Preparação das Bactérias Competentes Utilizando - IMT
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Preparação das Bactérias Competentes Utilizando Cloreto de Cálcio Semear as bactérias em meio LB sólido e incubar a 37 ºC por aproximadamente 20 horas. Isolar uma colônia e crescer em 3 ml de meio LB por aproximadamente 24 horas. Após esse período transferir 1ml do meio rico em bactérias em 100ml de meio LB. Incubar a cultura por aproximadamente 3 horas à 37 ºC sob forte agitação (300 ciclos/minutos). O crescimento da cultura deve ser monitorado espectrofotometricamente (D.O.600 ideal 0,3). Transferir o volume em dois tubos de 50ml, mantendo-os em gelo por 15 minutos. Centrifugar as células a 4000rpm por 10 minutos a 4ºC Descartar o sobrenadante. Os tubos contendo o pellets deve ser invertidos por aproximadamente 1 minuto. Ressuspender o pellet em 10 ml da solução gelada de CaCl 2 (0,1M) em banho de gelo. Centrifugar novamente as células a 4000rpm por 10 minutos a 4 ºC Descartar o sobrenadante. Os tubos contendo o pellets deve ser invertidos por aproximadamente 1 minuto. Ressuspender o pellet em 2ml da solução de CaCl2 (0,1M) + 15% de glicerol. Aliquotar (200 l/tubo) e congelar rapidamente no nitrogênio líquido Solução Mãe de CaCl2 (0,1M) 147,02g 1 litro 1000mM 73,51g 500ml 500mM ** Todo processo deve ser feito em banho de gelo **
