“Influência da concentração de nitrogênio e do caldo de cana

“ Fatores Físicos e Químicos que
Influenciam a Fermentação
Alcoólica”
Prof. Clóvis Parazzi
O que se deseja de um processo
fermentativo ?
ƒ Elevado Rendimento
ƒ Uniformidade na produção de metabólitos
pela levedura
ƒ Qualidade do produto final (cervejarias,
bebidas fermentadas e destiladas )
FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA
Produtos e Subprodutos ( Jackman, E.A, 1987)
z
z
z
z
z
z
z
z
z
Etanol ............................. 45 - 49 %
CO2
............................. 43 - 47 %
Glicerol ............................. 02 - 05 %
Ácido Succínico .................. 0,5 - 1,5 %
Ácido Acético ...................... 0 - 1,4 %
Ácido málico ....................... 0 - 0,3 %
Biomassa ............................. 0,7 - 1,7 %
Óleo Fúsel .......................... 0,2 - 0,6 %
Butileno Glicol.................... 0,2 - 0,6 %
LEVEDURAS ALCOÓLICAS
ƒ Saccharomyces cerevisae, S. elipsoideus, S.
anmensis, S. uvarum, Schizosaccharomyces pombe,
Hansenula ( Camhi,1979).
ƒ Leveduras de panificação ou selecionadas em
laboratório usadas na fermentação são inadequadas
por desaparecerem logo no início da safra e são
substituídas por outras oriundas da biodiversidade
ambiental. (Basso et.al., 1993).
ƒ Linhagens selvagens selecionadas pelo caráter de
dominância e persistência na indústria.
FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA
PRINCIPAIS FATORES QUE AFETAM A FERMENTAÇÃO
f Substrato – composição química do meio
z produtos: açúcar, álcool, ácidos, etc.
z nutrientes: N, K, P, Mg, Mn, etc.
fMicrorganismo – constituição e estágio dos microrganismo
z leveduras e contaminantes.
f Condições físicas e ambientais
z Temperatura
z pH (acidez)
z aerobiose/anaerobiose
f Sistemas de fermentação
z contínuo e descontínuo.
f Outros
FATORES QUE LIMITAM A PRODUTIVIDADE
a) NUTRIENTES MINERAIS ´ N, P, K, Mg, Zn, Mn
b) AGENTES TÓXICOS ´ ALUMÍNIO, SULFITO, EXCESSO K+ e Ca++
c) TEMPERATURA ELEVADA
d) CONCENTRAÇÃO DE ETANOL
e) ACIDEZ (pH)
f) PRESSÃO OSMÓTICA ´ AÇÚCARES E SAIS
g) CONTAMINAÇÃO ´ BACTÉRIA e LEVEDURAS
Condições estressantes para a levedura
Como as Leveduras Respondem
as
Mudanças do Meio
LEVEDURA – CONDIÇÕES ESTRESSANTES
Nutrientes
Pressão
Osmótica
Temperatura
pH
Álcool
Oxidantes
metais pesados
TEMPERATURA
Efeito da temperatura
a) Fatores externos
Mudanças na temperatura da água, clima e mosto
b) Fatores intrínsicos
Calor liberado na fermentação
Influência da temperatura na variação do tempo de geração e do
coeficiente específico de crescimento para a linhagem da
levedura Saccharomyces cerevisiae
Temperatura
20
24
27
30
36
38
40
Tempodegeração(h)
5
3.5
3.0
2.2
2.1
4.0
Coef. espec. decresc. g/l/h-1
0.15
0.21
0.30
0.31
0.29
0.19
-
TEMPERATURA
Efeito interativo de temperatura e espécie de levedura
TAXA DE CRESCIMENTO X TEMPERATURA
Fonte: LALUCE et.al., 1995.
TEMPERATURA DA FERMENTAÇÃO
¾ Influência direta sobre a fermentação
¾ Favorece multiplicação bacteriana
¾ Floculação
¾ Acima 35o C afeta desempenho da levedura
¾ Redução da viabilidade de leveduras
¾ Diminui rendimento da fermentação
hTemperatura ótima
• Crescimento ........... 30 a 34°C
• Fermentação............32 a 36°C
TEMPERATURA X VIABILIDADE
VINHO VIABILIDADE
95,0
94,0
93,0
92,0
91,0
90,0
89,0
32,8
33,3
33,8
VINHO TEMP. MÁXIMA
Y = 244,57798 - 4,54762 X
Fonte: Fermentec, 2002
(*
r = -0,80498)
TEMPERATURA FERMENTAÇÃO X CONTAMINAÇÃO VINHO
VINHO BAST. x 10^6
194
144
94
44
-6
-56
32,0
33,0
34,0
35,0
36,0
37,0
VINHO TEMP. MÁXIMA
Y = -1721,24045 + 52,10960 X
Fonte: Fermentec, 2002
(**
r = 0,78442)
pH
$
$
$
Crescimento ÄpH 3.0 a 8.0
Produção de Biomassa Ä pH 4 a 6.
Fermentação Ä pH Inicial 4,2 a ,5,1 Ä Reduz a pH 3,9-4,1.
Produção de etanol por Saccharomyces cerevisiae em função do tempo de cultivo
em melaço de soja (Ayube M. A Z., 2002).
EFEITO DO pH NA ATIVIDADE DA INVERTASE DE
LEVEDURA
--- invertase purificada
___ célula intacta
ATIVIDADES DE INVERTASES
FRUTOSE
H2 O
O
+
INVERTASE
GLICOSE
SACAROSE
Condições Ambientais
(Substrato x Produto)
Efeitos da concentração de etanol e glicose
sobre o metabolismo de S. cerevisiae.
>16%
<10%
VIAS DE DEGRADAÇÃO DE CARBOIDRATOS E A PRODUÇÃO DE ETANOL.
FATORES INTERFERENTES NO METABOLISMO DA LEVEDURA.
(>16%)
Efeito da condição ambiental sobre o
comportamento metabólico em S.
cerevisiae
(<10%)
Gráfico de velocidades de
consumo de açúcar, produção de
etanol e crescimento de leveduras
numa fermentação alcoólica
(HORAS)
a) Glicose
•1
> 15,0% (150 g/L) → inibe enzimas fermentativas.
•1
de 0,3 a 10% → inibição seletiva da respiração.
•1
≅ 5% em meio aeróbico → via fermentativa completa
(mitocôndria é reprimida e citocromo não funcionais).
•1
glicose ¾ e oxigênio½ alto → catabolismo oxidativo /
respiração (não há fermentação) → efeito Pasteur
b) Oxigênio / Agitação
•1
aeração moderada auxilia na suspensão das células
mais do que efeito direto do oxigênio (maior superfície de
contato).
•1
É capaz de induzir a respiração na dependência de
concentração de glicose do meio.
GLICOSE
y CRESCIMENTO Ä 2% a 5% de açúcar no meio (biomassa).
y CONCENTRAÇÃO LIMITE Ä 25 A 30%
• Produção de etanol passa a ser prejudicada
• Biomassa diminui.
c) Efeito da concentração de Etanol
•1
inibe a atividade metabólica e leva a morte (sem
condição de sobrevivência);
•1
limite no vinho → 12% de álcool → variável (espécie e
linhagem de leveduras e condições da fermentação).
Influência do etanol na fermentação (Franz, 1961)
O Estresse da levedura
TIPOS
♥
¾Térmico - temperaturas elevadas
¾Oxidativo -
produtos de oxidação
¾ Osmótico - presença de sais,alcoois, etc,
™Principais fatores que podem induzir à
levedura ao estresse
* características operacionais
S A-1
* composição química do mosto
* presença de sais (excesso de potássio no meio)
* concentração de álcoois superiores (isoamílico)
* deficiência de nutrientes (N)
Choque Osmótico
ƒ A levedura produz glicerol para se defender
ƒ A resposta leva cerca de 1 minuto
ƒ O glicerol tem a função de osmorregulador
ATIVIDADES DE INVERTASE
Pode levar ao estresse osmótico
FRUTOSE
H2 O
O
+
INVERTASE
GLICOSE
SACAROSE
(1 MOLÉCULA)
(2 MOLÉCULAS)
MAIOR PRESSÃO
OSMÓTICA
Diferença Entre Linhagens
Consumo de Açúcar (Alves, 2000)
ÁCIDO MÁLICO
GLICEROL
LEVEDURAS COM DIFERENTES ATIVIDADES
DE INVERTASE.
• PODE SE OBTER MELHOR DESEMPENHO DAS
LEVEDURAS EVITANDO O CHOQUE OSMÓTICO.
• LEVEDURAS
- ALTA ATIVIDADE DE INVERTASE DEVE-SE ALIMENTAR MAIS VAGAROSAMENTE.
• LEVEDURAS
- BAIXA ATIVIDADE DE INVERTASE
PODE – SE ALIMENTAR EM MENOR TEMPO.
NUTRIENTES
Esquema geral do
metabolismo da levedura
K+ Mg ++
(1) GLUCOSE P
TREALOSE
GLICOGÊNIO
(RESERVA)
SA
P
MA
S
P
P
FRUTOSE
BI
O
NADP+
ATP
NADPH+
H+
ÁCIDOS
NUCLEICOS
NH4+
ADP
PENTOSES
Mg++
FRUTOSE P - P
K+
Zn++
DIHIDROXIACETONA
NADH + H+
NAD
P
GLICEROL
K+Mn++
PROTEÍNAS
E ENZIMAS
(2) GLICERALDEIDO
P
Cu++
Fe+++
Mg ++
AMINOÁCIDOS
N
S
SUCCINATO
ALDEÍDOS
Pulmão
ácidos
(KREBS)
PIRUVATO
ALDEIDO ACÉTICO
NADH + H+
NAD
CO2
ETANOL
CO2
ESTERES
ÁCIDOS GRAXOS
ALCOOIS
P
Zn++
Mn++
Nutrientes
Funções
K
Ativador enzimático inclusive de reações da glicólise; estabilizador de membranas;
necessário para a absorção do H2P04 aumenta a tolerância para iônios tóxicos,
inclusive H, controlando o pH intracelular; participa da absorção, por troca, de
catiônios bivalentes (Zn e Co).
Mg
Ativador enzimático no processo glicolítico de transferases e carboxilases; estimula a
absorção de H2P04 incrementando a fermentação; mantém a integridade e
permeabilidade das membranas e regula o transporte de catiônios bivalentes. Sofre
ação antagônica do Ca++.
Ca
Parece não ser importante para fermentações e multiplicação. Mantém integridade da
membrana plasmática em condições adversas. Ativa ATPase em concentração 1 mM,
mas se mostra inibidor a 10 mM. Inibe absorção de aminoácidos em conc. de 1 mM e
inibe o crescimento em conc. de 25 mM.
Ti
Participa da glicólise e da síntese de vitaminas, sendo essencial ao crescimento e á
fermentação. Não é substituído por nenhum outro íon em suas funções; é integrante
de desidrogenases, aldolases e desulfidrases. A absorção é reduzida, em pH abaixo de
5 e é efetuada mediante troca com 2 íons K+.
Mn
Estimula a síntese de proteínas e tiarnina; aumenta o teor de desidrogenase.
Fe
Participa do sitio ativo de diversas enzimas (hemoenzimas). Requerido para
multiplicação na concentração de 1 a 3 μM. Concentrações de 10 a 15 μM inibem
crescimento e fermentação.
Cu
Integrante de algumas enzimas; em concentrações de 1 a 1,5 μM estimula
fermentação e crescimento, já em conc. de 10 μM inibe o crescimento
Mo. Co, B Estimulam crescimento e fermentação em baixas concentrações (1μM). Inibição com
concentrações acima de 5μM.
Principais nutrientes e suas funções (fonte: Rodney e Greenfield (1984))
NUTRIENTES
Condições de
estresse para
Trealose
leveduras
Mudanças morfológicas na células de leveduras podem
ser
entendidas
como
resposta
ao
desbalanço
de
nutrientes do caldo de cana-de-açúcar (Kuriyama &
Slaghter, 1995).
Pseudo-hifas
9 Linhagens de Saccharomyces cerevisiae sofrem
transição dimórfica que envolve mudanças na forma
das células e no padrão de divisão celular, resultando
em
crescimento
filamentoso
como
resposta
à
deficiência de nitrogênio (Gimeno et al., 1992);
9 Os
produtos
principais
do
catabolismo
de
aminoácidos de cadeia ramificada, os chamados álcoois
superiores (óleo fúsel), são responsáveis pela transição
dimórfica das células (Dickinson, 1996).
DEFICIÊNCIA DE NITROGÊNIO
(Silva & Parazzi, 2002)
Tabela 1 . Crescimento em meio sólido com ausência
de nitrogênio.
Linhagens
Crescimento
Pseudohifas
células agrupadas
não presente
SM4
formação de cachos
não presente
SL3
pouco agrupadas
FL
presente
Pseudo-hifas
Crescimento Normal
Crescimento com pseudo-hifas
Pseudo-hifas
LEVEDURAS DIMÓRFICAS
Alterações na forma das células e no padrão de
divisão celular.
*Crescimento filamentoso (Pseudohifas).
¬ deficiência de nitrogênio
¬ produtos do catabolismo de aminoácido álcoois
superiores, “’oleo fúsel” - estresse metabólico
¬ mudanças genéticas
(Kuryama & Slaghter, 1995; Dickinson, 1996)
* Ocorrem principalmente:
¬ culturas em meio sólidos
¬ culturas contínuas.
COMPOSIÇÃO DO CALDO
Concentração de Potássio no caldo
Meio Ä caldo extraído da cana-de-açúcar
Concentração de K2O no caldo
Ä 1,44g/L - tratamento (T)
Ä 2,47g/L – tratamento (P1)
Ä 3,35g/L tratamento (P2).
Tabela 2. Resultados obtidos após fermentação.
ART vinho*
(g/100mL)
Massa Seca*
(g/100mL)
Ef.Fermentativa*
(%)
Lev/
Trat
P1
P2
T
P1
P2
T
P1
P2
T
FL
5,72
5,42
8,69
1,81
3,61
1,18
80,31
79,91
72,16
SL3
3,86
2,82
3,80
3,18
4,18
2,63
72,42 64,16 74,20
SM4
3,90
2,35
5,18
3,17
4,26
2,68
61,40
Média
4,49
3,53
5,89
2,72
4,02
2,16
71,38 66,82 70,84
56,41
* diferenças significativas a 5% de probabilidade entre tratamentos,
levedura e interação leveduras x tratamentos.
66,16
100
80
60
FL
40
SL3
SM 4
20
0
P1
P2
T
Eficiência Média de três ciclos fermentativos (%).
LEVEDURAS COM ALTO DESEMPENHO
FERMENTATIVO
h SUPORTAR OS ESTRESSES DA FERMENTAÇÃO
INDUSTRIAL COM RECICLO DE CÉLULAS.
9 ALTAS TEMPERATURAS
9 ELEVADOS TEORES ALCOÓLICOS
9 TRATAMENTO ÁCIDO
9 PARADAS (FALTA DE AÇÚCAR)
9 SULFITO, ALUMÍNIO, ETC
9 PRESSÃO OSMÓTICA
9 CONTAMINAÇÃO BACTERIANA
h SUSTENTAR ALTA VIABILIDADE CELULAR DURANTE
RECICLOS E APRESENTAR BOA EFICIÊNCIA EM
ETANOL.
Comentários Finais
ƒ Um pouco de estresse “é bom”
ƒ Leva à adaptação e tolerância pelas leveduras às
mudanças do meio
ƒ Células em proliferação são mais sensíveis
ƒ Afetam o desempenho do processo industrial
CLÓVIS PARAZZI
[email protected]