,68mm de
diâmetro) na tentativa de formular meios de maturação in vitro mais fisiológicos. Verificaram
que as concentrações de glicose flutuam entre 4,25-5,05mmol/l em folículos não dominantes
e 4,84mmol/l em dominantes. E as concentrações de piruvato em folículos dominantes e não
dominantes não tiveram diferença ficando em 0,03 mmol/l.
O piruvato por sua vez é um subtrado energético originado ao fim da glicólise e pode
seguir duas vias metabólicas para geração de energia: a via aeróbia pelo ciclo do ácido
tricarboxílico e a via anaeróbica pela fermentação láctica ou alcoólica (SUTTONMCDOWALL ET AL., 2010). Em ratas foi verificado que durante o processo de maturação
oocitária em sistema de cultivo contendo glicose como única fonte de energia os oócitos
envolvidos pelas células do cumulus sofrem quebra da vesícula germinativa, reiniciando a
meiose (DOWNS ET AL., 2002). No entanto, sabe-se que o oócito também utiliza o piruvato
metabolizado a partir da glicose pelas células do cumulus e transferido pelas junções gap.
Corroborando com estes dados, foi descrito que oócitos desnudos podem completar a
maturação meiótica utilizando o piruvato como fonte energética, o que não acontece se o
substrato energético for a glicose ou lactato. Neste mesmo estudo, in vivo, foi bloqueada a
síntese de uma das subunidades do complexo piruvato desidrogenase. Mesmo após essa
inativação, os oócitos foram capazes de se desenvolver normalmente, ser ovulados e
fertilizados, contudo eles foram prejudicados na sua capacidade de suportar o
desenvolvimento embrionário além de zigoto de uma célula (JOHNSON ET AL., 2007).
Com base nos dados apresentados, fica evidente a importância de moléculas presentes
no fluído e nas células foliculares na capacitação e desenvolvimento oocitários. A presença e
atividade dessas moléculas pode levar a produção de gametas melhor preparados que levarão
a formação de embriões de características distintas após os procedimentos in vitro para a
produção embrionária. Neste sentido, além dos índices de desenvolvimento, a morfocinética
embrionária é um método que pode auxiliar a identificação de embriões de características
distintas. A morfocinética propõe avaliar o tempo de divisões das células embrionárias como
previsão do potencial de desenvolvimento e a probabilidade de um embrião ser competente no
estabelecimento da prenhez. Em humanos foi descrito que embriões que clivam primeiro (2
13
células a 25 - 27h pós inseminação ou ICSI) apresentam maior taxa de gestação após a
transferência do que aqueles que não clivaram neste período (FENWICK ET AL, 2002,
SALUMETS ET AL., 2004). Em estudos de time-lapse também se correlacionou a
capacidade de um embrião em gerar gravidez com alguns intervalos específicos do ciclo
celular e morfologia blastômeros (RAMSING, 2011).
BAUMMANN E COL. (2007) propuseram que um embrião metabolicamente mais
ativo pode ser um sinal de danos no DNA que levam a ativação prematura do genoma e
diminuição de qualidade do embrião. Além disso, LEESE E COL (2002) também propuseram
que os embriões mais viáveis são os que apresentam menor metabolismo, menor índice
glicolítico, menor turnover de aminoácidos e altos níveis de enzimas antioxidantes. Estas
características são sugeridas como sendo derivadas do oócito, uma vez que durante as
primeiras divisões (usadas para a classificação da cinética) o embrião utiliza principalmente o
estoque materno de mRNAs e proteínas (SCHULTZ, 2005). Nosso grupo vem trabalhando
com modelo já estabelecido de morfocinética embrionária em bovinos e de fato embriões
bovinos que clivam primeiro apresentam características metabólicas distintas em relação ao
metabolismo energético, de lipídeos, estresse celular, transcriptoma e metaboloma.
Sendo assim, a hipótese deste trabalho é de que o ambiente folicular ao qual o oócito
foi submetido anteriormente a MIV confere características as células foliculares e oocitária
que serão refletidas na qualidade e cinética embrionária. Além disso, os perfis obtidos dos
fluidos foliculares em relação à quantificação de colesterol, estradiol, glicose e piruvato e o
padrão de síntese de transcritos de genes relacionados à capacidade esteroidogênica das
células da granulosa possam predizer o padrão metabólico do gameta e consequentemente o
padrão metabólico do futuro embrião. Dessa forma, tais moléculas podem ser usadas como
biomarcadores da qualidade oocitária e futura qualidade embrionária.
14
2. Objetivo
Objetivo geral:
Quantificar biomarcadores metabólicos e moleculares presentes no fluido folicular e
células da granulosa e investigar sua possível relação com a qualidade embrionária.
Objetivos específicos:
Quantificar individualmente no fluído folicular de bovinos as moléculas de colesterol,
estradiol, glicose e piruvato.
Quantificar nas células da granulosa os transcritos referentes aos genes FSH-R,
CYP19, EGF-R, AT1 e AT2.
Relacionar os dados obtidos com os índices de produção e cinética de
desenvolvimento embrionário.
15
3. Metodologia
3.1.
Local dos experimentos
Os experimentos foram desenvolvidos no Laboratório de Biologia Celular e Molecular
do Centro de Ciências Naturais e Humanas da Universidade Federal do ABC.
3.2.
Procedimento experimental para PIV de embriões bovinos
3.2.1.
Coleta e maturação in vitro de oócitos
Os oócitos foram coletados de ovários obtidos em abatedouro comercial por aspiração
folicular com auxílio de um capilar de vidro acoplado a um cateter. Na seleção dos ovários,
tomou-se cuidado para que todos possuíssem corpo lúteo em sua morfologia. Foram
selecionados cinco ovários para cada placa de MIV (ovário 1, ovário 2, ovário 3, ovário 4,
ovário 5) e de cada ovário foram aspirados separadamente cinco folículos de 7-8mm. Evitouse a aspiração de folículos de tamanho distintos para que as possíveis alterações encontradas
não fossem relativas ao estágio de desenvolvimento do folículo. Após aspiração de cada
folículo, o oócito foi recuperado e lavado individualmente três vezes no meio de lavagem (M199 com HEPES - 90%, Soro fetal bovino – 10%, piruvato – 0,2mM, Gentamicina –
1,25ug/mL) e três vezes no meio de maturação (M-199 sem HEPES - 90%, Soro fetal bovino
– 10%, piruvato – 0,2mM, Gentamicina – 1,25ug/mL, FSH (Foltropin) 0,25ug/mL, hCG
(Chorulon) – 25UI, estradiol (Sigma) – 10ug/mL), sendo em seguida colocados para MIV em
uma gota de 50ul do meio de maturação, sob óleo mineral contendo cinco poços, onde cada
oócito foi acomodado dentro do poço que foi identificado de acordo com o folículo em que
foi aspirado. A identificação dos poços foi realizada conforme o mapa de localização (fig.3).
A maturação foi realizada em incubadora a 38,5oC; 5% de CO2 em ar e alta umidade
por 24horas. O fluido folicular retirado de cada folículo foi depositado em tubo de 0,2mL e
centrifugado à 1000 g por 5 minutos para separação do fluido folicular e das células
foliculares, sendo que o fluido folicular e as células da granulosa foram então transferidos
para tubos distintos devidamente identificado. O fluido folicular e as células foram
congelados em freezer a -80°C até o momento da análise.
16
Figura 3: Esquema representativo do mapa de localização dos oócitos em uma placa de MIV. Cada placa de
MIV contém cinco gotas de meio de maturação. Em cada gota foram feitos cinco poços e em cada
poço foi alocado um oócito proveniente de um folículo pré identificado. O liquido folicular referente a
este oócito foi congelado até o momento da análise.
3.2.2. Fecundação e cultivo in vitro
Para a fecundação in vitro, palhetas de sêmen de, no mínimo, dois touros diferentes
foram descongeladas em banho-maria a 37ºC, durante 30 segundos e seu conteúdo
centrifugado em gradiente Percoll (45% e 90%) para separar os espermatozóides móveis,
remoção do diluidor e do plasma seminal, além da separação de células não espermáticas. O
sobrenadante foi descartado, e feita avaliação da motilidade e concentração espermática por
microscopia ótica e os espermatozoides vivos foram diluídos na concentração de 1x106
espermatozoides/mL.
Os oócitos maturados foram fecundados in vitro nas mesmas gotas/poços da
maturação. Para isso, o meio de maturação foi lavado e substituído por 50µl do meio FIV
gota. Para a inseminação, 2uL do sêmen preparado foram adicionados em cada gota,
permanecendo em atmosfera com 5% de CO2 em ar, 38,5°C e alta umidade por 18 horas.
Após este período, os embriões foram desnudados com auxílio de micropipeta e retornaram
aos poços para cultivo em meio SOF acrescido de 5% de SFB, aminoácidos essenciais e não
essenciais, em estufa a 38,5oC, 5% de CO2 em ar e alta umidade onde permaneceram até o
momento das análises.
17
3.3.
Análise da produção e morfocinética embrionária
Para análise da morfocinética embrionária foi utilizada uma lupa binocular para
avaliar a clivagem dos prováveis embriões que foram classificados em grupos. Para a
determinação dos grupos a clivagem embrionária foi avaliada 22 horas após o início da CIV
(40hpi). Neste momento, embriões clivados com quatro ou mais células foram considerados
pertencentes ao grupo de rápidos (CLR) e embriões clivados com duas ou três células foram
considerados pertencentes ao grupo de lentos (CLL). CLR corresponde aos grupos ()Esta
classificação é usada de rotina pelo nosso grupo levando a geração de embriões que se
desenvolvem diferencialmente e apresentam características metabólicas e moleculares
distintas. Após 168 horas do início do CIV (186hpi - dia 7) os embriões que permaneceram no
cultivo foram novamente avaliados. Aqueles que estavam no estádio de blastocisto ou
posterior foram classificados como blastocistos rápidos (BLR - derivados do grupo de
clivagem rápida) e blastocistos lentos (BLL - derivados do grupo de clivagem lenta). Para as
análises estatísticas os grupos foram renomeados conforme o esquema a seguir:
3.4.
Análise dos componentes do fluido folicular
Os componentes do fluido folicular: glicose, colesterol, piruvato e estradiol foram
analisados utilizando kits comerciais baseados em reações enzimáticas com detecção
realizada por fluorimetria. Na tabela 1 encontram-se as especificações para cada um dos kits,
bem como a empresa fabricante:
18
Tabela 1: Moléculas que foram avaliadas neste projeto e sistema de avaliação
Molécula
Sistema
Fabricante
Glicose
AmplexRed Glucose
Life Technologies
Colesterol
Total Cholesterol Assay Kit
BioAssay Systems
Piruvato
EnzyChrom™ Pyruvate Assay
BioAssay Systems
Estradiol
Estradiol EIA
Cayman Chemical
A padronização dos kits de avaliação bioquímica foi realizada previamente a análise
das amostras. Para isso, uma amostra de um pool de fluidos foliculares foi usada como
referência para determinação da sensibilidade da avaliação e dos pontos da curva padrão.
Essas amostras foram diluídas até o limite mínimo de detecção de cada kit visando o uso do
menor volume possível de cada amostra, permitindo seu uso no maior número de avaliações
possível. As curvas padrão foram obtidas de uma regressão polinomial até que R 2 fosse igual
ou muito próximo a 1. Para cada kit, então, a curva padrão e a diluição das amostras foram
aplicadas conforme tabela 2:
Tabela 2: Dados utilizados na padronização dos kits de quantificação das moléculas que
foram avaliadas.
Molécula
N° de Pontos na
Curva Padrão
Pontos da Curva Padrão
Diluição
R2
Glicose
6
1µM, 2,5µM, 5µM, 10µM,
15µM e 20µM
50x
1
Colesterol
6
2µM, 4µM, 8µM, 16µM,
32µM e 64µM
50x
0,999
Piruvato
5
10µM, 20µM, 30µM, 40µM
e 50µM
10x
0,999
Estradiol
8
6,6pg, 16,4pg, 41pg,
102,4pg, 256pg, 640pg,
1600pg e 4000pg
10x
0,988
19
3.5.
Análise de expressão gênica das células da granulosa
Para esta análise foram utilizados pools de células foliculares, onde cada pool foi
referente a dois folículos cujo desenvolvimento embrionário posterior havia sido o mesmo.
Foram avaliadas quatro amostras biológicas de cada grupo analisado e duas replicatas
técnicas.
O RNA total das células da granulosa foi extraído com o auxílio do RNaspin Protect
Mini Kit RNA Isolation® (GE Healthcare UK Limited), seguindo instruções do fabricante e
quantificado pelo sistema NanoDrop. Resumidamente, as células foram descongeladas e
incubadas com tampão de estabilização para RNA e posteriormente com solução de lise. A
solução foi acrescida de Etanol e aplicada à coluna contendo membrana para separação do
RNA. Contaminantes foram removidos por sucessivas centrifugações com solução de
lavagem e o RNA eluído da membrana. As amostras foram imediatamente submetidas à
quantificação do RNA total pelo sistema NanoDrop® e congeladas em freezer a -80ºC até a
análise.
Do RNA total obtido foi utilizado 8µL em que foi adicionado 1µL de oligo dT e a
mistura incubada por 65°C por 5 minutos e resfriada no gelo por 1 minuto. Para a reação de
síntese da primeira fita de cDNA foi adicionada 2 µL de 10x RT Buffer,4 µL de 25mM
MgCl2, 2 µL de 0,1M de DTT, 1 µL de RNase Out e 1 µL de SuperScript III RT®
(Invitrogen). Essa reação aconteceu por 50 minutos a 50°C que foi seguida de reação terminal
por 5 minutos a 85°C . Em seguida, para remoção do RNA foi adicionado 1 µL de RNase H a
37°C por 20 minutos. Os cDNAs foram submetidos a reação de PCR em tempo real pelo
sistema TaqMan® (Life Technologies, Inc.) que permitiu a amplificação dos genes candidatos
FSH-R, CYP19, EGF-R, AT1 e AT2 e o controle endógeno, beta-actina. Todas as reações
foram realizadas em 20µL de volume total e 40 ciclos. Os sistemas (primer + sonda) usados
foram adquiridos já padronizados para espécie bovina. O desenho dos primers e das sondas
podem se encontrados no site do fabricante (www.lifetechnologies.com).
20
Tabela 3: Genes avaliados e seus respectivos códigos no fabricante e no GenBank.
Gene
COD (Life Technologies, Inc.)
GENE ID
RefSeq
FSH-R
Bt03212674_m1
281172
NM_174061.1
CYP19A
Bt03213774_m1
281740
NM_174305.1
EGF-R
AJT96D7
*
NC_007310.5
AT1
Bt03213473_m1
281607
NM_174233.2
AT2
AIY9Z3D
*
NW_001502154.2
ACTB
Bt03279174_g1
280979
NM_173979.3
*Primers + Sondas foram customizados para espécie bovina. Foi utilizado o software File Builder para fazer os
desenhos dos primers que foram sintetizados pela Life Tecnologies,Inc.
3.6.
Análise estatística
Foram realizadas seis manipulações para coleta de dados de desenvolvimento e
morfocinética embrionária que resultaram em um n= 266 folículos derivados de 6 replicatas.
Dados dos componentes do fluido folicular e expressão gênica foram avaliados
retrospectivamente aos dados de desenvolvimento embrionário sendo considerados os
seguintes grupos e análises:
1a análise – NCL x CL
2a análise – CLR x CLL
3a análise – NBL x BL
4a análise – CLNBL x CLBL
5a análise – BLR x BLL
Os dados de desenvolvimento embrionário (índice de clivagem, blastocisto e
cinética) foram analisados pelo software GraphPad Prism 5.0 com o teste Mann-Whitney. Os
índices de clivagem total, clivagem de embriões rápidos e embriões lentos foram calculados
sobre o número total de oócitos. O índice de blastocisto total foi calculado sobre o número de
21
oócitos clivados. O de blastocistos rápidos e lentos sobre o número de clivados rápidos e
lentos, respectivamente.
Os dados de quantificação das moléculas do fluido folicular foram analisados pelo
programa SAS System for Windows (SAS, 2000). Através do aplicativo Guided Data
Analisys, os dados foram testados quanto à normalidade dos resíduos (distribuição normal) e
homogeneidade das variâncias. Os casos que não obedeciam a estas premissas foram
transformados (logaritmo na base 10 - Log10X; Raiz quadrada - RQ X; Quadrado - X2). Foram
realizados testes para saber se os dados eram paramétricos ou não paramétricos. Os dados não
paramétricos foram convertidos a paramétricos e foi realizado o teste t de Student. Para
descrição dos resultados, foram empregadas as médias, seus respectivos erros-padrão. Os
níveis de significância (p) utilizados foram dos dados originais, quando obedecerem às
premissas, dos dados transformados, quando necessária à transformação. As variáveis
resposta foram submetidas aos testes de correlação de Pearson e o nível de significância
utilizado para rejeitar foi de 5%, isto é, para um nível de significância menor que 0,05,
considerou-se que ocorreram diferenças estatísticas entre os diferentes grupos. Esta análise é
uma medida que varia no intervalo de -1 até +1 que visa quantificar o grau de relacionamento
linear entre variáveis quantitativas. Os valores próximos de +1 indicam forte correlação direta
entre as variáveis enquanto os valores próximos de -1 indica forte correlação inversa e valores
em torno de zero indicam ausência de correlação. Todos os resultados foram expressos em
média e erro padrão.
A análise estatística da diferença de expressão dos genes nas diferentes fases
analisadas foi avaliada mediante a estimativa da eficiência de amplificação após a submissão
dos dados ao software REST2005 (Pfaffl et al., 2005) e a variação da expressão. As reações
foram normalizadas pela frequência de expressão do controle endógeno utilizado que foi o
ACTB (delta Ct). Uma amostra aleatória foi escolhida como normalizador para determinação
do delta delta Ct. Foi realizado teste t , para dados amostrais não paramétricos o teste KruskalWallis. Para as análises foi considerado o valor de p< 0.05.
22
4. Resultados
4.1.
Desenvolvimento embrionário
Na figura 4A é apresentado o índice de clivagem dos embriões rápidos e lentos e clivagem
total. Não houve diferença entre os índices de CLR e CLL, sendo que o índice de clivagem
total foi de 50.9±0.94% (p<0.05). Na figura 4B são apresentados os dados de índice de
Blastocistos (rápidos e lentos e blastocistos totais) e em 4C são apresentados os índices de
blastocistos rápidos e lentos calculados sobre os oócitos clivados dos seus respectivos grupos.
É possível evidenciar uma maior conversão a blastocisto dos embriões derivados de CLBLR
quando comparado com CLBLL (p<0,05).
Figura 4: Produção embrionária A) Índice de clivagem total (CLT) e clivados rápidos (CLR) e lentos (CLL), B)
Índice de blastocistos do grupo rápido (BLR), grupo lento (BLL) e blastocistos totais (BLT) em
relação aos oócito clivados totais e C) Índice de blastocistos em relação aos embriões clivados por
grupo – CLBLR – blastocistos rápidos/ CLBLL blastocistos lentos. (barras representam média de
erros baseados nas manipulações)
4.2.
Análise dos componentes do fluido folicular
As aferições das concentrações de glicose, colesterol, piruvato e estradiol foram realizadas
individualmente para cada folículo e seguem descritas.
23
Quantificação da Glicose no Fluido Folicular
Os resultados das avaliações das concentrações de glicose no fluido folicular das
amostras estão representados na Figura 5. Em BL, houve maior concentração de glicose em
relação aos NBL (médias±SE BL=0,0656±0,0131mM; NBL=0,0504±0,0095mM, p=0,0652).
Nos outros grupos analisados a concentração de glicose não diferenciou.
Figura 5: Concentração de glicose referente ao fluido folicular que derivaram: A) Não Clivados(NCL) e
Clivados(CL), B)Clivados Rápidos(CLR) e Clivados Lentos(CLL), C)Não Blastocistos(NBL) e
Blastocistos(BL), D) Clivados Não Blastocistos(CLNBL) e Clivados Blastocistos(CLBL) e E)
Blastocistos Rápidos e Blastocistos Lentos.** Indica grupo com tendência a ter maior concentração.
Quantificação Colesterol no Fluido Folicular
Os resultados das avaliações das concentrações de colesterol no fluido folicular das
amostras estão representados na Figura 6. A Figura 6C mostra que houve maior concentração
de colesterol no grupo de BL em relação ao NBL (médias±SE BL 1,657±0,099mM; NBL
24
1,437±0,051mM; p=0,048). O mesmo ocorreu no grupo de CLBL em relação ao CLNB
(médias±SE CLBL 1,657±0,099mM; CLNBL 1,443±0,066mM; p=0,035), dados mostrados
na Figura 6D.
Nos outros grupos analisados não houve diferença na concentração de
colesterol.
Figura 6: Concentração de colesterol referente ao fluido folicular que derivaram: A) Não Clivados (NCL) e
Clivados (CL), B) Clivados Rápidos (CLR) e Clivados Lentos (CLL), C) Não Blastocistos (NBL) e
Blastocistos (BL), D) Clivados Não Blastocistos (CLNBL) e Clivados Blastocistos (CLBL) e E)
Blastocistos Rápidos e Blastocistos Lentos. *Indica grupo com maior concentração do metabólito.
Quantificação de Piruvato no Fluido Folicular
Os resultados das avaliações das concentrações de piruvato no fluido folicular das
amostras estão representados na Figura 7. No grupo BL houve maior concentração de
25
piruvato em relação ao grupo de NBL (médias±SE BL 0,351±0,026mM; NBL
0,289±0,0183mM; p=0,050), Figura 7C. No grupo CLBL houve tendência deste metabólito
ter maior concentração em relação ao grupo CLNBL (médias±SE CLBL 0,351±0,026mM;
CLNBL 0,291±0,022mM; p=0,072), dados apresentados na Figura 7D. Entre os outros grupos
analisados, a concentração de piruvato não se diferenciou.
Figura 7: Concentração de piruvato referente ao fluido folicular que derivaram:: A) Não Clivados(NCL) e
Clivados(CL), B)Clivados Rápidos(CLR) e Clivados Lentos(CLL), C)Não Blastocistos(NBL) e
Blastocistos(BL), D) Clivados Não Blastocistos(CLNBL) e Clivados Blastocistos(CLBL) e E)
Blastocistos Rápidos e Blastocistos Lentos. *Indica grupo com maior concentração do
metabólito.**Indica grupo com tendência a ter maior concentração do metabólito.
Quantificação de Estradiol no Fluido Folicular
Os resultados das avaliações das concentrações de estradiol no fluido folicular das
amostras estão representados na Figura 8. O grupo CLR apresentou maior concentração de
estradiol em relação ao grupo CLL (médias±SE CLR 1836±343pg/mL; CLL 1072±322
pg/mL; p=0,041) (Figura 8B). Concentração de estradiol também foi maior no grupo BLR em
relação ao grupo BLL (médias±SE BLR 1920±405 pg/mL; BLL 594±63 pg/mL; p=0,005).
26
Em relação aos outros grupos analisados não houve diferença na concentração deste
metabólito.
Figura 8: Concentração de estradiol referente ao fluido folicular que derivaram: A) Não Clivados(NCL) e
Clivados(CL), B)Clivados Rápidos(CLR) e Clivados Lentos(CLL), C)Não Blastocistos(NBL) e
Blastocistos(BL), D) Clivados Não Blastocistos(CLNBL) e Clivados Blastocistos(CLBL) e E)
Blastocistos Rápidos e Blastocistos Lentos. *Indica grupo com maior concentração do metabólito
4.3.
Análise da expressão gênica das células da granulosa
Neste experimento, primeiramente foi realizada a amplificação do transcrito referente
ao receptor de IGF-II, um marcador específico de células teca e ausente nas células da
granulosa (Armstrong et al., 2000). De fato, o transcrito estava ausente em todas as amostras.
Do mesmo modo, não foi evidenciada amplificação do transcrito para AT1.
Os resultados da quantificação dos transcritos para FSH-R, CYP19A, AT2 e EGF-R
nas células da granulosa estão apresentados em termos da expressão relativa observada.
27
Receptor de FSH
Os resultados das expressões relativas de FSH-R em relação ao controle endógeno (βactina) nas células da granulosa estão representados na Figura 9. A expressão de FSH-R nas
células da granulosa referentes ao grupo NCL foi maior em relação ao grupo CL (médias±SE
NCL 5,26±0,49; CL 2,24±0,20; p=0,009), o mesmo ocorreu com o grupo NBL onde a
expressão foi maior em relação ao grupo BL (médias±SE NBL 3,59±0,31; BL 1,66±0,23;
p=0,023) (Figura 9C). No grupo CLNBL a expressão de FSH-R foi maior em relação ao
grupo CLBL (médias±SE CLNBL 2,78±0,30; CLBL 1,66±0,23; p=0,005) (Figura 9D) e no
grupo BLL a expressão também foi maior em relação a BLR (médias±SE BLL 2,73±0,40;
BLR 1,00±0,11; p=0,004) (Figura 9E).
Figura 9: Expressão relativa do gene FSHR em células da granulosa que derivaram os grupos: A) Não clivados
(NCL) e clivados (CL), B) clivados rápidos CLR e clivados lentos (CLL), C) não blastocistos (NBL) e
blastocistos (BL), D) clivados não blastocistos (CLNBL) e clivados blastocistos (CLBL) e E)
blastocistos rápidos (BLR) e blastocistos lentos (BLL). *Indica maior expressão relativa do gene.
28
CYP19A - codificador de P450arom
Os resultados das expressões relativas do gene codificador de aromatase (P450arom)
em relação ao controle endógeno nas células da granulosa estão representados na Figura 10. A
expressão de CYP19A nas células da granulosa referentes ao grupo BL foi maior em relação
ao grupo NBL (médias±SE NBL 1,49±0,11; BL 2,08±0,22; p=0,024) (Figura 10C). Foi
encontrada também maior expressão no grupo CLBL em relação ao CLNBL (médias±SE
CLNBL 1,40±0,16; CLBL 2,53±0,27; p=0,0008) (Figura 10D) e maior expressão em BLL em
relação ao BLR (médias±SE BLR 1,53±0,22; BLL 4,04±0,31; p<0,0001)(Figura 10E). Não
houve diferença na expressão entre os outros grupos analisados.
Figura 10: Expressão relativa do gene CYP19A em células da granulosa que derivaram os grupos: A) Não
clivados (NCL) e clivados (CL), B) clivados rápidos CLR e clivados lentos (CLL), C) não blastocistos
(NBL) e blastocistos (BL), D) clivados não blastocistos (CLNBL) e clivados blastocistos (CLBL) e E)
blastocistos rápidos (BLR) e blastocistos lentos (BLL). *Indica maior expressão relativa do gene.
29
Receptor de AngII AT2
Os resultados das expressões relativas do receptor de angiotensina II tipo2 (AT2) em
relação ao controle endógeno nas células da granulosa estão representados na Figura 11. A
expressão de AT2 nas células da granulosa referente ao grupo CLR foi maior em relação ao
grupo CLL (médias±SE CLR 34.74±6,00; CLL 4,94±0,46; p=0,003) (Figura 11B). Foi maior
a expressão relativa no grupo de CLBL em relação à CLNBL (médias±SE CLNBL 2,78±0,30;
CLBL 21,74±5,61; p=0,0023) (Figura 11D) e maior em BLR em relação a BLL (médias±SE
BLR 34.52±8,57; BLL 4,70±0,70; p=0,0035). No restante dos grupos analisados não houve
diferença na quantificação relativa.
Figura 11: Expressão relativa de RNAm para receptores de angiotensina II do tipo 2 (AT2) em células da
granulosa que derivaram os grupos: : A) Não clivados (NCL) e clivados (CL), B) clivados rápidos
CLR e clivados lentos (CLL), C) não blastocistos (NBL) e blastocistos (BL), D) clivados não
blastocistos (CLNBL) e clivados blastocistos (CLBL) e E) blastocistos rápidos (BLR) e blastocistos
lentos (BLL). *Indica maior expressão relativa do gene.
30
Receptor de EGF
Os resultados das expressões relativas do receptor de EGF em relação ao controle
endógeno nas células da granulosa estão representados na Figura 12. No grupo de CLBL foi
encontrada maior expressão relativa em relação à CLNBL (médias±SE CLNBL 1,40±0,16;
CLBL 2,08±0,22; p=0,0169) (Figura 12D). A expressão relativa também foi maior no grupo
de BLL em relação à BLR (médias±SE BLR 1,64±0,17; BLL 2,53±0,38; p=0,0488) (Figura
12E). Não houve diferença na expressão relativa nos outros grupos analisados.
Figura 12: Expressão relativa de RNAm para receptores de EGF em células da granulosa que derivaram os
grupos: A) Não clivados (NCL) e clivados (CL), B) clivados rápidos CLR e clivados lentos (CLL),
C) não blastocistos (NBL) e blastocistos (BL), D) clivados não blastocistos (CLNBL) e clivados
blastocistos (CLBL) e E) blastocistos rápidos (BLR) e blastocistos lentos (BLL). *Indica maior
expressão relativa do gene.
31
4.4.
Correlação entre moléculas do fluido folicular
Nas tabelas 4 a 13 são representados os resultados de correlação encontrados entre as
moléculas do fluido folicular referentes às estruturas analisadas, consideramos significativo
p≤ 0.05.
Na tabela 4, estão os resultados de correlação das moléculas analisadas no fluido
folicular de onde derivaram as estruturas que não clivaram. Foi observada correlação negativa
entre glicose e piruvato.
Tabela 4: Correlação das moléculas do fluido folicular que derivaram
embriões Não Clivados.
Glicose
Piruvato
Estradiol
Colesterol
0.08398
0.06369
0.50899
P
0.7325
0.8288
0.4910
Glicose
-0.63384
0.63286
P
0.0112
0.2518
Piruvato
0.29932
P
0.6247
Em relação os resultados de correlação das moléculas analisadas no fluido folicular
das estruturas que clivaram (Tabela 5), foram observados correlações positivas entre glicose e
colesterol, e também entre piruvato e estradiol.
32
Tabela 5: Correlação das moléculas do fluido folicular que derivaram
embriões Clivados.
Glicose
Piruvato
Estradiol
Colesterol
0.29093
-0.17395
-0.16397
p
0.0187
0.1763
0.3541
Glicose
0.13054
0.03403
p
0.3201
0.8533
Piruvato
0.38418
p
0.0249
Nos resultados de correlação das moléculas analisadas no fluido folicular de clivados
rápidos (Tabela 6), clivados blastocistos (Tabela 9) e blastocistos rápidos (Tabela 11) foi
observada correlação positiva entre piruvato e estradiol.
Tabela 6: Correlação das moléculas do fluido folicular que derivaram
Clivados Rápidos
Glicose
Piruvato
Estradiol
Colesterol
0.22361
-0.24036
-0.18151
p
0.1772
0.1643
0.4438
Glicose
0.10333
0.17374
p
0.5547
0.4638
Piruvato
0.64631
p
0.0021
Semelhante o que ocorreu com clivados, houve correlação positivas ente glicose e
colesterol nos fluidos foliculares que derivaram clivados lentos (Tabela 7) e clivados não
blastocistos (Tabela 8).
33
Tabela 7: Correlação das moléculas do fluido folicular que derivaram
Clivados Lentos
Glicose
Piruvato
Estradiol
Colesterol
0.41719
-0.14621
0.08170
p
0.0304
0.4668
0.7813
Glicose
0.16665
-0.21036
p
0.4259
0.5117
Piruvato
0.27645
p
0.3387
Tabela 8: Correlação das moléculas do fluido folicular que derivaram
Não Blastocistos
Glicose
Piruvato
Estradiol
Colesterol
0.32974
-0.14373
-0.16706
p
0.0140
0.3245
0.5076
Glicose
-0.07973
0.04693
p
0.5942
0.8580
Piruvato
0.29425
p
0.6247
34
Tabela 9: Correlação das moléculas do fluido folicular que derivaram
Blastocistos
Glicose
Piruvato
Estradiol
Colesterol
-0.05858
-0.29739
-0.11889
p
0.7628
0.1319
0.6176
Glicose
0.06384
-0.03714
p
0.7469
0.8765
Piruvato
0.44308
p
0.0504
Tabela 10: Correlação das moléculas do fluido folicular que derivaram
Clivados não Blastocistos
Glicose
Piruvato
Estradiol
Colesterol
0.43312
-0.20353
-0.26331
p
0.0083
0.2409
0.3630
Glicose
0.11288
0.04262
p
0.5385
0.8954
Piruvato
0.28435
p
0.3245
35
Tabela 11: Correlação das moléculas do fluido folicular que derivaram
Clivados Blastocistos
Glicose
Piruvato
Estradiol
Colesterol
-0.05858
-0.29739
-0.11889
p
0.7628
0.1319
0.6176
Glicose
0.06384
-0.03714
p
0.7469
0.8765
Piruvato
0.44308
p
0.0504
Para os resultados de correlação das moléculas analisadas no fluido folicular de
blastocistos lentos (Tabela 11), foi observada correlação negativa entre glicose e estradiol.
Tabela 12: Correlação das moléculas do fluido folicular que derivaram
Blastocistos Lentos
Glicose
Piruvato
Estradiol
Colesterol
0.09651
-0.44601
-0.03373
p
0.8049
0.2289
0.9368
Glicose
0.03745
-0.71440
p
0.9238
0.0465
Piruvato
0.25496
p
0.5423
36
Tabela 13: Correlação das moléculas do fluido folicular que derivaram
Blastocistos Rápidos
Glicose
Piruvato
Estradiol
Colesterol
-0.10925
-0.26632
-0.01758
p
0.6466
0.2854
0.9568
Glicose
0.08584
0.12629
p
0.7268
0.6957
Piruvato
0.70300
p
0.0108
37
5. Discussão
Durante o crescimento folicular, a concentração de metabólitos, enzimas, hormônios e
a capacidade de as células responderem aos estímulos causados por eles são fatores
importantes para o desenvolvimento normal do folículo e consequentemente produção de um
oócito melhor preparado para ser fecundado e suportar as primeiras clivagens até a ativação
do genoma embrionário (FERREIRA ET AL., 2008). Assim, é possível supor que o fluido
folicular e as células foliculares influenciam diretamente a qualidade do oócito e
consequentemente o futuro embrião.
Neste trabalho, foram avaliados individualmente metabólitos presentes no FF e
transcritos presentes nas CGs e sua relação com potencial dos oócitos derivados destes
folículos de clivarem, desenvolverem-se a blastocisto e sua cinética de desenvolvimento. O
índice de clivagem total deste experimento foi de 50.9±0.94%. Não houve diferença entre os
índices de clivagem de embriões rápidos e lentos. Da mesma forma, nenhum dos metabólitos
e transcritos analisados foram distintos entre CLR x CLL, tampouco NCL x CL, a exceção do
FSHR, que foi menos expresso em CL, BL e CLBL quando comparados a NCL, NBL e
CLNBL, respectivamente.
O FSH é responsável por estimular o crescimento folicular, a proliferação e
diferenciação das células da granulosa e induzir a formação do antro (SARAIVA ET AL.,
2010). Essa interação do FSH com FSH-R ativam vias de sinalizações intracelulares
essenciais para proliferação das células da granulosa e consequentemente maior produção de
estrógenos. Em teoria, os oócitos derivados de folículos com maior quantidade destes
transcritos estariam sintetizando um maior número de receptores, estando melhores
preparados para concluir sua maturação. De fato, em estudos realizados em mulheres com
diferentes respostas a estimulação por gonadotrofinas, foi demonstrado por CAI ET AL.
(2007) que houve uma menor expressão de FSH-R nas células da granulosa de folículos
antrais que possuíam menor concentração de estradiol no FF, oócitos com menores taxas de
maturação e consequente fertilidade reduzida. Nesse mesmo estudo, foi visto que os FFs
originados desses folículos possuíam maior concentração de FSH. Esse aumento na
concentração de FSH folicular poderia estimular por feedback positivo a expressão de RNAm
para FSH-R para que esse folículo conseguisse responder ao FSH. No caso deste trabalho, em
38
que maior quantidade de transcritos foi encontrada em CGs de oócitos que não se
converteram a blastocisto, é possível sugerir que o aumento da expressão RNAm para FSH-R
seja uma tentativa do folículo com menor quantidade de FSH no FF maximizar sua resposta
ao hormônio.
O índice de BL total foi de 27,3±3,9% e maior índice de blastocisto foi obtido no
grupo derivado de CLR do que CLL (25,1±3,8% e 19,2±3,8%, respectivamente). BL e CLBL
apresentaram maiores níveis de piruvato no FF e BL ainda apresentou maiores níveis de
glicose quando comparados aos seus respectivos NBL e CLNBL. De fato, substratos
energéticos são essenciais para o adequado desenvolvimento do folículo e capacitação do
gameta. A capacidade do oócito de utilizar a glicose como metabólito energético, no entanto,
é pequena. As células da granulosa metabolizam a maior parte da glicose consumida para
fornecer intermediários metabólicos para o oócito (BIGGERS ET AL. 1967). O intermediário
mais comumente transferido para o oócito é o piruvato, que chega a célula via junções do tipo
gap (SUTTON-MCDOWALL ET AL. 2010; WANG ET AL. 2012). Este piruvato
transportado ao oócito é essencial para o desenvolvimento pós-fecundação, em especial na
transposição da fase de ativação do genoma embrionário (JOHNSON ET AL., 2007). Dessa
forma, a maior conversão a blastocistos nos grupos com maiores níveis de glicose e piruvato
se devem, provavelmente, ao maior aporte energético transferido ao oócito.
Além do efeito direto das concentrações de piruvato no oócito, essa molécula tem
efeito no próprio metabolismo das células da granulosa. A produção de piruvato pelas células
da granulosa ocorre pela via glicolítica, e este metabólito pode ser adicionalmente
metabolizado através do ciclo do ácido tricarboxílico (TCA), seguido pela fosforilação
oxidativa para produção de energia na forma de ATP. A ativação do receptor de FSH pela
ação de seu ligante promove a conversão do ATP em AMPc/ PKA que age no núcleo,
estimulando a síntese de CYP19A (LUO & WILTBANK, 2006). Corroborando com este
dado, CL e CLBL também apresentaram maior síntese de CYP19A, além de aumento da
quantidade de colesterol no FF quando comparados a NCL e CLNBL.
Por ser um precursor da síntese de andrógenos e estrógenos no ovário, a concentração
de colesterol disponível no FF pode ser um fator limitante da esteroidogênese
(MONTFOORT ET AL., 2014). O colesterol presente no fluido folicular é transportado para
dentro da mitocôndria das células foliculares pela proteína StAR, onde se localizam a maioria
das enzimas envolvidas na esteroidogênese (AIRES, 2008). O colesterol folicular chega às
39
células da teca interna e lá encontra todo o aparato celular necessário para sua conversão em
androstenediona. A androstenediona, por sua vez, é transportada para as células da granulosa,
onde depende da ação da P450arom, produto de CYP19A, para sua conversão final a
estrogênio (AIRES, 2008). Em bovinos, o estrogênio desempenha funções fundamentais ao
desenvolvimento final do folículo pré-ovulatório estimulando a liberação do pulso préovulatório de LH, que causa a ovulação (BINELLI ET AL., 2009). Assim, maiores
concentrações de colesterol em folículos com maior conversão a blastocisto podem sugerir
uma maior capacidade esteroidogênica que, já na fase de crescimento, conferiram ao oócito
maior competência.
Reiterando a maior capacidade esteroidogênica dos folículos de CLBL, maiores níveis
de EGF-R e ANGII também foram encontrados. O EGF é um importante regulador da
esteroidogênese ovariana, pois medeiam StAR (JAMNONGJIT ET AL. 2005), fundamental
para o transporte de colesterol para o interior da mitocôndria. No caso das células da
granulosa, o aumento do transporte de colesterol para a mitocôndria é um indicativo duma
maior síntese de progesterona, uma vez que as células da granulosa não apresentam a
maquinaria necessária para a conversão de colesterol a androgênios, precursores dos
estrogênios (HILLIER ET AL., 1994). Apesar disso, a maior atividade de StAR nas células da
granulosa aumenta a expressão de EGF-R devido a uma sinalização de modificação póstraducional, a fosforilação (JAMNONGJIT ET AL. 2005). O EGF-R, por sua vez, estimula a
proliferação das células da granulosa, aumenta o diâmetro folicular, promove o aumento dos
oócitos e regula a expressão da conexina 43, essencial para o estabelecimento das junções gap
(MORBECK ET AL., 1993; MAO ET AL., 2004; SILVA ET AL., 2004; BOLAMBA ET
AL., 2002; KENNEDY ET AL., 2003). Além disso, o EGF age controlando a expressão de
receptores para FSH e LH, essenciais para a síntese de CYP19A na granulosa (LUCIANO ET
AL., 1994; HATTORI ET AL., 1995).
O aumento de AT2 nestes folículos também indica uma maior atividade
esteroidogênica. BERISHA ET AL., (2002) relataram um aumento da síntese de AT2 em
folículos altamente estrogênicos. Essa alta atividade se dá pela ação de AT2 em estimular a
síntese de transcritos de CYP19A (GONÇALVES ET AL., 2010). Além da atividade de
síntese destes estrogênios, AngII, via AT2, tem importante ação na formação do antro,
proliferação celular e, em especial, secreção de esteroides (SHUTTELEWORTH ET AL.,
2002). Dessa forma, com base nos dados de folículos que deram origem a BL e CLBL, é
40
possível sugerir que os mesmos não só apresentavam uma maior capacidade de síntese de
esteroidogênica, mas também uma maior capacidade de secretar estas moléculas para o
ambiente extracelular, formado pelo antro folicular.
Em relação à cinética de desenvolvimento, CG de onde derivaram BLR apresentaram
maiores níveis de estrógeno no FF e maior síntese de AT2, mas diminuição de CYP19A e
EGF-R quando comparados aos níveis de BLL. Estes dados sugerem que embriões de
desenvolvimento rápido derivam de folículos cuja capacidade esteroidogênica está mais
voltada a secreção do estrógeno para o antro, enquanto BLL estaria mais direcionado a
conversão da androstenediona a estrogênio, mantendo ainda altos níveis do seu precursor
(colesterol) no fluido folicular.
Nas análises de correlações entre as moléculas no fluido folicular e os grupos
analisados, nos FFs que derivaram os grupos de CL, CLR, BL, CLBL e BLR foi encontrada
correlação positiva entre piruvato e estradiol. Como o piruvato é um precursor energético de
mais rápido acesso para geração de energia (DOWNS ET AL., 2002), e como para a síntese
de estradiol o folículo requer ATP para conversão a AMPc/PKA estimulando a síntese de
CYP19A (JAMNONGJIT ET AL. 2005), a concentração de piruvato possibilita que haja um
estoque energético essencial para a síntese de estradiol pelas células foliculares. Isso permite
que esses folículos possam gerar oócitos mais aptos a se desenvolverem a blastocistos caso
haja a fecundação.
41
6. Conclusão
Com base nos resultados do presente estudo podemos concluir que folículos que
derivaram blastocistos (BL e CLBL) apresentam maior atividade esteroidogênica, o que
confere ao oócito maior potencial de desenvolvimento a blastocisto. Em relação à cinética de
desenvolvimento, os resultados sugerem que embriões de desenvolvimento rápido se
desenvolvem a partir de folículos com maior atividade secretora de estrogênio para o
ambiente folicular, enquanto que embriões de desenvolvimento lento parecem derivar de
folículos com incremento da síntese de estrogênios.
42
7. Referências
ACOSTA TJ, OZAWA T, KOBAYASHI S, HAYASHI K, OHTANI M, KRAETZL
WD, SATO K, SCHAMS D, MIYAMOTO A. Periovulatory Changes in the Local Release
of Vasoactive Peptides, Prostaglandin F2{alpha}, and Steroid Hormones from Bovine
Mature Follicles In Vivo. Biology of Reproduction; 63: 1253- 1261, 2000.
AGUILERA G, MILLAN MA, HARWOOD JP. Angiotensin II receptors in the
gonads. American Journal of Hypertension; 2: 395-402, 1989.
AIRES, M. M. ET AL. Fisiologia. 3. ed. Rio de Janeiro: Guanabara-Koogan,
2008.p.1051-1076, 2008.
ANDRADE ER, SENEDA MM, ALFIERI AA, OLIVEIRA JA, BRACARENSE
APFRL, FIGUEIREDO JR, TONIOLLI R. Interactions of indole acetic acid with EGF and
FSH in the culture of ovine preantral follicles. Theriogenology, v.64, p.1104-1113, 2005.
ARMSTRONG DG, GUTIERREZ CG, BAXTER G, GLAZYRIN AL, MANN GE,
WOAD KJ, HOGG CO, WEBB R. Expression of mRNA encoding IGF-I, IGF-II and type
1 IGF receptor in bovine ovarian follicles. J Endocrinol; 165:101–113, 2000.
BAUMANN, C.G., MORRIS, D.G., SREENAN, J.M., AND LEESE, H.J., The quiet
embryo hypothesis: molecular characteristics favoring viability. Mol. Reprod. Devel., vol.
74, pp. 1345–1353, 2007.
BAO, B., AND GARVERICK, H.A. Expression of steroidogenic enzyme and
gonadotropin receptor genes in bovine follicles during ovarian follicular waves: a
review. Journal of animal science 76.7: 1903-1921, 1998.
BAO, B., GARVERICK, H.A., SMITH, G.W., SMITH, M.F., SALFEN, B.E.,
YOUNGQUIST, R.S. Expression of messenger ribonucleic acid (mRNA) encoding
3bhydroxysteroid dehydrogenase D4,D5 isomerase (3b-HSD) during recruitment and
selection of bovine ovarian follicles: identification of dominant follicles by expression of
3bHSD mRNA within the granulose cell layer. Biol Reprod, v.56, p.1466-1473, 1997
43
BEKER, A. R. C. L.; COLENBRANDER, B.; BEVERS, M. M. Effect of 17βestradiol on the in vitro maturation of bovine oocytes. Theriogenology, v. 58, n. 9, p.
1663-1673, 2002.
BERISHA B, SCHAMS D, MIYAMOTO A. The mRNA expression of angiotensin
and endothelin system members in bovine ovarian follicles during final follicular
growth. J Reprod Dev, 48:573-582, 2002.
BERGH C, OLSSON J-H, SELLESKOG U & HILLENSJÖ T. Steroid production
in cultured thecal cells obtained from human ovarian follicles. Hum Reprod 8: 519-524.
1993.
BIGGERS JD, WHITTINGHAM DG & DONAHUE RP. The pattern of energy
metabolism in the mouse oocyte and zygote. Zoology 58 560–567, 1967.
BINELLI, M., PORTELA, V. M., MURPHY, B. D. Dinâmica ovariana e eficiência
reprodutiva: estado da arte. Congresso Brasileiro de Reprodução Animal, 18, 2009, Belo
Horizonte, MG. Anais ... Belo Horizonte: CBRA, 2009.
BOLAMBA D, FLOYD AA, MCGLONE JJ, LEE VH. Epidermal growth factor
enhances expression of connexin 43 protein in cultured porcine preantral follicles. Biol
Reprod, v.67, p.154-160, 2002.
CAI, JIE ET AL. Poor ovarian response to gonadotropin stimulation is associated
with low expression of follicle-stimulating hormone receptor in granulosa cells. Fertility
and sterility, v. 87, n. 6, p. 1350-1356, 2007.
CELESTINO, J. J. H., SILVA, C. M. G., CASTRO, S. V., & FIGUEIREDO, J. R.
Fator de crescimento epidermal como mediador de sobrevivência e desenvolvimento
folicular. Rev. Bras. Reprod. Anim., Belo Horizonte, v.36, n.3, p.148-157, 2012.
CETICA P, PINTOS L, DALVIT G & BECONI M. Activity of keynzymes involved
in glucose and triglyceride catabolism during bovine oocyte maturation in vitro.
Reproduction 124 675–681, 2002.
CHAVES R.N.,. DUARTE A.B.G,. MATOS M.H.T, FIGUEIREDO J.R. Systems in
vitro development of immature oocytes of mammalians. Rev. Bras. Reprod. Anim., Belo
Horizonte, v.34, n.1, p.37-49, 2010.
44
CHIU,A.T., ET AL. Identification of angiotensin II receptor subtypes. Biochemical
and Biophysical Research Communications, v.165, n.1, p.196-203, 1989.
DOWNS SM & UTECHT AM . Metabolism of radiolabeled glucose by mouse
oocytes and oocyte–cumulus cell complexes. Biology of Reproduction60 1446–1452, 1999.
DRUMMOND AE. The role of steroids in follicular growth. Reprod Biol
Endocrinol, v.4, p.1-11, 2006.
DOWNS SM, HUMPHERSON PG, LEESE HJ. Pyruvate utilization by mouse
oocytes is influenced by meiotic status and the cumulus oophorus. Mol Reprod
Dev.;62(1):113-23 , 2002.
FENWICK J, PLATTEAU P, MURDOCH AP AND HERBERT M. Time from
insemination to first cleavage predicts developmental competence of human
preimplantation embryos in vitro. Human Reprod; 17 (2): 407 – 412, 2002.
FERREIRA EM, VIREQUE AA, ADONA PR, MEIRELLES FV, FERRIANI RA,
NAVARRO PAAS. Cytoplasmic maturation of bovine oocytes: structural and
biochemical
modifications
and
acquisition
of
developmental
competence.
Theriogenology, 71:836-848, 2009.
FERREIRA EM, VIREQUE AA ; ADONA PR ; MEIRELLES FV ; FERRIANI RA ;
NAVARRO PAASN . Maturação citoplasmática de oócitos bovinos: aquisição de
competência para o desenvolvimento. Rev Bras Reprod Anim, Belo Horizonte, v.32, n.3,
p.172-181, 2008.
FERREIRA R, ET AL. Effect of Angiotensin II on Bovine Follicular Growth and
mRNA Encoding Steroidogenic Enzymes, Gonadotrophin Receptors, and Tissue
Development Genes. Biology of Reproduction, v. 81, n. 1 Supplement, p. 559, 2009
FERREIRA R, OLIVEIRA JF, FERNANDES R, MORAES JF & GONÇALVES PB .
The role of angiotensin II in the early stages of bovine ovulation. Reproduction 134 713–
719, 2007.
FORTUNE JE, RIVERA GM, YANG MY. Follicular development: the role of the
follicular microenvironmet in selection of the dominant follicle. Anim. Reprod. Sci. v. 8283, p. 109-126, 2004.
45
GÉVRY N, LOPES F, LEDOUX S, ET AL: Aberrant intracellular cholesterol
transport disrupts pituitary and ovarian function. Mol Endocrinol; 18:1778–1786. 2005.
GONÇALVES, P. B. D.; FIGUEIREDO, J. R.; FREITAS, V. J. F. Biotécnicas
aplicadas à reprodução animal. São Paulo: Varela, v.1. 2008
GONÇALVES, P. B. ET AL. Role of angiotensin II on follicle development and
ovulation. Anim Reprod, v. 7, p. 140-5, 2010.
GIOMETTI, I.C. ET AL. Angiotensin II reverses the inhibitory action produced
by theca cells on bovine oocyte nuclear maturation. Theriogenology, v.63, n.4, p.10141025. 2005.
GINTHER OJ, KOT K, KULICK LJ, WILTBANK MC. Sampling follicular fluid
without altering follicular status in cattle: oestradiol concentrations early in a follicular
wave. J Reprod Fertil; 109:181–186, 1997.
HASHIMOTO S, MINAMI N , YAMADA M, IMAI H. Excessive concentration of
glucose during in vitro maturation impairs the developmental competence of bovine
oocytes after in vitro fertilization: relevance to intracellular reactive oxygen species and
glutathione contents. Mol Reprod Dev, v.56, p.520-526, 2000.
HATTORI MA, YOSHINO E, SHINOHARA Y, HORIUCHI R, KOJIMA I. A novel
action of epidermal growth factor in rat granulosa cells: its potentiation of
gonadotrophin action. J Mol Endocrinol, v.15, p.283-291, 1995.
HILLIER SG, WHITELAW PF & SMYTH CD. Follicular oestrogen synthesis: the
'two-cell, twogonadotropin' model revisited. Mol Cell Endocrinol 100: 51-54. 1994.
HSIEH M, LEE D, PANIGONE S, HORNER, K, CHEN R, THEOLOGIS A, LEE
DC, THREADGILL DW, CONTI M. Luteinizing hormone-dependent activation of the
epidermal growth factor network is essential for ovulation. Mol Cell Biol, v.27, p.19141924, 2007.
HUSAIN,A., ET AL. Localization of Angiotensin II Receptors in Ovarian Follicles
and the Identification of Angiotensin II in Rat Ovaries. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, v.84, n.8, p.2489-2493, 1987.
46
Hyttel P, Fair T, Callesen H, Greve T. Oocyte growth, capacitation and final
maturation in cattle. Theriogenology, v.47, p.23-32, 1997
IETS 2012 Statistics and Data Retrieval Committee Report . The year 2011
worldwide statistics of embryo transfer in domestic farm animals. Embryo Transfer
Newsletter,Vol. 30 No. 4 , 2012.
IWATA H., HASHIMOTO S., OHOTA M., KIMURA K., SHIBANO K., MIYAKE
M. Effects of follicle size and electrolytes and glucose in maturation medium on nuclear
and developmental competence of bovine oocytes. Reproduction 127(2)159-164, 2004.
JAMNONGJIT, MICHELLE; GILL, ARVIND; HAMMES, STEPHEN R. Epidermal
growth factor receptor signaling is required for normal ovarian steroidogenesis and
oocyte maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America, v. 102, n. 45, p. 16257-16262, 2005.
JOHNSON, MARK T., ET AL. Oxidative metabolism of pyruvate is required for
meiotic maturation of murine oocytes in vivo. Biology of reproduction 77.1: 2-8, 2007.
KENNEDY KL, FLOYD AA, CLARKSON AM, LEE VH. Epidermal growth
factor regulation of connexin 43 in cultured granulosa cells from preantral rabbit
follicles. Mol Reprod Dev, v.64, p.61-69, 2003.
KHURANA NK & NIEMANN H. Effects of oocyte quality, oxygen tension,
embryo density, cumulus cells and energy substrates on cleavage and morula/blastocyst
formation of bovine embryos. Theriogenology 54 741–756, 2000.
KOHEK MBF, LATRONICO AC. O papel dos receptores das gonadotrofinas na
reprodução feminina. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia 45.4: 369374, 2001.
KOTANI, E. ET AL. Biological roles of angiotensin II via its type 2 receptor
during rat
follicle atresia. American Journal of Physiology - Endocrinology and
Metabolism, v.276, n.1, p.E25-33. 1999.
KUO, T.C. ET AL. Direct effect of angiotensin II on in-vitro perfused rabbit
ovary. Journal of Reproduction and Fertility, v.92, n.2, p.469-474. 1991.
47
LEESE HJ. Quiet please, do not disturb: A hypothesis of embryo metabolism and
viability. Bioessays 24: 845–849, 2002.
LIMA-VERDE, I. B., R. ROSSETTO, AND J. R. Figueiredo. Influência dos
hormônios esteroides na foliculogênese. Rev Bras Reprod Anim 35: 472-482, 2011.
LUCIANO AM, PAPPALARDO A, RAY C, PELUSO JJ. Epidermal growth factor
inhibits large granulose cell apoptosis by stimulating progesterone synthesis and
regulating the distribution of intracellular free calcium. Biol Reprod, v.51, p.646-654,
1994.
LUO, W., & WILTBANK, M. C. Distinct regulation by steroids of messenger
RNAs for FSHR and CYP19A1 in bovine granulosa cells. Biology of reproduction, 75(2),
217-225, 2006.
MAO, J., SMITH, M.F., RUCKER, E.B., WU, G.M., MCCAULEY, T.C.,
CANTLEY, T.C., PRATHER, R.S., DIDION, B.A., DAY, B.N. Effect of epidermal growth
factor and insulin-like growth factor I on porcine preantral follicular growth, antrum
formation, and stimulation of granulosal cell proliferation and suppression of apoptosis
in vitro. J Anim Sci, v.82, p.1967-1975, 2004.
MEINECKE B, JANAS U, PODHAJSKY E, MEINECKE-TILLMANN S. Histone
H1 and MAP kinase activities in bovine oocytes following protein synthesis inhibition.
Reprod Domest Anim, v.36, p.183-188, 2001.
MINGOTI, GZ, GARCIA JM, ROSA E SILVA AAM. The effect of serum on in
vitro maturation, in vitro fertilization and steroidogenesis of bovine oocytes co-cultured
with granulosa cells. Braz J Medd Bioll Res, v.2, p.213-217, 1995.
MINISTÉRIO
DA
AGRICULTURA
http://www.agricultura.gov.br/comunicacao/noticias/2014/12/produto-interno-bruto-daagropecuaria-deve-ser-de-rs-1-trilhao
MONTFOORT A PA VAN , PLÖSCH T, HOEK A, TIETGE UJF. Impact of
maternal cholesterol metabolism on ovarian follicle development and fertility. Journal of
Reproductive Immunology. ; 104-105, 2014.
48
MORBECK DE, FLOWERS WL, BRITT JH. Response of porcine granulosa cells
isolated from primary and secondary follicles to FSH, 8-bromo-cAMP and epidermal
growth factor in vitro. J Reprod Fertil, v.99, p.577-584, 1993.
NAUFAL, J. Deficiência de esteroides sexuais na mulher. Revista Brasileira de
Medicina, v.70, p.9-17, 2013.
NIELSEN, A.H., HAGEMANN, A., SVENSTRUP, B., NIELSEN, J., POULSEN, K.
Angiotensin-II receptor density in bovine ovarian follicles relates to tissue renin and
follicular size. Clin Exp Pharmacol Physiol, 21:463-469, 1994.
NOKELAINEN P, Biosynthesis of Estradiol_Cloning and characterization of
rodent 17β-hydroxysteroid dehydrogenase/17-ketosteroid reductase types 1 and 7. 75 f.
Dissertação (Mestrado em Medicina) – University of Oulu, Finlândia. 2000.
OLIVEIRA, M. E. F., R. M. FERREIRA, AND G. Z. MINGOTI. Controle do
crescimento e da seleção folicular por fatores locais e sistêmicos na espécie
bovina. Revista Brasileira de Reprodução Animal 35.4: 418-432, 2011.
ORSI, NICOLAS M. ET AL. Fluctuations in bovine ovarian follicular fluid
composition throughout the oestrous cycle. Reproduction, v. 129, n. 2, p. 219-228, 2005.
PAUL, M., MEHR, A. P., & KREUTZ, R. Physiology of local renin-angiotensin
systems. Physiological reviews, 86(3), 747-803, 2006.
PERRY,G . IETS Data Retrieval Committee. 2013 statistics of embryo collection
and transfer in domestic farm animals. Embryo Transfer Newsletter,Vol. 31 No. 4 , 2013.
PETERSON, C.M. ET AL. The angiotensin II antagonist saralasin inhibits
ovulation in the perfused rat ovary. American Journal of Obstetrics and Gynecology, v.168,
n.1 Pt 1, p.242-245. 1993.
PFAFFL, M.W.; HORGAN, G.W.; DEMPFLE, L. Relative expression software tool
(REST© ) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression
results in real-time PCR., 2005.
PFEIFER, LUIZ FRANCISCO M. ET AL. O nível de colesterol influencia a
quantidade de folículos na punção folicular de vacas de corte. Archivos de zootecnia, v.
58, n. 221, p. 153-156, 2009.
49
RAMSING NB, HILLIGSØE KM, PEDERSEN KS,. Morphokinetic analysis of
embryo development. Unisense FertiliTech A/S F7.797.4, 2011.
SALUMETS
A.,HYDÉN-GRANSKOG
C,
MÄKINEN
S.,
ANNE-MARIA
SUIKKARI, TIITINEN A.,AND TUURI T.. Early cleavage predicts the viability of human
embryos in elective single embryo transfer producers. Hum.Reprod. 18(4):821, 2004.
SARAIVA, M. V. A. ET AL. Hormônios hipofisários e seu papel na
foliculogênese. Rev. Bras. Reprod. Anim., Belo Horizonte, v. 34, n. 4, p. 206-221, 2010
SHUTTLEWORTH, G. ET AL. In vitro development of pig preantral follicles
cultured in a serum-free medium and the effect of angiotensin II. Reproduction, v.123,
n.6, p.807- 818. 2002.
SILVA JRV, VAN DEN HURK R, MATOS MHT, SANTOS RR, PESSOA C,
MORAES MO, FIGUEIREDO JR. Influences of FSH and EGF on primordial follicles
during in vitro culture of caprine ovarian cortical tissue. Theriogenology, v.61, p.16911704, 2004.
SIMONI M, GROMOLL J, NIESCHLAG E. The follicle-stimulating hormone
receptor: biochemistry, molecular biology, physiology and pathophysiology. Endocr
Rev 18:739–773,1997.
SUTTON-MCDOWALL, M.L., GILCHRIST, R.B., THOMPSON, J.G. Cumulus
expansion and glucose utilization by bovine cumulus-oocyte complexes during in vitro
maturation: the influence of glucosamine and follicle-stimulating hormone. Reproduction
128(3), 313-319,2004.
SUTTON-MCDOWALL ML, GILCHRIST RB, THOMPSON JG. The pivotal role
of glucose metabolism in determining oocyte developmental competence. Reproduction ,
v. 139, n. 4, p. 685-695, 2010.
ULLRICH A, SCHLESSINGER J. Signal transduction by receptors with tyrosine
kinase activity. Cell, v.61, p.203-212, 1990.
WANG, QIANG ET AL. An intercellular pathway for glucose transport into
mouse oocytes. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism, v. 302, n.
12, p. E1511-E1518, 2012.
50
WHITEBREAD,S., ET AL. Preliminary biochemical characterization of two
angiotensin II receptor subtypes. Biochemical and Biophysical Research Communications,
v.163, n.1, p.284-291, 1989.
YOSHIMURA Y. ET AL. Angiotensin II directly induces follicle rupture and
oocyte maturation in the rabbit. FEBS Letters, v.307, n.3, p.305-308. 1992.
YOSHIMURA Y, KOYAMA N, KARUBE M, ODA T, AKIBA M, YOSHINAGA
A, SHIOKAWA S, JINNO M, NAKAMURA Y. Gonadotropin stimulates ovarian reninangiotensin system in the rabbit. Journal of Clinical Investigation; 93: 180-187, 1994.
51
ANEXO
Meios para maturação in vitro – MIV

Meio de lavagem MIV (Pré-MIV)
Reagente
Fabricante
Catálogo
Volume
M-199 com HEPES
Gibco
12380-028
4,5 ml
Soro Fetal Bovino 10%
Gibco
16140-014
0,5 ml
Pyruvato 0,2mM
Sigma
P-4562
10 l
Gentamicina 50g/ml
Sigma
G-1264
25 l
Reagente
Fabricante
Catálogo
Volume
M-199 com BICARBONATO
Gibco
11150-026
4,5 ml
Soro Fetal Bovino 10%
Gibco
16140-014
0,5 ml
Piruvato 0,2mM
Sigma
P-4562
10 l
Gentamicina 50g/ml
Sigma
G-1264
25 l
FSH 0,5g/ml
Bioniche
Folltropin-V
5 l
hCG 7UI/ml
Intervet
Chorulon
50 l
E-4389
5 l
Filtrar em 0,22 m

Meio de maturação in vitro
Filtrar em 0,22 m
Estradiol 1g/ml
Sigma
52
Soluções estoques e meio para FIV

Soluções estoque para FIV (Parrish et al., 1988)
Fabricante
Catálogo
TALP
STOCK (50 ml)
TALP
SÊMEN (50 ml)
Sigma
S-5886
0,3330g
0,2910g
Sigma
P-5405
0,0120g
0,0115g
Sigma
M-2393
0,0050g
0,0040g
NaH2PO4
Sigma
S-0876
0,00205g
0,00175g
NaHCO3
Sigma
S-8875
0,1050g
0,1050g
CaCl2H2O
Sigma
C-5670
0,0150g
0,015g
Ác.Lactico syr.
Sigma
L-7900
71,5 l
155 l
Sigma
H-0891
**********
0,1190g
Reagente
NaCl
KCl
MgCl2
Hepes
pH = 7,4
OSM=295 – 300
Filtrar em 0,22µm

Solução de Gentamicina
Reagentes
Fabricante
Catálogo
100ml
Sulfato de
Gentamicina
Sigma
G-1264
50mg
Solução fisiológica
100ml
Aliquotar e manter a -20 C.
53

Solução de Piruvato
Reagentes
Ácido Pirúvico
Água Destilada
Fabricante
Catálogo
10ml
Sigma
P-3662
22mg
10ml
Aliquotar e manter a -20 C.

Solução pH 4.0
Reagente
Fabricante
Catálogo
50ml
Na Lactato
Sigma
L-7900
165mg
Na metabisulfito
Sigma
S-1516
0,050g
Água Milli-Q (q.s.p)
50ml
pH = 4,0

Componentes da solução PHE
Reagente
Penicilamina 2M
Fabricante
Sigma
Catálogo
P-40-3
3mg/10ml salina 0,9%
Hipotaurina 1M
Sigma
H-1384
1,09mg/10ml salina 0,9%
Epinefrina 0,25M
Sigma
21,930-4
1,83mg/40ml sol. pH 4,0
54

Solução PHE
Reagente
Fabricante
Catálogo
Volume
Penicilamina
Sigma
P-40-3
2,5ml
Hipotaurina
Sigma
H-1384
2,5ml
Epinefrina
Sigma
21,930-4
2ml
Solução salina 0,9%

4ml
Meio FIV
Reagente
Fabricante
Catálogo
TL – Stock
10ml
10 ml
BSA – Livre de Ácidos Graxos
Sigma
A-7511
0,060 g
Piruvato 0,2mM
Sigma
P-4562
20 l
Sigma
G-1264
50 l
Gentamicina 50g/ml
Filtrar em 0,22 m

Meio FIV gotas
Reagente
Meio – FIV
Heparina 140usp/mg
PHE
Fabricante
Catálogo
4ml
3.640 ml
Sigma
H-9399
40 l
160 l
Filtrar em 0,22 m
55

PERCOLL
90%

Percoll
3,6mL
Solução 10X
0,4mL
CaCl2 2H2O 1M (0,7350g/5mL de água Milli Q)
8L
MgCl2 6H2O 0,1M (0,1015g/5mL de água Milli Q)
15,6L
Ácido Lático (Lactado de Na)
14,8L
NaHCO3
0,0084g
Para fazer o Percoll 45%, diluir 1mL de Percoll 90% em 1mL de TL sêmen.
PERCOLZINHO
90%

Percoll
0,9mL
Solução 10X
0,1mL
CaCl2 2H2O 1M (0,7350g/5mL de água Milli Q)
2L
MgCl2 6H2O 0,1M (0,1015g/5mL de água Milli Q)
3,9L
Ácido Lático (Lactado de Na)
3,7L
NaHCO3
0,0021g
Para fazer o Percoll 45%, diluir 300ul de Percoll 90% em 300ul de TL sêmen.
56
Meio para cultivo (SOFaa)

Solução SOFaa estoque
Reagentes
Fabricante
Catálogo
100ml
NaCl
Sigma
S-5886
0,6294g
KCl
Sigma
P-5405
0,0534g
KH2PO4
Sigma
P-5655
0,0162g
NaHCO3
Sigma
S-5761
0,2106g
Na Lactato
Sigma
L-7900
0,0370g
Ácido Pirúvico
Sigma
P-3662
0,0034g
L-glutamina
Sigma
G-8540
0,0146g
MgCl2 7H2O
Sigma
M-2393
0,0098g
CaCl2
Sigma
C-5670
0,0252g
Filtrar em 0,22 m

Meio SOFaa (Uso)
Reagentes
Meio SOF estoque
Aminoácidos essenciais
Aminoácidos não
essenciais
Soro Fetal Bovino
Fabricante
Catálogo
Sigma
Sigma
M-5550
M-7145
5ml
4,6ml
0,100ml
0,050ml
Gibco
16140-014
0,250ml
Preparar na hora do uso
57