Preparação das Bactérias Competentes Utilizando - IMT

Preparação das Bactérias Competentes Utilizando
Cloreto de Cálcio
Semear
as bactérias
em
meio
LB
sólido
e
incubar
a
37 ºC
por
aproximadamente 20 horas.
Isolar uma colônia e crescer em 3 ml de meio LB por aproximadamente 24
horas.
Após esse período transferir 1ml do meio rico em bactérias em 100ml de meio
LB. Incubar a cultura por aproximadamente 3 horas à 37 ºC sob forte agitação (300
ciclos/minutos).
O
crescimento
da
cultura
deve
ser
monitorado
espectrofotometricamente (D.O.600 ideal 0,3).
Transferir o volume em dois tubos de 50ml, mantendo-os em gelo por 15
minutos.
Centrifugar as células a 4000rpm por 10 minutos a 4ºC
Descartar o sobrenadante. Os tubos contendo o pellets deve ser invertidos por
aproximadamente 1 minuto.
Ressuspender o pellet em 10 ml da solução gelada de CaCl 2 (0,1M) em banho
de gelo.
Centrifugar novamente as células a 4000rpm por 10 minutos a 4 ºC
Descartar o sobrenadante. Os tubos contendo o pellets deve ser invertidos por
aproximadamente 1 minuto.
Ressuspender o pellet em 2ml da solução de CaCl2 (0,1M) + 15% de glicerol.
Aliquotar (200 l/tubo) e congelar rapidamente no nitrogênio líquido
Solução Mãe de CaCl2 (0,1M)
147,02g
1 litro
1000mM
73,51g
500ml
500mM
** Todo processo deve ser feito em banho de gelo **