Análise dos fatores de virulência das Escherichia coli isoladas das

0
UNIVERSIDADE CEUMA
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
LARISSA DE MARIA CARVALHO PRASERES LOBÃO
ANÁLISE DOS FATORES DE VIRULÊNCIA DAS ESCHERICHIA COLI
ISOLADAS DAS DIETAS ENTERAIS INDUSTRIALIZADAS E MANIPULADAS
DE HOSPITAIS DE SÃO LUÍS - MA.
São Luís
2014
1
LARISSA DE MARIA CARVALHO PRASERES LOBÃO
ANÁLISE DOS FATORES DE VIRULÊNCIA DAS ESCHERICHIA COLI ISOLADAS
DAS DIETAS ENTERAIS INDUSTRIALIZADAS E MANIPULADAS DE HOSPITAIS
DE SÃO LUÍS - MA.
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Biologia Parasitária como parte dos
requisitos para a obtenção do título de Mestre em
Biologia Parasitária.
Orientador: Profª. Drª. Patrícia de Maria Silva
Figueirêdo
Co-orientador: Profº. Msc. Thiago Azevedo
Feitosa Ferro.
São Luís
2014
2
LARISSA DE MARIA CARVALHO PRASERES LOBÃO
Análise dos fatores de virulência das Escherichia coli
isoladas das dietas enterais industrializadas e manipuladas
de hospitais de São Luís - MA.
A Comissão julgadora da Defesa do Trabalho Final de Mestrado
em Biologia Parasitária, em sessão pública realizada no dia
/
/
considerou o(a) candidato(a)
(
) APROVADA
(
) REPROVADA
1) Examinador __________________________________
2) Examinador ___________________________________
3) Examinador ___________________________________
4) Presidente (Orientador)__________________________________
,
3
AGRADECIMENTOS
À Deus, que permitiu minha aprovação, me protegeu durante a realização deste
trabalho e me iluminou para eu adquirir o conhecimento.
À Nossa Senhora, que me ajudou a superar cada obstáculo que apareceu.
Ao meu esposo Ziro, pelo apoio durante toda caminhada, compreensão nos
momentos difíceis e pelo constante incentivo com muito carinho e amor.
Aos meus pais, Roze e Nilton, minhas irmãs, meus cunhados e sobrinhas, pelo
sempre e incondicional carinho, estímulo e compreensão nos momentos que estive ausente.
À Prof. Dra. Patrícia Figueiredo, que conduziu esse projeto com muito interesse e
competência. Obrigada pela oportunidade de conhecer o mundo da pesquisa e acreditar no
meu potencial e pela amizade durante todos esses anos.
Ao Prof. Ms. Thiago Ferro, que me conduziu com muita paciência, auxílio e
prontidão.
A prof Dra Maria Rosa Quaresma Bonfins, pelo apoio, prontidão e carinho.
Aos Prof. Dr. Sílvio Gomes Monteiro e Dra. Cristina Monteiro, pelo auxílio e
prontidão.
A companheira de laboratório Thalyta, pelo companheirismo e colaboração.
Aos colegas de laboratório pela colaboração direta ou indireta para com este
trabalho. Em especial a Andréa, Monique, Fernanda, Mariana, Saulo e Stanley. E toda turma
VI do mestrado de Biologia Parasitária pelo constante apoio.
Aos técnicos de laboratórios Marinaldo e Margarete por sempre poder contar com
ajuda de vocês na hora que mais precisava.
À FAPEMA, pelo auxílio, mesmo por um período curto.
À Universidade CEUMA, em especial aos professores do programa de Mestrado
de Biologia Parasitária.
4
“A Felicidade mantêm você doce, dores
mantêm você humano, quedas te mantêm
humilde, provações te mantêm forte, mas
somente Deus te mantêm prosseguindo.”
Autor desconhecido
5
RESUMO
Este estudo traz como base o tema Escherichia coli, uma bactéria que apresenta grande
potencial patogênico consideradas como agentes e risco em relação ao manejo. O objetivo do
estudo foi analisar os fatores de virulência de isolados das E.coli recuperados a partir de
amostras de dietas enterais industrializadas manipuladas e servidas aos pacientes de um
hospital público e outro privado do município de São Luís - MA. Trata-se de um estudo
experimental, prospectivo. As amostras foram coletadas separadamente em turnos e horários
diferentes, no período de março de 2013 a abril de 2014. A pesquisa foi direcionada para:
classificação molecular das Escherichia coli diarreiogênicas; análise das propriedades
relacionadas com a adesão às células, Hep 2 e HT29, materiais inertes (inox, latéx e vidro),
formação de biofilme, propriedades de hidrofobicidade, presença de fímbrias, curli e tipo I; e,
destacar, fenotipicamente a produção de lipase, protease, fosfolipase e hemolisina. Os
resultados apontaram que os fatores de virulência mais evidenciados nos isolados de E. coli,
obtidos de amostra de nutrição enteral dos hospitais pesquisados foram: produção de cápsula
em todos os isolados, produção fraca de biofilme em 75% das amostras hospital privado e em
50% dos isolados em hospital público; a expressão da fímbria curli em todas as amostras de
ambos hospitais, a fímbria tipo I foi mais evidente nas amostras do hospital privado (75%);
assim como a hidrofobidade (75%). Em relação à produção de hemolisinas, os isolados de
ambos os hospitais não apresentaram hemólise em meio sólido, apresentaram apenas em meio
líquido com sangue de carneiro. Não houve diferença quanto às propriedades da virulência
dos isolados de Escherichia coli recuperados das amostras dos dois hospitais. Esse índice de
contaminação por esse micro- organismo nas amostras colhidas nos dois hospitais e que, a
contaminação da nutrição enteral ocorre principalmente pela falta de técnicas de higiene
adequadas durante o trabalho de manipuladores, desinfecção dos locais de preparação e dos
equipamentos utilizados e utilização de aditivos não estéreis ou contaminados no preparo da
dieta poderá comprometer a evolução clínica desses pacientes.
Palavras-chave: Fatores de Virulência. E.coli. Análise. Dietas Enterais. Hospitais Públicos.
6
ABSTRACT
This study brings as base the theme Escherichia coli, a bacterium that presents great potential
pathogenic considered as agents and risk in relation to the handling. The objective of the
study was to analyze the factors of virulence of E.coli found in the diets enteral industrialized
manipulated of a public hospital and a private of the municipal district of São Luís - MA. It is
a study experimental, prospective. The samples for the study were collected in the period of
March from 2013 to April of 2014. The samples were collected separately in shifts and
different schedules. The research was addressed for: classification of molecules of
Escherichia coli diarrheagenic; analysis of the properties related with the adhesion to the cells,
Hep 2 and HT29, inert materials (inox, latéx and
glass), biofilm, hydrophobicity and
fímbrias, curli and type I; and, to highlight, phenotypically the lipase production, protease,
phospholipase and hemolysin in the samples of E.coli. The results showed that the factors
most evident in the virulence of E. coli isolates obtained from a sample of enteral nutrition in
a public hospital and one private, are: capsule production in both hospitals (100%), weak
biofilm production (75 %) and private hospitals (50%) public hospital; curli expression of the
fimbriae in both samples (100%), type I fimbriae was more evident in the private hospital
samples (75%); private hospital showed high hydrophobicity (75%). Regarding the
production of hemolysin in both hospitals did not show hemolysis on solid medium, showed
only in liquid medium in blood carneiro. Não was no difference between the two hospitals
and the virulence properties of Escherichia coli found. This index of contamination for those
microorganism in the samples picked at the two hospitals and that, the contamination of the
enteral nutrition happens mainly for the lack of appropriate hygiene techniques during the
manipulator’s work, disinfecting preparation places and of the equipment and use of additives
no sterile or contaminated in the preparation of the diet may compromise the clinical outcome
of these patients.
Keywords: Factors of Virulence. E.Coli. Analysis. Diets Enterals. Public hospitals.
7
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Percentual de amostras de Nutrição Enteral dos hospitais público e
privado de São Luís- MA em desacordo com os padrões legais
vigentes....................................................................................................
Figura 2
33
Produção de fímbria curli por cepas de E. coli, na Figura A e produção
de fímbria manose sensível na figura B...................................................... 38
Figura 3
Adesão ao inox e látex das cepas de E.coli, proveniente de amostras de
nutrição enteral de um hospital público e um privado de São Luís- MA.
A adesão ao inox; B – adesão ao látex........................................................ 39
Figura 4
Produção de cápsula por cepas de E.coli, identificada pela presença de
colônia enegrecidas..................................................................................... 42
Figura 5
Hemólise em meio líquido em sangue de carneiro apresentada por
isolados de E.coli provenientes de dietas enterais de um hospital público
e um hospital privado de São Luís-MA......................................................
46
8
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Iniciadores usados para a identificação por PCR multiplex de
Escherichia coli enteropatogênica..............................................................
Tabela 2
Número de Amostras que apresentaram contaminação no hospital
público e privado com Escherichia coli.....................................................
Tabela 3
26
Número
de
isolados
de
Escherichia
coli
que
35
apresentaram
hidrofobicidade...........................................................................................
37
Tabela 4
Número de isolados de Escherichia coli que apresentaram Fímbria.......... 38
Tabela 5
Características de adesão dos isolados de Escherichia coli proveniente
de dietas enterais de um hospital público e privado de São Luís, MA.......
Tabela 6
41
Número de isolados de E.coli proveniente de dietas enterais de um
hospital público e privado que apresentaram mecanismo de adesão.......
44
9
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANVISA
– Agência Nacional de Vigilância Sanitária
BHI
– Infusão de cérebro e coração
CH
– Colite hemorrágica
DAEC
– Escherichia coli difusamente agregativa
Doc
– Densidade ótica do controle
Doi
– Densidade ótica do isolado
EAEC
– Escherichia coli enteroagregativa
ECD
– Escherichia coli diarreiogênica
Efa1
– EHEC factor for adherence
EHEC
– Escherichia coli entero-hemorrágica
EIEC
– Escherichia coli enteroinvasora
EPEC
– Escherichia coli enteropatogênica
ETEC
– Escherichia coli enterotoxigênica
LB
– Luria-Bertani
LEE
– locus of enterocyte effacement
Lesão A/E
– Lesão attaching and effacing
TSB
Caldo triptona de soja
10
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO..................................................................................................
12
2
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA....................................................................
15
2.1
Nutrição enteral................................................................................................
15
2.2
Escherichia coli diarreiogênicas........................................................................
16
2.3
Adesão como fator de virulência......................................................................
20
3
OBJETIVOS.......................................................................................................
22
3.1
Geral.................................................................................................................
22
3.2
Específicos..........................................................................................................
22
4
MATERIAIS E MÉTODOS..............................................................................
23
4.1
Amostras
de
dietas
enterais
industrializada
manipuladas.......................................................................................................
23
4.2
Análise microbiológica.....................................................................................
23
4.2.1
Quantificação de Coliformes Totais e Coliformes a 45º C (Termotolerantes)....
23
4.2.2
Detecção de Salmonella spp.................................................................................
24
4.2.3
Detecção de Staphylococcus aureus....................................................................
24
4.2.4
Contagem de Leveduras e Bolores.......................................................................
25
4.3
Identificação pela pcr multiplex molecular das categorias patogênicas de
escherichia coli...................................................................................................
4.4
Determinação
da
hidrofobicidade
de
25
superfície
célular..................................................................................................................
27
4.5
Identificação de fímbrias....................................................................................
27
4.5.1
Identificação da fímbria curli...............................................................................
27
4.5.2
Identificação da fímbria tipo I..............................................................................
27
4.6
Capacidade de adesão a materiais inertes......................................................... 27
4.6.1
Adesão ao vidro....................................................................................................
27
4.6.2
Adesão ao látex siliconizado e aço inox...............................................................
28
4.7
Aderência bacteriana em células HEP-2 E HT29.............................................
28
4.7.1
Cultivo e preparo das monocamadas celulares....................................................
28
4.7.2
Realização do teste de adesão em células HT29 e HEp-2....................................
29
4.8
Verificação da presença de fatores de virulência pela formação de cápsula
e biofilme...........................................................................................................
29
11
4.8.1
Avaliação da produção de cápsula.......................................................................
29
4.8.2
Indução de biofilme in vitro.................................................................................
30
4.9
Detecção da atividade hemolítica....................................................................... 31
4.9.1
Pesquisa da atividade hemolítica em meio sólido................................................
31
4.9.2
Cultivo na presença de íons..................................................................................
31
4.9.3
Pesquisa da atividade hemolítica em meio líquido..............................................
31
4.10
Análise da atividade enzimática........................................................................
31
4.10.1 Proteinase.............................................................................................................
31
4.10.2 Fosfolipase............................................................................................................. 32
4.10.3 Lipase...................................................................................................................
32
4.10
Análise e tabulação dos dados..........................................................................
32
5
RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................
33
6
CONCLUSÃO....................................................................................................
46
7
CONSIDERAÇÕES FINAIS.............................................................................
47
REFERÊNCIAS.................................................................................................
48
ANEXOS..............................................................................................................
55
12
1 INTRODUÇÃO
A nutrição enteral (NE) é um alimento para fins especiais, com ingestão
controlada de nutrientes, na forma isolada ou combinada, especialmente formulada e
elaborada para uso por sondas ou via oral, industrializado ou não, utilizada exclusiva ou
parcialmente para substituir ou complementar a alimentação oral em pacientes desnutridos ou
não, conforme suas necessidades nutricionais, em regime hospitalar, ambulatorial ou
domiciliar, visando à síntese ou manutenção dos tecidos, órgãos ou sistemas de acordo a
Resolução da Diretoria Colegiada - RDC nº 63/00 da Agência Nacional de Vigilância
Sanitária – ANVISA (BRASIL, 2001).
O suporte nutricional enteral é utilizado como uma terapia de rotina em pacientes
com deficiência energético-proteica, disfagia severa, grandes queimaduras, ressecção
intestinal e fístulas, os quais são, na maior parte das vezes, pacientes graves, organicamente
comprometidos e que estão sujeitos a longos períodos de hospitalização. Estão também
incluídos neste grupo pacientes em pós-cirúrgico, bebês prematuros e pacientes de terapia
intensiva (MAURÍCIO et al., 2008).
Nos países desenvolvidos é comum o uso de dietas enterais industrializadas, e no
Brasil, isto vem aumentando gradativamente. Essas dietas são práticas, nutricionalmente
completas e oferecem maior segurança quanto ao controle microbiológico e composição
centesimal. No entanto, estas formulações não estão acessíveis para a maioria da população
brasileira, em função do seu custo (MEDINA; NASCIMENTO; OLIVEIRA, 2009).
Sob o ponto de vista bacteriológico, as dietas enterais em pó, ricas em macro e
micronutrientes, constituem excelente meio para o crescimento de micro-organismos, após a
reconstituição (ARRUDA et al., 2009).
Segundo Carvalho, Morais, Sigulem (1999), ressaltam que a administração de
dietas eventualmente contaminadas pode não somente causar distúrbios gastrointestinais, mas
contribuir para infecções mais graves, principalmente em pacientes imunossuprimidos.
Vários estudos foram desenvolvidos objetivando a produção de dietas adequadas
para o tratamento de portadores de enfermidades crônicas, em geral, impossibilitados de ter
uma alimentação via oral durante períodos mais prolongados. Muitos avanços e benefícios
foram alcançados nessa área da nutrição clinica, porém melhorias ainda são reivindicadas para
baixar o custo e proporcionar melhor aproveitamento dos nutrientes dos alimentos
tradicionais, como a fibra dietética, os minerais, e as vitaminas (MEDINA et al., 2009).
13
Alguns critérios deverão ser estabelecidos para o preparo da alimentação enteral,
seguindo as normas da Resolução nº 63/00, que estabelece um controle da qualidade
microbiológica, onde estão estabelecidos os limites toleráveis de microorganismos, acima dos
quais ocorrerá comprometimento da aceitação da NE, afetando também a evolução clínica dos
pacientes submetidos a essa terapia (CARVALHO FILHO et al., 2008).
A contaminação microbiana dos componentes dessa terapia poderá prejudicar a
recuperação e o reestabelecimento do enfermo a ela submetido, contribuindo para o aumento
no risco de infecção. A contaminação da nutrição enteral ocorrerá principalmente pela falta de
técnicas de higiene adequadas durante o trabalho de manipuladores, desinfecção dos locais de
preparação e dos equipamentos utilizados e utilização de aditivos não estéreis ou
contaminados no preparo da dieta. Além disto, as fórmulas enterais constituem-se como
excelente meio para o crescimento de diversas espécies de micro-organismos ou de flora
patogênica ou não, devido as suas características intrínsecas, como presença de nutrientes,
atividade de água, pH e osmolaridade. Sendo assim, quanto maior a manipulação da fórmula
enteral antes da administração, maior o risco de contaminação (MEDINA et al., 2009).
Geralmente os alimentos são facilmente contaminados com micro-organismos
durante sua manipulação e processamento, e se eles tiverem condições de crescimento,
poderão alterar as características químicas e organolépticas, podendo deteriorá-las. Além
disso, poderão propiciar a ocorrência de toxinfecções alimentares. Assim, é importante que
haja controle rigoroso das condições de higiene na produção e comercialização de alimentos,
uma vez que a maior parte das doenças de origem alimentar se deve à manipulação
inadequada do produto durante seu processamento (MEDINA et al., 2009).
Quando se considera a qualidade microbiológica de alimentos, frequentemente se
utiliza a pesquisa de micro-organismos indicadores, que, quando presentes em um alimento,
poderão fornecer informações sobre o nível de sua contaminação e as condições higiênico sanitárias durante o processamento, produção ou armazenamento. No Brasil, os limites
microbianos são estabelecidos pela ANVISA, Ministério da Saúde, através das RDC nº 63/00
para dietas enterais, e a RDC nº 12/01 para alimentos em geral (BRASIL, 2001).
No caso de preparações dietéticas para fins especiais como a alimentação enteral,
inúmeras pesquisas têm sido realizadas para avaliar a qualidade microbiológica. Na maioria
dos casos, ressaltam os autores, haverá grande dificuldade em orientar e fiscalizar
eficientemente os inúmeros locais de preparação, quanto às condições de higiene na produção
e na administração destas dietas (MEDINA et al., 2009).
14
Com base na importância das condições higiênico- sanitárias para a segurança e
qualidade da Nutrição Enteral, observou-se a necessidade de avaliar os fatores de virulência
das Escherichia coli, encontradas nas amostras coletadas em uma Unidade de Produção de
dietas Enterais de um Hospital Público e de um Hospital Privado de São Luís – MA. E se
estas apresentaram-se dentro dos padrões exigidos pela Legislação vigente para garantir a
inocuidade das formulações enterais e se as E.coli encontradas podem interferir na
recuperação do paciente.
15
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 Nutrição enteral
O suporte nutricional é a administração de nutrientes em formulações enterais ou
parenterais para pacientes determinados com o propósito de manter ou restaurar-lhes o estado
nutricional. A nutrição enteral é a provisão de nutrientes no trato gastrintestinal (TGI) através
de uma sonda ou cateter quando a ingestão oral for inadequada (MAHAN; ESCOTT-STUMP,
2005).
Segundo Waitzberg et al. (2004), indica-se terapia de nutrição enteral (TNE) em
duas situações: a primeira quando houver risco de desnutrição, ou seja: quando a ingestão oral
for inadequada para prover de dois terços a três quartos das necessidades diárias nutricionais;
e a segunda é quando o trato digestivo estiver total ou parcialmente funcionante. Em alguns
casos clínicos, apesar do tubo digestivo estar íntegro, o paciente não quer, não pode, ou não
deve alimentar-se pela boca.
Os casos mais frequentes de contraindicação do uso de TNE se aplicam a doenças
terminais, síndrome do intestino curto, obstrução intestinal mecânica, sangramento
gastrintestinal, vômitos, diarreia; fístulas intestinais, isquemia gastrintestinal, íleo paralítico,
inflamação do trato gastro intestinal (TGI), hiperêmese gravídica, pois impossibilitam o uso
do TGI (WAITZBERG et al., 2004).
Uma vez que o paciente tenha sido avaliado e considerado um bom candidato à
nutrição enteral, o clínico selecionará a via de acesso apropriada para a colocação da sonda. A
seleção do acesso enteral dependerá de vários fatores, entre eles a duração prevista da
alimentação enteral, o grau de risco de aspiração ou deslocamento da sonda, presença ou
ausência de digestão e absorção normais, se uma intervenção cirúrgica estiver ou não
planejada e questões da administração a exemplo de viscosidade e volume da fórmula
(MAHAN; ESCOTT-STUMP, 2005).
As vias de acesso em nutrição enteral poderão estar dispostas no estômago,
duodeno ou jejuno. Em pacientes que necessitam de nutrição enteral por curto período de
tempo (inferior a 6 semanas), a sonda nasoenteral é a mais utilizada, graças a seu baixo custo
e fácil colocação. Já a gastrostomia e a jejunostomia são utilizadas, em geral, quando a
duração da terapia nutricional (TN) for superior a 6 semanas (CUPPARI, 2005).
Depois de selecionada a via de acesso, de conhecer o tipo de administração a que
vai ser submetida a NE, iniciar-se-á a seleção da fórmula enteral. Para a seleção de uma dieta
16
enteral, é necessário conhecer as exigências específicas do paciente e a composição exata da
fórmula. A dieta escolhida precisa ser nutricionalmente completa e adequada ao uso em
períodos curtos e longos; cumpre satisfazer às exigências nutricionais do paciente, ser bem
tolerada, de fácil preparação e econômica (CUPPARI, 2005).
A nutrição enteral pode ser classificada em dois tipos de preparações, segundo
Coppini e Vasconcelos (2004): a não-industrializada e a industrializada. As preparações não
industrializadas referem-se às NE que são preparadas à base de alimentos in natura, produtos
alimentícios e/ou módulos de nutrientes. Tais preparações tenderão a ser usadas em situações
em que o trato gastrintestinal encontrar-se com capacidade de digestão e absorção normais,
tornando possível o emprego de nutrientes na forma intacta.
As preparações industrializadas em pó para constituição e as industrializadas
semiprontas para uso são classificadas como nutrição enteral em sistema aberto, que é a NE
que requer manipulação prévia à sua administração, para uso imediato ou atendendo à
orientação do fabricante. A industrializada pronta para uso é classificada como NE em
sistema fechado, que é estéril, acondicionada em recipiente hermeticamente fechado e
apropriado para a conexão ao equipo de administração (BRASIL, 2000).
Sob o ponto de vista bacteriológico, as dietas enterais em pó, são ricas em macro e
micro nutrientes e constituem excelente meio para o crescimento de micro- organismos, após
a reconstituição (ARRUDA, 2009)
Quando se considera a qualidade microbiológica dos alimentos, frequentemente se
utiliza a pesquisa de micro organismos indicadores, que quando presentes em um alimento
podem fornecer informações sobre o nível de contaminação e as condições higiênico sanitária
durante o processamento e, produção ou armazenamento. Essa contaminação foi constatada
por Lima et al. (2005), ao evidenciarem a contaminação de dietas enterais por coliformes
totais, Escherichia coli e bactérias mesófilas aeróbias em 25 %, 10 % e 20 % das amostras
analisadas, respectivamente. Maurício et al. (2008) também observaram em 100 % das
amostras dos hospitais analisados, contaminação por coliformes a 45º acima do padrão de
referência da RDC nº 12/2001.
2.2 Escherichia coli diarreiogênicas
A diarreia aguda é uma síndrome clinica que possui várias etiologias, sendo
caracterizada por alterações do volume, consistência e frequência das fezes. Estas alterações
também costumam ser acompanhada por vômitos, febre, cólicas e dores abdominais
17
(EDUARDO, 2008). Dentre os agentes causadores desta síndrome podemos destacar vírus,
protozoários e bactérias. A bactéria E. coli, pertencente ao grupo diarreiogênico, é uma das
responsáveis por causar esta síndrome.
A bactéria E. coli é um bacilo Gram-negativo, pertencente à família
Enterobacteriaceae, descrita em 1885 por um pediatra alemão, Theodor Escherich (18571911), nas fezes de uma criança que vinha sofrendo de diarreia (ESCHERICH, 1885). Em
1893, um veterinário dinamarquês postulou que a espécie E. coli compreenderia diferentes
linhagens, algumas sendo patógenas, enquanto outras não (JENSEN, 1893). O postulado de
Jensen provou ser verdadeiro. Várias linhagens patogênicas de E. coli estão associadas a
doenças intestinais, infecções do trato urinário e patologias internas, tanto em seres humanos,
quanto em outras espécies de animais. Esses sorotipos patogênicos de E. coli foram, portanto,
nomeados pela síndrome clínica que poderiam causar, sendo classificadas em E. coli
diarreiogênica (DEC), E. coli uropatogênica (UPEC), E. coli septicémica (SePEC), E. coli
associada à meningite neonatal (NMEC), etc. (MAINIL, 2003).
No entanto, essa classificação foi descartada a partir da identificação in vitro de
cepas patogênicas de E. coli. A primeira resposta veio do sistema de sorotipagem
desenvolvido por Kauffmann na década de 1940, isto é, a identificação de antígeno somático
(antígeno O), capsular (antígeno K) e flagelar (antígeno H), que são antígenos de superfície. O
antígeno somático (O) é um polissacarídeo termoestável (121ºC por 2h) e forma a parte do
lipopolissacarídeo presente na membrana externa das bactérias Gram negativas. O antígeno
capsular (K) refere-se aos polissacarídeos capsulares que envolvem a parede celular,
entretanto, 31 deles não possuem natureza polissacarídica. O antígeno flagelar (H) possui
estrutura de natureza proteica e é termolábil (100ºC por 30 min) (KAUFFMANN, 1947). A
presença de fímbrias, anteriormente caracterizada pelo fenótipo K, foi removida desta
classificação, passando a caracterizar o antígeno K apenas pela presença do polissacarídeo. O
antígeno proteico fímbria foi dada a designação F (ORSKOV et al., 1982).
A sensibilidade e especificidade limitada da técnica de sorotipagem torna a
detecção cara e difícil, de forma que um pequeno número de laboratórios de referência ainda a
utiliza. Assim, detecção de E. coli diarreiogênica tem se concentrado cada vez mais na
identificação das características que determinam a virulência desses organismos. Isso poderá
incluir ensaios fenotípicos in vitro que se correlacionam com a presença de traços de
virulência específicos ou a detecção dos genes que codificam essas características (MAINIL,
2013).
Os fatores de virulência presentes em E. coli são codificados por cromossomos,
18
plasmídios e DNA de bacteriófagos (VIDAL et al., 2005). A PCR é um método genotípico
largamente utilizado para identificação dos principais patótipos de DEC. Esta importante
ferramenta de diagnóstico utiliza iniciadores específicos para amplificação dos genes
cromossômicos e/ou plasmidiais respectivos aos patotipos de DEC (VICENTINI, 2013).
Alguns genes são considerados específicos para as categorias patogênicas de
DEC. A presença dos genes eae (intimina) e bfpA (fímbria BFP) e com ausência dos genes stx
(toxina Shiga) pode definir a categoria patogênica EPEC típica, já a presença de eae
(intimina) com ausência de stx (toxina Shiga) define EPEC atípica. Semelhantemente, os
genes elt e/ou est (enteroxinas) definem o grupo ETEC e os genes ipaH (antígeno de invasão)
definem o grupo EIEC (COSTA et al, 2010). Para definir as linhagens diarreiogênicas EAEC
poderão ser observados a presença dos genes aggRe e as regiões conservados dos genes stx1 e
stx2 podem definir a linhagem EHEC (TOMA et al., 2003).
As
linhagens
causadoras
de infecções
intestinais,
designadas
E. coli
diarreiogênicas (DEC), são divididas em seis patótipos: E. coli enteropatogênica (EPEC), E.
coli enterohemorrágica (EHEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteroagregativa
(EAEC), E. coli enteroinvasora (EIEC), E. coli de aderência difusa (DAEC) (FOCACCIA,
2005). As EPECs estão predominantemente presentes em crianças com idade inferior a um
ano nos países desenvolvidos. São classificadas em típicas (quando presente o plasmídeo
EAF, responsável por codificar genes que produzem fimbrias) e atípicas. Ao contrário das
EPEC típicas, encontradas quase exclusivamente em seres humanos, as amostras atípicas são
comuns em animais domésticos (FRANZOLIN et al., 2005; OSUGUI et al., 2014).
As E. coli enterohemorrágicas (EHECs) estão relacionadas a surtos epidêmicos de
diarreia em países desenvolvidos. O fator-chave para a virulência das EHEC é a produção da
toxina de Shiga (Stx) ou verotoxina (VT), codificada por genes bacteriofágicos, responsáveis
pela maioria das manifestações clínicas de infecções por EHEC (BOERLIN et al., 1999).
As E. coli enterotoxigênica (ETECs) são amostras ou sorotipos de E. coli, que
produzem as toxinas LT (termolábil) e ST (termoestável), ou uma das duas e expressam
fatores de colonização. A infecção por ETEC é caracterizada pela adesão e produção de suas
toxinas, provocando desta forma uma diarreia secretória. A criança poderá apresentar
desidratação grave nos primeiros anos de vida (RODRIGUES et al., 2008).
A característica que define o patótipo E. coli enteroagregativa (EAEC) é seu
padrão de adesão a células epiteliais, que consiste em um agregado celular lembrando tijolos
empilhados, onde, na mucosa intestinal, as EAEC formam um biofilme espesso. Os
mecanismos patogênicos das EAEC ainda não foram elucidados (FOCACCIA, 2005).
19
As cepas de E. coli enteroinvasora (EIEC) poderão ser identificadas, entre outros
critérios, pela invasão ao epitélio celular e associação com disenteria (NATARO; KAPER,
1998). E. coli aderente difusamente (DAEC) é um patótipo caracterizado por seu padrão de
adesão, que envolve toda a célula (adesão difusa). Alguns estudos sugerem que poderá causar
diarreia em certos grupos de crianças (FOCACCIA, 2005).
Um estudo realizado para identificar a presença de coliformes fecais e bactérias E
coli diarreiogênicas (DEC) em diferentes fontes de água potável em focos endêmicos de
diarreia na Bengala Ocidental, revelou que mais de um quinto (21,4%) das amostras foram
identificadas, por sorotipagem, com a presença da E. coli e análises moleculares revelaram a
presença de E. coli multirresistentes EPEC, EIEC e ETEC em 9% das amostras. Nesta
pesquisa os autores mostraram que períodos chuvosos parecem estar mais propícios à diarreia
associada a E. coli diarreiogênicas. Essas bactérias mostram-se multirresistentes a diversas
drogas como tetraciclina, canamicina, furazolidona, amoxicilina, ampicilina, norfloxacina e
ciprofloxacina, podendo ser a causa da grande potencialidade de contaminação em ambientes
aquáticos (BATABYAL et al., 2013).
O Brasil também apresenta surtos de E. coli diarreiogênicas. Em Botucatu – SP,
um trabalho realizado com 54 crianças do centro de saúde escola, no período de junho de
1997 a maio de 1998, identificou um total de 59 diferentes estirpes de E. coli a partir de 44
(81,0%) dos 54 pacientes estudados. A partir de marcadores moleculares de virulência de E.
coli diarreiogênicas, foi possível identificar a presença de EAEC e DAEC. Entre estas, EAEC
foi predominante, com um percentual 20,4%, estes dados levaram os autores a afirmar que a
incidência de diarreia infecciosa e a prevalência de um dado agente causal são estritamente
associadas a fatores socioeconômicos tais como nutrição, saneamento e habitat da população
(RODRIGUES et al., 2002).
Segundo Franzolin et al. (2005) avaliaram a prevalência de Escherichia coli
diarreiogênicas em crianças com diarreia em Salvador na Bahia. Em um total de 175
amostras, E. coli foi encontrado em 138 amostras. Foram identificadas sete categorias e DEC.
O isolado mais frequentemente foi o EPEC atípico (10,1%), seguido por ETEC (7,5%), e
EAEC (4,2%) (FRANZOLIN et al., 2005). EPEC atípica são patógenos entéricos emergentes
que só recentemente começou a atrair a atenção dos investigadores (TRABULSI; KELLER;
GOMES, 2002).
Semelhantemente, Orlandi et al. (2006) observaram em crianças da região
amazônica a presença de E. coli diarreiogênicas em 86 (18,2%) delas com diarreia. A
20
caracterização de estirpe por PCR mostrou que EPEC foi a estirpe mais frequentemente
associada à diarreia (6,1% de casos, com 2,1% sendo EPEC típica e 4,0% EPEC atípica),
seguido por E. coli enteroagregativa (EAEC) (5,5%) e de ETEC (4,4%). A alta frequência
desses organismos nesses estudos reforça a necessidade de mais pesquisas sobre a sua
epidemiologia, patogênese e papel na as diferentes formas de diarreia.
As Escherichia coli diarreiogênicas (DEC) são consideradas importante causa de
diarreia nos países em desenvolvimento. Para sua correta identificação, esses microorganismos deverão ser diferenciados dos membros não patogênicos da microbiota intestinal.
2.3 Adesão como fator de virulência
Um dos fatores de virulência, que desencadeia um mecanismo patogênico,
envolve adesão de E. coli à membrana plasmática dos enterócitos, provocando a destruição
das microvilosidades adjacentes. Esta aderência desencadeia a diarreia, resultado da perda das
propriedades absortivas das células infectadas, caracterizando-se pela presença de muco
abundante, sem sangue, acompanhada de dores abdominais, febre, vômitos e desidratação,
sendo reconhecida inclusive por causar diarreia crônica (ALVES, 2009).
Pelo menos três classes gerais de diferentes adesinas de E. coli
podem ser
definidas: diferentes apêndices como fímbrias, fibrilas e curli, a família afimbrial (Afa) e
proteínas da membrana exterior específica (OMPs), como a intimina (MAINIL, 2005).
Duguid et al. (1955) descreveram ao microscópio eletrônico os apêndices visíveis
responsáveis pela aglutinação de eritrócitos por algumas cepas de E. coli, que eles nomearam
de "Fímbria". Inicialmente esse apêndice também recebeu o nome de “Pili”.
Orskov e Orskov (1990) propuseram quatro classes de apêndice com base na sua
estrutura: rígidas, grossa (5-7 nm) com um furo central, chamados de fímbrias; flexível, fino
(2-3 nm) sem furo axial, apêndices peritricosos ou fibrilas; flexível, moderadamente grossa
(4-6 nm), formando apêndices polares ou fímbrias tipo 4; e altamente flexível, muito fino,
apêndices agregado ou curli.
As adesinas fímbrias e fibrilas de E. coli foram inicialmente descritas em E. coli
enterotoxigênica (ETEC) de suínos, bezerros e, em seguida, nos seres humanos (NATARO;
KAPER, 1998; GYLES; FAIRBROTHER, 2010). O primeiro passo para infecções por
qualquer microorganismo enteropatogênico (ETEC) é a colonização do epitélio intestinal, e,
neste aspecto, a E. coli enterotoxigênica produz uma série de fimbrias que lhe confere a
capacidade de aderência ao epitélio. Estre estas, a maior frequências são as cepas CFA-I y
21
CFA-II. Estas fimbrias se aderem a receptores específicos que se encontram na membrana dos
enterócitos do intestino delgado proximal (ESTAPÉ; ZBOROMYRSKA, 2013).
As mais conhecidas E. coli fímbrias tipo 4 ou BFP, são produzidos por E. coli
enteropatogênica típica (tEPEC) (WU; FIVES-TAYLOR, 2001). O BFP, codificado por genes
localizados no plasmídeo, foi a princípio pensado estar envolvido na adesão aos enterócitos
humanos, mas hoje acredita-se que desempenha função de ajudar as bactérias a ficar unidas
formando micro colônias na superfície das células hospedeiras, também chamado "adesão
localizada" (LA) (SCALETSKY; SILVA; TRABULSI, 1984). Alguns trabalhos também têm
relatado a importância das fímbrias tipo 4 em cepas ETEC presentes em seres humanos na
promoção da colonização intestinal, podendo também desempenhar um papel na proteção das
bactérias contra agentes antimicrobianos (GIRON et al., 1997; CLAVIJO; BAI; GOMEZDUARTE, 2010).
Os genes que codificam a fímbria curli, são localizados no cromossomo, este tipo
de fímbrias são produzidas por diferentes estirpes patogénicas, como algumas cepas E. coli
enterohemorrágica EHEC. No entanto, são necessários mais estudos, especialmente in vivo
para entender-se mais precisamente o seu papel na patogenicidade de E. coli (MAINIL,
2013).
22
3 OBJETIVOS
3.1 Geral
Analisar os fatores de virulência em isolados bacterianos recuperados de amostras
de dietas enterais industrializadas manipuladas de um hospital público e um privado do
município de São Luís - MA.
3.2 Específicos
a) Determinar o número mais provável (NMP) de coliformes totais e
termotolerantes.
b) Identificar os possíveis marcadores de virulência genotipicamente nos isolados;
eae (para EPEC e EHEC), stx1 e stx2 (para EHEC), elt e est (para ETEC), ipaH
(para EIEC) e aggR (para EAEC)
c) Analisar as propriedades relacionadas com a adesão.
d) Detectar fenotipicamente a produção de exoenzimas e hemolisina nas amostras
de E.coli;
23
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Coleta das amostras de dietas enterais industrializada manipuladas
As amostras foram coletadas com qualidade física satisfatória e características
organolépticas próprias de dois hospitais do município de São Luís – MA, sendo 15 amostras
de um público e 15 de um particular, total de 30 amostras, entre o período de março de 2013 a
abril de 2014. Foi estabelecida como unidade amostral 100 (ml) de cada amostra de dieta
enteral manipulada coletada. Todas as amostras foram coletadas separadamente em turnos e
horários diferentes. Em seguida, foram acondicionadas individualmente em frascos de vidro
de primeiro uso, sem contato manual, transportadas em caixa isotérmica, contendo saco de
gelo cristal, para o Laboratório de Microbiologia Médica e de Alimentos – Núcleo de
Doenças Endêmicas e Parasitárias do Centro Universitário do Maranhão - UNICEUMA, para
a realização das análises microbiológicas.
4.2 Análise microbiológica
Para todas as amostras foram realizadas as análises de contagem de bactérias,
leveduras e fungos, determinação de coliformes a 45º C, detecção de Escherichia coli,
Staphylococcus aureus e pesquisa de Salmonella spp (SILVA; JUNQUEIRA; SILVEIRA,
2001).
4.2.1 Quantificação de coliformes totais e coliformes a 45º C (Termotolerantes).
Após a fase de incubação dos tubos com lactosado simples, foi transferido 1 mL
do crescimento bacteriano: turvação do meio e presença de bolhas ou ar nos tubos de Durhan,
para tubos de ensaio contendo 10 mL de caldo Verde Brilhante (VB), os quais foram
incubados em estufa, a 37ºC por 24 a 48 horas, para pesquisa de coliformes totais e para tubos
de ensaio contendo 10 mL de caldo EC incubados por 24 a 48 horas a 44,5 ºC, em banho
maria, para pesquisa de coliformes termotolerantes.
A partir dos meios líquidos positivos (turvos e com produção de gás nos tubos
com Durhan) foi feita a tabulação dos dados pela Tabela de Hoskins, número mais provável
por militros (NMP/ml) e foram estriadas placas de Petri contendo ágar MacConkey, mantidas
em estufa por 24 horas a 35-37ºC. Após período de incubação, dos meios em que houve
24
crescimento, foi removida uma pequena porção da colônia crescida, com o auxílio da alça de
níquel cromo, e inoculado no kit para provas bioquímicas Enterokit B (Probac) para a
identificação de coliformes totais e Escherichia coli.
Para obtenção do resultado da análise microbiológica das amostras foi feita a
analise comparativa com os valores preconizados pela legislação brasileira, para pratos
prontos para o consumo à base de pescados cru e cereais, descritos na RDC nº12 (BRASIL,
2001).
Quando os resultados forem superiores aos preconizados, ou houver presença e/ou
quantificação de outros micro- organismos patogênicos não especificados pela resolução, o
produto é considerado em “condições sanitárias insatisfatórias”.
4.2.2 Detecção de Salmonella spp
A partir dos tubos positivos para crescimento microbiano dos tubos de caldo
lactosado simples, foi transferido 1 mL do inóculo para tubos com caldo Rapapport e
incubados os meios a 35-37ºC por 24 horas. Após 24 horas, os tubos contendo Rapapport
foram agitados e com o auxílio da alça de níquel cromo, foi estriada uma alça em placa de
Petri com meio seletivo e diferencial Salmonella- Shigella (SS), as quais foram incubadas
invertidas a 35- 37 º C por mais 24 horas.
Transcorrido o período de incubação foram observadas colônias suspeitas : com
centro negro devido à produção de H2S. Das colônias suspeitas foi retirada um a porção que
foi inoculada no kit para provas bioquímicas Enterokit B (Probac) para a identificação.
4.2.3 Detecção de Staphylococcus aureus
Foi transferido 0,1 mL dos tubos de ensaio de caldo lactosado simples par a placas
de Petri contendo o meio Ágar Manitol Salgado. O inóculo foi espalhado na placa até seu total
secamento, com a ajuda da alça de Drigalsky. As placas foram incubadas invertidas a 35-37ºC
por 48 horas. Após período de incubação, as colônias desenvolvidas foram submetidas ao
teste de coagulase pelo Staphy-Test para identificação.
4.2.4 Contagem de leveduras e bolores
Foram transferidos 0,1 mL das diluições de cada amostra com auxílio de
25
micropipeta automática, para placas de Petri contendo Ágar Saboroud, em duplicata. Espalha
– se o inóculo com auxilio de alça de Drigalsky deixando-se, na sequência, as placas em
repouso para que o meio de cultura absorvesse a amostra diluída. As placas serão incubadas a
25ºC/5 dias. Após a incubação, as unidades formadoras de colônias (UFC) foram contadas
com auxílio de contador de colônias manual. O resultado final foi calculado multiplicando-se
o resultado da contagem de colônias pelo fator de diluição correspondente a placa contada,
sendo expresso em UFC/mL.
4.3 Identificação pela PCR multiplex molecular das categorias patogênicas de
Escherichia coli
Para detecção de genes de virulência em E. coli, o DNA genômico, de 17 isolados
foi extraído pelo método da fervura. Para tal, um alíquota de 2mL de cada cultura de 24horas
de E.coli crescida em meioAgar nutriente por 24 horas a 37ºC, foi centrifugado 10.000 rpm
por 5 minutos, o sobrenadante foi descartado e o sedimento bacteriano foi lavado em 700 ul
de solução salina tamponada (PBS) pH 7.5. Novamente foi centrifugado 10.000 rpm por 5
minutos e o PBS descartado. O sedimento bacteriano foi ressuspenso em 400ul de Tris-EDTA
(TE) 1 x, pH.75. Os tubos contendo as amostras foram colocados em fervura a 100ºC durante
15 minutos e centrifugado por 1 minuto a 10.000 rpm e o sobrenadante foi recolhido e
guardado a -20ºC até o uso. A verificação da qualidade/quantificação relativa do DNA
extraído foi feita em gel de agarose 0,8%, contendo um marcador de massa molecular (New
England Biolabs). Os ensaios de mPCR foram feitos com iniciadores específicos, previamente
descritos por TOMA et al. (2003) para a identificação dos grupos de E. coli :eae (para EPEC e
EHEC), stx1 e stx2 (para EHEC), elt e est (para ETEC), ipaH (para EIEC) e aggR (para
EAEC) (Tabela 01).
Os ensaios de mPCR foram feitos em termociclador Amplitherm
(Eppendorf) num volume final de 25 uL contendo 15 picomoles de cada iniciador, 12.5 µl do
Master Mix (PROMEGA ®, Madison, USA), mais 100 ng do DNA bacteriano mais água
livre de nuclease para completar o volume final de 25 µl. O programa de amplificação
consistiu de um passo inicial de desnaturação de 94ºC por 5 minutos, seguidos de 30 ciclos de
94ºC por 1minuto, 52ºC por 1 minuto e 72ºC por 1 minuto e uma extensão final a 72ºC por 10
minutos.
O tamanho dos fragmentos amplificados foi aferido por eletroforese em gel de
agarose 2%, que foi submetido à eletroforese em tampão TBE 0,5X (Tris-borato-EDTA)
26
[100mM Tris-base; 2,0 mM de solução 0,5 EDTA (pH 8,0) e 50 mM ácido bórico] a 85 mV
durante 2 horas (SAMBROOK; FRITSCH; MANIATIS, 1989). Após a eletroforese, os géis
foram corados em uma solução de brometo de etídio (1:1000), durante 20 minutos
e
observados em transiluminador ultravioleta. Para a determinação do tamanho dos produtos da
mPCR foi incluído em cada corrida um marcador de tamanho molecular 100pb DNA ladder
(PROMEGA, EUA).
Como controle positivo foram utilazados as seguintes bactérias da espécie E. coli:
ATCC 042(EAEC), ATCC 234869 (EPEC), ATCC 1381-7 (EIEC), ATCC 2781-8 (STEC) e
ATCC 1651-1 (ETEC) (TOMA et al., 2003).
Tabela 1 - Iniciadores usados para identificar os isolados Escherichia coli enteropatogênica
DESIGNAÇÃO
Sequência (5' a 3')
SK1
CCCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG
SK2
CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC
Vtcom-u
GAGCGAAATAATTTATATGTG
VTcom-d
TGATGATGGCAATTCAGTAT
AL65
TTAATAGCACCCGGTACAAGCAGG
AL125
CCTGACTCTTCAAAAGAGAAAATTAC
LTL
TCTCTATGTGCATACGGAGC
LTR
CCATACTGATTGCCGCAAT
ipaIII
GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC
ipaIV
GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC
aggRks1
GTATACACAAAAGAAGGAAGC
aggRkas2
ACAGAATCGTCAGCATCAGC
Gene
Tamanho do
produto
amplificado (pb)
Eae
881
Stx
518
Est
147
Elt
322
ipah
619
aggR
Fonte: TOMA et al. 2003.
254
27
4.4 Determinação da hidrofobicidade de superfície célular
Após crescimento em BHI ágar por 24h a 37°C, as culturas foram suspensas em
concentrações crescentes de sulfato de amônio [(NH3)2SO4], de 0,5M, 1,0M, 1,5M, 2,0M,
2,5M e 3,0M. A formação de grumos em até dois minutos após a suspensão indicou resultado
positivo. Considerou - se amostra hidrofóbica aquela que formou grumos em concentrações
abaixo de 2M de sulfato de amônio (SCHMIDT et al.,1998).
4.5 Identificação de fímbrias
4.5.1 Identificação da fímbria curli
Micro organismos cultivados em meio Luria Bertani (LB), com pH igual a 8,a 37º
C/ 24h foram semeados em placas de LB (sem sal) contendo 0.004% de Vermelho Congo e
0.002% de Azul Brilhante. As placas foram incubadas por 24 a 48 horas em temperatura
ambiente. Colônias vermelhas ou rosas são indicativas de bactérias produtoras de curli (DA
RE, GHIGO, 2006).
4.5.2 Identificação da fímbria tipo I
Para a identificação foram feitos cultivos em BHI por 24 horas a 37ºC. Logo após,
uma porção de cada cultivo foi centrifugada três vezes (12000xg por 15 minutos), sempre
descartando-se o sobrenadante e colocando-se PBS com pH 7,4. Cerca de 500µl dos isolados
foram misturados, em lamínulas de vidro, com 500µl de sangue lavado três vezes com PBS,
com e sem adição de manose. As amostras que produziram hemaglutinação somente na
ausência de manose foram consideradas positivas para fímbria tipo I (CLEGG; OLD, 1979).
4.6 Capacidade de adesão a materiais inertes
4.6.1 Adesão ao vidro
Os ensaios para verificação da capacidade de adesão foram feitos segundo a
metodologia de Garcia-Aljaro et al. (2006), com algumas modificações. Lamínulas redondas
28
de vidro foram colocadas em poços de microplacas (24 poços) contendo Brain Heart Infusion
(BHI). Posteriormente, O inoculo foi padronizado segundo a escala de turbidez 0,5 da escala
de MacFarland. Em seguida inoculou-se 100μL da suspensão bacteriana previamente crescida
em BHI, em cada poço e a placa foi incubada por 3h/37 ºC. Depois, a placa foi lavada 3 vezes
com PBS (pH 7,2), as lamínulas foram coradas com cristal violeta por 10 minutos e depois
com fuscina por mais 10 minutos. A microplaca foi lavada novamente com PBS (pH 7,2), as
lamínulas retiradas e fixadas em lâminas para serem examinadas por microscopia de luz.
4.6.2 Adesão ao látex siliconizado e aço inox
No presente trabalho, foram utilizados fragmentos de látex siliconizado (cateter
urinário, Solidor®) medindo 0,5 mm de diâmetro e fragmentos de agulha medindo 1 cm. Os
fragmentos foram transferidos para tubos de ensaio, contendo 5 mL de caldo BHI e
esterilizados em autoclave por 15 minutos a 120°C para posteriormente serem utilizados. As
suspensões bacterianas foram preparadas a partir de inóculos previamente crescidos em Ágar
Muller Hinton, de onde se retiraram colônias bacterianas e foram transferidas para tubos com
3ml de salina 0,9% até adquirirem a turbidez 0,5 da escala de MacFarland. Em seguida,
retirou-se 0,1ml de cada suspensão preparada e inoculou-se aos tubos contendo BHI + látex
siliconizado e BHI + inox. Os tubos foram incubados em estufa bacteriológica a 37°C por 3 h
e, a seguir, retirados, lavados em salina 0,9%. Os tubos controles não receberam inóculo
bacteriano, mas receberam o mesmo tratamento que as amostras bacterianas testadas.
Após este período, todos os fragmentos de inox e látex siliconizado, foram
lavados em solução fisiológica e transferidos para 5mL de solução salina esterilizada. Em
seguida, foi realizada uma intensa homogeneização em aparelho Vortex durante 30s. Depois,
foram retiradas alíquotas de 0,1ml da suspensão obtida que foram semeadas em duplicata em
Ágar Muller Hinton, e as placas foram incubadas a 37ªC/ 24h (GOMES et al. 2012) com
adequações.
4.7 Aderência bacteriana em células HEp-2 e HT29
4.7.1 Cultivo e preparo das monocamadas celulares
As células HT29 (carcinoma de intestino humano) e HEp-2 (carcinoma de laringe)
foram descongeladas em banho-maria a 37o C e transferidas para uma garrafa de cultura de
29
células contendo meio MEM (meio mínimo essencial de Eagle modificado / Cultilab),
suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB / Cultilab) e 1% de solução de antibióticos
contendo penicilina (1000 U /mL; Sigma) e estreptomicina (250 μg / mL; Sigma). Os frascos
de cultura foram incubados em atmosfera de 5% de CO2 e 37 o C, por 48 h, até a formação do
tapete celular. Após esse período, o meio foi descartado, sendo adicionada à cultura celular
uma solução de ATV (Associação Tripsina-Versene / Cultilab) para o descolamento do tapete.
As células foram ressuspensas no meio MEM, acrescido de 10% de soro fetal bovino (SFB) e
1% de antibióticos, para um número estimado de 2,5 x células / mL. A suspensão de células
foi distribuída em microplacas de 24 cavidades, contendo lamínulas, em volumes de 1mL por
cavidade. As placas foram incubadas a 37 o C em atmosfera de 5% de CO2 por 48 h ou até que
a monocamada atingisse a semi-confluência.
4.7.2 Realização do teste de adesão em células HT29 e HEp-2
O inoculo foi padronizado segundo a escala de turbidez 0,5 da escala de
MacFarland. Em seguida 40μL das amostras de E. coli cultivadas em caldo triptona de soja
(TSB) por 18h a 37 o C em agitação de 150 RPM foi adicionado em placas de 24 orifícios,
contendo monocamadas celulares semiconfluentes de células HT29 e HEp-2 em meio MEM
acrescido de SFB a 2% na ausência ou presença de D-manose a 2%. Depois de 2h de
incubação a 37o C em atmosfera de 5% de CO2 (período de infecção), as placas foram lavadas
com PBS e adicionado ao meio 1mL de MEM acrescido de SFB com e sem manose. Após 2h
(período de multiplicação), cada uma das placas foi lavada com PBS (pH 7,4) a 0,05M e as
células fixadas com metanol por um período mínimo de 10 minutos. As preparações foram
coradas com May-Grunwald / Giemsa e analisadas quanto ao padrão de aderência em
microscópio óptico (Nikon). (SCALETSKY; SILVA; TRABULSI, 1984).
4.8 Verificação da presença de fatores de virulência pela formação de cápsula e biofilme
4.8.1 Avaliação da produção de cápsula
A avaliação da capacidade de E. coli de produzir cápsula como teste presuntivo
para a formação de biofilme, foi realizada pelo método de semeadura em Ágar Vermelho
Congo (AVC), descrito por Freeman, Falkiner e Keane (1989), com pequenas modificações.
Colônias de E.coli obtidas pelo crescimento prévio overnight em BHI foram semeadas por
30
esgotamento no meio AVC e incubadas a 37°C por 24 horas. Os resultados foram avaliados
de acordo com a coloração apresentada pelas colônias. As amostras foram consideradas
produtoras de cápsula quando apresentaram coloração preta e as não produtoras de cápsula
quando apresentaram coloração vermelha.
4.8.2 Indução de biofilme in vitro
A formação de biofilme por E. coli foi avaliada em placas de microtitulação de
poliestireno pelo método de Cristal Violeta descrito por Stepanovic et al. (2004), com
algumas modificações. Primeiramente, o inoculo foi padronizado segundo a escala de turbidez
0,5 da escala de MacFarland. Depois as amostras foram inoculadas em caldo BHI e incubadas
a 37°C por 24 horas. Em seguida, uma porção do caldo de cultivo foi diluída (1:40) em meio
BHI estéril. Os poços das placas de microtitulação foram preenchidos sequencialmente com
alíquotas de 200 μL de cada amostra em triplicata. No controle negativo, transferiram-se
somente 200 μL de caldo BHI em triplicata. Após preenchidas, as placas foram incubadas a
37°C por 24 horas em estufa microbiológica. Posteriormente foram lavadas três vezes com
PBS (pH 7,4) e deixadas secar à temperatura ambiente. Depois foi adicionado o Cristal violeta
(200 μL/cavidade) e as placas foram incubadas por 15 minutos à temperatura ambiente. Em
seguida cada cavidade foi lavada com água destilada estéril por três vezes e deixadas secar a
temperatura ambiente.
A avaliação de formação de biofilme foi realizada através da leitura da
absorbância de cada poço, utilizando-se o espectrofotômetro (BIO-RAD Laboratories PR
2100), em comprimento de onda de 490 nm.
Com base nas densidades ópticas dos isolados (DOi) e tomando-se por
fundamento a densidade óptica do controle negativo (DOc), os isolados foram classificados
nas seguintes categorias:
a) Não produtor: DOi < Doc;
b) Produtor fraco: DOc < DOi  (2x Doc);
c) Produtor moderado: (2x DOc) < DOi  (4x DOc);
d) Produtor forte: (4x DOc < DOi).
31
4.9 Detecção da atividade hemolítica
4.9.1 Pesquisa da atividade hemolítica em meio sólido
Para a pesquisa de hemolisina em ágar sangue as amostras de E. coli foram
inicialmente cultivadas em meio BHI a 37°C por 24 h. Após o crescimento bacteriano, as
linhagens foram semeadas sobre e em profundidade em ágar Muller Hinton contento 5% de
hemácias de carneiro ou de cavalo (BEUTIN; ZIMMERMANN; GLEIER, 1988). A presença de
halos de hemólise ao redor das colônias crescidas nos diferentes tipos de sangue foi observada
após 24 h de incubação a 37°C.
4.9.2 Cultivo na presença de íons
As amostras também foram crescidas na presença de cloreto de ferro e cloreto de
cálcio nas concentrações de 10mM. Estes testes foram realizados em placa, vistos em 4.9.1.
4.9.3 Pesquisa da atividade hemolítica em meio líquido
Alíquotas de 500µL de sobrenadante das amostras de E. coli cultivadas em BHI a
37°C foram centrifugadas três vezes (12.000Xg,15 min), e diluídas na razão 2, em orifícios de
microplaca contendo PBS (pH 7,4). Uma alíquota de 500 µL de suspensão a 1% de hemácias
de carneiro ou cavalo, previamente lavadas três vezes em PBS (pH 7,4), foi adicionada a cada
orifício a microplaca à 37°C / 1hora para posterior análise por espectrofotometria com
densidade óptica de 540nm (BHAKDI et al., 1986).
4.10 Análise da atividade enzimática
4.10.1 Proteinase
Para caracterizar fenotipicamente a produção da protease, empregou-se o método
descrito por Jagger, Bahner e Warren (1983). Inicialmente, as amostras de E.coli foram
inoculadas em BHI e, após incubação a 37o C por 24 h, foram semeadas por picada nas placas
de Petri contendo ágar Müeller-Hinton e skim Milk (HIMEDIA) (2%). A observação de halos
claros em torno dos pontos inoculados indica atividade proteolítica.
32
4.10.2 Fosfolipase
A realização do teste seguiu as recomendações descritas por Hobermann e Hardat
(1972), com algumas modificações. As cepas, inicialmente semeadas em BHI a 37oC durante
24 h, foram inoculadas em placas com ágar Müeller-Hinton enriquecido com egg yolk 10%
(vol/vol) (Laborclin). O aparecimento de um precipitado branco ao redor ou abaixo do local
do inóculo foi indicativo de produção de fosfolipase.
4.10.3 Lipase
Para a detecção da atividade lipolítica foi utilizado o método descrito por Edberg,
Gallo e Kontnick (1996) modificado. As amostras de E.coli, previamente cultivadas em ágar
nutriente a 37oC por 24 h, foram semeadas por picada em ágar BHI suplementado com 1% de
tween-80. As culturas foram incubadas à temperatura ambiente e avaliadas diariamente por 3
dias. A presença de um halo ao redor do local da inoculação, após 2 a 3 dias, foi considerado
como teste positivo.
4.11 Análise e tabulação dos dados
Os dados foram tabulados no programa estatístico Prisma, versão 5.0.
Posteriormente foram geradas tabelas e gráficos de acordo com as variáveis estudadas na
pesquisa. Os testes escolhidos para análise dos dados foram o Teste Exato de Fisher (tabela
2x2), Teste Qui Quadrado (tabela 3x2) e Teste T. Para este estudo, adotou-se o valor de α
igual a 0.005 para o nível de significância.
33
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A análise microbiológica de 30 amostras de nutrição enteral industrializada
manipulada em dois hospitais (um público e um privado) de São Luís - MA. Para a
comparação dos resultados obtidos foi consultada a resolução da ANVISA de 63 de julho de
2001 que fixa os requisitos mínimos exigidos para a terapia de nutrição enteral (Figura 1).
Figura 1 - Percentual de amostras de nutrição enteral dos hospitais público e privado de São
Luís- MA em desacordo com os padrões legais vigentes.
Fonte: Elaborado pela Autora (2014).
Como se pode observar na figura 1, não houve contaminação por Salmonella em
100% das amostras, estando portanto de acordo com a legislação. Tal resultado também foi
encontrado por Santos e Tondo (2000) que ao pesquisaram fórmulas enterais não encontraram
esse patógeno. As amostras isoladas do hospital particular 16,5% apresentaram contaminação
por Staphylococcus coagulase positiva, níveis acima do padrão Já nas análises do hospital
público não foram detectadas a presença deste patógeno, dados que corroboram com os de
Souza e Campos (2003) que analisaram dietas enterais e não encontraram este patógeno em
suas amostras. A presença de patógenos se torna importante sabendo que esta espécie de
micro- organismo é um dos patógenos que mais causam doenças veiculadas por alimentos,
além disto, o mesmo libera toxinas que representam um grande risco para a saúde pública.
Os fungos, bolores e leveduras estavam presentes em 58% das amostras do
hospital particular e 83% das amostras do hospital público. No Brasil dados sobre a
34
contaminação por fungos são abundantes e, além disto, a contaminação por fungos em
alimentos é indicativa de má qualidade da matéria-prima ou falhas ao longo do processamento
(MORAIS, 2003).
Na contagem de coliformes termotolerantes (E. coli) nas amostras isoladas do
hospital particular 58% estavam contaminadas, e nas amostras isoladas do hospital público
63% apresentaram contaminação. As amostras apresentaram níveis acima do preconizado pela
RDC 63/2000, que estabelece que as amostras analisadas devem apresentar menor 3 NMP/ml
de coliformes a 45° C.
Em estudo realizado em hospitais de Governador Valadares (MG), encontraram
em dietas não industrializadas em pó, valores de contaminação por coliformes totais acima de
104 UFC/mL Oliveira et al (2001). Igualmente, a pesquisa realizada por Carvalho et al.
(2000), resultou em 38,3% das dietas enterais contaminadas por coliformes totais logo após a
manipulação, sendo que após 24h do término da administração das mesmas uma nova análise
do material armazenado resultou em aumento da porcentagem para 44,7%.
Além disso, Tebaldi et al (2008) verificaram que das 16 amostras analisadas,
31,25% apresentaram contagem de coliformes termotolerantes acima de 103 NMP. mL–1,
valor considerado por Murphy (1997 apud BADARÓ; ARAÚJO; CARVALHO, 2007).
Resultado semelhante encontrado por Flach, Karnopp; Corção (2005), 14 (25%) das amostras
eram E. coli.
As amostras isoladas de dietas enterais apresentaram contaminação por coliforme
total em 12 (40%). Segundo a resolução RDC nº 63, de 6 de julho de 2000 do Ministério da
Saúde, a avaliação microbiológica em amostra representativa das preparações realizadas em
uma sessão de manipulação deve apresentar valor menor que 3 número mais provável por ml
(NMP/mL) de coliformes totais. Não houve diferença significativa entre a quantidade de
coliformes totais entre os hospitais público e privado. Apresentou mediana igual a
15 NMP/mL para hospital privado e 93 NMP/ml para o público, já os coliformes
termotolerantes 3 NMP/mL para o privado e 17 NMP/mL para o público.
Outros estudos mostraram, também, uma contaminação de dietas enterais por
coliformes totais. Em pesquisa realizada em um hospital da cidade de Natal- RN, Lima et al.
(2005) constataram contaminação em 25% das amostras analisadas, enquanto que, na cidade
de Cascavel, no Paraná, os resultados demonstram a contaminação de 41,3% das amostras
analisadas (GERUNTHOB et al., 2008). Resultados semelhantes foram obtidos por Maurício
et al. (2008), que analisaram a contaminação de dietas enterais de um hospital privado da
região noroeste do Paraná, encontrando contaminação por coliformes totais em 60% das
35
amostras.
A contaminação por coliformes totais, observada nas fórmulas enterais, não é,
necessariamente, um indicador de contaminação fecal ou presença de patógenos, mas um
número elevado desses micro-organismos em amostras de fórmulas enterais indica condições
sanitárias insatisfatórias durante o processamento de preparações. A falta de atenção dos
manipuladores com as técnicas de higiene adequadas, inabilidade para desinfetar
equipamentos de preparação podem acarretar a contaminação de dietas enterais por
coliformes totais (SANTOS, 2004).
Dos isolados identificados 8 (80%) eram do hospital privado e 4 (20%) do
hospital público foram identificadas como Escherichia coli. Estes isolados foram classificados
através da PCR multiplex nas categorias de E. coli diarreiogênicas. Os isolados de E. coli
proveniente do hospital privado foram identificadas como diarreiogênicas: EAEC 1(12,5%),
STEC 1(12,5%), ETEC 1(12,5%), EPEC 2(25%) e como cepas não diarreiogênicas
(37%). No hospital público 4(100%) dos isolados foram identificadas como EPEC (Tabela 2)
Tabela 2 - Número de Amostras que apresentaram contaminação no hospital público e privado
com Escherichia coli.
Hospital
Privado
Público
n=8 (%)
n= 4(%)
Valor de
p
Presença de Escherichia coli
Cepas diarreiogênicas
EAEC
STEC
ETEC
EPEC
1 (12,5)
1 (12,5)
1(12,5)
2 (25)
4(100)
0,610
0,610
0,610
0,080
Cepas não diarreiogênicas
3(37,5)
-
0,490
Fonte: Elaborado pela Autora (2014)
Dentre as E. coli diarreiogênicas a linhagem que se destacou no presente estudo
foi a EPEC em ambos os hospitais, quebrando o mito de que o hospital particular possui uma
dieta enteral mais segura para o paciente. Resultado que é extremamente preocupante, por se
tratar de amostras destinadas a um paciente de UTI, debilitado e correndo risco de adquirir
uma infecção severa, além de aumentar seu tempo internado.
A EPEC tem sido considerada um dos principais agentes etiológicos de diarreia
aguda em crianças com idade inferior a dois anos em países em desenvolvimento e, em
particular, nos pacientes com até seis meses de idade (TRABULSI; KELLER; GOMES, 2002).
36
Em estudo realizado por Alves (2009), entre as E. coli (diarreiogênicas), 2% para
o sorogrupo EHEC e 1% para o sorogrupo EPEC.O estudo foi realizado durante três anos. Em
2006, encontrou 21 amostras de E. coli diarreiogênica (6,48%).Em 2007, entre as E. coli
(diarreiogênica) a prevalência foi de (7,14%) para o sorogrupo EPEC. Em 2008, observaram a
seguinte distribuição entre os sorogrupos de E.coli: (5,36%) EPEC, (1,79%) ETEC, (0,89%)
EHEC e (0,89%) EIEC. A E. coli diarreiogênica mais encontrada no estudo foi EPEC.
Em estudo realizado no Hospital Centro Geral de Pediatria em Belo
Horizonte/MG, Collares (2005) relatou a incidência de amostras de EPEC típicas (1,9%)
semelhante ao relatado para outras regiões do País. Em Salvador e em Botucatu, a frequência
do micro-organismo foi de 0,8% (FRANZOLIN et al., 2005) e, no Rio de Janeiro, de 2,5%
(RÉGUA-MANGIA et al., 2004).
Escherichia coli patogênica é agrupada em categorias baseadas pela produção de
fatores de virulência. Virulência é definida como a habilidade de um organismo provocar
doença em um hospedeiro particular, devido ao impacto cumulativo de um ou vários fatores
de virulência (NAVEEN, MATHAI, 2005).
Essas características de patogenicidade habilitam as linhagens portadoras a
realizarem uma gama variada de funções, como processos de adesão; invasão e/ou destruição
de tecidos; produção de toxinas; ou captação de produtos essenciais ao hospedeiro. A
combinação destes fatores é determinante para a instalação da doença e sua severidade. (Ref)
A capacidade de adesão dos isolados em estudo foi inicialmente avaliada pela
capacidade hidrofóbica de cada cepa, já que alguns estudiosos têm comprovado que a
hidrofobicidade da superfície celular bacteriana é um dos fatores que acarretam no processo
de adesão bacteriana aos diferentes materiais (CAPELLO; GUGLIELMINO, 2006). Assim,
quanto mais hidrofóbica for a bactéria, possivelmente maior será sua capacidade de formar
biofilmes, uma vez que, as características físico-químicas da superfície podem desempenhar
uma forte influência sobre a adesão bacteriana, as quais aderem com mais facilidade às
superfícies hidrofóbicas (ex: plástico) do que às hidrofílicas (ex:vidro ou metais)
(RODRIGUES; SANTOS; RIZZO, 2009).
Deste modo, verificou-se que 1 (12,5%) das amostras do hospital privado e 2
(50%) do hospital público eram hidrofílicas, 2 (25%) e 1 (25%) respectivamente apresentaram
hidrofobicidade intermediaria e 5 (62,5%) e 1 (25%) respectivamente apresentaram alta
hidrofobicidade ou hidrofóbicas (Tabela 3).
37
Tabela 3 - Número de isolados de Escherichia coli que apresentaram hidrofobicidade.
Hospital
Privado Público
n = 8 (%) n=4 (%)
Hidrofobicidade
Hidrofílico
1 (12.5)
Intermediário
2 (25)
Alto
5 (62.5)
Valor
de P
0,320
2 (50)
1 (25)
1 (25)
Fonte: Elaborado pela Autora (2014)
Estudo realizado por Pinheiro (2014) com 21 amostras, 18 (85,7%) precipitaram o
sulfato de amônio na parede dos tubos. Esse resultado está de acordo com os obtidos neste
estudo onde 100% das amostras foram positivas.
As infecções bacterianas são consideradas complexas, por constituírem um
processo multifatorial que envolve fatores inerentes ao patógeno e do hospedeiro. A
habilidade em produzir enzimas hidrolíticas é considerada um importante fator de virulência,
fator que colabora para o desenvolvimento de doenças causadas por este micro-organismo
(HOLANDA, 2001).
Alguns micro-organismos apresentam a capacidade de se atrair ou repelir a
superfícies bióticas ou abióticas, isso dependerá de diferentes interações não específicas,
especialmente por interações hidrofóbicas (DOYLE, 2000; BRIANDET et al., 2001; COSTA
et al., 2006). A hidrofobicidade modula tanto a adesão quanto a formação de biofilme,
contudo, outros fatores como fímbrias, flagelos e cápsula, também estão envolvidos
(POMPILIO et al., 2008).
A adesão poderá ser realizada através de diversas fímbrias, dentre elas o curli que
tem um importante papel na patogenicidade. Sugere-se que a fímbria curli tem a função de
promover a autoagregação entre bactérias, além de facilitar invasão e colonização (DYER et
al., 2007).
A proteína curli é constituída por 2 subunidades (CsgA e CsgB), que tem alta
afinidade com o corante vermelho-congo. A diferenciação entre bactérias que expressam curli
e as que não a expressam se dá pela coloração deste indicador, onde as bactérias que
expressam curli formam colônias avermelhadas, enquanto as que não a expressam, deixam o
meio opaco, sem cor (OLSEN et al., 2002).
38
É possível que a produção da curli melhore a autoagregação bacteriana,
aumentando, por consequência, a habilidade de se ligar/unir em superfícies (DEL RE et al.,
2000). Amostras produtoras de curli são mais hidrofóbicas que amostras não-produtoras de
curli (BOYER, et al., 2007).
As amostras isoladas 100% apresentaram a fímbria curli (Figura 2). E as
linhagens presentes foram: seis EPEC, uma ETEC, uma STEC, uma EAEC. Contudo, apenas
4 (50%) das amostras do hospital privado e 1 (25%) das amostras do hospital público
apresentaram fímbria tipo I, sendo duas pertencentes a linhagem das EPEC e uma da
linhagem EAEC. Resultado semelhante a este foram encontrado por Ferro et al. (2012),dos
isolados testados apenas 4 (21%) não apresentaram a fímbria curli, desta apenas 3 amostras
apresentaram fímbria tipo I ( Tabela 4).
Tabela 4 - Número de isolados de Escherichia coli que apresentaram Fímbria.
Privado
n=8 (%)
Curli
Tipo 1
8 (100)
6 (75)
Hospital
Público
n= 4(%)
4(100)
1(25)
Valor de
p
1,000
0,150
Fonte: Elaborado pela Autora (2014)
Figura 2 - Produção de fímbria por cepas de E. coli, na figura A e produção de fímbria manose
sensível na figura B.
A
B
Fonte: Elaborado pela Autora (2014)
Biscola et al. (2011) observaram que, dentre 33 amostras de E. coli, 14 (42%)
39
expressaram curli em ágar vermelho-congo, após 48 horas, a 28ºC. No entanto, Cookson et
al., (2002), verificaram que a expressão de curli em 26 amostras de E. coli se deu em somente
5 isolados (19,2%).
Pinheiro et al. (2014), em seu estudo, observaram que somente sete isolados
(33,3%) expressaram os aspectos fenotípicos da produção da fímbria, pois mudaram a
coloração das placas de vermelho-congo para uma coloração mais avermelhada. Conforme
Hammar et al. (1995), as colônias que expressam curli se mostram vermelhas, enquanto as
bactérias, que não a expressam, mostram-se opacas, sem cor.
Brito et. al.(2014), verificou a hemaglutinação em sangue de carneiro na presença
e ausência de D-manose, para a identificação dos tipos de fímbrias neste processo. No
presente estudo os isolados avaliados mostraram ser manose resistentes em sangue de
carneiro.
O alto percentual de adesão evidencia o potencial patogênico desses isolados, pois
vários estudos epidemiológicos têm sido realizados em diversos países, nos quais tem sido
pesquisado o papel de E. coli na etiologia da diarréia infantil, havendo concordância de que
cepas de E. coli, que apresentam um padrão de adesão estão associadas a diarreia (RÉGUAMANGIA et al., 2004).
Na figura 3, as cepas de E. coli apresentaram o mesmo perfil de aderência em inox
e látex. Os isolados do hospital privado apresentaram uma maior aderência no látex e inox
que as cepas provenientes do hospital público. Não foi verificado diferença quanto à
aderência em látex e inox entre os isolados de E. coli diarreiogênicos (EAEC e EPEC) e as
não diarreiogênicas.
Figura 3- Adesão ao inox e látex das cepas de E.coli, proveniente de amostras de nutrição
enteral de um hospital público e um privado de São Luís- MA. A adesão ao inox; B
– adesão ao látex.
Fonte: Elaborado pela Autora (2014).
40
Em 2008, Trautner verificou uma baixa capacidade de aderência das E. coli
isoladas de cateter urinários de silicone. Entre 15% e 25% dos pacientes em hospitais gerais
irão utilizar um cateter urinário em algum momento durante a sua estadia (WARREN, 2001).
Cateteres urinários também são amplamente utilizados em instituições de cuidados à idosos.
Infelizmente, os cateteres são extremamente propensos à formação de biofilme bacteriano.
Nos Estados Unidos, ITU associada a cateter foi estimada em aproximadamente 1 milhão de
dias de hospitalização adicionais por ano (STAMM, 1991). E. coli e Klebsiella que foram as
duas principais espécies em ITU e geralmente são excelentes formadores de biofilme
(FERRIERES, 2007). O cateter urinário e a sonda por onde é adiministrada a nutrição enteral
são produzidas com o mesmo tipo material, o latex siliconizado.
Flach, Karnopp; Corção (2005), exaltaram que a E. coli aderiu melhor ao látex foi,
seguido do vidro e aço inoxidável. Segundo Hood e Zottola (1995), a simples presença de
micro-organismos, aderidos em uma superfície os quais poderiam eventualmente levar à uma
contaminação dos alimentos – deverá ser levada em consideração e interpretada como um
problema a ser resolvido. A E. coli foi o micro-organismo que melhor aderiu em todos os
materiais testados, tendo contagens similares para todos os materiais na temperatura de 25ºC
(LEUNG et al.,1998).
As infecções associadas aos materiais médico-hospitalares resultam da adesão
bacteriana à superfície de um biomaterial (KATSIKOGIANNI et al., 2004). Bactérias
patogênicas possuem uma variedade de mecanismos de adesão e invasão celular, que permite
explorar uma grande quantidade de componentes da superfície da célula hospedeira e
possibilitam a ocupação de nichos diferentes dentro do corpo humano (SANTOS, 2011).
Assim, a adesão é considerada um pré-requisito para a patogênese de quase todas as doenças
infecciosas (HULTGREN et al., 1996).
A capacidade de adesão das cepas de E. coli foi avaliada em células epiteliais
HEp-2 e em linhagem intestinal HT29 no presente estudo. 75% das amostras isoladas
apresentaram capacidade de adesão nas células HT-29.Em células HEp2,41,6% das amostras
apresentaram capacidade em aderir,como mostra a Tabela 3, sendo que destes,3 eram
provenientes do hospital público e também aderiram em células HT-29. Apenas 3(25%)
amostras não aderiram a nenhuma das duas linhagens (Tabela 5)
A adesão em células epitelial e intestinal foi mais evidenciada nas amostras de
EPEC, pois estas possuem o gene eaeA que permite ligação tão próxima e eficaz entre a
bactéria e o enterócito ,beneficiando a adesão bacteriana. (PATON; PATON, 1998).
41
Tabela 5 – Características de adesão dos isolados de Escherichia coli proveniente de dietas
enterais de um hospital público e privado de São Luís, MA.
Hospital
Privado Público
n = 8 (%) n=4 (%)
Valor
de P
Adesão
Hep2
HT-29
2 (25)
6 (75)
3 (75)
3(75)
0.150
0.760
Fonte: Elaborado pela Autora (2014)
Em 1998, Wieler encontrou uma porcentagem de adesão de células eucarióticas
66,7% (28 amostras de E. coli) que aderiram em células humanas HEp-2. No entanto, Lopes
(2005) evidenciou que 14,28% (3/21 de E. coli ) não aderiram as células HEp-2 ou seja bem
mais significativo.
Biofilmes são estruturas altamente complexas, contendo microcolônias separadas
por microcanais de água e podem tornar antibióticos e biocidas ineficazes. As células
derivadas de biofilme são, geralmente, mais resistentes às condições ambientais adversas do
que em sua forma planctônica. A formação do biofilme é um processo dinâmico de várias
fases. Inicialmente, a superfície afetada é coberta com um filme de moléculas orgânicas. O
attachment reversível da bactéria pode ser seguido por adesão irreversível, com o crescimento
e produção de um polímero extracelular (COSTERTON et al., 1987).
O primeiro passo na contaminação de superfícies de contato de alimentos é o
attachment das células bacterianas com o material, um processo que poderá ser influenciável
por um grande número de propriedades como a expressão de fímbria curli e a hidrofobicidade
da superfície celular (BOYER, et al., 2007).
Existem vários fatores relacionados à formação de biofilmes. Os principais são
características físico-químicas do material sobre o qual estão aderidos e expressão de fatores
de virulência pelos micro-organismos, como produção de cápsula exopolimérica, fímbrias e
síntese de adesinas fimbriais e não fimbriais (FLACH; KARNOPP; CORÇÃO, 2005).
A avaliação da capacidade de E. coli em produzir cápsula como teste presuntivo
para a formação de biofilme foi testada neste trabalho pelo método do Ágar Vermelho Congo,
por meio do qual foi observado que 100% dos isolados analisados foram produtores de
cápsula (Figura 4). Já a formação de biofilme por este micro-organismo foi avaliada em
42
placas de micro titulação de poliestireno pelo método do Cristal Violeta. O percentual
encontrado das amostras do hospital privado foi 75% como produtores fraco de biofilme e
25% como não produtor. Ao lado das amostras do hospital público 50% como produtores
fracos de biofilme e 50% como não produtores (Tabela 6).
Figura 4 - Produção de cápsula por cepas de E.coli, identificada pela presença de colônia
enegrecidas.
Fonte: Elaborado pela Autora (2014)
Tabela 6 - Número de isolados de E.coli proveniente de dietas enterais de um hospital
público e privado que apresentaram mecanismo de adesão.
Fonte: Elaborado pela Autora (2014).
Resultado semelhante de amostras produtoras fracas de biofilme foi encontrado
por Pinheiro et al. (2014), que verificaram a produção de biofilme em 16 amostras (76,2%),
43
segundo os parâmetros de densidade óptica por espectrofotometria, descritos por Stepanovic
et al. (2004). Biscola et al. (2011) analisaram 33 amostras de E.coli, 16 delas (48%) formaram
biofilme em microplacas de poliestireno com 96 poços, em 48 horas, a 37ºC. Das 13 cepas de
E.coli, 11 foram produtoras de cápsula, (FLACH, KARNOPP; CORÇÃO, 2005).
Essa capacidade de E. coli formar biofilme representa um grande problema para
pacientes hospitalizados, pois permite a colonização de cateteres (vasculares, peritoneais,
urinários), tubos nasogástricos, tubos endotraqueais, dispositivos ortopédicos, dentre outros,
podendo desencadear infecções crônicas. Além disso, protege a bactéria do sistema imune do
hospedeiro e da ação dos antibióticos tornando-as, portanto, mais resistentes às drogas.
A adesão e posterior produção de biofilme tem sido demonstrado como sendo um
fator primordial para que uma linhagem bacteriana inicie sua infecção. A habilidade para
formar biofilme está intimamente relacionada à persistência e virulência bacteriana
(FERRIERES et al., 2007; HARRISON et al., 2009).
Hemolisinas representam um grupo de toxinas bacterianas que, variavelmente de
muitas outras toxinas, não são internalizadas pelas células agindo como agentes ativos de
membranas levando, à lise e morte celular, além de sua característica principal de lisar
eritrócitos (ROWE; WELK, 1994). As hemolisinas são proteínas secretadas extracelularmente
(exoproteínas) por algumas cepas de E. coli, as quais possuem uma ação citotóxica,
provocando lise em uma variedade de tipos de células incluindo eritrócitos, fibroblastos,
granulócitos e outros leucócitos humanos (CAVALIERI et al, 1985; KONIG et al, 1986).
Quanto à detecção da atividade hemolítica em meio sólido, nos resultados
encontrados neste estudo, a ausência de halo foi evidenciada após 24 horas de incubação em
ágar sangue de carneiro, resultado semelhante apresentado em ágar sangue de cavalo. O
resultado em meio sólido não alterou a atividade hemolítica das amostras analisadas com
adição de cloreto de ferro e cloreto de cálcio.
Esse estudo vai ao encontro aos resultados obtidos no presente estudo, onde as 19
amostras de E. coli examinadas, 4 (21%) apresentaram halo de hemólise ao redor das colônias
em meio sólido agar sangue de carneiro e 16% foram positivas em agar sangue de cavalo
(FERRO, 2012).
A atividade hemolítica em meio sólido enriquecida com Cloreto de Ferro e
Cloreto de Cálcio apresentaram o mesmo resultado. Foram positivos 21% (4/19) das
amostras. (FERRO, 2012). Esse resultado confirma o resultado obtido, onde constatou-se que
o Cloreto de ferro e cálcio não interferem na atividade hemolítica, pois existem três
mecanismos de hemólise, diferentes e que não é dependente de íons provavelmente é de ação
44
detergente.
Por outro lado, a hemólise líquida apresenta hemólise em 58% do total das
amostras analisadas em sangue de carneiro (Figura 6). Desta forma pode-se notar que a
constituição do meio poderá afetar a atividade hemolítica. Já em sangue de cavalo o resultado
permaneceu igual em meio sólido; não foi constatada atividade hemolítica em meio líquido,
sugerindo que essa atividade parece ser dependente do método de detecção e/ou a hemolisina
poderá ser parte constituinte da célula bacteriana e precisa do contato com os eritrócitos para
se expressar. E. coli possui várias hemolisinas já descritas e cada uma delas com
características diferentes.
Figura 5 – Hemólise em meio líquido em sangue de carneiro apresentada por isolados de
E.coli provenientes de dietas enterais de um hospital público e um hospital
privado de São Luís -MA.
Fonte: Elaborado pela Autora (2014)
A produção de enzimas extracelulares por E. coli estão relacionacionadas com o
desenvolvimento de processos infecciosos, sendo já conhecidos de alguns estudiosos os
seguintes fatores de virulência: lipases, proteases e fosfolipase.
Nas amostras analisadas não se constatou produção de fosfolipase, protease nem
lipase. Resultado semelhante foi encontrado por Tebaldi e Oliveira (2008), identificaram
31cepas de E.coli, 100% das cepas identificadas não apresentaram produção de lipase e
45
protease.
Esses resultados sugerem que essas exoenzimas não fazem parte do padrão de
virulência dos isolados bacterianos aqui avaliados. E que a falta de expressão das exoenzimas
poderá ter sido a causa da não destruição do tapete celular durante o teste de adesão às células
humanas, onde algumas cepas manifestaram tal efeito.
46
6 CONCLUSÃO
Os isolados de E. coli provenientes das coletas foram encontradas com maior
frequencia no hospital particular em comparação com as amostras do hospital público. A E.
coli diarreiogênica mais prevalente foi a EPEC (25%).
A adesão ocorreu nas duas linhagens celulares pesquisadas em células HEp 2 e
HT-29, sendo mais frequente nos isolados de ambos hospitais nas células HT-29.
Pelo que foi discutido, verificou-se que os fatores de virulência mais evidenciados
nos isolados de E. coli, obtidos de amostra de nutrição enteral dos hospitais analisados são:
produção de cápsula em todos os isolados (100%), produção fraca de biofilme (75%) nos
isolados provenientes do hospital privado e (50%)
expressão da fímbria curli em todos os
isolados
nos isolados do hospital público; a
(100%), a fímbria tipo I e elevada
hidrofobicidade foram mais evidente nos isolados das amostras do hospital privado.
Em relação à produção de hemolisinas, não foi observado capacidade de hemólise
em sangue de carneiro e cavalo em meio sólido em nenhum dos isolados analisados; a adição
de cloreto de ferro e cloreto de cálcio não alterou os resultados; em meio líquido apresentou
hemólise apenas quando utilizado o sangue de carneiro e em maior frequência nos isolados
das amostras do hospital privado.
Pelo que foi discutido, verificou-se que não houve diferença entre os dois
hospitais quanto às propriedades de virulência da Escherichia coli identificadas.
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS
O elevado índice de contaminação por E.coli é preocupante, tendo em vista o
estado de saúde dos consumidores dessas dietas. Pacientes com câncer e seus respectivos
tratamentos de radioterapia e quimioterapia, em pré e pós- cirurgias de grande porte, póstrauma grave, doença autoimune, transplante de órgãos e AIDS, estão em estado de
imunossupressão, fator este que ratifica a importância da administração de fórmulas enterais
especializadas.
Sob esses aspectos, é fundamental que as condições higiênico-sanitárias, durante o
preparo e manipulação da nutrição enteral, sejam satisfatórias, já que a contaminação
microbiológica dessas dietas poderá comprometer a evolução clínica desses pacientes.
47
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54
ANEXOS
55
ANEXO A – Carta de envio do Artigo para Revista
Revista da Associação Médica Brasileira
ASSOCIAÇÃO MÉDICA BRASILEIRA
Rua São Carlos do Pinhal, 324 CEP: 01333-903 - Caixa Postal: 8904 - São Paulo SP - Brasil
Tel.: (11) 3178-6800 - Email: [email protected]
São Paulo, segunda-feira, 15 de setembro de 2014
Ilmo(a) Sr.(a)
Prof(a), Dr(a) Patricia de Maria Sulva Figueiredo
Referente ao código de fluxo: 2986
Classificação: Artigo Original
Informamos que recebem os o manuscrito ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DAS DIETAS ENTERAIS
INDUSTRIALIZADAS MANIPULADAS DE HOSPITAIS PÚBLICOS E PRIVADOS DO MUNICÍPIO
DE SÃO LUÍS - MA. será enviado para apreciação dos revisores para possível publicação/participação na
Revista da Associação Médica Brasileira. Por favor, para qualquer comunicação futura sobre o referido
manuscrito cite o número de referência apresentado acima.
Obrigado por submeter seu trabalho à Revista da Associação Médica Brasileira.
Atenciosamente,
Dr. Antonio Jorge Salomão
Editor
56
ANEXO B – Artigo submetido
ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DAS DIETAS ENTERAIS INDUSTRIALIZADAS
MANIPULADAS DE HOSPITAIS PÚBLICOS E PRIVADOS DO MUNICÍPIO DE
SÃO LUÍS - MA.
Larissa de Maria C. Praseres Lobão, Thalyta Araujo de Melo, Thiago Azevedo Feitosa Ferro,
Patricia de Maria Silva Figueiredo
Resumo
A nutrição enteral (NE) é um alimento para fins especiais, com ingestão controlada de
nutrientes, especialmente formulada e elaborada para substituir ou complementar a
alimentação oral de pacientes em regime hospitalar de acordo a RDC nº 63/00 da ANVISA. O
objetivo deste trabalho foi analisar a qualidade microbiológica de dietas enterais de dois
hospitais do município de São Luís – MA, ressaltando os cuidados e a correta aplicação das
Boas Práticas PNE dos manipuladores para com as dietas. Foram analisadas 24 amostras de
dieta de dois hospitais (um público e outro privado) para detecção de coliformes através da
técnica dos Tubos Múltiplos com Caldo Lactosado Simples (prova presuntiva), Caldo
Lactosado Verde Brilhante (prova confirmatória) incubados por 24-48hs horas a 37 ºC. Para a
análise de coliformes termotolerantes as amostras positivas para coliformes totais foram
semeadas em Caldo EC. A partir dos meios líquidos positivos (turvos e com produção de gás
para aqueles com Durhan) é consultada a Tabela de Hoskins para NMP/g. Inoculações em
meios sólidos também foram utilizadas para a pesquisa de espécies do gênero Staphylococcus
(ágar Manitol Salgado) e Salmonella (ágar SS). A partir de colônias típicas dos meios sólidos,
testes bioquímicos foram feitos para identificação das espécies. A presença de coliformes
totais, fecais e contaminantes foi confirmada (NMP ≥ 1600/g) somente nas as amostras
manipuladas e a espécie Escherichia coli predominante. Não foi identificada nenhuma espécie
do gênero Salmonella . Os resultados contaminação das amostras revelou -se acima dos
padrões estabelecidos pela Resolução vigente. Tal resultado sugere que não está havendo
correta manipulação da dieta, higienização do ambiente cuidados pessoais dos manipuladores,
podendo colocar em risco a saúde do indivíduo submetido a esta terapia.
Palavras-chave: Nutrição Enteral, Contaminação, Manipulação
57
Abstract
Enteral nutrition (EN) is a food for special purposes, with controlled intake of nutrients,
specially formulated and designed to replace or supplement oral feeding of patients in hospital
system according to RDC ANVISA 63/00. The aim of this study was to analyze the
microbiological quality of enteral feeding two hospitals in São Luís - MA, emphasizing the
care and the correct application of Good Practices for PNE manipulators with diets. 24 diet
samples from two hospitals (one public and one private) for detection of coliforms using the
technique of Multiple Tubes with Simple Lactose Broth (presumptive evidence), Brilliant
Green Lactose Broth (confirmatory test) incubated for 24-48hs hours were analyzed 37 oC.
For analysis of fecal coliform positive samples for total coliforms were sown in EC broth.
From the positive liquids (turbid and gas production for those with Durhan) is referred to
Table Hoskins to MPN / g. Inoculation on solid media were also used to search for species of
the genus Staphylococcus (Mannitol Salt Agar) and Salmonella (SS agar). The typical
colonies from solid media, biochemical tests were performed for species identification. The
presence of total, faecal coliforms and contaminants was confirmed (≥ 1600 MPN / g) only in
the manipulated samples and the predominant species Escherichia coli. We did not identify
any species of the genus Salmonella. The results revealed If contamination of samples above
the standards established by the current resolution. This result suggests that there is no correct
dietary manipulation, environmental hygiene personal care handlers, and may endanger the
health of the individual undergoing this therapy.
Key words: Enteral Nutrition. Contamination. Manipulation.
Introdução
A nutrição enteral é um alimento para fins especiais, com ingestão controlada de nutrientes,
na forma isolada ou combinada, especialmente formulada e elaborada para uso por sondas ou
via oral, industrializado ou não, utilizada exclusiva ou parcialmente para substituir ou
complementar a alimentação oral em pacientes desnutridos ou não, conforme suas
necessidades nutricionais, em regime hospitalar, ambulatorial ou domiciliar, visando à síntese
ou manutenção dos tecidos, órgãos ou sistemas de acordo a Resolução da Diretoria Colegiada
- RDC nº 63/00 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA (BRASIL, 2001).
58
O suporte nutricional enteral é utilizado como uma terapia de rotina em pacientes com
deficiência energético-protéica, disfagia severa, grandes queimaduras, ressecção intestinal e
fístulas, os quais são, na maior parte das vezes, pacientes graves, organicamente
comprometidos e que estão sujeitos a longos períodos de hospitalização. Estão também
incluídos neste grupo pacientes em pós-cirúrgico, bebês prematuros e pacientes de terapia
intensiva (MAURICIO; GAZOLA; MATIOLI, 2008).
Nos países desenvolvidos é comum o uso de dietas enterais industrializadas, e no Brasil, isto
vem aumentando gradativamente. Essas dietas são práticas, nutricionalmente completas e
oferecem maior segurança quanto ao controle microbiológico e composição centesimal. No
entanto, estas formulações não estão acessíveis para a maioria da população brasileira, em
função do seu custo (MEDINA; NASCIMENTO; OLIVEIRA, 2009). Sob o ponto de vista
bacteriológico, as dietas enterais em pó, ricas em macro e micronutrientes, constituem
excelente meio para o crescimento de micro- organismos, após a reconstituição (ARRUDA,
2011)
Carvalho et al (1999), ressaltam que a administração de dietas eventualmente contaminadas
pode não somente causar distúrbios gastrointestinais, mas contribuir para infecções mais
graves, principalmente em pacientes imunossuprimidos.
Vários estudos foram desenvolvidos objetivando a produção de dietas adequadas para o
tratamento de portadores de enfermidades crônicas, em geral, impossibilitados de ter uma
alimentação via oral durante períodos mais prolongados. Muitos avanços e benefícios foram
alcançados nessa área da nutrição clínica, porém melhorias ainda são reivindicadas para
baixar o custo e proporcionar melhor aproveitamento dos nutrientes dos alimentos
tradicionais, como a fibra dietética, os minerais, e as vitaminas (MEDINA et al, 2009).
Alguns critérios devem ser estabelecidos para o preparo da alimentação enteral, seguindo as
normas da Resolução nº 63/00, que estabelece um controle da qualidade microbiológica, onde
estão estabelecidos os limites toleráveis de microorganismos, acima dos quais, ocorrerá
comprometimento da aceitação da NE, afetando também a evolução clinica dos pacientes
submetidos a essa terapia (CARVALHO FILHO, 2008).
A contaminação microbiana dos componentes desta terapia pode prejudicar a recuperação e o
reestabelecimento do enfermo a ela submetido, contribuindo para o aumento no risco de
infecção. A contaminação da nutrição enteral ocorre principalmente pela falta de técnicas de
higiene adequadas durante o trabalho de manipuladores, desinfecção dos locais de preparação
e dos equipamentos utilizados e utilização de aditivos não estéreis ou contaminados no
preparo da dieta. Além disto, as fórmulas enterais constituem-se como excelente meio para o
59
crescimento de diversas espécies de micro-organismos seja de flora patogênica ou não, devido
as suas características intrínsecas, como: presença de nutrientes, atividade de água, pH e
osmolaridade. Sendo assim, quanto maior a manipulação da fórmula enteral antes da
administração, maior o risco de contaminação (MEDINA et al, 2009).
Alimentos são facilmente contaminados com micro-organismos durante sua manipulação e
processamento. Se tiverem condições de crescimento, podem alterar as características
químicas e organolépticas, podendo deteriorá-los. Além disso, podem propiciar a ocorrência
de toxinfecções alimentares. Assim é importante que haja um controle rigoroso das condições
de higiene na produção e comercialização de alimentos, uma vez que a maior parte das
doenças de origem alimentar se deve a manipulação inadequada do produto durante seu
processamento (MEDINA et al, 2009).
Quando se considera a qualidade microbiológica de alimentos, frequentemente se utiliza a
pesquisa de micro-organismos indicadores, que quando presentes em um alimento podem
fornecer informações sobre o nível de sua contaminação e as condições higiênico - sanitárias
durante o processamento, produção ou armazenamento. No Brasil os limites microbianos são
estabelecidos pela ANVISA, Ministério da Saúde, através das RDC nº 63/00 para dietas
enterais, e a RDC nº 12/01 para alimentos em geral (BRASIL, 2001).
No caso de preparações dietéticas para fins especiais como a alimentação enteral, inúmeras
pesquisas têm sido realizadas para avaliar a qualidade microbiológica. Na maioria dos casos,
ressaltam os autores, que há grande dificuldade em orientar e fiscalizar eficientemente os
inúmeros locais de preparação, quanto às condições de higiene na produção e na
administração destas dietas (MEDINA et al, 2009).
Diante da importância das condições higiênico-sanitárias para a segurança e qualidade da
nutrição enteral, observou-se a necessidade de avaliar se as amostras coletadas em uma
Unidade de Produção de dietas Enterais de Hospitais Públicos e Privados de São Luís – MA
apresentam-se dentro dos padrões exigidos pela Legislação vigente, afim de cumprirem com a
função de recuperação da saúde.
Esta pesquisa tem como objetivo examinar a qualidade microbiológica das dietas
industrializadas manipuladas de dois hospitais no município de São Luís-MA.
60
2 METODOLOGIA
2.1 Amostras.
Para a determinação da amostra, foi utilizada a técnica de amostragem não-probabilística,
sistematizada. Foram realizadas 24 coletas de NE (nutrição enteral) com qualidade física
satisfatória e características organolépticas próprias de dois hospitais do município de São
Luís – MA, sendo 12 amostras de um público e 12 de um particular. Foi estabelecida como
unidade amostral 100 (ml) de cada amostra de dieta enteral manipulada coletada.
As amostras foram coletadas no período de setembro de 2013 à agosto de 2014. As amostras
foram coletadas separadamente e de forma aleatória, conforme os critérios de seleção
estabelecidos. Em seguida foram acondicionadas individualmente em frascos de vidro de
primeiro uso, sem contato manual, transportadas em caixa isotérmica, contendo saco de gelo
cristal, e encaminhadas ao Laboratório de Microbiologia Médica e de Alimentos – Núcleo de
Doenças Endêmicas e Parasitárias da Universidade Ceuma, para a realização das análises
microbiológicas.
2.2 Análise Microbiológica
Para todas as amostras foram realizadas as análises de contagem de bactérias, leveduras e
fungos, determinação de coliformes a 45º C, detecção de Escherichia coli, Staphylococcus
aureus e pesquisa de Salmonella spp (SILVA, JUNQUEIRA, SILVEIRA, 2001).
2.2.1 Enumeração de Coliformes Totais, Coliformes a 45º C
Após a fase de incubação dos tubos com lactosado simples, foi transferido 1 mL do
crescimento bacteriano: turvação do meio e presença de bolhas ou ar nos tubos de Durhan,
para tubos de ensaio contendo 10 mL de caldo Verde Brilhante (VB), os quais foram
incubados em estufa, a 35-37ºC por 24 a 48 horas, para pesquisa de coliformes totais e para
tubos de ensaio contendo 10 mL de caldo EC incubados por 24 a 48 horas a 44,5 ºC, em
banho - maria, para pesquisa de coliformes termotolerantes.
A partir dos meios líquidos positivos (turvos e com produção de gás nos tubos com Durhan)
foi feita a tabulação dos dados pela Tabela de Hoskins (NMP/g) e foram estriadas placas de
Petri contendo ágar MacConkey, mantidas em estufa por 24 horas a 35-37ºC. Após período de
61
incubação, dos meios em que houve crescimento, foi removida uma pequena porção da
colônia crescida, com o auxílio da alça de níquel cromo, e inoculado no kit para provas
bioquímicas Enterokit B (Probac) para a identificação de coliformes totais e Escherichia coli.
O resultado da análise microbiológica das amostras foi comparado com os valores
preconizados pela legislação brasileira, para pratos prontos para o consumo à base de
pescados cru e cereais, descritos na RDC nº12 (BRASIL, 2001).
2.2.2 Detecção de Salmonella spp
A partir dos tubos positivos para crescimento microbiano dos tubos de caldo lactosado
simples, foi transferido 1 mL do inóculo para tubos com caldo Rapapport e incubados os
meios a 35-37ºC por 24 horas. Após 24 horas, os tubos contendo Rapapport foram agitados e
com o auxílio da alça de níquel cromo, foi estriada uma alça em placa de Petri com meio
seletivo e diferencial Salmonella-Shigella (SS), as quais foram incubadas inver tidas a 3537ºC por mais 24 horas. Transcorrido o período de incubação foram observadas colônias
suspeitas: com centro negro devido à produção de H2S. Das colônias suspeitas foi retirada
uma porção que foi inoculada no kit para provas bioquímicas Enterokit B (Probac) para a
identificação.
2.2.3 Detecção de Staphylococcus aureus
Foi transferido 0,1 mL dos tubos de ensaio de caldo lactosado simples para placas de Petri
contendoo meio Ágar Manitol Salgado. O inóculo foi espalhado na placa até seu total
secamento, com a ajuda da alça de Drigalsky. As placas foram incubadas invertidas a 35-37ºC
por 48 horas.
Após período de incubação, as colônias desenvolvidas foram submetidas ao teste de coagulase
pelo Staphy-Test para identificação.
2.2.4 Contagem de Leveduras e Bolores
Foram transferidos 0,1 mL das diluições de cada amostra com auxílio de micropipeta
automática, para placas de Petri contendo Ágar Saboroud, em duplicata. Espalha – se o
inóculo com auxilio de alça de Drigalsky deixando-se, na seqüência, as placas em repouso
para que o meio de cultura absorvesse a amostra diluída. As placas serão incubadas a 250C/5
62
dias. Após a incubação, as unidades formadoras de colônias (UFC) foram contadas com
auxílio de contador de colônias manual. O resultado final foi calculado multiplicando-se o
resultado da contagem de colônias pelo fator de diluição correspondente a placa contada,
sendo expresso em UFC/mL.
2.3 Análise e tabulação dos dados
Os dados foram tabulados no Excel na forma de tabelas e gráficos para melhor apresentação.
Os resultados foram interpretados e comparados aos padrões microbiólogicos existentes para
este tipo de alimento fixados na RDC 12/2001 da Anvisa para saber se estavam satisfatórios e
aptos para o consumo humano.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Para a comparação dos resultados obtidos foi consultada a resolução da Anvisa de 63 de julho
de 2001 que fixa os requisitos mínimos exigidos para a terapia de nutrição enteral. Como se
pode observar (figura 1), não houve contaminação por Salmonella em 100 % amostras nos
dois hospitais, estando portanto de acordo com a legislação. Tal resultado também foi
encontrado por Santos e Tondo () que ao pesquisarem formulas enterais não encontraram esse
patógeno em suas amostras. Houve contaminação por Staphylococcus coagulase positiva e em
níveis acima do padrão em 16,5 % das amostras do hospital particular, este fato se torna
importante sabendo-se que esta espécie de micro- organismo é um dos patógenos que mais
causam doenças veiculadas por alimentos, além disto o mesmo libera toxinas que representam
um grande risco para a saúde pública. Já nas análises do hospital público não foram
detectadas a presença deste patógeno, dados que corroboram com os de Souza e Campos
(2003) que ao analisarem dietas enterais não encontraram este patógeno em suas amostras. Já
na análise de bolores e leveduras foi verificada a presença em 58% das amostras do hospital
particular e 83% das amostras do hospital público. No Brasil dados sobre a contaminação por
fungos são abundantes e, além disto, a contaminação por fungos em alimentos é indicativa de
má qualidade da matéria-prima ou falhas a o longo do processamento (MORAIS, 2003)
Com relação às bactérias aeróbias mesófilas no hospital particular foi detectada a presença em
níveis elevados em 66,5%, e no hospital público 75%.
Muniz (2005) ao constatar a qualidade microbiológica de dietas enterais de um hospital da
cidade universitária de Uberlândia constatou que 62,5% encontravam-se contaminadas por
63
este micro- organismo, indicando condições higiênicas impróprias. Na contagem de
coliformes termotolerantes (E. coli) no hospital particular 58% das amostras encontraram-se
contaminadas e níveis elevados, e no hospital público um total de 41% de contaminação. Um
nível menor que estes foi encontrado por Lima 2005 que ao analisar amostras de dietas
enterais encontrou um percentual de 10% de E.coli. Já Milagres 2008 em sua pesquisa com 18
amostras de uma unidade hospitalar não encontrou a presença de E. coli em nenhuma. Além
da presença desse micro- organismo indicar provável contaminação do alimento por material
de origem fecal, alguns podem ser responsáveis por diversas doenças e são considerados um
grande problema de saúde pública para diversos países.
Já na contagem de coliformes totais os dois hospitais tiveram níveis acima do preconizado em
41% de suas amostras. Em uma pesquisa realizada por Sulivan em 2001 ao pesquisar as dietas
de quatro hospitais encontrou um percentual de contaminação por coliformes totais em 38%
de suas amostras, estes resultados são próximos e requerem atenção uma vez que números
elevados destes micro- organismos podem indicar condições sanitárias insatisfatórias, técnicas
inadequadas de manipulação, falhas durante o processo de higienização e até falta de higiene
pessoal. Os resultados obtidos mostram que as dietas enterais analisadas dos dois hospitais
tanto o público quanto o particular encontram-se em condições higiênicas sanitárias
insatisfatórias evidenciando um maior controle na sua manipulação e a realização de análises
microbiológica rotineiras.
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66
Figura 1 -. Percentual de amostras de nutrição enteral dos hospitais público e privado de São
Luís- MA em desacordo com os padrões legais vigentes. Azul- hosp ital privado; Vermelho –
hospital público.
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
Hospital Privado
Hospital Público
Figura 2 -. Percentual de coliformes termotelarantes e coliformes totais acima do pa drão
legal vigente das amostras de nutrição enteral dos hospitais público e privado de
São Luís- MA.
Quantidades de coliformes totais e
coliformes termotolerantes(E.coli) acima
do padrão de dietas enterais de dois
hospitais de São Luís-MA
60%
40%
Coliformes totais
Coliformes termotolerantes
20%
0%
Hospital Público
Hospital Privado
67
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68
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70
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www.nlm.nih.gov/tsd/serials/lji.html ou www.nlm.nih.gov/ citingmedicine ou, se não for
possível, a Associação de Normas Técnicas (ABNT). Exemplos:
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Universidade Estadual de Campinas, 1998.
Referências de “resultados não publicados” e “comunicação pessoal” devem aparecer, entre
parênteses, seguindo o(s) nome(s) individual (is) no texto. Exemplo: Oliveira AC, Silva PA e
Garden LC (resultados não publicados). O autor deve obter permissão para usar
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normoglicemia6
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Terminologia
Visando o emprego de termos oficiais dos trabalhos publicados, a RAMB adota a
Terminologia Anatômica Oficial Universal, aprovada pela Federação Internacional de
Associações de Anatomistas (FIAA). As indicações bibliográficas para consulta são as
seguintes: FCAT – IFAA (1998) – International Anatomical Terminology – Stuttgart –
Alemanha – Georg Thieme Verlag ou CTA-SBA (2001) – Terminologia Anatômica. S. Paulo,
Editora Manole.
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L796A
Lobão, Larissa de Maria Carvalho Praseres.
Análise dos fatores de virulência das Escherichia coli isoladas das
dietas enterais industrializadas e manipuladas de hospitais de São Luís - MA.
/ Larissa de Maria Carvalho Praseres Lobão. São Luís: UNICEUMA, 2014.
73 p.:il.
Dissertação (Mestrado) – Mestrado em Biologia Parasitária.
Universidade do CEUMA, 2014.
1.
Fatores de Virulência. 2. E.coli. Análise. 3. Dietas Enterais. 4.
Hospitais Públicos I. Figueirêdo, Patrícia de Maria Silva. (Orientador) II.
Título.
CDU: 573:576.8:614.21(812.1)