Mini-prep

Universidade Estadual de Londrina
Departamento de Biologia Geral
Laboratório de Citogenética Animal - LACA
MINIPREP
Preparação de pequena escala de DNA plasmidial
A) Replicação e lise de Bactérias
1) Diluir 0,4 g de meio de cultura (LB/Broth Base) em 20 mL de água destilada e
autoclavar.
2) Em câmara asséptica (deixar a UV ligada por 15 minutos) acrescentar ao meio LB
ampicilina (100 µg/mL) (4 µl de ampicilina em 2 mL de meio), e colocar uma colônia* ao
meio ou 5 µl de bactéria em meio Hogness ou glicerol. Incubar a 37ºC em agitação lenta
overnight.(*escolher uma colônia com bordas bem definidas e isolada).
3) Colocar em geladeira para dar choque térmico para inibir o crescimento.
4) Aliquotar 1,5 mL de bactérias por (2) microtubos e centrifugar a 14000 rpm por 2
minutos. Descartar o sobrenadante e deixar secar durante 20 minutos, invertendo o tubo
sobre um papel com a boca para baixo.
*Guardar clones em 250 µl de glicerol 50% + 750 µl de cultura.
B. Lise Alcalina
1) Ressuspender o pellet em 100 µl de solução I (GTE-mantida no gelo) com agitação
vigorosa para misturar (com a ponta de uma ponteira divulsionar bem o sedimento e em
seguida homogeneizar), se assegurando que o pellet tenha dissolvido completamente.
Solução I – GTE (Pode ser preparada em quantidades de 100 ml, autoclavada e guardada 4ºC).
50mM de glicose (0,9 g)
25 mM de Tris-HCl (pH 8.0) – (25 mL da solução estoque 1M)
10 mM de EDTA (pH 8.0) – (2mL da solução estoque 0,5M)
Adicionar 4mg/mL de lisozima (para 12 mL de GTE acrescentar 0,048g de lisozima ela deve ser acrescentada na hora).
2) Deixar a temperatura ambiente por 5 minutos.
3) Adicionar 200 µl de solução II recém preparada, no gelo.
Solução II
NaOH 0.2N (estoque a 10M)
SDS 1% (estoque a 10%)
OBS: O SDS não pode ser acrescentado em NaOH gelado, porque ele precipita.
Quantidade por microtubo (200 µl por tubo):
20 µl de SDS 10%
176 µl de água ultra-pura
4 µl de NaOH 10M
4) Fechar o tubo e misturar o conteúdo invertendo 5 vezes, assegurando que toda a
superfície do tubo tenha entrado em contato. Não agitar de forma que produza espuma.
5) Guardar no gelo por 5 minutos.
6) Adicionar 150 µl de solução III e manter no gelo.
Solução III (para 100 mL)
por microtubo
60 mL de Acetato de potássio 6M
90 µl
11,5 mL de Ácido acético glacial
17,25 µl
28,5 mL de Água destilada
42,75 µl
A solução resultante é 3M para acetato de potássio e 5M ácido acético
7) Fechar o tubo e inverter suavemente, manter em posição invertida durante 10-12
segundos para dispersar a solução III e a suspensão ficar viscosa por causa da lise das
bactérias. Guardar o tubo no gelo durante 5 minutos.
8) Centrifugar a 14000 rpm durante 5 minutos a 4ºC em microcentrífuga. Transferir o
sobrenadante (300 µl) para um microtubo (1,5 mL) limpo.
9) Adicionar um volume igual (300 µl) de fenol-clorofórmio-álcool isoamílico (25:24:1).
Inverter os tubos até que a solução fique bem homogênea (±5 minutos).
10) Centrifugar a 14000 rpm durante 5 minutos. Depois transferir o sobrenadante (200 µl)
para um tubo limpo (somente a faixa clara). Tratar com RNAse, acrescentando 1µl de
RNAse (10 mg/mL) para cada 100µl de solução, por 30 minutos à 37ºC.
11) Precipitar o DNA com 2 volumes de etanol absoluto gelado. Misturar e deixar por 2
minutos a temperatura ambiente. Deixar no freezer -20°C por 15 minutos.
12) Centrifugar durante 5 minutos a 14000 rpm
13) Descartar o sobrenadante. Colocar o tubo invertido sobre um papel e deixar secar
muito bem. Colocar TE (30µl a 100µl depende da quantidade de pellet) e deixar overnight
em geladeira.
14) Adicionar 1 mL de etanol 70% a 4ºC. Misturar em vortex e centrifugar 2-5 minutos.
15) Eliminar o sobrenadante e secar
16) Ressuspender em 30 µl de TE (pH 8.0). Misturar em vortex.Guardar o DNA a −20ºC
Os passsos 14 a 15 são opcionais.