transferencia de embrioes em bovinos - TCC On-line
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UNIVERSIDADE TUIUTI DO PARANÁ NATHANAEL PEZARINI PEREIRA TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES EM BOVINOS CURITIBA 2012 NATHANAEL PEZARINI PEREIRA TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES EM BOVINOS Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Medicina Veterinária da Faculdade de Ciências Biológicas e de Saúde da Universidade Tuiuti do Paraná, como requisito parcial para obtenção do Grau de Médico Veterinário. Orientador: Prof. Dr. Welington Hartmann Orientador Profissional: Clovis Juk Fazzano CURITIBA 2012 Reitor Prof. Luiz Guilherme Rangel Santos Pró-Reitor Administrativo Sr. Carlos Eduardo Rangel Santos Pró-Reitora Acadêmica Profa Carmen Luiza da Silva Pró-Reitor de Planejamento e Avaliação Sr. Afonso Celso Rangel Santos Pró-Reitor de Pós-Graduação, Pesquisa e Extensão Prof a Roberval Eloy Pereira Diretor de Graduação Prof. João Henrique Faryniuk Coordenadora do Curso de Medicina Veterinária Prof a Ana Laura Angeli Coordenadora de Estágio Curricular do Curso de Medicina Veterinária Prof a Ana Laura Angeli Metodologia Cientifica Prof. Jair Mendes Marques CAMPUS: PROF. SYDNEI LIMA SANTOS Rua: Sydnei A. Rangel Santos, 238 – Santo Inácio CEP: 82010-330 – Curitiba - Paraná Fone: (41) 3331-7700 TERMO DE APROVAÇÃO NATHANAEL PEZARINI PEREIRA TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES EM BOVINOS Este trabalho de conclusão de curso foi julgado e aprovado para obtenção do título de Médico Veterinário por uma banca examinadora do Curso de Medicina Veterinária da Universidade Tuiuti do Paraná. Curitiba, 05 de dezembro de 2012 Universidade Tuiuti do Paraná Orientador Prof. Dr. Welington Hartmann Prof. Dra. Ana Laura Angeli Med. Vet. Residente Fernando Augusto Sella APRESENTAÇÃO O presente Trabalho de Conclusão de Curso (TCC) é composto de relatório de estágio, no qual estão descritas as atividades na área de clínica, cirurgia de grandes animais e biotecnologia da reprodução, acompanhadas durante o período de 01/08/2012 a 26/10/2012 em Araçatuba - São Paulo, e uma revisão de literatura sobre Transferência de Embriões. O estágio foi realizado em diversas localidades, cumprindo estágio curricular correspondente a 360 horas de atividades. Nesse trabalho foram descritas as atividades realizadas durante o estágio dando ênfase em Transferência de Embriões (TE). AGRADECIMENTO Primeiramente gostaria de agradecer a Deus por clarear minha mente no momento de escolha e me ajudar a escolher esta profissão de médico veterinário, à qual dediquei 5 anos de estudo e dedicarei minha vida inteira. Agradeço ao meu pai e a minha mãe por terem me apoiado em todo o momento e terem me incentivado a fazer o que eu mais gostava, é por eles que estou fazendo o que mais gosto e realizando um grande objetivo. Pelo esforço deles que por muitas vezes foi grande em me proporcionar tudo isso é que faz minha dedicação e meu esforço, e me proporcionam mais forças para continuar me dedicando. Pai e Mãe, muito obrigado por acreditarem nesse sonho e terem feito o possível e o impossível para realizá-lo. Aos meus irmãos que estavam sempre ao meu lado, e que nunca pouparam esforços para me ajudar de alguma forma, sempre me apoiando e me incentivando em todos os momentos, e que agora me deram uma alegria maior ainda pela chegada das minhas sobrinhas que mesmo ainda não sabendo, puderam me dar uma energia maior para o começo da minha caminhada. Não posso deixar de agradecer ao Clovis Juk Fazzano por ter me proporcionado o estágio, onde pude aprender muito na pratica o que foi me ensinado em sala de aula, e a toda sua equipe Fazz Embryo, que foram essenciais nesta etapa final. Agradeço também a todos os professores que passaram neste período de faculdade, nos passando todo seu conhecimento, e em especial agradeço meu orientador Welington Hartmann que além de um grande professor e orientador é um grande amigo. Não posso deixar de agradecer todos os meus colegas do curso que no decorrer da faculdade viraram verdadeiros amigos, tanto dentro como fora da sala de aula, espero encontrá-los agora como colegas de profissão. Enfim, a todos que de alguma forma contribuíram para minha formação pessoal ou acadêmica, meus sincero Obrigado! RESUMO O presente trabalho trata da biotecnologia da reprodução aplicada em bovinocultura denominada de Transferência de Embriões. Uma atividade que está se difundindo pelas diversas vantagens que apresenta, e por ela aumentando a eficiência reprodutiva de uma fazenda dedicada tanto a bovinocultura de leite como de corte. O avanço na superovulação de doadoras e a sincronização das receptoras deve ser levado em consideração por ser uma das etapas de grande importância no resultado final da Transferência de Embriões, o principal avanço é no emprego da TETF, que é a transferência de embriões em tempo fixo. Esta técnica permite a rápida multiplicação de animais considerados melhoradores, de acordo com as respectivas aptidões de cada raça. LISTA DE TABELAS TABELA 1 - ESQUEMA DE VACINAÇÃO DE DOADORAS E RECEPTORAS............ 33 TABELA 2 - CÓDIGO PARA CLASSIFICAÇÃO DOS EMBRIÕES............................... 58 TABELA 3 - RELAÇÃO DAS ATIVIDADES REALIZADAS NO ESTÁGIO.................... 69 TABELA 4 - PROTOCOLO DE SUPEROVULAÇÃO DA FAZENDA CRIOULA, APARTIR DO PRIMEIRO DIA DE APLICAÇÃO DO FSH........................ TABELA 5 - 72 DEFINIÇÕES DE CLASSIFICAÇÃO E QUALIDADE DE CL ATRAVÉS DO SEU TAMANHO.................................................................................. 75 LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 - FOTOMICROGRAFIA DE FOLÍCULOS PRIMORDIAIS (ACIMA) E FOLICULO PRIMARIO (ABAIXO)....................................................... FIGURA 2 - 19 FOLÍCULO SECUNDÁRIO (ESQUERDA) E UM FOLÍCULO TERCIÁRIO (DIREITA)........................................................................ 21 FIGURA 3 - AÇÃO HORMONAL NAS ONDAS FOLICULARES............................ 23 FIGURA 4 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA PRODUÇÃO DE BEZERROS ATRAVÉS DA TE........................................................... FIGURA 5 - 31 ABELHA TE DO CARMO, DOADORA DA FAZENDA GUADALUPE...................................................................................... 34 FIGURA 6 - RECEPTORAS DE EMBRIÕES......................................................... 37 FIGURA 7 - DESENHO ESQUEMÁTICO DA AÇÃO HORMONAL NA ONDA FOLICULAR EM BOVINOS SUPEROVULADOS.............................. FIGURA 8 - PROTOCOLO SUPEROVULATÓRIO P-36 UTILIZADOS EM VACAS ................................................................................................ FIGURA 9 - 39 42 PROTOCOLO DE SINCRONIZAÇÃO DE ESTRO EM RECEPTORAS UTILIZANDO APENAS PGF2α E OBSERVAÇÃO DE CIO................................................................................................. FIGURA 10 - 45 PROTOCOLO DE SINCRONIZAÇÃO DE ESTRO EM RECEPTORAS ASSOCIANDO ESTRADIOL, PREGESTERONA, PROSTAGLANDINA E ECG............................................................... FIGURA 11 - MATERIAIS UTILIZADOS PARA TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES......................................................................................... FIGURA 12 - 47 50 COLETA DE EMBRIÃO TRANSCERVICAL (ESQUEMÁTICO)................................................................................ 52 FIGURA 13 - LAVAGEM UTERINA PARA COLETA DE EMBRIÕES..................... 53 FIGURA 14 - LAVAGEM DO FILTRO PARA PROCURA DAS ESTRUTURAS.................................................................................... FIGURA 15 - FIGURA 16 - 54 EMBRIÕES EM AUMENTO DE 80 VEZES, MÓRULA, BLASTOCISTO E BÇASTOCISTO EXPANDIDO.............................. 55 10 GOTAS DE HOLDING PARA LAVAGEM DOS EMBRIÕES......... 56 FIGURA 17 - ESTÁGIO DE DESENVOLVIMETO EMBRIONÁRIO, CONSIDERANDO-SE OS CÓDIGOS RECOMENDADOS PELA IETS (1998).......................................................................................... 59 FIGURA 18 - PALHETA COM O EMBRIÃO.............................................................. 62 FIGURA 19 - FOTO ILUSTRATIVA DO ÚTERO E OVÁRIO, ONDE PODE-SE OBSERVAR OS LOCAIS DE DEPOSIÇÃO DO EMBRIÃO NO CORNO UTERINO IPSILATERAL DO CL.......................................... 63 FIGURA 20 - COLETA DE SANGUE PARA EXAME DE BRUCELOSE.................. 65 FIGURA 21 - PATOLOGIA ESPERMÁTICA REALIZADA NO LABORATÓRIO DA FAZZEMBRYO..................................................................................... FIGURA 22 - 66 NECROPSIA DE UMA BEZERRA DA FAZENDA GUADALUPE....................................................................................... 67 FIGURA 23 - EXAME DE ULTRASSONOGRAFIA.................................................. 68 FIGURA 24 - INOVULAÇÃO..................................................................................... 68 FIGURA 25 - QUATRO NOVILHAS DA RAÇA SINDI MISTURADA NAS NOVILHAS DA RAÇA NELORE........................................................... FIGURA 26 - PALHETA 0,25 COM O EMBRIÃO, PRONTA PARA INOVULAR........................................................................................... FIGURA 27 - APLICADOR DEVIDAMENTE MONTADO, PRONTO ESTUFA PORTÁTIL UTILIZADA PARA TRANSPORTE 76 DE EMBRIÕES........................................................................................... FIGURA 29 - 74 PARA INOVULAR........................................................................................... FIGURA 28 - 71 77 FICHA COM A RELAÇÃO DOS EMBRIÕES ONDE ERAM ANOTADAS AS INFORMAÇOES SOBRE AS RECEPTORAS........ 79 LISTA DE ABREVIATURAS BE – Benzoato de Estradiol CE – Cipionato de Estradiol cm – Centímetro D - Dia ECC – Escore de Condição Corporal eCG – Gonadotrofina Coriônica Eqüina FIV – Fertilização in vitro FSH – Hormônio Folículo Estimulante GnRH – Hormônio Liberador de Gonadotrofinas IA – Inseminação Artificial IATF – Inseminação Artificial em Tempo Fixo IETS – International Embryo Transfer Society Kg - Quilograma LH – Hormônio Luteinizante E2 – Estrógeno P4 – Progesterona SNC – Sistema Nervoso Central mg – Miligrama ml – Mililitro µl - microlitro mm – milímetro h - horas ºC – Graus Celsius OPU – Ovum Pick Up PBS – Phosphate Buffer Saline PGF2α – Prostaglandina F2α PO – Puro de Origem SOV - Superovulação TE – Transferência de Embrião TETF – Transferência de Embrião em Tempo Fixo UI – Unidade Internacional US – Ultrassom CL – Corpo Lúteo ZP – Zona Pelúcida ANCP - Associação Nacional de Criadores e Pesquisadores ABCZ - Associação Brasileira dos Criadores de Zebu IBR - rinotraqueíte infecciosa bovina BVD - diarreia viral bovina MAPA - Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento SFB - Soro Fetal Bovino SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO............................................................................................. 15 2 DESCRIÇÃO DO LOCAL DE REALIZAÇÃO DO ESTÁGIO.................. 16 3 FISIOLOGIA DO CICLO ESTRAL............................................................. 18 3.1 FOLICULOGÊNESE.................................................................................... 18 3.2 HORMÔNIOS DA REPRODUÇÃO............................................................ 23 3.2.1 Hipotálamo.................................................................................................... 23 3.2.2 Hipófise......................................................................................................... 24 3.2.3 Gônadas....................................................................................................... 25 3.2.4 Útero............................................................................................................. 26 3.3 CICLO ESTRAL........................................................................................... 26 3.3.1 Proestro....................................................................................................... 27 3.3.2 Estro............................................................................................................ 27 3.3.3 Metaestro.................................................................................................... 28 3.3.4 Diestro......................................................................................................... 28 4 TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES.......................................................... 29 4.1 IMPORTÂNCIA DA TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES......................... 29 4.2 MANEJO SANITÁRIO RELACIONADO A TE.......................................... 32 4.3 SELEÇÃO DE DOADORAS...................................................................... 33 4.4 SELEÇÃO DE RECEPTORAS.................................................................. 36 4.5 SUPEROVULAÇÃO DAS DOADORAS.................................................... 38 4.6 SINCRONIZAÇÃO DE RECEPTORAS..................................................... 44 4.7 INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL DAS DOADORAS....................................... 47 4.8 MATERIAL UTILIZADO PARA TE.............................................................. 48 4.9 COLETA DE EMBRIÕES............................................................................. 50 4.10 MANIPULAÇÃO DOS EMBRIÕES............................................................. 53 4.10.1 Classificação dos Embriões......................................................................... 56 4.11 TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES (INOVULAÇÃO)............................... 61 5 DESCRIÇÃO DAS ATIVIDADES REALIZADAS NO ESTÁGIO............ 64 5.1 ATIVIDADES RELACIONADAS COM TRANSFERENCIA DE EMBRIÕES................................................................................................... 70 CONCLUSÃO............................................................................................... 80 REFERÊNCIAS............................................................................................................ 81 6 15 1. INTRODUÇÃO A pecuária de corte no Brasil está alcançando destaque internacional devido à alta qualidade genética dos rebanhos aliada aos avanços tecnológicos de manejo sanitário e nutricional. A Transferência de Embriões (TE) permite avanços mais rápidos de melhoramento animal a partir da superovulação de vacas doadoras de alta qualidade genética, diminuindo o intervalo entre gerações e permitindo a utilização de animais de grau de sangue elevado na pecuária de corte brasileira. Este processo representa um grande avanço em qualidade e está se difundindo a passos largos entre os pecuaristas, sob a coordenação de médicos veterinários habilitados. O melhoramento genético, baseado na seleção de indivíduos com maior desenvolvimento ponderal, rendimento de carcaça, produção leiteira, capacidade de conversão alimentar, precocidade, entre outros, possibilita o aumento da produtividade de carne e de leite. Assim, a eficiência da multiplicação de animais superiores, por biotécnicas da reprodução, proporciona maior retorno econômico à atividade. A TE está cada dia mais avançada, e os estudos para que ocorram melhorias nesta técnica não param, por isso ela é uma biotecnologia que ainda irá se expandir na bovinocultura nacional. Através do presente este tema foi abordado com mais detalhes, e também suas atualizações para a melhoria da técnica. 16 2. DESCRIÇÃO DO LOCAL DE REALIZAÇÃO DO ESTÁGIO O estágio foi realizado na empresa Fazzembryo Produção e Reprodução Ltda., com sede na cidade de Araçatuba - SP, no período de 01/08/2012 a 26/10/2012, perfazendo um total de 360 horas, sob a supervisão do Médico Veterinário Clovis Juk Fazzano. Além do médico veterinário orientador, a empresa conta com três outros médicos veterinários, uma zootecnista, a qual fica encarregada do planejamento dos acasalamentos utilizados em estação de monta e controle zootécnico credenciado pela ANCP (Associação Nacional de Criadores e Pesquisadores) e uma auxiliar administrativa. A empresa foi fundada em 2004 pelo Médico Veterinário Clovis Juk Fazzano, criada inicialmente com o objetivo de atender criadores utilizando-se de técnicas em transferência de embriões. Atualmente a empresa presta serviço especializado em diversas áreas como: coleta e congelamento de sêmen, atendimento clínico e cirúrgico, avaliação reprodutiva por ultrassonografia em bovinos, ovinos e equinos, monitoramento de estação de monta por monta natural, inseminação artificial, inseminação artificial em tempo fixo, transferência de embriões em tempo fixo, controle sanitário, monitoramento de programas de melhoramento genético, sendo referência neste segmento. Algumas atividades são terceirizadas, como aspiração folicular (OPU), fertilização in vitro (FIV) e maturação in vitro (MIV), que são realizadas por laboratórios terceirizados, que possuem excelentes históricos de resultados. 17 Durante o período de estágio houve oportunidade de acompanhar diversas atividades que englobam a área da reprodução animal, clinica e cirúrgica, aplicadas em diversas propriedades na região Noroeste de São Paulo e Leste do Mato Grosso do Sul, desde o pequeno produtor que está iniciando na atividade pecuária, ao produtor que direciona seu foco na produção de carne diretamente ao frigorífico e aos grandes produtores, com nome já consolidado na pecuária nacional, de animais de elite (por exemplo: Katayama Agropecuária, Agropecuária Jacarezinho Ltda., Fazenda Guadalupe, Fazenda São Pedro, Nelore Zeus, Fazenda Bonsucesso, Fazenda Bela Alvorada, Agropecuária Onix, Fazenda Terra Boa, Fazenda Crioula, entre outras). 18 3. FISIOLOGIA DO CICLO ESTRAL 3.1 FOLICULOGÊNESE A foliculogênese pode ser definida como o desenvolvimento folicular desde o estágio primordial até o estágio pré-ovulatório, envolvendo as etapas de ativação, crescimento e maturação. O desenvolvimento folicular é controlado por uma complexa interação entre fatores endócrinos, parácrinos e autócrinos ainda na fase fetal (MAGALHÃES et al., 2012). As fêmeas ruminantes domésticas são poliéstricas, anuais apresentando estros em intervalos mais ou menos regulares de 21 dias. Durante o ciclo estral ocorre uma cadeia de eventos que se repetem até o impedimento da luteólise pela gestação. Nas fêmeas ruminantes, o processo de foliculogênese (ativação, crescimento/maturação folicular) tem início com a formação dos folículos primordiais nas suas gônadas (GONÇALVES et al., 2008). Da reserva de folículos primordiais formadas durante a vida fetal ou logo após nascimento, alguns folículos crescem continuamente durante a vida do animal, ou pelo menos até a reserva se exaurir. Quando um determinado folículo deixa essa reserva, ele cresce até a ovulação ou até que ocorra sua degeneração, o que acontece com a maioria dos folículos (HAFEZ e HAFEZ, 2004). Durante muitos anos, acreditou-se que a reserva folicular ovariana fosse formada na embriogênese e que não haveria a possibilidade de renovação. Porém, com o avanço da ciência e consequente aumento de metodologias para o estudo da foliculogênese, a teoria se tornou alvo de grande controvérsia. Demonstrou-se, 19 então, a possibilidade de renovação, todavia ainda não se sabe se ela realmente ocorre naturalmente e em quais condições poderia ocorrer (VIANA et al., 2009). Embora o mecanismo de recrutamento não esteja completamente elucidado, acredita-se que o numero de folículos primordiais recrutados é controlado por fatores intraovarianos (HAFEZ e HAFEZ, 2004), no folículo primordial (Figura 1), já ocorre a esteroidogênese, todavia ela é independe de gonadotropinas (LH, FSH). FIGURA 1. Fotomicrografia de folículos primordiais (acima) e folículo primário (abaixo). FONTE: UNIFESP, 2008. O crescimento ou ativação do folículo primordial caracteriza a fase de transição para folículo primário. Esta fase é acompanhada pela proliferação e diferenciação de células da granulosa, cuja forma anteriormente pavimentosa 20 adquire conformação cubóide (SENEDA et al., 2010). Há o início da formação da zona pelúcida (camada acelular constituída de glicoproteínas oriunda da secreção das células da granulosa e localizada entre o oócito e as células foliculares) (Figura 1), que permanece por todo o desenvolvimento folicular até a fase inicial de desenvolvimento embrionário. Com o aumento do oócito, a caracterização da zona pelúcida, as primeiras células da teca e pelo menos duas camadas da granulosa, o folículo secundário (Figura 2) encontra-se constituído. Ao fim deste estágio, a ação gonadotrófica já pode ser detectada, sendo então iniciados os efeitos amplos do FSH e LH (SENEDA et al., 2010). Segundo o crescimento folicular, há a formação da cavidade antral, constituída pela transudação do líquido folicular, originado principalmente do plasma periférico, através da membrana basal folicular (HAFEZ e HAFEZ, 2004). Os processos de desvio e de dominância folicular (quando o folículo de maior tamanho adquire a capacidade de inibir o crescimento dos demais (FERREIRA, 2010) ocorrem após esses importantes eventos fisiológicos. Uma elevação nas concentrações plasmáticas de FSH estimula o recrutamento folicular e a emergência da onda folicular (BURATINI JUNIOR, 2006). O estágio mais avançado do crescimento folicular está bem caracterizado pela presença de duas ou três ondas de crescimento folicular durante cada ciclo estral, as quais já são observadas antes mesmo da puberdade e durante os períodos de anestro (OLIVEIRA et al., 2011). Cada onda de crescimento folicular em bovinos é caracterizada pelo recrutamento de um grupo de folículos (emergência), 21 os quais continuam a crescer até aproximadamente 6 a 8 mm de diâmetro (Bos indicus e Bos taurus, respectivamente), quando passam pela seleção folicular. FIGURA 2: Folículo secundário (esquerda) e um folículo terciário (direita). FONTE: UNIFESP, 2008. O folículo selecionado para dominância parece ser o primeiro a desenvolver receptores para LH nas células da granulosa, o que ocorre quando atinge mais ou menos 8-9mm de diâmetro (FERREIA, 2010). O início da dominância ocorre no primeiro dia do ciclo estral em que o folículo dominante apresenta 1-2mm a mais no diâmetro em relação ao segundo maior folículo da onda folicular e cessa o crescimento dos folículos subordinados da mesma onda. Na fase final de desenvolvimento folicular, após a divergência folicular, é observada a expressão de receptores de LH da camada de células da granulosa 22 (GONÇALVES et al., 2008). O folículo dominante secreta mais que 80% do estradiol e também é responsável por 55% da inibina liberada na circulação (GONÇALVES et al., 2008). As mudanças da arquitetura intracelular desses folículos, também refletem a alta capacidade de produção de hormônios, já que apresentam três vezes mais área de retículo endoplasmático liso, aumento de cinco vezes na área do sistema de Golgi e o dobro de membranas mitocondriais, quando comparados com folículos antrais pequenos (GONÇALVES et al., 2008). A ovulação do folículo dominante selecionado requer condições endócrinas favoráveis. Se a regressão luteal ocorre ainda durante a fase de crescimento do folículo dominante, a queda dos níveis de progesterona permite o aumento da frequência dos pulsos de LH, estimulado pelo aumento da produção de estradiol do folículo dominante. O aumento da pulsatilidade do LH culmina então no pico de LH necessário à ovulação e à maturação oocitária com retomada da meiose que havia sido interrompida no início do desenvolvimento folicular. Caso não ocorra luteólise enquanto o folículo dominante permanece viável, ele regride e deixa de inibir a secreção de FSH, possibilitando a emergência de uma nova onda folicular (Figura 3) (BURATINI JUNIOR, 2006). 23 FIGURA 3. Ação dos hormônios nas ondas foliculares. FONTE: TECNOPEC, 2010. 3.2 HORMÔNIOS DA REPRODUÇÃO Um hormônio é classicamente definido como uma substância química fisiológica, orgânica, sintetizada e secretada por uma glândula endócrina sem ducto e transportada via corrente circulatória. Os hormônios tem a ação básica de inibir, estimular ou regular a atividade funcional de seus órgãos ou tecidos-alvo. Entretanto, órgãos como o útero e o hipotálamo produzem hormônios que não se encaixam nessa definição clássica (HAFEZ e HAFEZ, 2004). 3.2.1 Hipotálamo O hipotálamo é uma combinação dos centros neurológico e endócrino. Constitui o local em que o sistema nervoso faz conexão com o sistema endócrino. Compõe-se de mais de doze diferentes núcleos (grupos de neurônios) e áreas. Suas 24 funções são a regulação do sistema endócrino, da temperatura corporal, do apetite, do comportamento sexual, das reações defensivas (medo, raiva), dos ritmos de atividade e do sistema vegetativo (REECE, 2006). O hipotálamo produz o hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) pelas células nervosas (neurônios) dispensas nas áreas periventriculares, preópticas e mediais do hipotálamo, além de diversos outros fatores liberadores. O GnRH ocupa papel central na função reprodutiva de bovinos e, uma vez liberado dos neurônios, chega a hipófise através de um sistema peculiar de vasos denominado “SistemaPorta-Hipotalâmico-Hipofisário”, que tem como característica um primeiro plexo capilar localizado no hipotálamo entre a artéria hipofisária superior e os longos vasos portais (FERREIRA, 2010). Em resposta à estimulação nervosa, pulsos de GnRH são liberados no sistema porta-hipotálamo-hipofisário promovendo a liberação de LH e FSH (HAFEZ e HAFEZ, 2004). 3.2.2 Hipófise Hipófise é uma estrutura altamente complexa formada por grupos celulares que sintetizam diferentes tipos de hormônios. Está localizada diretamente abaixo do hipotálamo, sendo constituída de duas partes, adenohipófise e neurohipófise (FERREIRA, 2010). O GnRH é transportado pelo sistema porta hipotálamo-hipofisário ao lobo anterior da hipófise, seu órgão alvo, estimulando as células da pituitária a secretar o Hormônio Folículo Estimulante (FSH) e o Hormônio Luteinizante (LH). O GnRH, FSH e LH não são secretados em níveis constantes, mas em uma série de pulsos. O FSH 25 estimula o desenvolvimento dos folículos ovarianos, o LH estimula sua maturação, produção de estradiol e ovulação. O LH dá suporte à formação e à função inicial do corpo lúteo (INTERVET INTERNACIONAL, 2007). 3.2.3 Gônadas O ovário é a gônada feminina que desempenha duas funções prioritárias para o sistema reprodutivo de fêmeas, sendo responsável pela diferenciação e liberação de um oócito maturo para fecundação (Saraiva et al., 2010), além da síntese e secreção de hormônios e fatores de crescimento. Tais substâncias produzidas são essenciais para o desenvolvimento folicular, ciclicidade, bem como manutenção e funções do trato reprodutivo (Saraiva et al., 2010). Estrógeno (E2) e progesterona (P4) são os hormônios produzidos no ovário a partir de colesterol, respectivamente pelo folículo e corpo lúteo, sob ação das gonadotrofinas hipofisárias (FERREIRA, 2010). O Estrógeno atua no desenvolvimento sexual (dos órgãos sexuais e características sexuais secundárias), sobre o endométrio, promovendo desenvolvimento glandular e maior fluxo sanguíneo local, sobre as glândulas mamárias promovendo desenvolvimento glandular, sobre o miométrio estimulando a contratilidade no parto em sinergismo com a PGF2α e sobre a vagina e vulva aumentando a vascularização (PALHANO, 2008). Atua no SNC induzindo comportamento de cio na fêmea, efeito de retroalimentação tanto negativos quanto positivos no controle da liberação de LH e FSH (HAFEZ e HAFEZ, 2004). 26 A principal função do Corpo Lúteo (CL) é a secreção de progesterona (P4), que prepara o útero para o início e manutenção da gestação (CUNNINGHAM, 2004), provoca a inibição do cio e do pico pré-ovulatório do LH quando em níveis elevados (HAFEZ e HAFEZ, 2004), bloqueia a secreção de GnRH (hipotálamo) e FSH (hipófise) (FERREIRA, 2010). As células da granulosa também produzem inibina. Nem todos os efeitos deste hormônio são compreendidos, mas seu nome é derivado do feedback negativo que provoca na liberação de FSH da glândula pituitária, controlando assim o desenvolvimento dos folículos (INTERVET INTERNACIONAL, 2007) 3.2.4 Útero Segundo Palhano (2008) a prostaglandina (PGF2α) é um hormônio uterino que promove luteólise, possibilitando assim o início de um novo ciclo, aumenta a motilidade uterina e estimula a contração miometrial no trabalho de parto (efeito ocitótico), facilita o transporte dos espermatozóides e ovócito auxiliando na concepção. 3.3 CICLO ESTRAL As fases do ciclo estral consistem no proestro, estro, metaestro e diestro. Uma fêmea não gestante irá exibir tais fases de modo sequencial, começando com o estro (REECE, 2006). O ciclo é mais bem descrito em termos de função ovariana, como consistindo em dois componentes, a fase folicular (correspondente do proestro e ao estro) e a 27 fase lútea (metaestro e diestro). O estro comportamental ocorre em direção ao final da fase folicular (BALL e PETERS, 2006). 3.3.1 Proestro Fase em que ocorre a diminuição da produção de progesterona pelo CL devido à sua luteólise. Como consequência da diminuição dos níveis de progesterona, ocorre redução no feedback negativo a nível de hipotálamo e hipófise com posterior descarga dos hormônios GnRH, FSH e LH. Há também um aumento na concentração de estradiol, que alcança o máximo no dia do estro (ALBUQUERQUE et al., 2004; HAFEZ e HAFEZ, 2004). Essa fase tem duração de aproximadamente 3 dias. 3.3.2 Estro É a fase mais conhecida do ciclo estral por ser caracterizada pelos visíveis sintomas comportamentais de cio e receptividade sexual (locomoção, expressão vocal, nervosismo e esforço para montar outros animais), o estro representa o dia do cio e sua duração pode variar de 6-21hrs (FERREIRA, 2010). O principal sinal do estro é o da vaca em estação se deixando montar por um touro ou por outras vacas do rebanho (BALL e PETERS, 2006). O folículo de Graaf secreta estrógenos, particularmente o 17β-estradiol. Os níveis crescentes de estradiol induzem o cio comportamental e, em combinação com o declínio nos níveis de P4, acionam o pico de LH, se um folículo estiver presente, o pico de LH provocará a ovulação em cerca de 24 horas (HAFEZ e HAFEZ, 2004). 28 3.3.3 Metaestro Fase em que o folículo maduro antral se rompe, eliminando seu conteúdo de liquido folicular na cavidade abdominal e liberando o oócito não fertilizado, ainda cercado pelas células do cúmulos (BALL e PETERS, 2006). Segundo Bowen e Burghardt (2000) e Senger (2003), metaestro em bovinos é considerado o período que vai do final do cio até o quinto dia do ciclo estral (FERREIRA, 2010). Após a ovulação tem início a formação do CL, começando com o corpo hemorrágico, que nada mais é do que o CL em sua fase bem inicial e este não responde à PGF2α por falta de receptores específicos para estes hormônios (FERREIRA, 2010). 3.3.4 Diestro Diestro é o período em que o CL está funcionalmente ativo produzindo P4. Esta fase vai do 5º-17º dia de ciclo estral (fase de maior duração do ciclo estral), sendo a única em que se encontra CL e, portanto, a única em que pode haver resposta à PGF2α (FERREIRA, 2010). À medida que há progressão do metaestro para o diestro, a secreção de progesterona aumenta e alcança um platô relativo durante o diestro. Em geral, uma relação hipofisário-ovariana opera de modo que os hormônios da hipófise são necessários à atividade do CL (efeito luteotrópico). A progesterona exerce um efeito de retroalimentação negativa sobre a secreção hipofisária de LH; consequentemente, durante o diestro, a secreção de LH é reduzida (RECEE, 2006). 29 4. TRANFERÊNCIA DE EMBRIÕES 4.1 IMPORTÂNCIA DA TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES O bom desempenho reprodutivo é requisito essencial para garantir máxima produção do rebanho bovino com retorno econômico satisfatório. Neste contexto, a incorporação estratégica de programas de reprodução assistida na rotina da fazenda melhora os resultados reprodutivos e a rentabilidade de propriedades produtoras de leite e carne (BARUSELLI et al., 2012). O principal objetivo da implantação dos programas de transferência de embriões em rebanhos de corte é o melhoramento genético (BÓ et al., 2012 a). As últimas décadas foram marcadas por avanços significativos no entendimento dos processos moleculares e celulares que regulam o desenvolvimento e as funções fisiológicas, assim como os mecanismos de morte celular e doenças. Com base nesse avanço dos conhecimentos foi possível desenvolver e/ou aprimorar diferentes tecnologias que passaram de instrumentos de suporte a pesquisas em laboratório para aplicações clínicas em animais e humanos (BORDIGNON, 2012). Segundo Santos (2011), a pecuária brasileira vem passando por modificações com objetivo de atender às demandas do mundo globalizado. Nesse contexto, as diversas biotécnicas da reprodução (inseminação artificial convencional e em tempo fixo, transferência de embriões, punção folicular e fertilização in vitro) apresentam-se como importantes ferramentas nos programas de melhoramento genético. 30 A transferência de embriões (TE) é uma biotécnica que permite recolher embriões de uma fêmea doadora e transferi-los para fêmeas receptoras com a finalidade de completarem o período de gestação. A TE em bovino continua sendo um dos métodos mais econômicos e práticos para a obtenção do aumento das taxas de reprodução de fêmeas com alto valor genético, tanto em rebanhos de leite e de corte, sua importância básica para a produção animal consiste na possibilidade de uma fêmea produzir um numero de descendentes muito superior ao que seria possível obter fisiologicamente durante sua vida reprodutiva (GONÇALVES et al., 2008). De acordo com Ball & Peters (2006), a TE oferece um meio de transporte de criação entre países com menores gastos e sem o trauma associado com o transporte de animais adultos. Os animais transportados como embriões e se desenvolvendo em receptoras nos países de destinação tendem a se adaptar mais prontamente às condições locais do que aqueles transportados como adultos. Uma fêmea bovina (doadora) pode aumentar o número de descendentes produzidos em sua vida concebendo repetidamente, recuperando os embriões no inicio da prenhez e transferindo-os para o trato reprodutivo de outras fêmeas (receptoras) para completar a gestação (Figura 4) (HAFEZ e HAFEZ, 2004). 31 FIGURA 4: Representação esquemática da produção de bezerros através da TE. FONTE: CPT cursos presenciais, 2011. A TE permite a introdução de material genético nos plantéis de alto valor zootécnico e comercial sem oferecer maior risco de contaminação do rebanho por enfermidades infectocontagiosas, quando comparada com o risco imposto pela aquisição de animais (GONÇALVES et al., 2008). 32 4.2 MANEJO SANITÁRIO RELACIONADO A TE O controle sanitário dos animais envolvidos nos trabalhos de TE compõe-se de exames, vacinações e controle de endo/ectoparasitas, de forma a reduzir os riscos de perdas embrionárias por estresse e doenças reprodutivas, e acima de tudo garantir ao feto o desenvolvimento em um ambiente saudável no útero da receptora (SANTOS, 2011). A ocorrência de doenças da esfera reprodutiva, tais como brucelose, tricomonose, campilobacteriose, leptospirose, rinotraqueíte infecciosa (IBR) e a diarréia viral bovina (BVD), pode também comprometer o desempenho reprodutivo do rebanho de cria. Nesse aspecto, deve-se observar a importância das doenças infecciosas de origens bacteriana, virótica e parasitárias que podem impedir a fecundação, causar abortos ou produzir bezerros com peso inferior à média. Portanto, como preparação à prevenção dessas doenças, deve ser adotado um programa de controle sanitário do rebanho (VALLE et al., 2000). Higiene e bom manejo devem ser sempre praticados para minimizar o risco de introdução de infecção, e os procedimentos de vacinação (Tabela 1) apropriados devem ser rigorosamente seguidos (BALL e PETERS, 2006). O primeiro cuidado sanitário, no início de qualquer trabalho deve ser com os exames de brucelose e tuberculose, principalmente no ato de aquisição de receptoras provenientes de diferentes rebanhos, que na maioria das vezes não tem um controle sanitário tão rigoroso para tal trabalho, é interessante que se tenha uma área de quarentena para os animais adquiridos de outras propriedades para que se evite a introdução de doenças no rebanho de animais de elite (SANTOS, 2011). 33 TABELA 1 - ESQUEMA DE VACINAÇÃO DE DOADORAS E RECEPTORAS DOENÇAS VACINAÇÃO Febre Aftosa 2x ao ano de acordo com o MAPA Clostridioses (Carbúnculo e Tétano) 1ª dose + reforço anual Raiva 1ª dose + reforço anual IBR/BVD 1ª + 2ª dose (após 21 dias) + reforço anual Leptospirose Rotavirose + Pneumoenterite reforço a cada 6 meses (após 2 vacinações) Receptoras: 1ª dose 30 dias antes do parto 2ª dose 30 dias depois do parto IBR:Rinotraqueíte Infecciosa Bovina BVD: Diarréia Viral Bovina MAPA: Ministério da Agricultura,Pecuária e Abastecimento FONTE: CPT cursos presenciais, 2011 4.3 SELEÇÃO DE DOADORAS É um dos pontos críticos da TE, haja vista a obrigatoriedade de utilizar animais sem distúrbios reprodutivos, com ciclo estral regular e em adequado estado nutricional (Figura 5). Antes de iniciar o tratamento hormonal para induzir a superovulação é recomendável verificar a identificação correta da doadora e obter uma amostra de sangue ou do pelo do animal para tipificação, necessária para uma posterior comprovação da descendência. Nesse sentido, é necessário inseminar as doadoras somente com sêmen de touros tipificados (GONÇALVES et al., 2008). De acordo com WILLIAMS (2001), a inclusão das doadoras num programa de TE nunca deve ser inferior aos 60 dias pós-parto e, mesmo assim, deve ser precedida de rigorosa observação da regularidade de, pelo menos, dois ciclos estrais consecutivos. Outro aspecto a ser considerado é o bem-estar das doadoras, 34 porque em situações de estresse não respondem ao tratamento superovulatório ou fazem de forma muito deficiente. FIGURA 5: Abelha TE do Carmo, doadora da Fazenda Guadalupe. FONTE: Fazenda Guadalupe, 2012. Exames ultrassonográficos do trato reprodutivo são de grande importância para determinar se um animal está apto para reprodução, qual a fase do ciclo estral ou se apresenta alguma desordem do trato reprodutivo (GOUVEA, 2011). Segundo Gonsalves et al. (2002), as novilhas púberes devem ser incluídas num programa de TE desde que tenham adquirido massa muscular representativa de seu peso adulto e apresentem desenvolvimento anátomo-fisiológico que permita a realização dos procedimentos necessários para coleta de embriões. Para Andrade et al. (2002), apesar das novilhas mostrarem reação satisfatória ao estímulo superovulatório, algumas vezes existe dificuldade de introduzir o cateter por via transcervical, o que pode comprometer a eficiência da TE em algumas ocasiões, 35 mesmo assim, a utilização de novilhas em programas de TE é estimulado porque reduz o intervalo entre gerações e acelera o melhoramento genético. As doadoras devem estar sadias, em bom estado corporal preferencialmente fora de lactação (seca). Animais com baixo escore corporal não respondem adequadamente a tecnologias reprodutivas, em geral. Contudo, quando tratamos de doadoras, o problema, na maioria das vezes, é a obesidade. O que também compromete a obtenção de resultados. Devendo-se evitar trabalhar com essas duas categorias animais. Também deverão estar vazias, com mais de 45 dias de parição, apresentando ciclo estral normal (observação de 2 cios recentes com intervalo de 19-21 dias), com ausência de infecções e sem histórico de problemas reprodutivos (SANTOS, 2011). Segundo Gonçalves et al. (2008), não é recomendado superovular as doadoras antes dos 60 dias, mesmo porque a maior taxa de ovulação com embriões viáveis é obtida quando a superovulação é iniciada entre o 60º e o 90º dia após o parto. Finalmente, a meticulosa atenção dada aos exames clínicos e a avaliação zootécnica, deve ser dada também ao controle sanitário. As principais doenças que influenciam o sucesso da TE são: campilobacteriose, leptospirose, brucelose, tricomonose, leucose, rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR), vírus da diarréia bovina (BVD), neosporose, parasitoses, além das consideradas exóticas dependendo o país que se trabalha (RUMPF et al., 2007). 36 4.4 SELEÇÃO DE RECEPTORAS As receptoras constituem uma parte fundamental de um programa de TE porque necessitam conceber e levar a gestação a termo. A aquisição desses animais é de custo elevado, a manutenção é dispendiosa e o estado de saúde pode ser critico para o êxito de TE. As novilhas e as fêmeas multíparas que apresentem ciclo estral regular, que tenham parido há no mínimo 60 dias, que o puerpério tenha decorrido normalmente e que estejam livres de doenças e anomalias do trato reprodutivo podem ser selecionadas como receptoras de embriões (GOLÇALVES et al., 2008). Para SCARPELLI (2003), o ideal é que sejam aproveitadas fêmeas oriundas da mesma propriedade em razão de se conhecer o histórico reprodutivo de cada indivíduo. Todavia, na necessidade de se comprar fêmeas destinadas a receptoras, deve-se ter a precaução de adquirir fêmeas com cria ao pé ou novilhas em bom estado de desenvolvimento corporal e com ciclo estral regular. Apesar de não ser requerida uma avaliação de qualidade zootécnica da receptora é fundamental que alguns critérios de seleção sejam adotados, tais como: possuir porte compatível com a raça do embrião a ser transferido garantindo uma gestação e parto normal, livre de auxílio obstétrico. Bem como apresentar boa habilidade materna e rusticidade (Figura 6) (ANDRADE et al., 2002). 37 FIGURA 6: Receptoras de embriões. De forma geral, uma doadora produz, em média, quatro a cinco embriões de boa qualidade em cada coleta. Em consequência, aproximadamente 10 receptoras deverão ser preparadas (sincronização do cio) para obter aproximadamente seis receptoras (sincronizadas com o cio da doadora) aptas para receber um embrião (ALVAREZ, 2009). A seleção final de uma fêmea como receptora de embriões somente deve ocorrer no dia da transferência em função, principalmente, dos sintomas de estro evidenciados após a sincronização e da avaliação do CL cíclico (GONÇALVES et al., 2008). 38 4.5 SUPEROVULAÇÃO DAS DOADORAS A seleção genética em bovinos proporcionou animais com alta produção de leite e carne, no entanto, em condições naturais, os animais conseguem produzir, no máximo, uma cria por ano. A multiplicação mais efetiva de animais geneticamente superiores implica na necessidade de promover múltiplas ovulações como ferramenta importante para aumentar a produção de embriões. Quanto maior o número de embriões viáveis produzidos, maior será o número de crias geradas por ano (AMARAL et al., 2004). Denomina-se superovulação ao aumento do número fisiológico de ovulações próprias da espécie, provocada mediante a administração de gonadotrofinas. No bovino, se considera que houve resposta ao tratamento quando se produzem mais de duas ovulações. A superovulação deve complementar-se com um regime ótimo de inseminação artificial, utilizando sêmen de ótima qualidade (CABODEVILA & TORQUATI, 2001). De acordo com Ferreira (2010), o princípio da superovulação envolve fornecer à fêmea maior nível de FSH que o normal, para que mais folículos sejam recrutados e selecionados. A superovulação é usada na técnica de TE e consiste na estimulação hormonal dos ovários da fêmea bovina doadora de embriões, com objetivo de induzir o desenvolvimento e a maturação de vários folículos simultaneamente, de modo que, após a indução da luteólise, ocorram múltiplas ovulações durante o mesmo cio. A ovulação hormonal induzida requer uma prematura luteólise. 39 Segundo Santos (2011), os protocolos de sincronização e superovulação usados atualmente são baseados em dispositivos que liberam progesterona combinados com estradiol ou GnRH e FSH, que controlam a dinâmica das ondas foliculares e a ovulação (Figura 7). FIGURA 7: Desenho esquemático da ação hormonal na onda folicular em bovinos superovulados. FONTE: TECNOPEC, 2010. Os tratamentos superovulatórios tradicionais consistiam de uma única administração de gonadotrofina coriônica equina (eCG) ou duas injeções diárias de extratos de FSH da pituitária por 4 ou 5 dias (BÓ et al., 2012 a). 40 O hormônio folículo estimulante (FSH) tem função essencial no desenvolvimento dos folículos. O uso de FSH exógeno para induzir a superovulação é baseado nessa função fisiológica. Folículos em vários estágios de desenvolvimento estão normalmente presentes nos ovários, em qualquer tempo. Grupos consecutivos de folículos pequenos crescem, maturam e se degeneram ou ovulam. O FSH estimula o crescimento dos folículos pequenos (PRADO, 2005). Como o FSH tem uma meia-vida mais curta que o eCG, geralmente é necessário dividir a dose total e injetar com intervalos de 12 horas ao longo de 3 a 4 dias para estimular a mesma quantidade de crescimento folicular que resultaria de uma injeção de eCG (HAFEZ e HAFEZ, 2004). A maioria dos protocolos de superovulação empregando FSH indica oito aplicações em doses decrescentes por via intramuscular. No quarto dia do tratamento, pela manhã, é necessário administrar PGF2α visando regredir o corpo lúteo cíclico e uma segunda dose é aplicada ao anoitecer, sendo que as doadoras evidenciam estro, em média 48 a 72 horas depois da aplicação. Nas doadoras sincronizadas com dispositivos intravaginais ou auriculares, os mesmos devem ser retirados no quarto dia do tratamento do FSH pela manhã, sendo recomendada à aplicação concomitante de PGF2α, para um melhor efeito de sincronização. Nesse caso as doadoras mostram sinais de estro em média 12 horas antes, ou seja, 36 a 60 horas após a retirada do implante e administração de PGF2α (REICHENBACH et al., 2002). Prado e Toniollo (2006) relatam ter experimentado a dosagem de 300, 400 ou 500 UI de FSH, sendo administradas em 8 subdoses decrescentes, com início em 41 fase aleatória do ciclo estral, durante 4 dias consecutivos, com intervalos de 12 horas, em vacas da raça Gir leiteiras. Das variáveis analisadas apenas o tratamento com 400 UI de FSH influenciaram a recuperação de embriões viáveis, sendo a dosagem de melhor resultado. Por meio de uma série de experimentos, demonstraram que o uso de uma fonte de progesterona (dispositivos intravaginais), associada a administração intramuscular de estrógeno, promove atresia folicular e origina uma nova onda folicular, cerca de 4 dias após o início dos tratamentos (BARROS et al., 2004). A fim de evitar a presença de um folículo dominante o tratamento superestimulatório com FSH começa justamente no início da nova onda folicular, ou seja, 4 dias após a colocação do dispositivo intravaginal e administração de estrógeno. Dois dias após a primeira injeção de FSH, é administrada uma dose luteolítica de PGF2α e 12 horas mais tarde o dispositivo intravaginal é removido. As doadoras são inseminadas artificialmente 12 e 24 horas após a detecção do cio. Seis a sete dias mais tarde os embriões são colhidos, classificados e congelados ou inovulados. Este protocolo (Figura 8) apresenta duas vantagens: pode ser iniciado em qualquer dia do ciclo estral e dispensa a observação do cio base. Porém, ainda requer a detecção do estro para a inseminação artificial das doadoras (BARROS et al., 2004). Barros et al. (2004) testaram a eficácia de protocolos, nos quais o momento esperado da ovulação era atrasado por 6 a 12 horas e a ovulação era induzida pela administração de LH ou GnRH. Estes protocolos não aumentaram significativamente o número de embriões viáveis quando comparados a protocolos com detecção do estro. Entretanto, com estes tratamentos hormonais foi possível controlar o momento 42 da ovulação, permitindo a utilização da IATF. A partir destes experimentos um novo protocolo denominado P-36, no qual a fonte de progesterona (CIDR-B® ou DIB®) é mantida por até 36 horas após a aplicação de PGF2α (daí a denominação P-36) e a ovulação é induzida com LH exógeno, administrado 12 horas após a remoção da fonte de progesterona (ou seja, 48 h após a aplicação de PGF2α), a IATF é realizada 12 e 24 h após a injeção de LH, evitando a inconveniência da detecção do estro (Figura 8). FIGURA 8: Protocolo superovulatório P-36 utilizados em vacas. FONTE: 2º SIRAA, 2005. Geralmente, as doadoras respondem de maneira similar ao primeiro, segundo e terceiro tratamento superovulatório. A resposta a tratamentos subsequentes, no entanto, é menor em algumas fêmeas, provavelmente, devido ao aumento de anticorpos contra gonadotrofinas, que são hormônios proteicos (ANDRADE et al., 2002), 43 Segundo Sá Filho et al. (2007), é possível obter resultados satisfatórios quando do emprego de eCG para superovulação, associado ao protocolo de sincronização da onda de crescimento folicular e da ovulação em doadoras. O eCG apresenta a mesma eficiência que os animais superovulados com FSH, mostrando ser uma alternativa viável para programas de TE com inseminação artificial em tempo fixo em zebuínos, com vantagens significativas quanto ao manejo das doadoras. Os animais recebem um dispositivo de P4 associado a 2 mg de BE no Dia 0. Nos tratamentos com eCG, a superestimulação é realizada com a administração única de 2500 ou 2000 UI de eCG no Dia 4. No Dia 6, administra-se PGF2α. Os dispositivos são retirados 36 horas após a administração de PGF2α, e o LH aplicado 48 horas após a PGF2α (Dia 8 M), e a IATF realizada 16 h após a aplicação de LH, com a colheita dos embriões realizados do Dia 15. Finalmente, embora exista a necessidade de mais estudos sobre a administração da eCG para superestimulação ovariana, seu uso possibilita racionalização de manejo sem comprometer as taxas de produção de embriões em protocolos de superovulação com inseminação artificial em tempo fixo. De acordo com Fátima et al. (2012), a eCG pode ser utilizada em protocolos de superovulação de uma maneira mais prática em única administração. A resposta superovulatória é variável entre as vacas, mas definitivamente aumenta o número de ovulações e a eCG prepara o ovário e o folículo para este aumento. Uma típica resposta superovulatória em vacas seria de 8-10 ovulações com 57 embriões viáveis. Entretanto, 30% das vacas respondem produzindo apenas um ou nenhum embrião viável, enquanto cerca de 2% produzem muitos embriões (30 ou 44 mais). As razões fisiológicas para esta ampla variação na resposta ovariana à hiperestimulação não é conhecida (FERREIRA, 2010). 4.6 SINCONIZAÇÃO DE RECEPTORAS A sincronização entre o estágio de desenvolvimento do embrião e o trato reprodutivo da receptora é um pré-requisito. Isso geralmente é conseguido pela seleção de receptoras que estavam em cio ao mesmo tempo que a doadora, seja naturalmente ou como resultado da sincronização do cio. Para resultados ótimos, a receptora deve estar em cio dentro de um prazo de 12 horas em relação à doadora. As taxas de prenhez declinam drasticamente se a diferença for maior que 24 horas (HAFEZ e HAFEZ, 2004). Segundo VALENTIM e GOFERT (2004), a sincronização de receptoras é fundamental para o sucesso da TE, sem ela seria necessário um número elevadíssimo de receptoras para o uso do cio natural. Existem várias técnicas de controle do ciclo estral para sincronização de receptoras, dos mais antigos, à base de prostaglandina (Figura 9), aos mais modernos protocolos, que utilizam o conceito de sincronização do crescimento folicular e da ovulação. 45 FIGURA 9: Protocolo de sincronização de estro em receptoras utilizando apenas PGF2α e observação de cio. FONTE: ANAIS SBTE, 2004. Geralmente, os tratamentos usados para a sincronização de receptoras consistem na administração de duas doses de PGF2α com intervalos de 11 a 14 dias. Se todas as receptoras estiverem ciclando, em torno de 80% delas apresentarão sinais de estro 5 dias após o tratamento. Entretanto, devido a baixa acurácea na detecção do estro, apenas 50% das receptoras tratadas serão detectadas em cio, apresentarão CL e receberão um embrião 7 dias após o estro (BÓ et al., 2004). Segundo Gonçalves et al. (2008), para a sincronização do estro em doadoras e receptoras, durante o tratamento superovulatório, recomenda-se administrar a prostaglandina nas receptoras, 12h antes do momento da aplicação nas doadoras. Tal recomendação deve-se ao fato das doadoras mostrarem sinais de estro mais rapidamente do que as receptoras devido à influência do tratamento superovulatório. Segundo Bó et al. (2012 b), para evitar problemas associados à detecção de estro, tratamentos que sincronizam o momento da ovulação, que foram 46 originalmente desenvolvidos para a inseminação artificial (IATF), têm sido utilizados mais recentemente para a transferência de embriões em tempo fixo (TETF). A associação entre dispositivos de progesterona e estradiol são os tratamentos mais comumente usados para sincronizar emergência de onda folicular e ovulação em receptoras de corte e leite na América do Sul (BÓ et al., 2012 b). O protocolo consiste da inserção de um dispositivo liberador de progesterona e a administração de 2mg de benzoato de estradiol no dia 0 (para sincronizar a emergência de onda folicular), e PGF2α 5 dias depois do momento da inserção do dispositivo de progesterona (para garantir a luteólise). O dispositivo de progesterona geralmente é removido no dia 8 e a ovulação é induzida pela administração de 0,5 ou 1mg de benzoato de estradiol 24h após a remoção do dispositivo de progesterona. Como nos programas de TETF a detecção do estro geralmente não é realizada, o dia 10 é considerado o dia do estro. Todas as receptoras com CL aparentemente funcional no dia 17 recebem um embrião (BÓ et al., 2012 b). De acordo com Bó et al. (2012 a), a estratégia mais comum usada para aumentar a proporção de receptoras gestantes sobre o número de fêmeas sincronizadas em bovinos de corte mantidos a pasto na América do Sul é adição de 400 UI de eCG no dia 5 ou no dia 8 do protocolo de sincronização que utiliza a associação de estradiol e progesterona (Figura 10). Este fármaco proporciona uma maior concentração de progesterona durante a fase lútea subsequente, pela qualidade do CL formado (MARINHO et al., 2012). 47 FIGURA 10: Protocolo de sincronização de estro em receptoras bovinas associando estradiol, progesterona, prostaglandina e eCG. FONTE: ANAIS SBTE, 2004. As fêmeas receptoras, que retornarem ao estro após a primeira transferência podem ser novamente aproveitadas para posteriores transferências. Porém, aquelas que não conceberem depois de três tentativas consecutivas devem ser descartadas e, na medida do possível, substituídas do rebanho (GONÇALVES et al., 2008). 4.7 INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL DAS DOADORAS Segundo REICHENBACH et al. (2002), as doadoras são inseminadas duas a três vezes conforme os sinais aparentes de estro, sendo a primeira inseminação realizada imediatamente após os primeiros indícios e as demais em intervalos de, aproximadamente, 12 horas. Aquelas fêmeas que não expressarem os sinais de estro devem ser também inseminadas, preferencialmente, após 48 e 60 horas da aplicação de PGF2α ou 36 e 48 horas depois da retirada do dispositivo intravaginal ou implante auricular. Segundo Gonçalves et al. (2008), desvantagem óbvia desse procedimento consiste na necessidade da observação de estro. Além disso, em 48 alguns casos de estro silencioso, que é caracterizado pelo não aparecimento de sinais do estro nos animais, mesmo tendo ocorrido superovulação no período esperado, a doadora acaba não sendo inseminada, acarretando perdas importantes. Como já relatado anteriormente, o protocolo mais utilizado é o P-36, onde ocorre uma aplicação de LH (dia 8) 48 h depois da aplicação de PGF2α, e a IATF é feita no dia 9 se caso o LH for aplicado no dia 8 no período da tarde, pois a primeira inseminação é feita 12 horas após a aplicação e a segunda inseminação após 24 horas da aplicação (BARROS et al., 2004). 4.8 MATERIAL UTILIZADO PRA TE Para a correta execução dos trabalhos, é necessário que a propriedade tenha uma estrutura mínima que permita que os animais sejam medicados e manipulados de forma segura e eficiente. Basicamente, a estrutura requerida consiste em um curral para o manejo dos animais e um laboratório para a manipulação dos embriões, o curral de manejo deve ser de tal forma que permita os procedimentos normais de manejo do gado (apartação, marcação, vacinação, inseminação artificial, pesagem doa animais, embarque e desembarque dos animais), como também a contenção individual para a inseminação das doadoras, coleta e inovulação dos embriões, através de um tronco de contenção (SANTOS, 2011). De acordo com Santos (2011), o laboratório deve ser um cômodo pequeno, com boa luminosidade, de preferência laváveis, com pia, mesa e pontos de luz e água. Também é importante uma geladeira medicamentos durante as aplicações hormonais. para o armazenamento de 49 Tendo como referência o estágio realizado na empresa Fazzembryo, o material utilizado no processo de transferência de embriões compreende (Figura 11): Seringas e agulhas para aplicação dos hormônios; Luvas de procedimento e palpação retal; Aplicadores de sêmen para IA das doadoras; Sêmen de boa qualidade genética; Anestésico local para epidural das doadoras e receptoras; Cateter de Foley, que é o cateter que se fixa no corno do utero para sua lavagem; Mandril para introdução do cateter de Foley; Equipo para o sistema fechado de lavagem uterina; Frasco de 1000 mL de meio PBS (tampão fosfato salino), para lavagem do útero; Copo coletor de embriões que vai acoplado no final do sistema fechado de lavagem; Pacas de Petri 35 x 10mm e 100 x 20 mm; Mesa aquecedora; Estereomicroscópio (lupa) com zoom; Micropipeta e ponteiras; Meio holding, soro fetal bovino (SFB) ou albumina bovina, tripsina, para lavagem dos embriões, e etilenoglicol que é um crio protetor para o caso de congelamento dos embriões; Palhetas 0,25mm para envase dos embriões; 50 Aplicadores específicos para inovulação de embriões, bainha para o aplicador e camisa sanitária; Maquina de congelamento caso os embriões sejam congelados, ou estufa portátil pra conservação da temperatura (36ºC) para os embriões até a chegada do local de inovulação; FIGURA 11: Materiais utilizados para transferência de embriões. (1) equipo em Y, cateter de Foley e copo coletor; (2) mesa aquecedora, placas de Petri de 100 e 35 mm; (3) bainhas para inovulação; (4) esteriomicroscópio; (5) aplicador; (6) estufa portátil; (7) aplicadores montados com camisa sanitária; (8) palheta 0,25ml; (9) frasco de PBS. 4.9 COLETA DE EMBRIÕES A coleta de embriões com fins comerciais em bovinos é efetuada, preferencialmente, entre o 6º e o 8º dia após a primeira inseminação das doadoras. Nesse período, os embriões encontram-se flutuando num filme líquido no lúmen da 51 ponta dos cornos uterinos. Isso permite sua captação por meio da técnica de lavagem dos cornos uterinos (Figura 12). Trata-se do período mais indicado para a obtenção de embriões nos estádios de mórula ou blastocisto destinado à transferência imediata, bipartição ou criopreservação (GONÇALVES et al., 2008). O método mais utilizado é o transcervical com o sistema fechado de coleta, este método, o meio de lavagem introduzido no corno uterino é recolhido através de um sistema composto por dois tubos de plástico flexíveis, sendo que um é o recipiente contendo o meio de coleta e o outro, um filtro para a obtenção dos embriões. Esse meio de coleta deve fluir por gravidade através do tubo acoplado ao recipiente, bem como através do cateter em direção ao corno uterino, sendo necessário que o recipiente seja posicionado cerca de um metro acima da garupa do animal (REICHENBACH et al., 2002). 52 FIGURA 12: Coleta de embrião transcervical (esquemático). FONTE: GUIDO, 2005. Inicialmente é realizada a contenção do animal por meio de um tronco específico para contenção, evitando riscos de ferimento no animal e no operador. O animal é devidamente higienizado ao redor da vulva, ânus e inserção da calda, com água, em seguida, utiliza-se anestesia epidural, a fim de promover relaxamento do reto e do útero do animal, facilitando a passagem da sonda (cateter de Foley) pela cérvix e a sua fixação no útero, inflando-se o balão localizado na extremidade da sonda com ar (SANTOS, 2011). Após o posicionamento do cateter em um dos cornos, o balão é inflado. O corno uterino é preenchido com 30 a 60 ml de meio PBS aquecido (30ºC), permitindo-se a sua passagem para um recipiente de coleta (filtro), enquanto o útero 53 delicadamente massageado pelo reto (Figura 13). Isso é repetido até que 300 a 800 ml de meio tenham sido usados. O cateter de Foley é, então, inserido no outro corno uterino e o processo é repetido (HAFEZ e HAFEZ, 2004). FIGURA 13: Lavagem uterina para coleta de embriões. Ao final da lavagem do corno uterino, o meio de coleta retorna através do outro tubo plástico para o filtro acoplado nesse tubo retendo os embriões juntamente com dez a 30 mL do meio de lavagem (GONSALVES, 2002). 4.10 MANIPULAÇÃO DOS EMBRIÕES. Logo após a colheita, o filtro é lavado por jatos de PBS proveniente de uma agulha acoplada a uma seringa de 20 mL até ficar limpo e livre de muco na tela 54 filtrante, e a fração do lavado uterino é transferida para placas de Petri estéreis de 100 x 20 mm (Figura 14). A procura dos embriões é feita com auxílio do esteromicroscópio binocular no aumento de 15 vezes. As estruturas obtidas são transferiras para placas de Petri de 35 x 10 mm e mantidas em solução de manutenção contendo PBS e 0,4% de albumina bovina ou 10 a 20% de soro fetal bovino (SFB) para posterior classificação em aumento de 80 vezes (Figura 15) (WÜNSCHE JÚNIOR et al., 2008). FIGURA 14: Lavagem do filtro para procura das estruturas FONTE: CPT cursos presenciais, 2011. 55 FIGURA 15: Embriões em aumento de 80 vezes, mórula, blastocisto e blastocisto expandido. FONTE: CPT cursos presenciais, 2011. Após a seleção dos embriões viáveis para transferência ou congelamento estes devem ser lavados em 10 gotas (Figura 16) de meio holding (manutenção) de volume tal que permita uma diluição de 100 X em relação à gota precedente, ou seja, usando uma pipeta de volume de 20 µl para manipulação dos embriões o volume da gota deve ser de no mínimo 2 mL (ou 5 µl em 500 µl) (SANTOS, 2011). Existe alguns requerimentos essenciais para lavagem adequada dos embriões, tais como: lavar juntos apenas embriões de uma doadora; lavar de uma só vez dez ou menos embriões; lavar somente embriões com zona pelúcida intacta; lavar apenas embriões isentos de material aderente; mínimo de dez lavagens; usar uma nova micropipeta estéril cada vez que os embriões são passados de um banho para outro (STRINGFELLOW, 1998). Além disso, Andrade et al. (2002) relataram que para embriões com fins de exportação são necessários submetê-los a 56 tratamento com tripsina, pois esta, possui atividade proteolítica sob os agentes patogênicos que se alojarem na zona pelúcida (ZP). Inicialmente, os embriões são lavados três a cinco vezes no meio de cultivo para em seguida serem lavados em duas alíquotas contendo tripsina, por um tempo de 60 a 90 segundos, para depois serem novamente lavados por cinco vezes no meio de cultivo. FIGURA 16: 10 gotas de holding para lavagem dos embriões. FONTE: CPT cursos presenciais, 2011. 4.10.1 Classificação dos Embriões. Segundo Gonçalves et al. (2008), a qualidade do embrião é o fator que mais influencia os resultados de prenhez da TE. Existe uma relação entre as características morfológicas e estruturais de embriões bovinos de diferentes qualidades e capacidade de desenvolvimento do embriões após transferência. Esta classificação é realizada em função do estádio de desenvolvimento e da 57 qualidade morfológica, e a avaliação final da eficiência do processo superovulatório e a definição do destino dos embriões (transferência direta, congelação ou descarte) devem levar em consideração estes dois parâmetros. Na avaliação do estádio, são consideradas características associadas à progressão do desenvolvimento embrionário, como número, tamanho e grau de compactação dos blastômeros (células embrionárias), formação da blastocele (cavidade embrionária), espaço ocupado pelo embrião e espessura da zona pelúcida (envoltório externo). Para cada dia após a ovulação, é esperado um determinado estádio de desenvolvimento (VIANA, 2012). A Sociedade Internacional de Transferência de Embriões (IETS) normatizou os critérios para classificação morfológica de embriões bovinos produzidos in vivo quanto ao estádio de desenvolvimento e qualidade (VIANA, 2012). A classificação do estádio de desenvolvimento da IETS usa códigos numéricos que vão de 1 (oócito não fecundado) até 9 (blastocisto eclodido e expandido) (Tabela 2 e Figura 17). A classificação da qualidade dos embriões usa códigos que vão de 1 (embriões de qualidade excelente ou boa) até 4 (embriões mortos ou degenerados). 58 TABELA 2: Código pra classificação dos embriões. FONTE: CPT cursos presenciais, 2011. 59 FIGURA 17: Estágios de desenvolvimento embrionário, considerando-se os códigos recomendados pela IETS (1998). FONTE: GUIDO, 2005. Na avaliação individual dos embriões, são várias as características a serem observadas, tais como: tamanho, forma, cor, homogeneidade do citoplasma, forma e integridade da membrana pelúcida, tamanho e presença de células no espaço perivitelíneo e presença de vesículas (BEM et al., 1995). 60 De acordo com a morfologia, os embriões são classificados, segundo IETS, em 4 graus (GONÇALVES et al., 2008): GRAU 1 (Excelente ou Bom): possui uma massa embrionária simétrica e esférica com blastômeros individuais que são uniformes em tamanho, cor e densidade, forma regular. A zona pelúcida não deve apresentar superfície côncava ou plana, deve ser lisa, preferencialmente intacta; células extrusadas da massa celular do embrião compreendem menos de 15% do material celular total. GRAU 2 (Regular): estádio de desenvolvimento correspondente ao esperado, forma regular, zona pelúcida intacta ou não, irregularidades moderadas na forma geral da massa embrionária ou no tamanho, cor e densidade das células individuais, células extrusadas da massa celular compreendem mais de 15% do material celular total, pelo menos 50% das células compõem uma massa embrionária viável, intacta. GRAU 3 (Pobre): estádio de desenvolvimento não corresponde ao esperado, irregularidades maiores na forma geral da massa embrionária ou no tamanho, cor e densidade das células individuais, menos de 75% das células degeneradas, pelo menos 25% das células compõem uma massa embrionária viável, intacta. GRAU 4 (Morto ou Degenerado): estádio de desenvolvimento não corresponde ao esperado, embrião em degeneração, massa embrionária de menos de 25% de todo o material celular presente no 61 interior da zona pelúcida, oócitos ou estruturais unicelulares degeneradas. De acordo com Viana (2009), é importante lembrar também que a classificação morfológica é apenas indicativa do potencial de desenvolvimento dos embriões. Alterações funcionais que podem comprometer o desenvolvimento embrionário não são necessariamente refletidas imediatamente na morfologia, ou seja, um embrião aparentemente perfeito pode ter um baixo potencial de desenvolvimento em função de fatores intrínsecos como, por exemplo, defeitos genéticos, ou extrínsecos, como contaminações ou fontes de estresse no dia da coleta. 4.11 TRANFERÊNCIA DE EMBRIÕES (INOVULAÇÃO) Somente embriões classificados de 1 a 3 devem ser transferidos para receptoras. Antes da transferência, o embrião precisa ser acomodado no centro de uma palheta contendo meio de cultivo (Figura 18). O envasamento da palheta é feito de tal forma que uma coluna central contendo o embrião encontra-se separada das colunas nas extremidades por duas colunas de ar. As palhetas precisam ser devidamente identificadas para evitar equívocos no momento da transferência (GONÇALVES et al., 2008). 62 FIGURA 18: Palheta com o embrião. Nos primórdios da TE, os embriões eram transferidos por laparotomia sob anestesia geral ou local. Desde 1978, a técnica cirúrgica foi descartada a favor da via transcervical (HAFEZ e HAFEZ, 2004). Na abordagem transcervical, a receptora é palpada retalmente para determinar o ovário que contém o corpo lúteo. A seguir, a anestesia epidural posterior é induzida para evitar movimentação durante o procedimento. A dose da anestesia local é ajustada para assegurar que o animal permaneça de pé ao longo da transferência (HAFEZ e HAFEZ, 2004). O animal é devidamente higienizado ao redor da vulva, ânus e inserção da cauda, com água (SANTOS, 2011). A TE propriamente dita, também conhecida por inovulação, é semelhante ao adotado para IA. O embrião deve ser depositado no corno uterino ipsilateral ao corpo lúteo cíclico (GONÇALVES et al., 2008). Sob condições assépticas, a palheta contendo o embrião é encaixada em um aplicador (inovulador) revestida por uma bainha estéril e uma camisa sanitária, em seguida é introduzida via transcervical (na entrada da cervix se rompe a camisa sanitária), e por manipulação retal é guiada até o corno uterino ipsilateral do corpo 63 lúteo cíclico (Figura 19), onde finalmente o líquido contendo o embrião é depositado (HAFEZ e HAFEZ, 2004). FIGURA 19: Foto ilustrativa do útero e ovários, onde pode-se observar os locais de deposição do embrião no corno uterino ipsilateral ao CL. FONTE: PIERONI, 2009. 64 5. DESCRIÇÃO DAS ATIVIDADES REALIZADAS NO ESTÁGIO As atividades realizadas no estágio foram voltadas à reprodução e produção de bovinos, mas também houve possibilidade de acompanhar atividades relacionadas á clínica cirúrgica de bovinos e clínica médica de equinos. As atividades relacionadas com reprodução englobavam tanto os machos quanto as fêmeas. Nas fêmeas eram realizados exames ginecológicos, avaliando ovários de novilhas e de vacas com ultrassom para certificar que estavam ciclando e assim poderiam entrar nos protocolos de IATF, ou poderiam servir como receptoras para embriões; também eram avaliadas as vacas doadoras de oócitos para a produção de embriões fertilizados in vitro, realizando a contagem dos números de folículos encontrados nos ovários que poderiam ser aspirados pelas empresas terceirizadas, avaliando também todo seu útero para certificar ausência de doenças. Com o próprio ultrassom também eram realizados diagnósticos de prenhez com 30 dias ou de 60 dias que é o período certo para ser feita a sexagem fetal. Ainda em fêmeas, houve o acompanhamento de um parto distócico que foi possível reverter sem intervenção cirurgica, mas em um caso a cesareana foi a melhor opção. Com o começo da estação de monta neste período, também houve acompanhamento da iniciação dos protocolos para IATF, fazendo a colocação de implantes intravaginais de P4, e a aplicação de hormônios (benzoato de estradiol) para no decorrer haver a IATF propriamente dita, lavagem uterina para coleta de embriões, inovulação de embriões. Além dessas atividades relacionadas com a reprodução também eram realizados exames de tuberculose com a aplicação de 65 tuberculina na prega caudal e coleta de sangue (Figura 20) para fazer o exame de brucelose com Antígeno Acidificado Tamponado (AAT). FIGURA 20: Coleta de sangue para exame de Brucelose. Além dos procedimentos realizados com a fêmea também havia com machos, que praticamente girava em torno do exame andrológico, englobando também exame de tuberculose e brucelose, avaliando perímetro escrotal, coletando sêmen para avaliar turbilhão, vigor e motilidade e fazer sua patologia espermática (Figura 21), também acompanhou-se a cirurgia de rufião realizada em dois touros. 66 FIGURA 21: Avaliação da patologia espermática, realizada no laboratório da Fazzembryo. Procedimentos clínicos e cirurgicos também foram acompanhados, casos de diarréia de bezerros e potros, fratura de membro posterior de um touro, necropsia de bezerros (Figura 22), procedimentos de redução de prolapso de útero de uma ovelha e de uma vaca, redução de hérnia umbilical, cesareana e cirurgia de rufião por fixação do S peniano. 67 FIGURA 22: Necropsia de uma bezerra realizada na Fazenda Guadalupe. Também houve treinamento para a realização de exames de ultrassonografia e inovulação de embriões em vacas descarte (Figura 23 e 24). 68 FIGURA 23: Exame de ultrassonografia. FIGURA 24: Inovulação. Além das atividades acompanhadas com os veterinários da empresa também houve acompanhamento do trabalho desenvolvido pela zootecnista, fazendo a avaliação de touros para a Associação Nacional de Criadores e Pesquisadores 69 (ANCP), medindo circunferência escrotal e pesando os animais, e também acompanhamento de um técnico da ABCZ (Associação Brasileira dos Criadores de Zebu) para a avaliação dos touros e registros dos mesmos. Essas e outras atividades que foram realizadas no período do estágio estão relacionadas na Tabela 3. TABELA 3: Relação das atividades realizadas no estágio Atividade US para Avaliação de Ciclo Estral Implantação do Protocolo de IATF Exames de Brucelose (AAT) US para diagnóstico de gestação em Bovinos Pesagem e Medição de CE Coleta de Sangue para Exame de Brucelose Patologia Espermática Inoculação de Tuberculina na Prega Caudal Exame Andrológico em Bovinos Leitura de Turberculina Inovulação de embriões US Sexagem Fetal Diagnóstico de Gestação por Palpação Retal Vacinação de Terneiras para Brucelose US para Avaliação de Doadoras para OPU Exame Andrológico em Ovinos Coleta de Semen de Touro para Congelamento Atendimento Clinico US para Diagnóstico de Gestação em Equinos Necropsia Coleta de Sangue de Cavalo para Exame de AIE Cirurgia de Rufião Cirurgia de Correção de Hernia Umbilical Cirurgia de Prolapso de Útero Cesária Lavegem de Útero para Coleta de Embrião Parto Distócico n 1195 671 641 601 450 422 389 304 269 231 143 16 16 15 13 11 10 5 4 2 2 2 2 2 1 1 1 % 22,08% 12,40% 11,84% 11,10% 8,31% 7,80% 7,19% 5,62% 4,97% 4,27% 2,64% 0,30% 0,30% 0,28% 0,24% 0,20% 0,18% 0,09% 0,07% 0,04% 0,04% 0,04% 0,04% 0,04% 0,02% 0,02% 0,02% 5412 100% 70 5.1 ATIVIDADES RELACIONADAS COM TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES No estágio houve a oportunidade de acompanhar uma coleta de embriões em uma fazenda e inovulações de embriões em outras, sendo este o tema que mais chamou a atenção e que foi escolhido para ser tratado detalhadamente neste relatório. A fazenda acompanhada na atividade de coleta de embriões foi a Fazenda Crioula localizada em Valparaiso – SP, a 80 km de Araçatuba, com criação de gado Nelore PO e também cavalos da raça Quarto de Milha, e está começando a implantar gado da raça Sindi (Figura 25), que foi a raça que realizou-se a transferência de embriões. 71 FIGURA 25: Quatro novilhas da raça Sindi misturadas com as novilhas da raça Nelore. A vaca foi superovulada com um protocolo diferente dos citados na revisão da literatura, a maioria dos protocolos estipulavam a aplicação da dose de FSH dividida em 8 aplicações, isso daria 4 dias de tratamento com FSH, já neste protocolo (Tabela 4) utilizado pela Fazzembryo, a dose do FSH foi dividida em 6 frações e as aplicações ocorreram em 3 dias, e no quarto dia foi aplicada uma dose de eCG dividida em duas aplicações, a dose total do FSH foi de 140 mg, isso deu um total de volume de 14 mL, primeiramente no D0 foi aplicada uma dose de benzoato de estradiol e colocado o implante intravaginal de progesterona (CIDR®). Após isso no D4, 3 mL de manhã (7:00 h) e à tarde (18:00 h) de FSH foram aplicados, no dia seguinte (D5) 2 mL de manhã e à tarde, e no D6 2 mL de manhã e 2 mL à tarde de 72 FSH, nesse mesmo dia a PGF2α foi aplicada dividida em 2 mL de manhã e 2 mL de tarde, no D7 o implante de progesterona foi retirado pela manhã e o eCG (Novormon®) foi aplicado, 1 mL de manha e 1,5 mL à tarde, no D8 o estimulante para ovulação (GnRH) foi aplicado também dividido em 2 frações de 2 mL aplicados de manha e à tarde, a primeira IA feita no mesmo dia às 16:00 h e a segunda IA feita no outro dia às 6:00 h da manha. A coleta dos embriões foi realizada 7 dias após a primeira IA no D15. TABELA 4. Protocolo de superovulação da Fazenda Crioula, a partir do primeiro dia de aplicação do FSH. PROTOCOLO SOV FAZENDA CRIOULA Doadora Vaca Sindi 22/07 Domingo M T 23/07 segunda M T 3,0 ml 2,0 ml 14 ml Folltropin , FSH equivalen te 140 mg 3,0 ml FSH FSH 2,0 ml FSH 24/07 Terça M T 2,0 ml 2,0 ml FSH FSH 2,0 ml pgf2 2,0 ml pgf2 25/07 Quarta M T 26/07 Quinta CIO/M IA Retirar CIDR GnRH GnRH 2,0 ml 2,0 ml 1,5 ml eCG 27/07 Sexta IA 2º IA 6:00 1,0 ml eCG FONTE: FAZZEMBRYO Para a sincronização das receptoras foi feito um protocolo simples, onde só era realizada a aplicação de uma dose de PGF2α, foi estipulado de 6 a 8 receptoras a entrarem no protocolo, essas receptoras eram todas da raça Nelore, receberam 2 mL pela manha no dia 23/07 (Dia 0) (segundo dia do tratamento de FSH da doadora), e observado o cio no D2, D3, D4 e a coleta de embriões aconteceria no D10 como já mostrado na Figura 9 do item 4.6 SINCRONIZAÇÃO DE 73 RECEPTORAS, onde foi apontado como um dos protocolos mais antigos por Valentim e Gofert (2004). No dia da coleta de embriões que ocorreu no dia 02/08, 7 dias após a primeira IA, o material foi preparado, a vaca foi colocada no tronco e em seguida feita sua higienização, após feito isto, foi feita anestesia epidural com 5 mL de lidocaína 2% para que a vaca não sentisse o procedimento e não contraísse o útero prejudicando na lavagem. Então o primeiro toque para avaliação dos ovários foi realizado e constatou-se que a vaca não respondeu ao esperado do protocolo de superovulação, tendo em vista que estava com apenas 3 CL, consequentemente poderia estar com só 3 embriões. Então um cateter de Foley foi introduzido em seu útero com um mandril através de sua cervix para lavagem de seus cornos uterinos, utilizando o equipo em Y com o copo coletor e 1000 mL de meio PBS, a vaca foi lavada devidamente. Após o término da lavagem o copo coletor foi levado para dentro da sala no curral onde o material já estava montado, e começou a procura dos embriões, foram encontrados os 3 embriões que estavam previstos, mas na classificação observouse que 2 estavam degenerados e o outro era uma mórula grau 3, levando em conta que a lavagem foi feita 7 dias da IA e a mórula é localizada no dia 6, e o grau 3 é considerado um embrião pobre segundo Santos (2011): GRAU 3 (Pobre): estádio de desenvolvimento não corresponde ao esperado, irregularidades maiores na forma geral da massa embrionária ou no tamanho, cor e densidade das células individuais, 74 menos de 75% das células degeneradas, pelo menos 25% das células compõem uma massa embrionária viável, intacta. Este embrião com esta qualidade serviria apenas para a inovulação a fresco, então o embrião foi lavado com os devidos procedimentos, lavando-o nas 10 gotas de meio holding, então passando pelas 2 gotas do meio com tripsina para que fosse eliminada qualquer forma de contaminação que porventura estivesse aderida em sua zona pelúcida, e em seguida foi envasado em palheta 0,25 mL (Figura 26). FIGURA 26: Palheta 0,25 com o embrião, pronta para inovular. Então as receptoras sincronizadas foram palpadas para definir o grau de seu CL e ver qual era a melhor para receber o embrião. O CL pode ser classificado em 4 graus avaliados pelo seu tamanho, onde se espera que o maior CL é o que produz mais progesterona assim mantendo a prenhez com maior qualidade (Tabela 5). 75 TABELA 5: Definição da classificação e qualidade do CL através do seu tamanho. FONTE: FAZZEMBRYO, 2012. No geral as receptoras não estavam em boa qualidade e sincronizadas adequadamente, mas o embrião foi inovulado em uma receptora com um CL de grau 2. A receptora foi colocada no tronco e foram adotados os mesmos procedimentos de higiene semelhantes aos da doadora, em seguida também procedeu-se a epidural, o aplicador para inovulação foi montado com uma bainha adequada para transferir embriões e em seguida foi introduzido em uma camisa sanitária (Figura 27), pra que não ocorra nenhuma forma de contaminação para dentro do útero da receptora. E conforme relata Hafez & Hafez (2004), por manipulação retal o aplicador é guiado até o corno uterino ipsilateral do corpo lúteo cíclico, onde finalmente o líquido contendo o embrião deve ser depositado. 76 FIGURA 27: Aplicador devidamente montado, pronto para inovulação. Após todos esses procedimentos a prenhez é confirmada depois de aproximadamente 25 dias, tendo em vista que a vaca já estaria prenhe há 7 dias pela idade do embrião, com a utilização de um ultrassom, e neste caso, mesmo o embrião não estando em boas condições a prenhez foi confirmada. Além desta transferência de embrião na Fazenda Crioula, também houve várias inovulações em outras fazendas, mas nestas, tratava-se de embriões produzidos de fertilização in vitro (FIV). Também foi realizada transferência de embriões na fazenda Katayama Agropecuária localizada em Guararapes - SP, onde 63 embriões foram inovulados, e também em um Haras chamado Vila dos Pinheiros em Nova Andradina – MS, onde foram transferidos 80 embriões. Os embriões produzidos através da aspiração e fertilização in vitro, que eram produzidos através do laboratório Fervitro, eram levados para o local da 77 transferência em uma estufa portátil adequada para serem mantidos na temperatura certa de 36ºC (Figura 28) . FIGURA 28: Estufa portátil utilizada para transporte de embriões. Da mesma forma, as receptores eram avaliadas, anotava-se o ovário em que o CL estava e seu grau, por exemplo: ovário direito com CL grau 2 (D2) ou ovário esquerdo com CL grau 3 (E3). Os funcionários responsáveis pelas receptoras informavam o dia em que o cio havia sido observado, desta forma, a sincronização era anotada como + 24, 0 ou - 24. Receptoras “+ 24” representam aquelas em que a sincronia passou 1 dia da fertilização do embrião, ou seja, se o embrião tem 7 dias a receptora apresentou cio no dia anterior à fertilização (receptora está no 8º dias pós ovulação). Receptoras “0” representam aquelas que entraram em cio no dia em que o embrião foi fertilizado. Esta é a sincronização perfeita, pois a idade do embrião bate 78 com o dia de ovulação da receptora (7 dias o embrião, 7 dias da ovulação da receptora). Receptoras “- 24” são as que apresentaram cio atrasado, ou seja, as vacas que apresentaram cio um dia após o esperado (embrião tem 7 dias e ovulação tem 6). Estas vacas não são desejáveis, portanto são descartadas deste programa de transferência. Também é anotado o número da receptora e o embrião transferido, são anotações muito importantes para que ao nascerem possa ser reconhecida a verdadeira mãe do bezerro (doadora do embrião), como se pode observar na Figura 29. 79 FIGURA 29: Ficha com relação dos embriões, onde eram anotadas as informações sobre as receptoras. Em seguida era feita a inovulação dos embriões nas receptoras com melhores condições para recebê-los. E após aproximadamente 25 dias era feito o diagnóstico de gestação. Estes programas de TE tinham como média um resultado que variava entre 45 e 50%, que é considerado excelente para esta técnica 80 6. CONCLUSÃO A pecuária brasileira está gradativamente saindo dos métodos empíricos, adotando novas tecnologias de acordo com a evolução científica por intermédio da classe médico veterinária. Os resultados podem ter êxito ou serem frustrantes dependendo de diversos fatores como: nutrição dos rebanhos, manejo sanitário, mão de obra nas fazendas e habilidade do médico veterinário responsável. Neste contexto, passa a ser preponderante a capacitação técnica dos profissionais e sua constante atualização. A transferência de embriões em bovinos permite a multiplicação de animais com alta qualidade genética, diminuindo o intervalo entre gerações, e possibilitando que a produção de um bezerro por vaca por ano passe a ser de doze a quatorze aproximadamente. Este método permite também a comercialização de embriões entre estados longínquos e entre países, contribuindo amplamente para a difusão da genética, com o nascimento de bezerros aclimatados. 81 REFERÊNCIAS ALBUQUERQUE, F. T.; FILHO, J. B. 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