In II .1 II 7111 7111 1111111211

(21)
PI0707300-3 A2
In II .1 II 71 1 71 1 1 1 1 1 211
(22) Data de Depósito: 26/01/2007
(43) Data da Publicação: 03/05/2011
(RPI 2104)
(54) Título: COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, MÉTODO
PARA PREPARAÇÃO DA MESMA E ENSAIO
IMUNOLÓGICO PARA ANÁLISE DE UMA VACINA
CONTRA INFLUENZA
(30) Prioridade Unionista:
27/01/2006 GB 0601733.9,
11/10/2006 GB 0620175.0, 11/10/2006 GB 0620175.0
(73) Titular(es):
Novartis Vaccines And Diagnostics GMBH & CO
(51) Int.CI.:
A61K 39/145
(57) Resumo:
COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, MÉTODO PARA
PREPARAÇÃO DA MESMA E ENSAIO IMUNOLÓGICO PARA
ANÁLISE DE UMA VACINA CONTRA INFLUENZA. Uma composição
imunogênica que compreende hemaglutinina e proteínas da matriz do
vírus influenza. Estas podem ser de vírus influenza desenvolvidos em
cultura de células, e não em ovos. A proteína da matriz pode ser um
fragmento de uma proteína da matriz virai de comprimento total, por
exemplo, um fragmento MI da matriz, com um peso molecular de
menos de 20 kDa. A composição pode ser uma vacina de subunidade
que compreende glicoproteinas de superfície purificadas.
KG
(72) Inventor(es):
Holger Kost, Michael Broeker
(74) Procurador(es): FLÁVIA SALIM LOPES
(86) Pedido Internacional:
PCT IB2007001150 de 26/01/2007
(87) Publicação Internacional: wo
2007/085969de 02/08/2007
M 1 2 3 4 5 6 M
.
- 250
- 150
- 100
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1/84
COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, MÉTODO PARA PREPARAÇÃO DA MESMA E
ENSAIO IMUNOLÓGICO PARA ANÁLISE DE UMA VACINA CONTRA
INFLUENZA
Todos os documentos aqui citados são incorporados por
5 referência em sua totalidade.
CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO
Essa invenção está no campo das vacinas para a
proteção contra infecção pelo vírus influenza e, em
particular, vacinas que incluem proteínas da matriz.
10
FUNDAMENTOS DA TÉCNICA
Várias formas de vacinas contra o vírus influenza
estão disponíveis atualmente (por exemplo, veja os
capítulos 17 & 18 da referência 1). Vacinas são geralmente
baseadas em vírus vivo ou em vírus inativado. Vacinas
15 inativadas podem se basear em vírions inteiros, vírions
"divididos"
(split)
ou em antígenos de superfície
purificados.
A hemaglutinina (HA) é o principal imunógeno em
vacinas inativadas de influenza, e as doses de vacina são
20 padronizadas por referência aos níveis de HA, tipicamente
medidas por um ensaio de imunodifusão radial simples
(SRID). As vacinas atuais tipicamente contêm cerca de 15 pg
de HA por cepa por dose. Além de conter HA de influenza, as
vacinas podem ainda incluir proteínas do vírus influenza.
25 Por exemplo, todas as vacinas atuais incluem neuraminidase
(NA). A referência 2 relata que as vacinas contra influenza
européias também podem incluir quantidades significativas
de outras proteínas do vírus influenza. Por exemplo, a
proteína da matriz (M) foi encontrada em vacinas divididas,
30 mas não em vacinas de antígeno de superfície purificado.
--
3
2/84
Além dos antígenos do vírus influenza, a referência 2
relata que as vacinas também contêm proteínas derivadas do
ovo, por exemplo, ovalbumina. Essas proteínas surgem porque
o método-padrão para o crescimento do vírus influenza na
5 fabricação de vacinas utiliza ovos de galinha embrionados,
com o vírus sendo purificado do conteúdo do ovo (fluido
alantóico).
REVELAÇÃO DA INVENÇÃO
Ao invés de utilizar ovos para o crescimento viral na
10 fabricação de vacinas, foi proposto que os vírus cresçam em
cultura de células. Durante a investigação dessa técnica,
os inventores detectaram inesperadamente seqüências da
matriz. Em particular, enquanto a referência 2 não
encontrou proteína da matriz em vacinas de antígeno de
15 superfície purificado preparadas a partir de vírions
desenvolvidos em ovos, os inventores detectaram proteína da
matriz em vacinas de antígeno de superfície purificado
preparadas a partir de vírions desenvolvidos em cultura de
células.
20
Dessa forma, a invenção fornece uma composição
imunogênica que compreende hemaglutinina e proteínas da
matriz do vírus influenza, preparada a partir de vírus
desenvolvido em cultura de células.
A invenção também fornece uma composição imunogênica
25 que compreende hemaglutinina e proteínas da matriz do vírus
influenza, em que a composição não contém ovalbumina. A
composição também pode ser livre de outras proteínas do ovo
(por exemplo, ovomucóide) e de DNA de galinha.
A invenção também fornece um método para a preparação
30 de uma composição imunogênica que compreende as etapas de:
3/84
(i) crescimento do vírus influenza em cultura de células;
(ii) preparação de uma composição de antígeno a partir de
vírus desenvolvidos na etapa (i), em que a composição de
antígeno compreende hemaglutinina e proteínas da matriz; e
5 (iii) combinação da composição de antígeno com um veículo
farmacêutico, para gerar a composição imunogênica.
Uma proteína da matriz em particular que foi observada
é um fragmento de Ml. A proteína M1 de comprimento total é
uma proteína de 27,8 kDa, mas o fragmento observado possui
10 um peso molecular de cerca de 5 kDa em um gel de SDS-PAGE
de baixo peso molecular (veja abaixo). Ele inclui uma
seqüência de aminoácidos altamente conservada LSYSXGALA
(ID. DE SEQ. N°: 1), em que X é A ou T. Dessa forma, a
invenção fornece uma composição imunogênica que compreende
15 hemaglutinina e proteínas da matriz do vírus influenza, em
que: a proteína da matriz possui um peso molecular de menos
de 20 kDa e compreende uma seqüência de aminoácidos que
possui pelo menos 50% de identidade (por exemplo, pelo
menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais) para o ID. DE
20 SEQ. N°: 1. Outro fragmento de M1 que foi observado possui
comprimento em torno de 75 aa e é desprovido da metionina
do terminal N da seqüência total de M1 (por exemplo, ele
possui a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 28 ou
ID. DE SEQ. N°: 29). Dessa forma, a invenção fornece uma
25 composição imunogênica que compreende hemaglutinina e
proteínas da matriz do vírus influenza, em que a proteína
da matriz é uma proteína M1 desprovida da metionina do
terminal N da seqüência de Ml natural. A proteína da matriz
pode compreender uma seqüência de aminoácidos que possui
30 pelo menos 50% de identidade (por exemplo, pelo menos 60%,
4/84
70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais) para o ID. DE SEQ.
ou para o ID. DE
SEQ. N°: 29.
N°: 28
Além de não possuir a
metionina do terminal N, o fragmento pode ser desprovido de
um ou mais aminoácidos adicionais abaixo da metionina do
5 terminal N.
Embora
essas
composições
sejam
preparadas
preferivelmente a partir de vírus desenvolvido em cultura
de células, elas podem alternativamente ser preparadas de
outras formas, por exemplo, por adição da proteína da
10 matriz e uma vacina derivada do ovo, com a utilização de um
protocolo de purificação com vírions derivados do ovo, o
que resulta na produção e presença da proteína da matriz,
por combinação da proteína da matriz com uma HA expressa de
forma recombinante (e, opcionalmente, outras proteínas
15 expressas de forma recombinante) etc.
Preparação de componentes antigênicos
A invenção não utiliza um antígeno de vírion inteiro
(WV), ou seja, ela não engloba vacinas que utilizam um
vírus vivo ou um vírion inativado inteiro. Em vez disso, os
20 antígenos da invenção são antígenos não-WV, por exemplo,
vírions divididos ou antígenos de superfície purificados.
As composições da invenção compreendem pelo menos dois
antígenos do vírus influenza: hemaglutinina e matriz. Elas
também podem incluir outro(s) antígeno(s) do vírus
25 influenza, por exemplo, neuraminidase. Os antígenos
tipicamente serão preparados a partir de vírions influenza
(preferivelmente crescidos em cultura de células), mas, em
algumas modalidades, os antígenos podem ser expressos em um
hospedeiro recombinante (por exemplo, em uma linhagem de
30 células de inseto com o uso de um vetor de baculovírus) e
5/84
usados na forma purificada [3,4]. Em geral, no entanto, os
antígenos serão de vírions.
Na preparação de antígenos não-WV a partir de vírions,
os vírions podem ser inativados. Meios químicos para a
5 inativação de um vírus incluem o tratamento com uma
quantidade eficaz de um ou mais dos seguintes agentes:
detergentes, formaldeído, P-propiolactona, azul de
metileno,
psoraleno,
carboxifulereno
(C60),
etilamina
binária, acetil etilenoimina, ou combinações destes.
10 Métodos não químicos de inativação viral são conhecidos na
técnica como, por exemplo, luz UV ou irradiação gama.
Os vírions podem ser coletados de líquidos que contêm
vírus por vários métodos. Por exemplo, um processo de
purificação pode envolver a centrifugação por zona com o
15 uso de uma solução de gradiente linear de sacarose que
inclui detergente para romper os vírions. Os antígenos
podem então ser purificados, após diluição opcional, por
diafiltração.
Vírions divididos podem ser obtidos por tratamento de
20 vírions purificados com detergentes (por exemplo, éter
etílico,
polissorbato
fosfato,
Triton
X-100,
80,
desoxicolato,
Triton
N101,
tri-N-butil
brometo
de
cetiltrimetilamônio, Tergitol NP9 etc.) para a produção de
preparações sub-vírion, incluindo o processo de divisão
25 "Tween-éter". Métodos de divisão dos vírus influenza são
bem conhecidos na técnica, por exemplo, veja as referências
5-10 etc. A divisão do vírus é tipicamente realizada por
ruptura ou fragmentação de vírus inteiros, sejam eles
infecciosos ou não infecciosos, com uma concentração de
30 ruptura de um agente de divisão. A ruptura resulta em uma
6/84
solubilização total ou parcial das proteínas virais,
alterando a integridade do vírus. Agentes de divisão
preferidos são tensoativos não iônicos e iônicos (por
exemplo, catiônicos), por exemplo, alquilglicosídeos,
5 alquiltioglicosídeos,
betaínas,
acil
açúcares,
polioxietilenoalquiléteres,
sulfobetaínas,
N,N-dialquil-
Glucamidas, Hecameg, alquilfenoxi-polietoxietanóis,
compostos de amônio quaternário, sarcosil, CTABs (brometos
de cetil trimetil amônio), tri-N-butil fosfato, Cetavlon,
10 sais de mirisitiltrimetilamônio, lipofectina, lipofectamina
e
DOT-MA, os octil- ou nonilfenoxi polioxietanóis (por
exemplo, os tensoativos Triton, por exemplo, Triton X-100
ou Triton N101), ésteres de polioxietileno sorbitano (os
tensoativos Tween), éteres de polioxietileno, ésteres de
15 polioxietileno etc. Um procedimento de divisão útil utiliza
os efeitos consecutivos de desoxicolato de sódio e
formaldeído, e a divisão ocorre durante a purificação
inicial do vírion (por exemplo, em uma solução de gradiente
de densidade de sacarose). Dessa forma, um processo de
20 divisão pode envolver a clarificação do material que contém
o
vírion (para a remoção de material não-vírion),
concentração dos vírions coletados (por exemplo, com o uso
de um método de adsorção, por exemplo, adsorção de CaHPO 4 ),
separação de vírions inteiros do material não-vírion,
25 divisão do vírions com o uso de um agente de divisão em uma
etapa de centrifugação por gradiente de densidade (por
exemplo, com o uso de um gradiente de sacarose que contém
um agente de divisão, por exemplo, desoxicolato de sódio),
e
depois filtração (por exemplo, ultrafiltração) para
30 remoção de materiais indesejados. Os vírions divididos
7/84
podem ser proveitosamente re-suspensos em solução isotônica
de cloreto de sódio tamponada com fosfato. Os produtos
BEGRIVACTM , FLUARIXTM , FLUZONE TM e FLUSHIELD TM são vacinas
divididas.
5
Vacinas de antígeno de superfície purificado
compreendem os antígenos de superfície de influenza,
hemaglutinina e, tipicamente, também neuraminidase.
Processos para a preparação dessas proteínas na forma
purificada são bem conhecidos na técnica. Os produtos
10 FLUVIRINTM ,
AGRIPPALTM e INFLUVACTM são vacinas de
subunidades.
Os antígenos de
influenza também podem ser
apresentados na forma de virossomas [11]
lipossômicas sem ácido nucléico
viral-like),
(partículas
como nos
15 produtos INFLEXAL VTM e INVAVACTM , mas prefere-se não usar
virossomas com a presente invenção. Dessa forma, em algumas
modalidades, o antígeno de influenza não está na forma de
um virossoma.
O vírus influenza pode ser atenuado. O vírus influenza
20 pode ser sensível à temperatura. O vírus influenza pode ser
adaptado ao frio. Essas três características são
particularmente úteis quando se utiliza vírus vivo como
antígeno.
As cepas do vírus influenza para uso em vacinas mudam
25 de estação para estação. No atual período interpandêmico,
as vacinas tipicamente incluem duas cepas de influenza A
(H1N1 e H3N2) e uma cepa de influenza B, e as vacinas
trivalentes são típicas. A invenção também pode utilizar HA
de cepas pandêmicas (ou seja, cepas para as quais o
30 receptor da vacina e a população humana geral são
8/84
imunologicamente virgens), por exemplo, cepas dos subtipos
H2, H5, H7 ou H9
(em particular, do vírus influenza A), e
as vacinas contra influenza para cepas pandêmicas podem ser
monovalentes ou podem ser baseadas em uma vacina trivalente
5
normal suplementada por uma cepa pandêmica. Dependendo da
estação e da natureza do antígeno incluído na vacina, no
entanto, a invenção pode proteger contra um ou mais dos
subtipos HA do vírus influenza A Hl, H2, H3, H4, H5, H6,
H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15 ou H16. A
invenção
10 pode proteger contra um ou mais dos vírus subtipos
NA
de
influenza A N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 ou N9.
Além de serem adequadas à imunização contra cepas
interpandêmicas, as composições da invenção são
particularmente úteis para a imunização contra cepas
15
pandêmicas. As características de uma cepa de influenza que
geram o potencial para causar um surto pandêmico são: (a)
ela contém uma nova hemaglutinina, comparada com as
hemaglutininas em cepas humanas que circulam atualmente, ou
seja, uma que não era evidente na população humana por mais
20
de uma década (por exemplo,
H2), ou
que não havia sido
observada previamente de forma alguma na população humana
(por exemplo,
H5, H6 ou H9,
que geralmente só eram
encontradas em populações de pássaros), de tal forma que a
população humana será imunologicamente virgem para a
25
hemaglutinina da cepa; (b) ela é capaz de ser transmitida
horizontalmente na população humana; e (c) ela é patogênica
para seres humanos. Um vírus com o tipo H5 de hemaglutinina
é preferido para a imunização contra influenza pandêmica,
por exemplo, uma cepa H5N1. Outras cepas possíveis incluem
30 H5N3, H9N2, H2N2, H7N1
e
H7N7,
e quaisquer outras cepas
9/84
pandêmicas que potencialmente venham a surgir. Dentro do
subtipo H5, um vírus pode se classificar em HA ciado 1, HA
ciado 1', HA ciado 2 ou HA ciado 3 [12], com os ciados 1 e
3 sendo particularmente relevantes.
5
Outras cepas cujos antígenos podem ser proveitosamente
incluídos nas composições são cepas que são resistentes à
terapia antiviral (por exemplo, resistentes ao oseltamivir
[13] e/ou zanamivir), incluindo cepas pandêmicas
resistentes [14].
10
As composições da invenção podem incluir antígeno(s)
de uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou mais) cepas do
vírus influenza, incluindo vírus influenza A e/ou vírus
influenza B. As vacinas monovalentes não são preferidas, e
quando uma vacina incluir mais de uma cepa de influenza, as
15 diferentes cepas são tipicamente desenvolvidas
separadamente e são misturadas após os vírus terem sido
coletados e os antígenos terem sido preparados. Dessa
forma, um processo da invenção pode incluir a etapa de
mistura de antígenos de mais de uma cepa de influenza.
20 Prefere-se uma vacina trivalente, que inclui antígenos de
duas cepas do vírus influenza A e uma cepa do vírus
influenza B.
Em algumas modalidades da invenção, as composições
podem incluir antígeno de uma única cepa influenza A. Em
25 algumas modalidades, as composições podem incluir antígeno
de duas cepas de influenza A, desde que essas duas cepas
não sejam H1N1 e H3N2. Em algumas modalidades, as
composições podem incluir antígeno de mais de duas cepas de
influenza A.
30
O vírus influenza pode ser uma cepa recombinante
10/84
(reassortant),
e pode ter sido obtido por técnicas de
genética reversa. Técnicas de genética reversa [por
exemplo, 15-19] permitem que sejam preparados vírus
influenza com segmentos genômicos desejados in vitro com o
5 uso de plasmídeos. Tipicamente, elas envolvem a expressão
de: (a) moléculas de DNA que codificam as moléculas de RNA
viral desejadas, por exemplo, de promotores polI, e (b)
moléculas de DNA que codificam proteínas virais, por
exemplo, de promotores polII, de forma que a expressão de
10 ambos os tipos de DNA na célula leve à montagem de um
vírion infeccioso intacto completo. O DNA preferivelmente
fornece todo o RNA e todas as proteínas virais, mas também
é possível usar um vírus auxiliar
(helper)
para fornecer
uma parte do RNA e das proteínas. Métodos baseados em
15 plasmídeos que utilizam plasmídeos separados para a
produção de cada RNA viral são preferidos [20-22], e esses
métodos também envolverão o uso de plasmídeos para a
expressar de todas ou algumas (por exemplo, somente as
proteínas PB1, PB2, PA e NP) das proteínas virais, com 12
20 plasmídeos sendo usados em alguns métodos.
Para reduzir o número de plasmídeos necessários, uma
abordagem recente [23] combina diversos cassetes de
transcrição de RNA polimerase I (para a síntese de RNA
viral) no mesmo plasmídeo (por exemplo, seqüências que
25 codificam 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou todos os 8 segmentos de
mRNA de influenza A), e diversas regiões que codificam
proteína com promotores de RNA polimerase II no outro
plasmídeo (por exemplo, seqüências que codificam 1, 2, 3,
4, 5, 6, 7 ou todos os 8 transcritos de mRNA de influenza
30 A). Aspectos preferidos do método da referência 23
11/84
envolvem: (a) regiões de codificação de mRNA PB1, PB2 e PA
em um único plasmídeo; e (b) todos os 8 segmentos que
codificam vRNA em um único plasmídeo. A inclusão dos
segmentos de NA e HA em um plasmídeo e dos seis outros
5 segmentos no outro plasmídeo também pode facilitar o
processo.
Como alternativa ao uso dos promotores poll para
codificar os segmentos de RNA virai, é possível usar
promotores de bacteriófago polimerase [24]. Por exemplo,
10 promotores para as SP6, T3 ou T7 polimerases podem
convenientemente ser usados. Por causa da especificidade
por espécie dos promotores polI, os promotores de
bacteriófago polimerase podem ser mais convenientes para
muitos tipos de células (por exemplo, MDCK), embora uma
15 célula também tenha que ser transfectada com um plasmídeo
que codifica a enzima polimerase exógena.
Em outras técnicas é possível usar promotores duplos
poli e polII para codificar simultaneamente RNAs virais e
para mRNAs passíveis de expressão a partir de um único
20
modelo [25,26].
Dessa forma, um vírus influenza A pode incluir um ou
mais segmentos de RNA de um vírus A/PR/8/34 (tipicamente 6
segmentos de A/PR/8/34, com os segmentos HA e N sendo de
uma cepa da vacina, ou seja, uma recombinante 6:2). Ele
25 também pode incluir um ou mais segmentos de RNA de um vírus
A/WSN/33, ou de qualquer outra cepa do vírus útil para a
geração de vírus recombinante para a preparação da vacina.
Tipicamente, a invenção protege contra uma cepa que é capaz
de transmissão de ser humano para ser humano e, dessa
30 forma, o genoma da cepa normalmente incluirá pelo menos um
12/84
segmento de RNA que se originou em um vírus influenza
mamífero (por exemplo, em um ser humano). Ele pode incluir
segmento NS que se originou em um vírus influenza aviário.
Os vírus usados como fonte dos antígenos são
5 geralmente desenvolvidos em cultura de células, mas, em
algumas modalidades, eles podem se desenvolver em ovos. O
método-padrão atual para o crescimento do vírus influenza
utiliza ovos de galinha embrionados específicos, livres de
patógenos (SPF), com o vírus sendo purificado do conteúdo
10 do ovo (fluido alantóico). Mais recentemente, no entanto,
foram desenvolvidos vírus em cultura de células animais e,
por razões de velocidade e alergias de pacientes, esse
método de crescimento é preferido. Caso seja usado o
crescimento viral baseado no ovo, um ou mais aminoácidos
15 poderão ser introduzidos no fluido alantóico do ovo, junto
com o vírus [10].
O substrato celular tipicamente será uma linhagem de
células de origem mamífera. Células de origem mamífera
adequadas incluem, sem limitação, células de hamster, gado,
20 primatas (incluindo seres humanos e macacos) e cachorros.
Vários tipos de células podem ser usados, por exemplo,
células renais, fibroblastos, células retinianas, células
do pulmão etc. Exemplos de células de hamster adequadas são
as linhagens de células que possuem os nomes BHK21 ou HKCC.
25 Células de macaco adequadas são, por exemplo, células de
macaco verde africano, por exemplo, células renais, como na
linhagem de células Vero. Células de cachorro adequadas
são, por exemplo, células renais, como na linhagem de
células MDCK. Dessa forma, linhagens de células adequadas
30 incluem, sem limitação: MDCK; CHO; 293T; BHK; Vero; MRC-5;
13/84
PER.C6; WI-38 etc. O uso de células mamíferas significa que
as vacinas podem ser livres de DNA de galinha, além de
serem livres de proteínas do ovo (por exemplo, ovalbumina e
ovomucóide) reduzindo, dessa forma, a alergenicidade.
5 Linhagens de células mamíferas preferidas para o
crescimento de vírus influenza incluem: células MDCK [2730], derivadas do rim canino Madin Darby; células Vero [3133], derivadas do rim de macaco verde africano
(Cercopithecus aethiops); ou células PER.C6 [34], derivadas
10 de retinoblastos embriônicos humanos. Essas linhagens de
células são amplamente disponíveis, por exemplo, da coleção
da "American Type Cell Culture" (ATCC) [35], dos "Coriell
Cell Repositories" [36], ou da "European Collection of Cell
Cultures" (ECACC). Por exemplo, a ATCC fornece várias
15 células Vero diferentes sob os números de catálogo CCL-81,
CCL-81.2, CRL-1586 e CRL-1587, e fornece células MDCK sob o
número de catálogo CCL-34. PER.C6 é disponível pelo ECACC
sob o número de depósito 96022940. Como alternativa menos
preferida às linhagens de células mamíferas, os vírus podem
20 crescer em linhagens de células aviárias [por exemplo,
referências 37-39], incluindo linhagens de células
derivadas de patos (por exemplo, retina de pato) ou
galinhas. Exemplos de linhagens de células aviárias incluem
células-tronco embriônicas aviárias [37,40] e células da
25 retina de pato [38]. Células-tronco embriônicas aviárias
adequadas incluem a linhagem de células EBx derivadas de
células-tronco embriônicas de galinhas, EB45, EB14 e EB14074 [41]. Fibroblastos de embrião de galinha (CEF) também
podem ser usados.
30
As linhagens de células mais preferidas para o
14/84
crescimento de vírus influenza são linhagens de células
MDCK. A linhagem de células MDCK original é disponível pela
ATCC como CCL-34, mas derivados dessa linhagem de células
também podem ser usados. Por exemplo, a referência 27
5 revela uma linhagem de células MDCK que foi adaptada para o
crescimento em cultura de suspensão ("MDCK 33016",
depositada como DSM ACC 2219). Similarmente, a referência
42
revela uma linhagem de células derivada de MDCK que
cresce em suspensão em cultura sem soro ("B-702",
10 depositada como FERM BP-7449). A referência 43 revela
células MDCK não tumorigênicas, incluindo "MDCK-S" (ATCC
PTA-6500), "MDCK-SF101" (ATCC PTA-6501), "MDCK-SF102" (ATCC
PTA-6502) e "MDCK-SF103" (PTA-6503). A referência 44 revela
linhagens de células MDCK com suscetibilidade elevada à
15 infecção, incluindo células "MDCK.5F1" (ATCC CRL-12042).
Qualquer uma dessas linhagens de células MDCK pode ser
usada.
A cultura para o crescimento celular e também o
inóculo viral usado para iniciar a cultura serão
20 preferivelmente isentos de (ou seja, serão testados e
considerados negativos para contaminação por) vírus do
herpes simples, vírus sincicial respiratório, vírus
parainfluenza 3, coronavírus da SARS, adenovírus,
rinovírus, reovírus, vírus do polioma, birnavírus,
25 circovírus e/ou parvovírus [45]. A ausência de vírus do
herpes simples é particularmente preferida.
Os vírus podem crescer em células em suspensão [46] ou
em cultura aderente. Em uma modalidade, as células podem
ser adaptadas para crescimento em suspensão. Uma linhagem
30 de células MDCK adequada que está adaptada ao crescimento
15/84
em cultura de suspensão é MDCK 33016 (depositada como DSM
ACC 2219). Como alternativa, pode ser usada cultura de
microcarregadores
(microcarrier).
As linhagens celulares que apóiam a replicação do
5 vírus influenza crescem preferivelmente em meios de cultura
livres de soro e/ou em meios livres de proteínas. Um meio é
considerado um meio livre de soro no contexto da presente
invenção quando não há aditivos do soro de origem humana ou
animal. O termo "livre de proteína" visa significar
10 culturas nas quais a multiplicação das células ocorre com
exclusão de proteínas, fatores de crescimento, outros
aditivos protéicos e proteínas não séricas, mas podem
opcionalmente incluir proteínas como, por exemplo, tripsina
ou outras proteases que podem ser necessárias para o
15 crescimento viral. As células que crescem nestas culturas
naturalmente contêm as próprias proteínas.
As linhagens celulares que apóiam a replicação do
vírus influenza crescem preferivelmente abaixo de 37°C (47]
(por exemplo, 30-36°C) durante a replicação viral.
20 O método para a propagação do vírus em células
cultivadas geralmente inclui as etapas de inoculação das
células cultivadas com a cepa a ser cultivada, o cultivo
das células infectadas por um período de tempo desejado
para a propagação do vírus como, por exemplo, como
25 determinado pela titulação do vírus ou expressão do
antígeno (por exemplo, entre 24 e 168 horas após a
inoculação) e coleta do vírus propagado. As células
cultivadas são inoculadas com uma proporção de vírus
(medido por PFU ou TCID 50 ) para células de 1:500 a 1:1,
30 preferivelmente 1:100 a 1:5, mais preferivelmente 1:50 a
16/84
1:10. O vírus é adicionado a uma suspensão das células ou é
aplicado a uma monocamada das células, e o vírus é
absorvido sobre as células por pelo menos 60 minutos, mas
normalmente menos de 300 minutos, preferivelmente entre 90
5 e 240 minutos a 25°C a 40°C, preferivelmente 28°C a 37°C. A
cultura de células infectadas (por exemplo, monocamadas)
pode ser removida por congelamento-descongelamento ou por
ação enzimática para aumentar o teor viral dos
sobrenadantes da cultura coletados. Os líquidos coletados
10 são então inativados ou armazenados congelados. As células
cultivadas podem ser infectadas em uma multiplicidade de
infecção ("m.o.i.") de cerca de 0,0001 a 10,
preferivelmente 0,002 a 5, mais preferivelmente até 0,001 a
2. Ainda mais preferivelmente, as células são infectadas em
15 uma m.o.i de cerca de 0,01. As células infectadas podem ser
coletadas 30 a 60 horas após a infecção. De preferência, as
células são coletadas 34 a 48 horas após a infecção. Ainda
mais preferivelmente, as células são coletadas 38 a 40
horas após a infecção. Proteases (tipicamente tripsina) são
20 geralmente adicionadas durante a cultura de células para
permitir a liberação viral, e as proteases podem ser
adicionadas em qualquer estágio adequado durante a cultura.
HA é o principal imunógeno nas vacinas inativadas de
influenza atuais, e as doses da vacina são padronizadas por
25 referência aos níveis de HA, medidos tipicamente por SRID.
As vacinas existentes tipicamente contêm cerca de 15 pg de
HA por cepa, embora possam ser usadas doses menores, por
exemplo, para crianças ou em situações pandêmicas, ou
quando se utiliza um adjuvante. Doses fracionadas, por
30 exemplo, 1/2 (ou seja, 7,5 pg de HA por cepa), 1/4 e 1/8
17/84
foram usadas [89,90], bem como doses maiores (por exemplo,
doses de 3x ou 9x [48,49]). Dessa forma, as vacinas podem
incluir entre 0,1 e 150 pg de HA por cepa de influenza,
preferivelmente entre 0,1 e 50 pg, por exemplo, 0,1-20 pg,
5
0,1-15 pg, 0,1-10 pg, 0,1-7,5 pg, 0,5-5 pg etc. Doses
específicas incluem, por exemplo, cerca de 45, cerca de 30,
cerca de 15, cerca de 10, cerca de 7,5, cerca de 5, cerca
de 3,8, cerca de 1,9, cerca de 1,5 etc. por cepa.
Para vacinas vivas, a dosagem é medida por dose
10 infecciosa média para cultura de tecido (TCID 50 ), e não
pelo teor de HA, e uma TCID 50 entre 10 6 e 10 8
6 ' 5 -10 7 ' 5 ) por cepa é típica.
A HA usada com a invenção pode ser uma HA natural como
encontrada em um vírus, ou pode ter sido modificada. Por
15 exemplo, é conhecida a modificação da HA para a remoção de
determinantes (por exemplo, regiões hiper-básicas em torno
do sítio de clivagem entre HA1 e HA2), o que faz com que um
vírus seja altamente patogênico em espécies aviárias, na
medida em que esses determinantes podem, de outro modo,
20 evitar que um vírus cresça em ovos.
A proteína da matriz
Além de incluir hemaglutinina, as composições da
invenção incluem uma proteína da matriz. O segmento 7 do
vírus influenza A codifica os polipeptídeos Ml e M2. M1
25 está abaixo da bicamada lipídica viral, enquanto M2 é uma
proteína integral da membrana que fornece um canal de íon
que é inibido por amantadina. M2 é expressa por um mRNA
spliced.
O segmento 7 do vírus influenza B codifica os
polipeptídeos Ml e BM2.
30
A proteína da matriz incluída em composições da
(prefivlmnt re10
18/84
invenção é tipicamente uma proteína Ml de um vírus
influenza A. A seqüência de comprimento total de 252 aa de
Ml do vírus influenza A PR/8/34 está disponível nas bases
de dados sob GI:138817, que é o ID. DE SEQ. N°: 2
5 apresentado abaixo:
D4SLLTEVETYVLSII ESGPL KAEIAQRLEDVFAGKNTDLEVLMEWLKTRPILSPL'I'KGILGFVFTL
TVPSERGLQRRRFVQNALNGNGDPNNMDKAVKLYRKI,KRE I T FFIGAKE I SLS YSAGALAS CMGL I Y
NRMGAVTTEVAFGLVCATCEQIADSQHRSIIRQMVTTTNPL I RHENRMLAS TTAKAMEOMAGS SE()
AAEAMEVAS QARQMVQAMRT I GTH PS SSAGLKN DLLENLQAYORMGVWQRFK
A proteína da matriz incluída em composições da
10 invenção preferivelmente compreende uma seqüência de
aminoácidos de M1 que tem comprimento de pelo menos
m
aminoácidos, em que os referidos m aminoácidos possuem pelo
menos
n%
de identidade para o ID. DE SEQ. N°: 2. Os
m
aminoácidos incluirão tipicamente um fragmento de pelo
15 menos p aminoácidos consecutivos do ID. DE SEQ. N°: 2.
O valor de m pode ser, por exemplo, 7, 8, 9, 10, 12,
14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100
ou mais. O valor de
n
pode ser, por exemplo, 70 (por
exemplo, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99
20 ou mais). O valor de p pode ser, por exemplo, 5, 6, 7, 8,
9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70,
80, 90, 100 ou mais. Quando n < 100, p será menor do que m.
A seqüência de m aminoácidos pode, comparada com o ID.
DE SEQ. N°: 2, incluir uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3,
25
4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 etc.) substituições de aminoácidos
conservadoras, ou seja, substituições de um aminoácido com
outro que tenha uma cadeia lateral relacionada. Os
aminoácidos codificados geneticamente são geralmente
divididos em quatro famílias: (1) ácidos, ou seja,
30 aspartato, glutamato;
(2) básicos, ou seja,
lisina,
19/84
arginina, histidina; (3) não polares, ou seja, alanina,
valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina,
metionina, triptofano; e (4) polares não carregados, ou
seja, glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina,
5 treonina, tirosina. Fenilalanina, triptofano e tirosina
algumas vezes são classificados em conjunto como
aminoácidos aromáticos. Em geral, a substituição de
aminoácidos únicos dentro dessas famílias não tem um efeito
importante sobre a atividade biológica. Os
m aminoácidos
10 também podem incluir uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4,
5, 6, 7, 8, 9, 10 etc.) eliminações de um único aminoácido
em relação ao ID. DE SEQ. N°: 2. Os m aminoácidos também
podem incluir uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6,
7, 8, 9,
15
10 etc.) inserções (por exemplo, cada um de 1, 2,
3, 4 ou 5 aminoácidos) em relação ao ID. DE SEQ. N°: 2.
Proteínas da matriz preferidas para inclusão em
composições da invenção compreendem um epítopo de Ml. O
epítopo pode ser um epítopo de células T e/ou de células B.
Epítopos de células T e B podem ser identificados
20 empiricamente (por exemplo, com o uso de PEPSCAN [50,51] ou
de métodos similares), ou podem ser previstos (por exemplo,
com o uso do índice antigênico de Jameson-Wolf [52], por
abordagens baseadas na matriz [53], TEPITOPE [54], por
redes neurais [55] , OptiMer & EpiMer [56, 57] , ADEPT [58],
25 Tsites [59], hidrofilicidade [60], índice antigênico [61]
ou pelos métodos revelados na referência 62 etc.). Por tais
métodos, já foram identificados epítopos de células T na
proteína viral M1 de influenza A, incluindo os seguintes
[63]:
MHC
Seqüência
ID. DE SEQ. REF.
20/84
HLA-A*0201
GILGFVFTL
3
64
HLA-A*0201
ILGFVFTLTV
4
64
HLA-A*1101
SIIPSGPLK
5
65
H-2Kb
MGLIYNRM
6
66
HLA-B*3501
ASCMGLIY
7
67
HLA-CW*0102
ILSPLTKGI
8
68
HLA-CW*0102
ILSPLTKGIL
9
68
HLA-DQw1
AYQKRMGVQMQR
10
69
HLA-DQw3
LENLQAYQKR
11
69
HLA-DRB1*0101 GPLKAEIAQRLE
12
70
Saoe-G*02
RKLKREITF
13
71
Saoe-G*04
RKLKREITFH
14
71
Outros epítopos de células T em M1 incluem: SLLTEVETYV
(ID. DE SEQ. N°: 15; resíduos 2-11 do ID. DE SEQ. N°: 2);
IIPSGPLK (ID. DE SEQ. N°: 16; resíduos 14-21 do ID. DE SEQ.
N°: 2); e LEDVFAGK (ID. DE SEQ. N°: 17; resíduos 28-35 do
5
ID. DE SEQ. N°: 2).
Uma proteína da matriz em particular que foi primeiro
detectada em vacinas preparadas em cultura de células é uma
proteína de 5 kDa com a seqüência do terminal N
EISLSYSAGALA (ID. DE SEQ. N°: 18; resíduos 114-125 do ID.
10 DE SEQ. N°: 2). O resíduo do terminal N e o tamanho desse
polipeptídeo são consistentes com o fato de ele ser um
fragmento tríptico de Ml, quando então o polipeptídeo de
comprimento total pode ter uma das seguintes seqüências de
aminoácidos:
15
ID.
DE
SEQ.
N°:
19
EISLSYSAGALASCMGLIYNRMGAVTTEVAFGLVCATCEQIADSQHRSHR
ID.
DE
SEQ.
N°:
EISLSYSAGALASCMGLIYNRMGAVTTEVAFGLVCATCEQIADSQHR
20
21/84
O ID. DE SEQ. N°:
19 inclui o motivo Cys-Cys-His-His
completo (resíduos 148-162 do ID. DE SEQ.
N°:
2) que pode
fornecer afinidade por zinco [72]. Dessa forma, uma
proteína da matriz usada com a invenção pode adicionalmente
5 incluir um íon zinco.
A seqüência do ID. DE SEQ. N°: 18 inclui a seqüência
LSYSXGALA (ID. DE SEQ. N°: 1), que é muito bem conservada
entre cepas do vírus influenza A, com o 5° resíduo "X"
sendo Thr (LSYSTGALA, ID. DE SEQ. N°: 21) ou Ala
10
(LSYSAGALA, ID. DE SEQ. N°: 22). São conhecidas variações
desse
9mer conservado (por exemplo, em
A/Swine/Ontario/01911-2/99 (H4N6) o 9mer é LSYSTGALA [GI:
10442678;
ID.
DE
SEQ.
N°:
23]
e
em
A/swine/England/191973/92 (H1N7) ele é LGYSTGALA [GI:
15
1835734;
ID.
DE
SEQ.
N°:
24],
em
A/Chicken/Pennsylvania/13609/93 (H5N2) ele é LSYSTGALT [GI:
4584948; ID. DE SEQ. N°: 25], em A/WSN/33 ele é FSYSAGALA
[GI: 324407; ID. DE SEQ. N°: 26]),
mas o ID. DE SEQ. N°: 1
é a seqüência mais comum. A YSXGAL (ID. DE SEQ. N°: 27)
20 central aparece em todas essas seqüências. As seqüências
nos vírus influenza podem ser localizadas convenientemente
na "Influenza Sequence Database" (ISD) em www.flu.lanl.gov
[73]. Seqüências adicionais podem ser encontradas na
referência 74.
25
Dessa forma, proteínas da matriz preferidas incluídas
em composições da invenção incluem uma ou mais das
seqüências de aminoácidos dos IDS. DE SEQ. N os : 1, 21, 22,
23, 24, 25,
26 e/ou 27. Enquanto a proteína M1 de
comprimento total é uma proteína de 27,8 kDa, no entanto, a
30
proteína da matriz incluída nas composições da invenção
22/84
possui um peso molecular < 20 kDa, por exemplo,
12 kDa, nO kDa,
9 kDa, < 8 kDa, 5. 7 kDa,
15 kDa,
6 kDa, < 5,5
kDa, ou de cerca de 5 kDa. O peso molecular da proteína da
matriz preferivelmente se situa na faixa de 2-8 kDa, por
5 exemplo, 3-7 kDa, 4-6 kDa ou cerca de 5 kDa. O terminal N
da proteína da matriz pode ser Glu-Ile-Ser, seguido por uma
das seqüências de aminoácidos dos IDS. DE SEQ. N °5 : 1, 19,
20, 21, 22, 23 ou 24.
A proteína da matriz pode formar oligômeros (por
10 exemplo, dímeros, por exemplo, homodímeros) dentro da
composição.
Caso a proteína da matriz inclua o aminoácido 137
(numerado como no ID. DE SEQ. N°: 2), esse aminoácido
poderá ser Ala (como no ID. DE SEQ. N°: 2) ou Thr (como
15 observado em vírus patogênicos humanos H5N1).
A proteína da matriz pode estar presente em várias
quantidades, mas tipicamente estará presente em 1 µg/ml a
15 gg/ml, por exemplo, entre 2-14 pg/ml, entre 3-13 pg/ml,
entre 4-12 gg/ml, entre 5-11 µg/ml, entre 6-10 pg/ml, entre
20 7-9 pg/ml etc. Concentrações de menos de 1 pg/ml também são
possíveis.
Com a inclusão dessas proteínas da matriz, além da
hemaglutinina, as composições da invenção se beneficiam de
quaisquer epítopos de células T que estejam presentes, o
25 que pode aumentar a proteção cruzada (dentro do mesmo tipo
de HA e também entre diferentes tipos de HA) despertada por
uma vacina [75]. As proteínas da matriz podem estar
presentes endogenamente em conseqüência da preparação da
composição (por exemplo, ela pode co-purificar com HA), ou
30 elas podem ser adicionadas como componentes exógenos, por
23/84
exemplo, para aprimorar vacinas que não contêm o componente
da matriz, incluindo vacinas derivadas do ovo.
Sem se prender a uma teoria, os inventores acreditam
que a proteína da matriz possa se ligar à HA em uma vacina
5 para formar um complexo estável. Caso o complexo seja mais
estável do que a HA isoladamente, o prazo de validade de
uma vacina pode ser aumentado e, em particular, sua
habilidade para tolerar o armazenamento fora de um
refrigerador.
10
A região em torno do ID. DE SEQ. N°: 1 em M1 pode
atuar como um domínio de ligação de lipídeo [76]. Com a
inclusão dessa região em uma proteína da matriz, portanto,
a proteína pode vantajosamente interagir com adjuvantes
graxos, como descrito com mais detalhe abaixo.
15
Quando uma composição incluir HA de mais de uma cepa
do vírus influenza A, ela geralmente também incluirá
proteína da matriz de mais de uma cepa. Enquanto as HAs das
cepas normalmente serão diferentes entre elas, no entanto,
as proteínas da matriz podem ser as mesmas. Caso elas sejam
20 idênticas no produto final, poderá não ser possível
distinguir as duas proteínas da matriz, mas elas terão
origens diferentes.
Além de incluir HA e matriz, as composições da
invenção podem incluir neuraminidase e/ou nucleoproteína.
25 Quando uma composição incluir HA de um vírus influenza
B, ela também poderá incluir proteína Ml de um vírus
influenza B.
DNA da célula hospedeira
Quando o vírus tiver crescido em uma linhagem celular,
30 é uma prática padronizada a minimização da quantidade de
24/84
DNA residual da linhagem celular na vacina final, a fim de
minimizar qualquer atividade oncogênica do DNA. Essa medida
de segurança é particularmente importante quando se inclui
uma proteína da matriz do vírus influenza em uma vacina, na
5 medida em que a proteína da matriz pode se ligar aos ácidos
nucléicos (incluindo RNA e DNA de fita dupla) [77] e pode,
dessa forma, reter DNA mais facilmente do que as vacinas
baseadas em HA existentes.
Dessa forma, a composição preferivelmente contém menos
10 de 10 ng (preferivelmente menos de 1 ng e, mais
preferivelmente, menos de 100 pg) de DNA residual da célula
hospedeira por dose, embora quantidades residuais de DNA da
célula hospedeira possam estar presentes. Prefere-se que o
comprimento médio de qualquer DNA residual da célula
15 hospedeira seja menor do que 500 bp, por exemplo, menor do
que 400 bp, menor do que 300 bp, menor do que 200 bp, menor
do que 100 bp etc. Em geral, o DNA da célula hospedeira que
é desejável excluir das composições da invenção é o DNA que
é mas longo do que 100 bp.
20
A medida do DNA residual da célula hospedeira é agora
uma exigência reguladora de rotina para substâncias
biológicas e está dentro dos conhecimentos daqueles
habilitados na técnica. O ensaio usado para medir o DNA
tipicamente será um ensaio validado [78,79]. As
25 características de desempenho de um ensaio validado podem
ser descritas em termos matemáticos e quantificáveis, e
suas possíveis fontes de erro serão identificadas. O ensaio
geralmente irá testar características como, por exemplo,
exatidão, precisão, especificidade. Após um ensaio ter sido
30 calibrado (por exemplo, contra quantidades padronizadas
25/84
conhecidas de DNA da célula hospedeira) e testado, poderão
ser feitas rotineiramente medidas quantitativas de DNA.
Três técnicas principais para quantificação de DNA podem
ser realizadas: métodos de hibridização, por exemplo,
5
Southern blots ou slot blots
[80]; métodos de imunoensaio,
por exemplo, o Sistema ThresholdTM [81]; e PCR quantitativa
[82]. Todos esses métodos são familiares àquelas
habilitados na técnica, embora as características precisas
de cada método possam depender da célula hospedeira em
10 questão, por exemplo, a escolha de sondas para
hibridização, a escolha de iniciadores e/ou sondas para
amplificação etc. O sistema Threshold Tm de Molecular
Devices é um ensaio quantitativo para níveis de picogramas
de DNA total, e tem sido usado para o monitoramento de
15 níveis de DNA contaminante em substâncias biofarmacêuticas
[81]. Um ensaio típico envolve a formação sem
especificidade de seqüência de um complexo de reação entre
uma proteína de ligação biotinilada de ssDNA, um anticorpo
anti-ssDNA conjugado à urease e DNA. Todos os componentes
20 do ensaio são incluídos no kit completo "Total DNA Assay
Kit" disponível pelo fabricante. Vários fabricantes
comerciais oferecem ensaios de PCR quantitativa para
detecção do DNA residual da célula hospedeira, por exemplo,
AppTec TM de Laboratory Services, BioReliance TM , de Althea
25 Technologies etc. Uma comparação de um ensaio de
hibridização quimioluminescente com o sistema de DNA total
ThresholdTm para medida da contaminação por DNA da célula
hospedeira de uma vacina viral humana pode ser encontrada
na referência 83.
30
O DNA contaminante pode ser removido durante a
26/84
preparação da vacina com o uso de procedimentos
padronizados de purificação, por exemplo, cromatografia
etc. A remoção de DNA residual da célula hospedeira pode
ser aprimorada por tratamento de nuclease, por exemplo,
5 pelo uso de uma DNase. Um método conveniente para a redução
da contaminação por DNA da célula hospedeira é revelado nas
referências 84 & 85, que envolve um tratamento em duas
etapas, primeiro com o uso de uma DNase (por exemplo,
Benzonase), que pode ser usada durante o crescimento viral,
10 e a seguir com um detergente catiônico (por exemplo, CTAB),
que pode ser usado durante a ruptura do vírion. O
tratamento com um agente alquilante, por exemplo,
13-
propiolactona, também pode ser usado para remover DNA da
célula hospedeira e, vantajosamente, também pode ser usado
15 para inativar vírions [86].
Vacinas que contêm < 10 ng (por exemplo, < 1 ng, < 100
pg) de DNA da célula hospedeira por 15 gg de hemaglutinina
são preferidas, bem como vacinas que contêm < 10 ng (por
exemplo, < 1 ng, < 100 pg) de DNA da célula hospedeira por
20 volume de 0,25 ml. Vacinas que contêm < 10 ng (por exemplo,
< 1 ng, < 100 pg) de DNA da célula hospedeira por 50 gg de
hemaglutinina são mais preferidas, bem como vacinas que
contêm < 10 ng (por exemplo, < 1 ng, < 100 pg) de DNA da
célula hospedeira por volume de 0,5 ml.
25
Adjuvantes
As composições da invenção podem vantajosamente
incluir um adjuvante, que pode funcionar para aumentar as
respostas imunológicas (humoral e/ou celular) despertadas
em um paciente que recebe a composição. O uso de adjuvantes
30 com vacinas contra influenza foi descrito anteriormente.
-
27/84
Nas referências 87 & 88, foi utilizado hidróxido de
alumínio, e na referência 89, foi usada uma mistura de
hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio. A referência
90 também descreveu o uso de adjuvantes de sal de alumínio.
5 O produto FLUADTM de Chiron Vaccines inclui uma emulsão
óleo-em-água.
Adjuvantes que podem ser usados com a invenção
incluem, sem limitação:
- Uma composição que contém minerais, incluindo sais
10 de cálcio e sais de alumínio (ou misturas destes). Sais de
cálcio incluem fosfato de cálcio (por exemplo, as
partículas "CAP" reveladas na referência 91). Sais de
alumínio incluem hidróxidos, fosfatos, sulfatos etc., com
os sais assumindo qualquer forma adequada (por exemplo,
15
gel, cristalinos, amorfos etc.). A adsorção a esses sais é
preferida. As composições que contêm minerais também podem
ser formuladas como uma partícula de sal metálico [92].
Adjuvantes de sal de alumínio serão descritos com mais
detalhe abaixo.
20
- Agentes indutores de citocina (veja com mais detalhe
abaixo).
-
Saponinas [capítulo 22 da referência 128], que
formam um grupo heterólogo de glicosídeos de esterol e
glicosídeos de triterpenóide que são encontrados na casca,
25 folhas, caules, raízes e até mesmo nas flores de uma ampla
gama de espécies de plantas. A saponina da casca da árvore
Molina
Quillaia saponaria
foi amplamente estudada como
adjuvante. A saponina também pode ser obtida comercialmente
de
Smilax ornata (sarsaprilla), Gypsophilla paniculata
30 (mosquitinho
brides veil)
e
Saponaria officinalis
28/84
(saponária - soap root). Formulações adjuvantes de saponina
incluem formulações purificadas, por exemplo, QS21, além de
formulações lipídicas, por exemplo, ISCOMs. QS21 é
comercializado como StimulonTm . As composições de saponina
5 foram purificadas com o uso de HPLC e RP-HPLC. Foram
identificadas frações purificadas específicas com o uso
dessas técnicas, incluindo QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QHB
e QH - C.
De preferência, a saponina é QS21. Um método de
produção de QS21 é revelado na referência 93. As
10 formulações de saponina também podem compreender um
esterol, por exemplo, colesterol [94]. Podem ser usadas
combinações de saponinas e colesteróis para formar
partículas únicas denominadas complexos imunoestimulantes
(ISCOMs) [capítulo 23 da referência 128]. ISCOMs
15 tipicamente também incluem um fosfolipídeo, por exemplo,
fosfatidiletanolamina ou fosfatidilcolina. Qualquer
saponina conhecida pode ser usada em ISCOMs. De
preferência, o ISCOM inclui um ou mais de QuilA, QHA e QHC.
ISCOMs são ainda descritos nas referências 94-96.
20 Opcionalmente, os ISCOMS podem ser desprovidos de
detergente adicional [97]. Uma revisão do desenvolvimento
de adjuvantes baseados em saponina pode ser encontrada nas
referências 98 & 99.
- Adjuvantes graxos (veja com mais detalhe abaixo),
25 incluindo emulsões óleo-em-água.
- Toxinas bacterianas que ribosilam ADP (por exemplo,
a enterotoxina termolábil de
E. coli
"LT", a toxina
colérica "CT" ou a toxina de pertussis "PT") e derivados
detoxificados destas, por exemplo, as toxinas mutantes
30 conhecidas como LT-K63 e LT-R72 [100]. O uso de toxinas
29/84
detoxificadas que ribosilam ADP como adjuvantes mucosos é
descrito na referência 101 e como adjuvantes parenterais na
referência 102.
-
Bioadesivos
e
mucoadesivos,
por
exemplo,
5 microesferas de ácido hialurônico esterificado [103] ou
quitosana e seus derivados [104].
- Micropartículas (ou seja, uma partícula com -100 nm
a -150 gm de diâmetro, mais preferivelmente -200 nm a -30
pm de diâmetro ou -500 nm a -10 pm de diâmetro) formadas
10 por materiais que são biodegradáveis e atóxicos (por
exemplo, um poli(ácido a-hidróxi), um ácido
poliidroxibutírico, um poliortoéster, um polianidrido, uma
policaprolactona etc.), com poli(lactida-co-glicolida)
sendo preferida, opcionalmente tratadas para terem uma
15 superfície carregada negativamente (por exemplo, com SDS)
ou uma superfície carregada positivamente (por exemplo, com
um detergente catiônico, por exemplo, CTAB).
- Lipossomos (capítulos 13 & 14 da referência 128).
Exemplos de formulações lipossômicas adequadas ao uso como
20 adjuvantes são descritos nas referências 105-107.
- Éteres de polioxietileno e ésteres de polioxietileno
[108]. Estas formulações ainda incluem tensoativos de éster
de polioxietileno sorbitano em combinação com um octoxinol
[109], além de tensoativos de alquil éteres ou éster de
25 polioxietileno, em combinação com pelo menos um tensoativo
não iônico adicional, por exemplo, octoxinol [110]. Éteres
de polioxietileno preferidos são selecionados do seguinte
grupo: polioxietileno-9-lauril éter (laureth 9),
polioxietileno-9-esteoril éter, polioxietileno-8-esteoril
30 éter,
polioxietileno-4-lauril éter,
polioxietileno-35-
30/84
lauril éter e polioxietileno-23-lauril éter.
- Muramil peptídeos, por exemplo, N-acetilmuramil-Ltreonil-D-isoglutamina ("thr-MDP"), N-acetil-normuramil-Lalanil-D-isoglutamina
("nor-MDP"), N-acetilglucosaminil-
5 N - acetilmuramil-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxi propilamida
("DTP-DPP" ou "Theramide Tm "), N-acetilmuramil-L-alanil-Disoglutaminil - L - alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3hidroxifosforiloxi)-etilamina ("MTP-PE").
-
Uma preparação de proteína de proteossoma da
10 membrana externa preparada a partir de uma primeira
bactéria Gram-negativa em combinação com uma preparação de
lipossacarídeo derivada de uma segunda bactéria Gramnegativa, em que as preparações de proteína de proteossoma
da membrana externa e de lipossacarídeo formam um complexo
15 adjuvante estável não covalente. Estes complexos incluem
"IVX-908", um complexo composto por membrana externa e
lipopolissacarídeos de
Neisseria meningitidis.
Eles foram
usados como adjuvantes para vacinas contra influenza [111].
-
Um polímero de polioxidônio [112,113] ou outro
20 derivado N-oxidado de polietileno-piperazina.
- 5'-Monofosfato de metil inosina ("MIMP") [114].
- Um composto poliidroxilado de pirrolizidina [115],
por exemplo, um que possua a fórmula:
éK)
25
FAO
OH
OH
Cl-WH
em que R é selecionado do grupo que compreende
30 hidrogênio, grupos acil lineares ou ramificados, não
31/84
substituídos ou substituídos, saturados ou insaturados,
alquil (por exemplo, cicloalquil), alquenil, alquinil e
aril, ou um sal ou derivado farmaceuticamente aceitável
destes. Exemplos incluem, sem limitação: casuarina,
5 casuarina-6-a-D-glicopiranose,
casuarina,
3-epi-casuarina,
7 epi-
3,7-diepi-casuarina etc.
- Um ligante de CDld, por exemplo, uma aglicosilceramida
[116-123]
galactosilceramida),
10
fitoesfingosina,
(por
a-glicosilceramidas
OCH,
KRN7000
exemplo,
que
acontêm
[(2S,3S,4R)-1-0-(a-D-
galactopiranosil)-2-(N-hexacosanoilamino)-1,3,4octadecanetriol], CRONY-101, 3"-0-sulfo-galactosilceramida
etc.
- Uma gama inulina [124] ou derivado desta, por
15 exemplo, algamulina.
Essas e outras substâncias adjuvantes ativas são
discutidas com mais detalhe nas referências 128 & 129.
As composições podem incluir dois ou mais dos
referidos
adjuvantes.
Por
exemplo,
elas
podem
20 vantajosamente incluir tanto uma emulsão óleo-em-água
quanto um agente indutor de citocina, na medida em que essa
combinação aumenta as respostas de citocina despertadas por
vacinas contra influenza, por exemplo, a resposta de
interferon-y, com o aumento sendo bem maior do que o
25 observado quando a emulsão ou o agente é usado
isoladamente.
Antígenos e adjuvantes em uma composição estarão
tipicamente misturados.
Adjuvantes de emulsão óleo-em-água
30
Verificou-se que as emulsões óleo-em-água são
32/84
particularmente adequadas ao uso em vacinas com adjuvantes
contra o vírus influenza. São conhecidas várias destas
emulsões, e elas tipicamente incluem pelo menos um óleo e
pelo menos um tensoativo, com o(s) óleo(s) e o(s)
5 tensoativo(s) sendo biodegradáveis (metabolizáveis) e
biocompatíveis. As gotículas de óleo na emulsão geralmente
possuem menos de 5 pm de diâmetro, e podem até mesmo ter um
diâmetro submícron, com esses tamanhos diminutos sendo
obtidos com um microfluidificador para fornecer emulsões
10 estáveis. Gotículas com um tamanho menor do que 220 nm são
preferidas, na medida em que elas podem ser submetidas à
esterilização por filtro.
A invenção pode ser usada com óleos como, por exemplo,
aqueles de uma fonte animal (por exemplo, de peixe) ou
15 vegetal. Fontes para óleos vegetais incluem nozes, sementes
e grãos. Óleo de amendoim, óleo de soja, óleo de coco e
azeite de oliva, os mais comumente disponíveis,
exemplificam os óleos de nozes. O óleo de jojoba pode ser
usado, por exemplo, obtido do grão de jojoba. Óleos de
20 sementes incluem óleo de açafroa, óleo de semente de
algodão, óleo de semente de girassol, óleo de semente de
gergelim e semelhantes. No grupo dos grãos, o óleo de milho
é o mais facilmente disponível, mas o óleo de outros grãos
de cereais, por exemplo, trigo, aveia, centeio, arroz, tef,
25 triticalo e semelhantes também podem ser usados. Ésteres de
ácido graxo com 6-10 carbonos de glicerol e 1,2propanediol, embora não ocorram naturalmente em óleos de
sementes, podem ser preparados por hidrólise, separação e
esterificação dos materiais apropriados, partindo dos óleos
30 de nozes e de semente. Gorduras e óleos do leite de
33/84
mamíferos são metabolizáveis e podem, portanto, ser usados
na prática dessa invenção.
Os
procedimentos
para
separação,
purificação,
saponificação e outros meios necessários para a obtenção de
5 óleos puros a partir de fontes animais são bem conhecidos
na técnica. A maioria dos peixes contém óleos
metabolizáveis que podem ser prontamente recuperados. Por
exemplo, o óleo de fígado de bacalhau, óleos de fígado de
tubarão e o óleo de baleia, por exemplo, espermacete,
10 exemplificam vários dos óleos de peixe que podem ser aqui
usados. Vários óleos de cadeia ramificada são sintetizados
bioquimicamente em unidades de isopreno de 5 carbonos e são
geralmente citados como terpenóides. O óleo de fígado de
tubarão contém um terpenóide ramificado, insaturado,
15 conhecido
como
esqualeno,
2,6,10,15,19,23-hexametil-
2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno, que é particularmente
aqui preferido. O esqualano, o análogo saturado do
esqualeno, também é um óleo preferido. Óleos de peixe,
incluindo esqualeno e esqualano, são facilmente disponíveis
20 por fontes comerciais ou podem ser obtidos por métodos
conhecidos na técnica. Outros óleos preferidos são os
tocoferóis (veja abaixo). Podem ser usadas misturas de
óleos.
Os tensoativos podem ser classificados por seu "HLB"
25
(equilíbrio hidrófilo/lipófilo). Tensoativos da invenção
preferidos possuem um HLB de pelo menos 10, preferivelmente
pelo menos 15 e, mais preferivelmente, pelo menos 16. A
invenção pode ser usada com tensoativos que incluem, sem
limitação: os tensoativos de ésteres de polioxietileno
30 sorbitano (comumente denominados Tweens), especialmente
34/84
polissorbato 20 e polissorbato 80; copolímeros de óxido de
etileno (EO), óxido de propileno (PO) e/ou óxido de
butileno (B0), vendidos sob o nome comercial DOWFAX TM , por
exemplo, copolímeros lineares em bloco de EO/PO;
5 octoxinóis, que podem variar no número de repetições grupos
etóxi (oxi-1,2-etanodiil), com octoxinol-9 (Triton X-100 ou
t-octilfenoxipolietoxietanol) sendo de particular
interesse; (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP40); fosfolipídeos, por exemplo, fosfatidilcolina
10 (lecitina); nonilfenol etoxilatos, por exemplo, a série
Tergitol TM NP; éteres graxos de polioxietileno derivados de
alcoóis laurílico, cetílico, estearílico e oleílico
(conhecidos
como
tensoativos
Brij),
por
exemplo,
trietilenoglicol monolauril éter (Brij 30); e ésteres de
15 sorbitano (comumente conhecidos como SPANs), por exemplo,
trioleato de sorbitano (Span 85) e monolaurato de
sorbitano. Tensoativos não iônicos são preferidos.
Tensoativos preferidos para inclusão na emulsão são Tween
80 (monooleato de polioxietileno sorbitano), Span 85
20
(trioleato de sorbitano), lecitina e Triton X-100.
Podem ser usadas misturas de tensoativos, por exemplo,
misturas de Tween 80/Span 85. Uma combinação de um éster de
polioxietileno sorbitano, por exemplo, monooleato de
polioxietileno sorbitano (Tween 80), e um octoxinol, por
25 exemplo, t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100),
também é adequada. Outra combinação útil compreende laureth
9 mais um éster de polioxietileno sorbitano e/ou um
octoxinol.
Quantidades preferidas de tensoativos (% por peso)
30 são: ésteres de polioxietileno sorbitano (por exemplo,
35/84
Tween 80) 0,01 a 1%, em particular, cerca de 0,1%; octilou nonilfenoxi polioxietanóis (por exemplo, Triton X-100,
ou outros detergentes na série Triton) 0,001 a 0,1%, em
particular, 0,005 a 0,02%; éteres de polioxietileno (por
5 exemplo, laureth 9) 0,1 a 20%, preferivelmente 0,1 a 10% e,
em particular, 0,1 a 1% ou cerca de 0,5%.
Adjuvantes de emulsão óleo-em-água específicos úteis
com a invenção incluem, sem limitação:
- Uma emulsão submícron de esqualeno, Tween 80 e Span
10 85. A composição da emulsão por volume pode ser de cerca de
5% de esqualeno, cerca de 0,5% de polissorbato 80 e cerca
de 0,5% de Span 85. Em termos de peso, essas proporções se
tornam 4,3% de esqualeno, 0,5% de polissorbato 80 e 0,48%
de Span 85. Esse adjuvante é conhecido como "MF59" [12515 127], como descrito com mais detalhe no capítulo 10 da
referência 128 e no capítulo 12 da referência 129. A
emulsão MF59 vantajosamente inclui íons citrato, por
exemplo, 10 mM de tampão citrato de sódio.
- Uma emulsão de esqualeno, um tocoferol e Tween 80. A
20 emulsão pode incluir solução salina tamponada com fosfato.
Ela também pode incluir Span 85 (por exemplo, a 1%) e/ou
lecitina. Essas emulsões podem ter de 2 a 10% de esqualeno,
de 2 a 10% de tocoferol e de 0,3 a 3% de Tween 80, e a
proporção de peso de esqualeno:tocoferol é preferivelmente
25 __ 1, na medida em que essa proporção fornece uma emulsão
mais estável. Esqualeno e Tween 80 podem estar presentes em
uma proporção de volume de cerca de 5:2. Uma emulsão desse
tipo pode ser feita dissolvendo Tween 80 em PBS, para gerar
uma solução 2%, e depois misturando 90 ml dessa solução com
30 uma mistura de 5 g de DL-a-tocoferol e 5 ml de esqualeno,
36/84
e microfluidizando-se a mistura. A emulsão resultante pode
ter gotículas de óleo submicron, por exemplo, com um
diâmetro médio entre 100 e 250 nm, preferivelmente cerca de
180 nm.
5
- Uma emulsão de esqualeno, um tocoferol e um
detergente Triton (por exemplo, Triton X-100). A emulsão
também pode incluir um 3d-MPL (veja abaixo). A emulsão pode
conter um tampão fosfato.
- Uma emulsão que compreende um polissorbato (por
10 exemplo, polissorbato 80), um detergente Triton (por
exemplo, Triton X-100) e um tocoferol (por exemplo, um
succinato de a-tocoferol). A emulsão pode incluir esses
três componentes em uma proporção de massa de cerca de
75:11:10 (por exemplo, 750 pg/ml de polissorbato 80, 110
15 pg/ml de Triton X-100 e 100 pg/ml de succinato de atocoferol), e essas concentrações devem incluir qualquer
contribuição desses componentes por antígenos. A emulsão
também pode incluir esqualeno. A emulsão também pode
incluir um 3d-MPL (veja abaixo). A fase aquosa pode conter
20 um tampão fosfato.
- Uma emulsão de esqualano, polissorbato 80 e
poloxâmero 401 ("PluronicTM L121"). A emulsão pode ser
formulada em solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4.
Essa emulsão é um veículo de liberação útil para muramil
25 dipeptídeos, e foi usada com treonil-MDP no adjuvante "SAF1" [130] (0,05-1% de Thr-MDP, 5% de esqualano, 2,5% de
Plurônico L121 e 0,2% de polissorbato 80). Ela também pode
ser usada sem o Thr-MDP, como no adjuvante "AF" [131] (5%
de esqualano, 1,25% de Plurônico L121 e 0,2% de
30 polissorbato 80). A microfluidificação é preferida.
37/84
- Uma emulsão que possui de 0,5-50% de um óleo, 0,110% de um fosfolipídeo e 0,05-5% de um tensoativo não
iônico. Como descrito na referência 132, componentes de
fosfolipídeo preferidos são fosfatidilcolina,
5 fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina,
fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico,
esfingomielina e cardiolipina. São vantajosos tamanhos de
gotícula submícron.
Uma emulsão óleo-em-água submícron de um óleo não
10 metabolizável (por exemplo, óleo mineral leve) e pelo menos
um tensoativo (por exemplo, lecitina, Tween 80 ou Span 80).
Podem ser incluídos aditivos, por exemplo, saponina QuilA,
colesterol a conjugado saponina-lipófilo (por exemplo, GPI0100, descrito na referência 133, produzido por adição de
15 amina alifática à desacilsaponina por meio do grupo
carboxil de ácido glicurônico), brometo de
dimetildioctadecilamônio e/ou N,N-dioctadecil-N,N-bis (2hidroxietil)propanodiamina.
- Uma emulsão na qual uma saponina (por exemplo, QuilA
20 ou QS21) e um esterol (por exemplo, um colesterol) estão
associados como micelas helicoidais [134].
As emulsões podem ser misturadas com antígeno de forma
extemporânea, no momento da liberação. Dessa forma, o
adjuvante e o antígeno podem ser mantidos separadamente em
25 uma vacina embalada ou distribuída, prontos para a
formulação final no momento da utilização. O antígeno
geralmente estará em uma forma aquosa, de modo que a vacina
seja finalmente preparada por mistura de dois líquidos. A
proporção de volume dos dois líquidos para a mistura pode
30 variar (por exemplo, entre 5:1 e 1:5), mas é geralmente de
38/84
cerca de 1:1.
Após o antígeno e o adjuvante terem sido misturados, o
antígeno de hemaglutinina geralmente permanecerá em solução
aquosa, mas pode se distribuir em torno da interface
5 óleo/água. Em geral, pouco ou nenhuma hemaglutinina entrará
na fase oleosa da emulsão.
Quando uma composição incluir um tocoferol, qualquer
um dos a,
p,
y, 3,
E
ou E-tocoferóis pode ser usado, mas a-
tocoferóis são preferidos. O tocoferol pode assumir várias
10 formas, por exemplo, diferentes sais e/ou isômeros. Sais
incluem sais orgânicos, por exemplo, succinato, acetato,
nicotinato etc. Tanto D-a-tocoferol quanto DL-a-tocoferol
podem ser usados. Tocoferóis são vantajosamente incluídos
em vacinas para uso em pacientes idosos (por exemplo, com
15 idade de 60 anos ou mais), pois há relatos de que a
vitamina E possui um efeito positivo sobre a resposta
imunológica nesse grupo de pacientes [135]. Eles também
possuem propriedades antioxidantes que podem ajudar a
estabilizar as emulsões [136]. Um a-tocoferol preferido é
20 o DL-a-tocoferol, e o sal preferido desse tocoferol é o
succinato. Verificou-se que o sal de succinato coopera com
ligantes relacionados ao TNF
in vivo.
Além disso, o
succinato de a-tocoferol é conhecido por ser compatível
com vacinas contra influenza e por ser um conservante útil
25 como alternativa aos compostos mercuriais [9].
Agentes indutores de citocina
Agentes indutores de citocina para inclusão em
composições da invenção são capazes, quando administrados a
um paciente, de despertar o sistema imunológico para
30 liberar citocinas, incluindo interferons e interleucinas.
39/84
As respostas de citocina são conhecidas por estarem
envolvidas nos estágios iniciais e decisivos da defesa do
hospedeiro contra a infecção por influenza [137]. Agentes
preferidos podem despertar a liberação de um ou mais de:
5 interferon-y; interleucina-l; interleucina-2; interleucina12; TNF-a; TNF-P; e GM-CSF. Agentes preferidos despertam a
liberação de citocinas associadas a uma resposta
imunológica do tipo Thl, por exemplo, interferon-y, TNF-a,
interleucina-2. Prefere-se a estimulação tanto de
10 interferon-y quanto de interleucina-2.
Em conseqüência do recebimento de uma composição da
invenção, portanto, um paciente terá células T que, quando
estimuladas com um antígeno de influenza, irão liberar a(s)
citocina(s) desejada(s) de uma forma antígeno-específica.
15 Por exemplo, células T purificadas do seu sangue liberarão
y-interferon quando expostas
in vitro à hemaglutinina do
vírus influenza. Métodos para a medida destas respostas em
células mononucleares do sangue periférico (PBMC) são
conhecidos na técnica, e incluem ELISA, ELISPOT, citometria
20 de fluxo e PCR em tempo real. Por exemplo, a referência 138
relata um estudo no qual respostas imunológicas mediadas
por células T antígeno-específicas contra o toxóide
tetânico, especificamente respostas de y-interferon, foram
monitoradas, e verificou-se que ELISPOT foi o método mais
25 sensível para discriminar respostas induzidas pelo TT
antígeno-específicas de respostas espontâneas, mas que a
detecção de citocina intracitoplasmática por citometria de
fluxo foi o método mais eficiente para detectar efeitos de
re-estimulação.
30
Agentes indutores de citocina adequados incluem, sem
40/84
limitação:
- Um oligonucleotídeo imunoestimulante, por exemplo,
um que contenha um motivo CpG (uma seqüência dinucleotídica
que contém uma citosina não metilada ligada por uma ligação
5 fosfato a uma guanosina), ou um RNA de fita dupla, ou um
oligonucleotídeo que contém uma seqüência palindrômica, ou
um oligonucleotídeo que contém uma seqüência poli(dG).
-
Monofosforil 3-0-desacilado lipídeo A ("3dMPL",
também conhecido como "MPL Tm ") [139-142].
10
- Um composto de imidazoquinolina, por exemplo,
Imiquimod ("R-837") [143,144], Resiquimod ("R-848") [145],
e seus análogos; e sais destes (por exemplo, os sais de
cloridrato). Detalhes adicionais sobre imidazoquinolinas
imunoestimulantes podem ser encontrados nas referências 146
15
a 150.
-
Um composto de tiossemicarbazona, por exemplo,
aqueles revelados na referência 151. Métodos para a
formulação, fabricação e teste de compostos ativos também
são descritos na referência 151. As tiossemicarbazonas são
20 particularmente eficazes na estimulação de células
mononucleares do sangue periférico humano para a produção
de citocinas, por exemplo, TNF-a.
- Um composto de triptantrina, por exemplo, aqueles
revelados na referência 152. Métodos para a formulação,
25 fabricação e teste de compostos ativos também são descritos
na referência 152. As tiossemicarbazonas são
particularmente eficazes na estimulação de células
mononucleares do sangue periférico humano para a produção
de citocinas, por exemplo, TNF-a.
30
Um análogo nucleosídico,
por exemplo:
(a)
41/84
Isatorabina (ANA 245; 7 tia 8 oxoguanosina):
-
-
-
-
O
5
O O
e pró-fármacos deste;
(b) ANA975;
(c) ANA-025-1;
(d)
ANA380; (e) os compostos revelados nas referências 153 a
155; (f) um composto que possui a fórmula:
R1
10
R»'N
em que:
R1 e
NRa Rb,
-
R4
R3
R2
são, cada um independentemente, H, halo, -
OH,
C1-6
alcóxi,
C1_6
alcóxi
heterociclil, heterociclil substituído,
15 aril substituído, C1_6 alquil, ou
está ausente, H,
R3
substituído,
aril,
C6-10
C6-10
C1-6
C1-6
substituído,
C6_10
aril,
6-1
Co
alquil substituído;
alquil, C1-6 alquil
aril substituído, heterociclil
ou heterociclil substituído;
e
R4
R5 são,
cada um independentemente, H, halo,
20 heterociclil, heterociclil substituído, -C(0)-Rd, C1-6
alquil,
alquil substituído, ou ligados em conjunto para
C1-6
formarem um anel de 5 membros como em
pf X.1
R4-5:
s
PÁ-5
X2
R9
25 a ligação sendo opciaa nas ligaçoes indicadas por um
X1 e
são, cada um independentemente, N, C, O ou S;
X2
H, halo, -OH,
R8 é
alquinil,
-
OH,
-
NRaRb,
C1-6
-
alquil,
(CH2) n O Hb ,
-
-
alquenil,
C2-6
-
O
-
(C1 6
-
C2-6
alquil),
S(0) pRe , ou -C(0) - Rd;
30
R9
é
H,
C1-6
alquil,
C1-6
alquil
substituído,
42/84
heterociclil, heterociclil substituído ou R 9 a, em que R 9a é:
O
RIO
R9E,
R11
R10
a ligação sendo obtida na ligação indicada por um
5
R10 e R11 são, cada um independentemente, H, halo,
alcóxi, C 1 _6 alcóxi substituído, cada Ra e
Rb
é
alquil substituído,
cada
Rb
10 trifosfato,
cada
ou -OH;
independentemente H,
- C(0)Rd,
C6-10
C1-6
alquil,
C1-6
aril;
é independentemente H, fosfato, difosfato,
C1-6
Rd
NRaRb,
C1.6
é
alquil ou
C1_6
alquil substituído;
independentemente H, halo,
alquil substituído,
C1_6
alcóxi,
C1_6
C1-6
alquil,
C1-6
alcóxi substituído,
NH 2 , -NH(C1_6 alquil), -NH(C 1 _ 6 alquil substituído), -N (C1_6
alquil) 2 ,
-N(C 1 _6 alquil
substituído) 2 ,
C6-10 aril ou
15 heterociclil;
cada Re é independentemente H,
substituído,
C6-10
aril,
C6-10
C1-6
alquil,
C1-6
alquil
aril substituído, heterociclil
ou heterociclil substituído;
cada Rf é independentemente H,
C1-6
alquil,
C1-6
alquil
20 substituído, -C(0)Rd, fosfato, difosfato ou trifosfato;
cada n é independentemente 0, 1, 2 ou 3;
cada p é independentemente 0, 1 ou 2; ou
(g) um sal farmaceuticamente aceitável de qualquer um
de (a) a (f) , um tautômero de qualquer um de (a) a (f), ou
25 um sal farmaceuticamente aceitável do tautômero.
- Loxoribina (7-alil-8-oxoguanosina) [156].
- Compostos revelados na referência 157, incluindo:
compostos de acilpiperazina, compostos de indolediona,
compostos de tetrahidroisoquinolina (THIQ), compostos de
30 benzociclodiona, compostos de aminoazavinil, compostos de
43/84
aminobenzimidazol quinolinona (ABIQ) [158,159], compostos
de hidraptalamida, compostos de benzofenona, compostos de
isoxazol, compostos de esterol, compostos de quinazilinona,
compostos de pirrol [160], compostos de antraquinona,
5 compostos de quinoxalina, compostos de triazina, compostos
de pirazalopirimidina e compostos de benzazol [161].
- Compostos revelados na referência 162.
- Um derivado de fosfato de aminoalquil glucosaminida,
por exemplo, RC-529 [163,164].
Um
10
fosfazeno,
poli[di(carboxilatofenoxi)fosfazeno]
por
exemplo,
("PCPP"),
como
descrito, por exemplo, nas referências 165 e 166.
- Imunopotencializadores de pequena molécula (SMIPs),
por exemplo:
15
N2-metil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolina2,4-diamina
N2,N2-dimetil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]
quinolina-2,4-diamina
N2-etil-N2-metil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]
20 quinolina-2,4-diamina
N2-metil-1-(2-metilpropil)-N2-propil-1H-imidazo[4,5-c]
quinolina-2,4-diamina
1-(2-metilpropil)-N2-propil-1H-imidazo[4,5-c]
quinolina-2,4-diamina
25
N2-butil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolina2,4-diamina
N2-butil-N2-metil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]
quinolina-2,4-diamina
N2-metil-1-(2-metilpropil)-N2-pentil-lH-imidazo[4,5-c]
30 quinolina-2,4-diamina
44/84
N2-metil-1-(2-metilpropil)-N2-prop-2-enil-1Himidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina
1-(2-metilpropil)-2-[(fenilmetil)tio]-1H-imidazo[4,5c]quinolin-4-amina
5
1-(2-metilpropil)-2-(propiltio)-1H-imidazo[4,5-c]
quinolin-4-amina
2-[[4-amino-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]
quinolin-2-iii(metil)aminoletanol
2-([4-amino-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]
10 quinolin-2-ill(metil)amino]etil acetato
4 - amino-1-(2-metilpropil)-1,3-dihidro-2H-imidazo[4,5c] quinolin-2-ona
N2-butil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-1Himidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina
15
N2-butil-N2-metil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis
(fenilmetil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina
N2-metil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-1Himidazo[4,5-c]quinolina2,4-diamina
N2,N2-dimetil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-
20 1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina
1-{4-amino-2-[metil(propil)amino]-1H-imidazo[4,5c]quinolin-l-i1}-2-metilpropan-2-ol
1-[4-amino-2-(propilamino)-1H-imidazo[4,5-c]quinolinl-i1]-2-metilpropan-2-ol
25
N4,N4-dibenzi1-1-(2-metóxi-2-metilpropil)-N2-propil1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina.
Os agentes indutores de citocina para uso na presente
invenção podem ser moduladores e/ou agonistas de Receptores
Toll-Like
(TLR). Por exemplo, eles podem ser agonistas de
30 um ou mais das proteínas TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8
45/84
e/ou TLR9 humanas. Agentes preferidos são agonistas de TLR7
(por exemplo, imidazoquinolinas) e/ou TLR9 (por exemplo,
oligonucleotídeos CpG). Esses agentes são úteis para
ativação das vias da imunidade inata.
5
O agente indutor de citocina pode ser adicionado à
composição em vários estágios durante sua produção. Por
exemplo, ele pode estar dentro de uma composição de
antígeno, e essa mistura pode então ser adicionada a uma
emulsão óleo-em-água. Como alternativa, ele pode estar
10 dentro de uma emulsão óleo-em-água, quando então o agente
pode ser adicionado aos componentes da emulsão antes da
emulsificação, ou ele pode ser adicionado à emulsão após a
emulsificação. Da mesma forma, o agente pode ser coacervado
dentro das gotículas da emulsão. A localização e a
15 distribuição do agente indutor de citocina dentro da
composição final dependerão de suas propriedades
hidrofílicas/lipofílicas, por exemplo, o agente pode estar
localizado na fase aquosa, na fase oleosa e/ou na interface
óleo-água.
20
O agente indutor de citocina pode ser conjugado a um
agente separado, por exemplo, um antígeno (por exemplo,
CRM197). Uma revisão geral das técnicas de conjugação para
pequenas moléculas é fornecida na referência 167. Como
alternativa, os adjuvantes podem ser associados de forma
25 não covalente a agentes adicionais, por exemplo, por meio
de interações hidrofóbicas ou iônicas.
Dois agentes indutores de citocina preferidos são: (a)
oligonucleotídeos imunoestimulantes e (b) 3dMPL.
Oligonucleotídeos imunoestimulantes podem incluir
30 modificações/análogos
nucleotídicos,
por
exemplo,
46/84
modificações de fosforotioato, e podem ser de fita dupla ou
(exceto para RNA) de fita simples. As referências 168, 169
e 170 revelam substituições análogas possíveis, por
exemplo, substituição de guanosina com 2'-desoxi-75 deazaguanosina. O efeito adjuvante de oligonucleotídeos CpG
é ainda discutido nas referências 171-176. Uma seqüência
CpG pode ser dirigida a TLR9, por exemplo, o motivo GTCGTT
ou TTCGTT [177]. A seqüência CpG pode ser específica para a
indução de uma resposta imunológica Thl, por exemplo, um
10 ODN (oligodesoxinucleotídeo)CpG-A, ou ela pode ser mais
específica para indução de uma resposta de células B, por
exemplo, ODN CpGB. ODNs CpG-A e CpG-B são discutidos nas
referências 178-180. De preferência, o CpG é um ODN CpG-A.
De preferência, o oligonucleotídeo CpG é construído de modo
15 que a extremidade 5' esteja acessível para reconhecimento
do receptor. Opcionalmente, duas seqüências de
oligonucleotídeos CpG podem ser anexadas em suas
extremidades 3' para a formação de "imunômeros". Veja, por
exemplo, as referências 177 & 181-183. Um adjuvante CpG
20 útil é CpG7909, também conhecido como ProMune TM (Coley
Pharmaceutical Group, Inc.).
Como alternativa, ou adicionalmente, ao uso de
seqüências CpG, podem ser usadas seqüências TpG [184].
Esses 25 oligonucleotídeos podem ser livres de porções CpG
25 não metilados.
O oligonucleotídeo imunoestimulante pode ser rico em
pirimidina. Por exemplo, ele pode compreender mais de um
nucleotídeo consecutivo de timidina (por exemplo, TTTT,
como revelado na referência 184) e/ou ele pode ter uma
30 composição de nucleotídeos com > 25% de timidina (por
47/84
exemplo, > 35%, > 40%, > 50%, > 60%, > 80% etc.). Por
exemplo, ele pode compreender mais de um nucleotídeo
consecutivo de citosina (por exemplo, CCCC, como revelado
na referência 184) e/ou ele pode ter uma composição de
5 nucleotídeos com > 25% de citosina (por exemplo, > 35%, >
40%, > 50%, > 60%, > 80% etc.). Esses oligonucleotídeos
podem ser livres de porções CpG não metilados.
Oligonucleotídeos imunoestimulantes tipicamente
compreenderão pelo menos 20 nucleotídeos. Eles podem
10 compreender menos de 100 nucleotídeos.
3dMPL (também conhecido como monofosforil 3 des-0acilado lipídeo A ou 3-O-desacil-4'-monofosforil lipídeo A)
é um adjuvante no qual a posição 3 da glicosamina da
extremidade redutora no monofosforil lipídeo A foi
15 desacilada. 3dMPL foi preparado a partir de um mutante sem
heptose de Salmonella minnesota,
e é quimicamente similar
ao lipídeo A, mas desprovido de um grupo fosforil ácidolábil e de um grupo acil base-lábil. Ele ativa células da
linhagem de monócitos/macrófagos e estimula a liberação de
20 várias citocinas, incluindo IL-1, IL-12, TNF-a e GM-CSF
(veja também a referência 185). A preparação de 3dMPL foi
originalmente descrita na referência 186.
3dMPL pode assumir a forma de uma mistura de moléculas
relacionadas que variam por sua acilação (por exemplo,
25 possuindo 3, 4, 5 ou 6 cadeias acil, que podem ser de
comprimentos diferentes). Os dois monossacarídeos de
glicosamina (também conhecida como 2-desoxi-2-aminoglicose) são N-acilados em seus carbonos da posição 2 (ou
seja, nas posições 2 e 2'), e também há 0-acilação na
30 posição 3'. O grupo anexado ao carbono 2 possui a fórmula -
48/84
NH-CO-CH 2 -CR 1 R 1' . O grupo anexado ao carbono 2' possui a
fórmula -NH-CO-CH2-CR2 R2 '. O grupo anexado ao carbono 3'
possui a fórmula -0-CO-CH 2 -CR 3 R 3' .
Uma estrutura
representativa é:
5
OH
10
Os grupos R', R 2 e R 3 s ã
o, cada um independentemente, —
-
(CH 2 ) n -CH3. O valor de n é preferivelmente entre 8 e 16,
15 mais preferivelmente entre 9 e 12 e, principalmente, 10.
Os grupos R I ', R2 ' e R 3'
podem ser, cada um
independentemente: (a) —H; (b) —OH; ou (c) —O-CO-R 4 , em que
R4 é —H ou —(CH 2 ) m -CH3, em que o valor de
m
é
preferivelmente entre 8 e 16 e é, mais preferivelmente, 10,
20 12 ou 14. Na posição 2,
2',
m
m é preferivelmente 14. Na posição
é preferivelmente 10. Na posição 3',
m
é
preferivelmente 12. Os grupos R I , R2 ' e R3 ' são, dessa
forma, preferivelmente grupos -0-acil de ácido dodecanóico,
ácido tetradecanóico ou ácido hexadecanóico.
25
Quando todos de Ry , R2 ' e R3 ' forem -H, então o 3dMPL
possuirá apenas 3 cadeias acil (uma em cada uma das
posições 2, 2' e 3'). Quando somente dois de R", R 2 ' e R3 '
forem —H, então o 3dMPL poderá ter 4 cadeias acil. Quando
apenas um de R I ', R2 ' e R3 ' for -H, então o 3dMPL poderá ter
30 5 cadeias acil. Quando nenhum de R v , R2 ' e R3 ' for -H, então
49/84
o 3dMPL poderá ter 6 cadeias acil. O adjuvante 3dMPL usado
de acordo com a invenção pode ser uma mistura dessas
formas, com 3 a 6 cadeias acil, e prefere-se incluir 3dMPL
com 6 cadeias acil na mistura e, em particular, para
5 assegurar que a forma de cadeia hexaacil constitua pelo
menos 10% por peso do 3dMPL total, por exemplo,
30%,
40%,
20%,
50% ou mais. Verificou-se que 3dMPL com 6
cadeias acil é a forma com ação adjuvante mais ativa.
Dessa forma, a forma mais preferida de 3dMPL para
10 inclusão na composição da invenção possui a fórmula (IV),
mostrada abaixo.
Quando 3dMPL é usado na forma de uma mistura, então as
referências às quantidades ou concentrações de 3dMPL em
composições da invenção se referem às espécies combinadas
15 de 3dMPL na mistura.
Em condições aquosas, 3dMPL pode formar agregados
micelares ou partículas com diferentes tamanhos, por
exemplo, com um diâmetro < 150 nm ou > 500 nm. Um ou ambos
destes podem ser usados com a invenção, e as melhores
20 partículas podem ser selecionados por ensaios de rotina.
Partículas menores (por exemplo, suficientemente pequenas
para gerar uma suspensão aquosa transparente de 3dMPL) são
preferidas para uso de acordo com a invenção por causa de
sua atividade superior [187]. Partículas preferidas possuem
25 um diâmetro médio de menos de 220 nm, mais preferivelmente
de menos de 200 nm ou menos de 150 nm ou menos de 120 nm, e
podem até mesmo ter um diâmetro médio de menos de 100 nm.
Na maioria dos casos, no entanto, o diâmetro médio não será
menor do que 50 nm. Essas partículas são suficientemente
30 pequenas para serem adequadas à esterilização por filtro. O
50/84
diâmetro da particular pode ser avaliado pela técnica de
rotina de dispersão luminosa dinâmica, que revela o
diâmetro médio de uma partícula. Quando se diz que uma
partícula possui um diâmetro de x nm, geralmente haverá uma
5 distribuição de partículas em torno dessa média, mas pelo
menos 50% por número (por exemplo, ?_ 60%, 70%, 80%, >
90%, ou mais) das partículas terão um diâmetro dentro de
faixa de x + 25%.
3dMPL pode vantajosamente ser usado em combinação com
10 uma emulsão óleo-em-água. Substancialmente todo o 3dMPL
pode estar localizado na fase aquosa da emulsão.
O 3dMPL pode ser usado isoladamente ou em combinação
com um ou mais compostos adicionais. Por exemplo, é
conhecido o uso de 3dMPL em combinação com a saponina QS21
15 [188] (incluindo em uma emulsão óleo-em-água [189]), com um
oligonucleotídeo imunoestimulante, tanto com QS21 quanto
com um oligonucleotídeo imunoestimulante, com fosfato de
alumínio [190], com hidróxido de alumínio [191] ou tanto
com fosfato de alumínio quanto com hidróxido de alumínio.
20
25
30
51/84
Formula (IV)
Adjuvantes graxos
Adjuvantes graxos que podem ser usados com a invenção
incluem as emulsões óleo-em-água descritas acima, e também
5 incluem, por exemplo:
- Um composto de fórmula I, II ou III, ou um sal
deste:
1
II
III
y 1____ Rt_y 1
/
(C1 12)L
I
O
10
I
°
I
O
140-4=0
I
C
r--Ci-1
9
(a-Ww
w4
1401:1
(h4à.
;—'''s2\
(CMAT
(C H2 )re
voz
re
(ek2fd•
R 4/G?
R?
15
como definido na referência 192, por exemplo, "ER 803058",
"ER 803732", "ER 804053", ER 804058", "ER 804059", "ER
804442", "ER 804680", "ER 804764", ER 803022 ou "ER
804057", por exemplo:
20
o
O
Qfils
.1
IIN
liIi
25
•
ER804057
RN
O
\
O—P-0
(I) Na
30
HN
o
52/84
r;\
0 0
ER-803022:
00
- Derivados de lipídeo A de
Escherichia coli,
por
10 exemplo, OM-174 (descrito nas referências 193 & 194).
-
Uma formulação de um lipídeo catiônico e um
(normalmente
neutro)
co-lipídeo,
por
exemplo,
aminopropil-dimetil-miristoleiloxi-propanamínio
brometo-
diftanoilfosfatidil-etanolamina
("VaxfectinTM ")
15 aminopropil-dimetil-bis-dodeciloxi-propanamínio
dioleoilfosfatidil-etanolamina
ou
brometo-
("GAP-DLRIE:DOPE").
Formulações que contêm sais de (+)-N-(3-aminopropil)-N,Ndimetil-2,3-bis(sin-9-tetradeceneiloxi)-1-propanamínio são
preferidas [195].
20
- Monofosforil lipídeo A 3-0-desacilado (veja acima).
-
Compostos que contêm lipídeos ligados a uma
estrutura central acíclica contendo fosfato, por exemplo, o
antagonista de TLR4 E5564 [196,197]:
o
cujo
25
03: 2)jr.rt y
(E K))2t) Ptt
Si!
til:40-12M
also
30
o
Adjuvantes de sal de alumínio
53/84
Os adjuvantes conhecidos como hidróxido de alumínio e
fosfato de alumínio podem ser usados. Esses nomes são
convencionais, mas são usados apenas por conveniência, na
medida em que nenhum deles é uma descrição precisa do real
5 composto químico que está presente (por exemplo, veja o
capítulo 9 da referência 128). A invenção pode usar
qualquer um dos adjuvantes de "hidróxido" ou "fosfato" que
são de uso geral como adjuvantes.
Os adjuvantes conhecidos como "hidróxido de alumínio"
10 são tipicamente sais de oxihidróxido de alumínio, que são
normalmente pelo menos parcialmente cristalinos.
Oxihidróxido de alumínio, que pode ser representado pela
fórmula AlO(OH), e pode ser distinguido de outros compostos
de alumínio, por exemplo, hidróxido de alumínio A1(OH) 3 ,
15 por espectroscopia infravermelha (IR), em particular pela
presença de uma banda de adsorção a 1.070 cm -1 , e um forte
ressalto a 3.090-3.100 cm -1 [capítulo 9 da referência 128].
O grau de cristalinidade de um adjuvante de hidróxido de
alumínio se reflete pela largura da banda de difração na
20 metade da altura (WHH), com partículas pouco cristalinas
exibindo um alargamento de linha maior em função de
tamanhos de cristalito menores. A área de superfície
aumenta à medida que a WHH aumenta, e foi observado que
adjuvantes com valores de WHH maiores possuem uma
25 capacidade maior para adsorção de antígeno. Uma morfologia
fibrosa (por exemplo, como observado em micrografias de
transmissão eletrônica) é típica para adjuvantes de
hidróxido de alumínio. O pI de adjuvantes de hidróxido de
alumínio é tipicamente de cerca de 11, ou seja, o próprio
30 adjuvante possui uma carga de superfície positiva em pH
54/84
fisiológico. Capacidades de adsorção entre 1,8-2,6 mg de
proteína por mg de Al + " em pH 7,4 foram relatadas para
adjuvantes de hidróxido de alumínio.
Os adjuvantes conhecidos como "fosfato de alumínio"
5 são tipicamente hidroxifosfatos de alumínio que
freqüentemente também contêm uma pequena quantidade de
sulfato (ou seja, sulfato de hidroxifosfato de alumínio).
Eles podem ser obtidos por precipitação, e as condições de
reação e concentrações durante a precipitação influenciam o
10 grau de substituição de fosfato para hidroxil no sal.
Hidroxifosfatos geralmente possuem uma proporção molar de
PO4 /A1 entre 0,3 e 1,2. Hidroxifosfatos podem ser
distinguidos do A1PO 4 estrito pela presença de grupos
hidroxil. Por exemplo, uma banda de espectro IR a 3.164 cm 15
1 (por exemplo, quando aquecido até 200°C) indica a
presença de hidroxilas estruturais [capítulo 9 da
referência 128].
A proporção molar de PO 4 /A1 3+ de um adjuvante de
fosfato de alumínio geralmente será entre 0,3 e 1,2,
20 preferivelmente entre 0,8 e 1,2 e, mais preferivelmente,
0,95 ± 0,1. O fosfato de alumínio geralmente será amorfo,
particularmente para sais de hidroxifosfato. Um adjuvante
típico é hidroxifosfato de alumínio amorfo, com uma
proporção molar de PO 4 /A1 entre 0,84 e 0,92, incluído a 0,6
25 mg de A1 3-7m1. O fosfato de alumínio geralmente será
particulado (por exemplo, morfologia semelhante a uma
placa, como observado em micrografias de transmissão
eletrônica). Diâmetros típicos das partículas estão na
faixa de 0,520 pm (por exemplo, cerca de 5-10 pm) após
30 qualquer adsorção de antígeno. Capacidades de adsorção
55/84
entre 0,7-1,5 mg de proteína por mg de Al +++ em pH 7,4 foram
relatadas para adjuvantes de fosfato de alumínio.
O ponto de carga zero (PZC) do fosfato de alumínio
está inversamente relacionado ao grau de substituição de
5 hidroxil por fosfato, e esse grau de substituição pode
variar, dependendo das condições de reação e da
concentração de reagentes usadas para a preparação do sal
por precipitação. O PZC também é alterado por alteração da
concentração de íons fosfato livres em solução (mais
10 fosfato = PZC mais ácido) ou por adição de um tampão como,
por exemplo, um tampão histidina (torna o PZC mais básico).
Os fosfatos de alumínio usados de acordo com a invenção
geralmente terão um PZC entre 4,0 e 7,0, mais
preferivelmente entre 5,0 e 6,5, por exemplo, cerca de 5,7.
15
Suspensões de sais de alumínio usadas para preparar as
composições da invenção podem conter um tampão (por
exemplo, um tampão fosfato ou um tampão histidina ou um
tampão Tris), mas isso nem sempre é necessário. As
suspensões são preferivelmente estéreis e livres de
20 pirogênio. Uma suspensão pode incluir íons fosfato aquosos
livres, por exemplo, presentes em uma concentração entre
1,0 e 20 mM, preferivelmente entre 5 e 15 mM e, mais
preferivelmente, em torno de 10 mM. As suspensões também
podem compreender cloreto de sódio.
25
A invenção pode usar uma mistura tanto de um hidróxido
de alumínio quanto de um fosfato de alumínio [89]. Nesse
caso, pode haver mais fosfato do que hidróxido de alumínio,
por exemplo, uma proporção de peso de pelo menos 2:1, por
exemplo, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 etc.
30
A concentração de Al'' em uma composição para
56/84
administração a um paciente é preferivelmente menor do que
10 mg/ml, por exemplo, 5 5 mg/ml, 4 mg/ml, 3 mg/ml, 5 2
mg/ml, S 1 mg/ml etc. Uma faixa preferida é entre 0,3 e 1
mg/ml. Prefere-se um máximo de 0,85 mg/dose.
5
Além de incluir um ou mais adjuvantes de sal de
alumínio, o componente adjuvante pode incluir um ou mais
adjuvantes adicionais ou agentes imunoestimulantes. Estes
componentes adicionais incluem, sem limitação: um adjuvante
de monofosforil lipídeo A 3-0-desacilado ("3d-MPL"); e/ou
10 uma emulsão óleo-em-água. 3d-MPL também é citado como 3
des-O-acilado monofosforil lipídeo A ou como 3-0-desacil4'-monofosforil lipídeo A. O nome indica que a posição 3 da
glicosamina da extremidade redutora no monofosforil lipídeo
A é desacilada. Ele foi preparado a partir de um mutante
15 sem heptose de S. minnesota,
e é quimicamente similar ao
lipídeo A, mas é desprovido de um grupo fosforil ácidolábil e de um grupo acil base-lábil. Ele ativa células da
linhagem de monócitos/macrófagos e estimula a liberação de
várias citocinas, incluindo IL-1, IL-12, TNF-a e GM-CSF. A
20 preparação de 3d-MPL foi originalmente descrita na
referência 186, e o produto vem sendo fabricado e vendido
por Corixa Corporation, sob o nome comercial MPLTM
Detalhsdiconpemsrcontad srefência
139 a 142.
25
Composições farmacêuticas
As composições da invenção são farmaceuticamente
aceitáveis. Elas normalmente incluem componentes além dos
antígenos; por exemplo, elas tipicamente incluem um ou mais
veículos ou excipientes farmacêuticos. Uma discussão
30 detalhada de cada um dos componentes está disponível na
57/84
referência 198.
As composições geralmente estarão em forma aquosa.
A composição pode incluir conservantes, por exemplo,
timerosal ou 2-fenoxietanol. Prefere-se, no entanto, que a
5 vacina deva ser substancialmente livre de (ou seja, menos
de 5 pg/ml) material mercurial, por exemplo, livre de
timerosal [9,199]. As vacinas que não contêm mercúrio são
mais preferidas. Vacinas sem conservantes são
particularmente preferidas.
10
Para controlar a tonicidade, prefere-se incluir um sal
fisiológico, por exemplo, um sal de sódio. Prefere-se o
cloreto de sódio (NaC1), que pode estar presente entre 1 e
20
.
mg/ml. Outros sais que podem estar presentes incluem
cloreto de potássio, fosfato de potássio dihidrogênio,
15 dihidrato de fosfato dissódico, cloreto de magnésio,
cloreto de cálcio etc.
As composições geralmente terão uma osmolaridade entre
200 mOsm/kg e 400 mOsm/kg, preferivelmente entre 240-360
mOsm/kg, e mais preferivelmente estará na faixa de 290-310
20 mOsm/kg. A osmolaridade foi relatada previamente como não
tendo um impacto sobre a dor causada pela vacinação [200],
mas, no entanto, prefere-se manter a osmolaridade nessa
faixa.
As composições podem incluir um ou mais tampões.
25 Tampões típicos incluem: um tampão fosfato; um tampão Tris;
um tampão borato; um tampão succinato; um tampão histidina
(particularmente com um adjuvante de hidróxido de
alumínio); ou um tampão citrato. Os tampões tipicamente
serão incluídos na faixa de 5-20 mM.
30
O pH de uma composição geralmente estará entre 5,0 e
58/84
8,1 e, mais tipicamente, entre 6,0 e 8,0, por exemplo, 6,5
e 7,5, ou entre 7,0 e 7,8. Um processo da invenção pode,
portanto, incluir uma etapa de ajuste do pH da vacina a
granel, antes da embalagem.
5
A composição é preferivelmente estéril. A composição é
preferivelmente não pirogênica, por exemplo, contendo < 1
EU (unidade de endotoxina, uma medida-padrão) por dose, e
preferivelmente < 0,1 EU por dose. A composição é
preferivelmente livre de glúten.
10
As composições da invenção podem incluir detergentes,
por exemplo, um tensoativo de éster de polioxietileno
sorbitano (conhecido como "Tweens"), um octoxinol (por
exemplo, octoxinol-9 (Triton X-100) ou toctilfenoxipolietoxietanol), um cetil trimetil amônio
15 brometo ("CTAS"), ou desoxicolato de sódio, particularmente
para uma vacina dividida ou de antígeno de superfície. O
detergente pode estar presente apenas em quantidades
residuais. Dessa forma, a vacina pode incluir menos de 1
mg/ml de cada um de octoxinol-10 e polissorbato 80. Outros
20 componentes residuais em quantidades residuais poderiam ser
antibióticos (por exemplo, neomicina, canamicina,
polimixina B).
A composição pode incluir material para uma única
imunização, ou pode incluir material para imunizações
25 múltiplas (ou seja, um kit "multidoses"). A inclusão de um
conservante é preferida em arranjos multidoses. Como
alternativa (ou adicionalmente) à inclusão de um
conservante em composições multidoses, as composições podem
estar contidas em um recipiente que possua um adaptador
30 asséptico para a remoção de material.
59/84
As
vacinas
contra
influenza
são
tipicamente
administradas em um volume de dosagem de cerca de 0,5 ml,
embora metade da dose (ou seja, cerca de 0,25 ml) possa ser
administrada em crianças.
5
As composições e os kits são preferivelmente
armazenados entre 2°C e 8°C. Eles não podem ser congelados.
Idealmente eles devem ser mantidos protegidos da luz
direta.
Kits da invenção
10
As composições da invenção podem ser preparadas de
forma extemporânea, no momento da liberação,
particularmente quando estiver sendo usado um adjuvante.
Dessa forma, a invenção fornece kits que incluem os vários
componentes prontos para mistura. O kit permite que o
15 adjuvante e o antígeno sejam mantidos separadamente até o
momento da utilização. Esse arranjo é particularmente útil
quando se utiliza um adjuvante de emulsão óleo-em-água.
Os componentes estão fisicamente separados uns dos
outros dentro do kit, e essa separação pode ser obtida de
20 várias formas. Por exemplo, os dois componentes podem estar
em dois recipientes separados, por exemplo, frascos. O
conteúdo dos dois frascos pode então ser misturado, por
exemplo, por remoção do conteúdo de um frasco e
adicionando-o ao outro frasco, ou removendo-se
25 separadamente o conteúdo de ambos os frascos e misturandoos em um terceiro recipiente.
Em um arranjo preferido, um dos componentes do kit
está em uma seringa e o outro está em um recipiente como,
por exemplo, um frasco. A seringa pode ser usada (por
30 exemplo, com uma agulha) para inserir seu conteúdo no
60/84
segundo recipiente para mistura, e a mistura pode então ser
removida da seringa. O conteúdo misto da seringa pode então
ser administrado a um paciente, tipicamente por meio de uma
nova agulha estéril. A embalagem de um componente em uma
5 seringa elimina a necessidade de utilização de uma seringa
separada para administração ao paciente.
Em outro arranjo preferido, os dois componentes do kit
podem ser mantidos juntos, mas separadamente, na mesma
seringa, por exemplo, uma seringa de câmara dupla, por
10 exemplo, aquelas reveladas nas referências 201-208 etc.
Quando a seringa é acionada (por exemplo, durante
administração a um paciente), o conteúdo das duas câmaras é
misturado. Esse arranjo evita a necessidade de uma etapa
separada de mistura no momento da utilização.
15
Os componentes do kit geralmente estarão em forma
aquosa. Em alguns arranjos, um componente (tipicamente o
componente antigênico, e não o componente adjuvante) está
em forma seca (por exemplo, em uma forma liofilizada), com
o outro componente estando em forma aquosa. Os dois
20 componentes podem ser misturados a fim de reativar o
componente seco e gerar uma composição aquosa para
administração a um paciente. Um componente liofilizado
tipicamente estará localizado dentro de um frasco, e não em
uma seringa. Os componentes secos podem incluir
25 estabilizantes como, por exemplo, lactose, sacarose ou
manitol, além de misturas destes, por exemplo, misturas de
lactose/sacarose, misturas de sacarose/manitol etc. Um
arranjo possível utiliza um componente adjuvante aquoso em
uma seringa pré-preenchida e um componente antigênico
30 liofilizado em um frasco.
61/84
Embalagem de composições ou componentes do kit
Recipientes adequados para as composições da invenção
(ou para os componentes do kit) incluem frascos, seringas
(por exemplo, seringas descartáveis), sprays nasais etc.
5 Esses recipientes devem ser estéreis.
Quando uma composição/componente está localizado em um
frasco, o frasco preferivelmente é feito de um material de
vidro ou de plástico. O frasco é preferivelmente
esterilizado antes da composição ser adicionada a ele. Para
10 evitar problemas com pacientes sensíveis ao látex, os
frascos são preferivelmente lacrados com uma tampa sem
látex, e a ausência de látex em todo o material de
embalagem é preferida. O frasco pode incluir uma dose única
de vacina, ou pode incluir mais de uma dose (um frasco
15 "multidoses"), por exemplo, 10 doses. Frascos preferidos
são feitos de vidro incolor.
Um frasco pode ter uma tampa (por exemplo, um Luer
lock)
adaptada de tal forma que uma seringa pré-preenchida
possa ser inserida na tampa, o conteúdo da seringa possa
20 ser expelido no frasco (por exemplo, para reconstituir o
material liofilizado nele contido), e o conteúdo do frasco
possa ser removido de volta para a seringa. Após remoção da
seringa do frasco, uma agulha pode então ser anexada, e a
composição pode ser administrada a um paciente. A tampa
25 preferivelmente está localizada dentro de um lacre ou
cobertura, de tal forma que o lacre ou cobertura tenha que
ser removida, antes que a tampa possa ser acessada. Um
frasco pode ter uma tampa que permite a remoção asséptica
de seu conteúdo, particularmente para frascos multidoses.
30
Quando um componente é embalado em uma seringa, a
62/84
seringa pode ter uma agulha a ela anexada. Caso uma agulha
não esteja anexada, uma agulha separada poderá ser
fornecida com a seringa para montagem e uso. Uma agulha
desse tipo pode ter uma proteção. Preferem-se agulhas de
5 segurança. Agulhas de 2,54 cm/23 gauge, 2,54 cm/25 gauge e
0,625
cm/25 gauge são típicas. As seringas podem ser
fornecidas com rótulos destacáveis, nos quais podem ser
impressos o número do lote, a estação da influenza e a data
de validade do conteúdo, para facilitar o gerenciamento dos
10 registros. O êmbolo na seringa preferivelmente possui um
plugue para evitar que o êmbolo seja acidentalmente
removido durante a aspiração. As seringas podem ter uma
tampa e/ou êmbolo de borracha de látex. Seringas
descartáveis contêm uma dose única de vacina. A seringa
15 geralmente terá uma tampa na ponta para lacrar a ponta,
entes da adesão de uma agulha, e a tampa da ponta
preferivelmente é feita de uma borracha de butil. Caso a
seringa e a agulha sejam embaladas separadamente, a agulha
preferivelmente será adaptada com uma proteção de borracha
20 de butil. Seringas preferidas são aquelas comercializadas
sob o nome comercial "Tip-Lok 74 ".
Os recipientes podem ser marcados para exibir um
volume de meia dose, por exemplo, para facilitar a
aplicação em crianças. Por exemplo, uma seringa contendo
25
uma dose de 0,5 ml pode ter uma marca que exiba um volume
de 0,25 ml.
Quando é utilizado um recipiente de vidro (por
exemplo, uma seringa ou um frasco), prefere-se utilizar um
recipiente feito de um vidro de borossilicato, e não de um
30 vidro de cal sodada.
63/84
Um kit ou uma composição pode ser embalado (por
exemplo, na mesma caixa) com um folheto que inclui detalhes
da vacina, por exemplo, instruções para administração,
detalhes dos antígenos dentro da vacina etc. As instruções
5 também podem conter avisos, por exemplo, para manter uma
solução de adrenalina prontamente disponível em caso de
reação anafilática após vacinação etc. Em algumas
modalidades da invenção, o folheto estabelecerá que a
vacina inclui proteína da matriz.
10
Métodos de tratamento e administração da vacina
As composições da invenção são adequadas para
administração a pacientes humanos, e a invenção fornece um
método de despertar uma resposta imunológica em um
paciente, que compreende a etapa de administração de uma
15 composição da invenção ao paciente.
A invenção também fornece um kit ou uma composição da
invenção para uso como medicamento.
A invenção também fornece o uso de: (i) uma preparação
de antígeno do vírus influenza que inclui hemaglutinina e
20 proteínas da matriz, preparada a partir de vírus
desenvolvido em cultura de células, na fabricação de um
medicamento para despertar uma resposta imunológica em um
paciente.
A resposta imunológica despertada por esses métodos e
25
usos geralmente incluirá uma resposta de anticorpos,
preferivelmente uma resposta protetora de anticorpos.
Métodos para avaliação de respostas de anticorpos,
capacidade neutralizante e proteção após vacinação contra o
vírus influenza são bem conhecidos na técnica. Estudos em
30 humanos demonstraram que as titulações de anticorpos contra
64/84
hemaglutinina
de
vírus
influenza
humano
estão
correlacionadas à proteção (uma titulação da inibição da
hemaglutinação da amostra de soro de cerca de 30-40 gera
uma proteção em torno de 50% por infecção por um vírus
5 homólogo) [209]. As respostas de anticorpos tipicamente são
medidas por inibição de hemaglutinação, por
microneutralização, por imunodifusão radial simples (SRID)
e/ou por hemólise radial simples (SRH). Essas metodologias
de ensaio são bem conhecidas na técnica.
10
As composições da invenção podem ser administradas de
várias formas. A via de imunização mais preferida é por
injeção intramuscular (por exemplo, no braço ou na perna),
mas outras vias disponíveis incluem injeção subcutânea,
intranasal [210-212], oral [213], intradérmica [214,215],
15 transcutânea, transdérmica [216] etc.
As vacinas preparadas de acordo com a invenção podem
ser usadas para tratar tanto crianças quanto adultos. As
vacinas contra influenza são atualmente recomendadas para
uso em imunização pediátrica e de adultos, a partir da
20 idade de 6 meses. Dessa forma, o paciente pode ter menos de
1 ano de idade, 1-5 anos de idade, 5-15 anos de idade, 1555 anos de idade ou, pelo menos, 55 anos de idade.
Pacientes preferidos para receber as vacinas são os idosos
(por exemplo, 50 anos de idade, 60 anos de idade e,
25 preferivelmente, 65 anos de idade), as crianças (por
exemplo, S 5 anos de idade), pacientes hospitalizados,
profissionais da área de saúde, militares, mulheres
grávidas, os doentes crônicos, pacientes imunodeficientes,
pacientes que receberam um composto antiviral (por exemplo,
30 um composto de oseltamivir ou zanainivir; veja abaixo) nos
65/84
7 dias anteriores à administração da vacina, pessoas com
alergias ao ovo e pessoas que viajam para o exterior. No
entanto, as vacinas não são adequadas apenas para esses
grupos, e podem ser usadas de forma geral em uma população.
5 Para cepas pandêmicas, prefere-se a administração a todas
as faixas etárias.
As composições preferidas da invenção satisfazem 1, 2
ou 3 dos critérios CPMP quanto à eficácia. Em adultos (1860 anos), esses critérios são: (1) 70% de soroproteção;
10
(2) ?. 40% de soroconversão; e/ou (3) um aumento GMT de
2,5 vezes. Em idosos (> 60 anos), esses critérios são: (1)
?_ 60% de soroproteção; (2)
30% de soroconversão; e/ou (3)
um aumento GMT de > 2 vezes. Esses critérios se baseiam em
estudos abertos com pelo menos 50 pacientes.
15
O tratamento pode ser por um esquema de dose única ou
por um esquema de doses múltiplas. Doses múltiplas podem
ser usadas em um esquema de imunização primária e/ou em um
esquema de imunização de reforço. Em um esquema de doses
múltiplas, as várias doses podem ser dadas pela mesma via
20 ou por vias diferentes, por exemplo, uma dose primária
parenteral e um reforço mucoso, uma dose primária mucosa e
um reforço parenteral etc. A administração de mais de uma
dose (tipicamente duas doses) é particularmente útil em
pacientes imunologicamente virgens, por exemplo, para
25 pessoas que nunca receberam uma vacina contra influenza
antes, ou para a vacinação contra um novo subtipo de HA
(como em um surto pandêmico). Doses múltiplas tipicamente
serão administradas com um intervalo de pelo menos 1 semana
(por exemplo, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca
30 de 4 semanas, cerca de 6 semanas, cerca de 8 semanas, cerca
66/84
de 10 semanas, cerca de 12 semanas, cerca de 16 semanas
etc.).
As vacinas produzidas pela invenção podem ser
administradas aos pacientes simultaneamente (por exemplo,
5 durante a mesma consulta médica ou visita a um profissional
de saúde ou centro de vacinação) com outras vacinas, por
exemplo, simultaneamente com uma vacina contra sarampo, uma
vacina contra caxumba, uma vacina contra rubéola, uma
vacina MMR, uma vacina contra varicela, uma vacina MMRV,
10 uma vacina contra difteria, uma vacina contra tétano, uma
vacina contra pertussis, uma vacina DTP, uma vacina
conjugada de H.
influenzae do tipo B, uma vacina inativada
de poliovírus, uma vacina contra o vírus da hepatite B, uma
vacina meningocócica conjugada (por exemplo, uma vacina
15 tetravalente A-C-W135-Y), uma vacina contra o vírus
sincicial respiratório, uma vacina pneumocócica conjugada
'etc. A administração simultaneamente com uma vacina
pneumocócica e/ou uma vacina meningocócica é
particularmente útil em pacientes idosos.
20
Da mesma forma, as vacinas da invenção podem ser
administradas aos pacientes simultaneamente (por exemplo,
durante a mesma consulta médica ou visita a um profissional
de saúde) com um composto antiviral e, em particular, um
composto antiviral ativo contra vírus influenza (por
25 exemplo, oseltamivir e/ou zanamivir). Esses antivirais
incluem inibidores da neuraminidase, por exemplo, um ácido
(3R,4R,5S)-4-acetilamino-5-amino-3(1-etilpropoxi)-1ciclohexeno-l-carboxílico ou ácido 5-(acetilamino)4-[(aminoiminometil)-amino]-2,6-anidro-3,4,5-tridesoxi-D30 glicero-D-galactonon-2-enônico, incluindo ésteres destes
67/84
(por exemplo, os ésteres etílicos) e sais destes (por
exemplo, os sais de fosfato). Um antiviral preferido é o
ácido (3R,4R,5S)-4-acetilamino-5-amino-3(1-etilpropoxi)-1ciclohexeno-l-carboxílico, éster etílico, fosfato (1:1),
5 também conhecido como fosfato de oseltamivir (TAMIFLU Tm ).
Ensaios
Para caracterizar uma vacina contra influenza, pode
ser útil determinar a quantidade de proteína da matriz que
está presente. Dessa forma, a invenção fornece ensaios para
10 análise de vacinas contra influenza, em que uma amostra da
vacina é analisada para determinar a presença de proteína
da matriz. Os ensaios são particularmente úteis para a
pesquisa de fragmentos de proteína Ml.
A vacina contra influenza pode incluir antígenos de
15 vírus influenza A e/ou influenza B. A invenção fornece
ensaios para análise das vacinas que compreendem antígenos
de um vírus influenza B, em que uma amostra da vacina é
analisada para determinar a presença de uma proteína da
matriz do vírus influenza B.
20
A vacina contra influenza pode incluir antígenos de
vários subtipos de HA. A invenção fornece ensaios para a
análise de vacinas que compreendem antígenos de um vírus
influenza A, em que uma amostra da vacina é analisada para
determinar a presença de uma proteína da matriz do vírus
25 influenza A, e em que o vírus influenza A possui um subtipo
de hemaglutinina selecionado de: H2, H4, H5, H6, H7, H8,
H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 ou H16.
A vacina contra influenza pode incluir antígenos
desenvolvidos em cultura de células. A invenção fornece
30 ensaios para análise de vacinas desenvolvidas em cultura de
68/84
células, em que uma amostra da vacina é analisada para
determinar a presença de uma proteína da matriz do vírus
influenza.
A vacina contra influenza pode incluir um adjuvante. A
5 invenção fornece ensaios para a análise de vacinas com
adjuvantes contra influenza, em que uma amostra da vacina é
analisada para determinar a presença de uma proteína da
matriz do vírus influenza. A invenção também fornece
ensaios para a análise de vacinas sem adjuvantes contra
10 influenza, em que uma amostra da vacina sem adjuvante é
analisada para determinar a presença de uma proteína da
matriz do vírus influenza, e em que um adjuvante é então
adicionado à vacina.
Esses ensaios tipicamente serão imunoensaios, por
15 exemplo, um
western blot
ou ELISA. Um imunoensaio pode
utilizar anticorpos policlonais ou monoclonais. Quando é
usado um anticorpo monoclonal, em algumas modalidades ele
não é um anticorpo murídeo, pode exemplo, um anticorpo
murídeo IgGl. Anticorpos que reconhecem fragmentos de M1
20 podem ser usados nos ensaios, incluindo aqueles que
reconhecem os fragmentos de M1 aqui revelados, por exemplo,
anticorpos que reconhecem fragmentos com um peso molecular
de 10 kDa ou menos (por exemplo, 5 kDa), que reconhecem
fragmentos desprovidos da metionina no terminal N, que
25 reconhecem fragmentos com a seqüência do terminal N do ID.
DE SEQ. N°: 15, que reconhecem o ID. DE SEQ. N°: 28 e/ou
29, que reconhecem fragmentos que incluem o ID. DE SEQ. N°:
30, que reconhecem fragmentos com um resíduo modificado de
forma covalente do terminal N etc.
30
Os ensaios são particularmente úteis para a detecção
69/84
de fragmentos de proteína Ml, tais como fragmentos com um
peso molecular de 10 kDa ou menos (por exemplo, ... 5 kDa)
e/ou os fragmentos aqui revelados (por exemplo, desprovidos
da metionina do terminal N da seqüência total de Ml).
5 Ensaios preferidos podem distinguir entre a presença de
proteína Ml de comprimento total e fragmentos da proteína
Ml, e também podem distinguir entre diferentes fragmentos.
Os ensaios podem ser qualitativos, semiquantitativos
ou quantitativos.
10
A
invenção também fornece vacinas que foram testadas
desta forma.
Aspectos adicionais da invenção
A invenção fornece uma composição imunogênica que
compreende: (i) hemaglutinina e proteínas da matriz do
15 vírus influenza, e (ii) um adjuvante. As proteínas do vírus
influenza podem ser preparadas a partir de vírus
desenvolvido em cultura de células ou desenvolvidos no ovo.
Como descrito acima, a composição também pode incluir
componentes adicionais, por exemplo, proteína neuraminidase
20 do vírus influenza, veículos/excipientes farmacêuticos etc.
A invenção também fornece um método para a preparação
de uma composição imunogênica que compreende as etapas de:
(i) crescimento do vírus influenza; (ii) preparação de uma
composição de antígeno a partir de vírus desenvolvidos na
25 etapa (i), em que a composição de antígeno compreende
hemaglutinina e proteínas da matriz; e (iii) combinação da
composição de antígeno com um adjuvante, para gerar a
composição imunogênica.
A
30
invenção fornece uma composição imunogênica que
compreende: (i) hemaglutinina e proteínas da matriz do
70/84
vírus influenza, em que a hemaglutinina possui um subtipo
selecionado de:
H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12,
H13, H14, H15 ou H16.
A invenção também fornece um método para a preparação
5
de uma composição imunogênica que compreende as etapas de:
(i) crescimento do vírus influenza; (ii) preparação de uma
composição de antígeno a partir de vírus desenvolvidos na
etapa (i), em que a composição de antígeno compreende
hemaglutinina e proteínas da matriz, e em que a
10 hemaglutinina possui um subtipo selecionado de: H2, H4, H5,
H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 ou H16;
e
(iii) combinação da composição de antígeno com um
adjuvante, para gerar a composição imunogênica.
A invenção fornece uma composição imunogênica que
15
compreende: (i) hemaglutinina e proteínas da matriz do
vírus influenza, em que a concentração de hemaglutinina na
composição é de 29 gg/ml ou menos (por exemplo,
28
pg/ml,
•
27
pg/ml,
26
pg/ml, 5_ 25 pg/ml,
24
pg/ml,
23
pg/ml,
•
22
pg/ml,
21
pg/ml, 5_ 20 pg/ml,
19
pg/ml,
18
pg/ml,
17
pg/ml,
16
pg/ml,
pg/ml, 5_ 14 pg/ml,
13
pg/ml,
•
12
pg/ml,
11 pg/ml,
7
pg/ml,
20
6
pg/ml,
15
10 pg/ml,
5
9
pg/ml,
pg/ml, 5_ 4 pg/ml,
8
3
pg/ml,
pg/ml,
2
pg/ml). A composição pode incluir hemaglutinina de mais de
uma cepa de vírus influenza, quando então a referida
25
concentração é por cepa (ou seja,
29
gg/ml por cepa).
A invenção fornece uma composição imunogênica que
compreende: (i) hemaglutinina e proteínas da matriz do
vírus influenza, em que a concentração de hemaglutinina na
composição é de 31 pg/ml ou mais (por exemplo,
30 ?_ 33 pg/ml,
34
pg/ml,
35
pg/ml, ?_ 40 pg/ml,
32
pg/ml,
45
pg/ml,
71/84
50 pg/ml,
55 pg/ml,
60 pg/ml,
70 pg/ml,
80 pg/ml,
90 pg/ml, ?._ 100 pg/ml etc., mas tipicamente < 200 pg). A
composição pode incluir hemaglutinina de mais de uma cepa
de vírus influenza, quando então a referida concentração é
5 por cepa (ou seja,
31 pg/ml por cepa).
A invenção também fornece uma composição imunogênica
que compreende uma proteína M2 da matriz do vírus
influenza, mas que é substancialmente livre de uma proteína
Ml da matriz do vírus influenza, como definido acima.
10 Vacinas que contêm M2 estão atualmente sendo desenvolvidas
[217]. M2 é codificada naturalmente por um segmento viral
que também codifica Ml. Dessa forma, em um sistema de
expressão recombinante, talvez a proteína M1 seja expressa
como subproduto. De acordo com a invenção, essa expressão
15 colateral pode ser evitada, ou as proteínas M1 da matriz
podem ser removidas da composição que contém M2. A proteína
M2 pode ser uma proteína de comprimento total ou pode ser,
por exemplo, um fragmento de M2, por exemplo, o domínio
extracelular de M2 (conhecido na técnica como "M2e"). A
20
proteína M2 pode ser conjugada a outro antígeno, por
exemplo, a um antígeno do vírus da hepatite B. A vacina
também pode ser livre de HA e/ou NA.
Considerações gerais
O termo "que compreende" engloba "que inclui", além de
25 "que consiste", por exemplo, uma composição "que
compreende" X pode consistir exclusivamente em X ou pode
incluir algo adicional, por exemplo, X + Y.
A
palavra
"substancialmente"
não
exclui
"completamente", por exemplo, uma composição que é
30 "substancialmente livre" de Y pode ser completamente livre
72/84
de Y. Quando necessário, a palavra "substancialmente" pode
ser omitida da definição da invenção.
O termo "cerca de", em relação a um valor numérico x,
significa, por exemplo,
5
x ± 10%.
A menos que especificamente definido, um processo que
compreende uma etapa de mistura de dois ou mais componentes
não exige qualquer ordem específica de mistura. Dessa
forma, os componentes podem ser misturados em qualquer
ordem. Quando há três componentes, dois componentes podem
10 ser combinados entre eles, e depois a combinação pode ser
combinada com o terceiro componente etc.
Quando são usados materiais animais (e particularmente
bovinos) na cultura de células, eles devem ser obtidos de
fontes que sejam livres de encefalopatias espongiformes
15 transmissíveis (TSEs) e, em particular, livres de
encefalopatia espongiforme bovina (BSE). Em geral, preferese o cultivo de células na ausência total de materiais de
origem animal.
Quando um composto é administrado ao corpo como parte
20 de uma composição, aquele composto pode alternativamente
ser substituído por um pró-fármaco adequado.
Quanto um substrato celular é usado para procedimentos
recombinantes ou de genética reversa, ele preferivelmente é
um que tenha sido aprovado para uso na produção de vacinas
25 humanas, por exemplo, como em Ph Eur, capítulo geral 5.2.3.
A identidade entre seqüências de polipeptídeos é
preferivelmente determinada pelo algoritmo de pesquisa de
homologia de Smith-Waterman, da forma implementada no
programa MPSRCH (Oxford Molecular), com o uso de pesquisa
30 de afinidade de lacuna
(gap)
com os parâmetros: penalidade
73/84
de lacuna aberta = 12 e penalidade de extensão de lacuna =
1.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 é um SDS-PAGE de várias preparações de
5 vacina. As raias
V115411
são marcadores de peso molecular
(kDa). A raia 1 é a vacina desenvolvida em MDCK. As raias
2-6 são vacinas comerciais existentes. As setas mostram (a)
HA1 (b) HA2 (c) o fragmento Ml da invenção.
A Figura 2 mostra os resultados da análise
10
western
blot de vírions influenza fracionados com o uso de antisoro de coelhos imunizados com o fragmento da proteína da
matriz de -5 kDa. O painel da esquerda é um blot com o uso
de soros pré-imunes, e o painel da direita utiliza soros
pós-imunes.
15
MODOS PARA REALIZA A INVENÇÃO
Embora trabalhando em uma vacina de antígenos de
superfície purificados para o vírus influenza, em que os
vírions cresceram em células MDCK, foi observado que uma
quantidade relativamente grande de polipeptídeo de baixo
20 peso molecular podia ser detectada por SDS-PAGE após a
divisão do vírus influenza A com CTAB. Esse polipeptídeo de
baixo peso molecular também estava presente durante a
purificação adicional do antígeno, e estava presente na
preparação final de antígenos de superfície. Para
25 investigar esse polipeptídeo, foi usado um sistema tampão
que permite a identificação de polipeptídeos tão pequenos
quanto 2 kDa (Géis Bis-Tris NuPAGE TM Novex de Invitrogen).
Com o uso desse sistema, foi identificada uma banda de
polipeptídeo com um peso molecular aparente de -5 kDa. Essa
30 banda de polipeptídeo não era observada nas vacinas atuais
74/84
INFLEXAL
VTM ,
INFLUSPLIT Tm ,
MUTAGRIPTM ,
VAXIGRIPTM ,
BEGRIVACTM , FLUARIXTM , INFLUVAC TM ou FLUVIRINTM , todas elas
preparada a partir de vírions desenvolvidos no ovo.
Surpreendentemente, a banda de polipeptídeo foi detectada
5 em alguns lotes de AGRIPPAL TM , mas sua existência ou
presença não era previamente reconhecida.
A imunização de coelhos com a banda de -5 kDa induziu
anticorpos que eram capazes de detectar a proteína M1
nativa. A Figura 2 mostra os resultados da análise western
10
blot de vírions influenza fracionados com o uso de antisoros dos coelhos, com forte reatividade para a proteína M1
do vírion. Dessa forma, um polipeptídeo na banda de -5 kDa
carrega epítopos que são imunogênicos e podem causar a
produção de anticorpos que se ligam à proteína Ml nativa
15 correspondente.
A análise da seqüência de aminoácidos do terminal N da
banda de -5 kDa derivada de dois vírus diferentes (um vírus
H1N1 e um vírus H3N2) revelou um peptídeo com seqüência do
terminal N de EISLSYSAGALA (ID. DE SEQ. N°: 15). Essa
20 seqüência de aminoácidos é um fragmento da proteína M1 do
vírus influenza idêntico às posições de aminoácidos 114 a
125 do ID. DE SEQ. N°: 1.
Uma investigação posterior com o uso de análise MS de
fragmentos trípticos revelou um fragmento mais abundante
25 com a seqüência de aminoácidos do terminal N do ID. DE SEQ.
N°: 28, que é desprovida da metionina do terminal N do ID.
DE SEQ. N°: 1:
SLLTEVETYVLSIIPSGPLKAEIAQRLEDVFAGKNTDLEVLMEWLKTRPILSPLTKGIL
GFVFTLTVPSERGLQR (ID. DE SEQ. N°: 28)
30
O terminal C desse fragmento pode ter um resíduo Arg
75/84
adicional (ou seja, SLL...QRR, ID. DE SEQ. N°: 29). A
serina do terminal N pode ser modificada de forma
covalente, por exemplo, acetilada. O 12-mer do terminal N
desse fragmento (SLLTEVETYVLS; ID. DE SEQ. N°: 30) é bem
5 conservado entre cepas.
As composições da invenção podem conter ambos os
fragmentos, com o fragmento próximo ao terminal N (por
exemplo, ID. DE SEQ. N°: 28) sendo mais abundante.
Entende-se que a invenção foi descrita apenas como
10 exemplo, e que podem ser feitas modificações ainda
permanecendo dentro do escopo e do espírito da invenção.
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Xaa is Aia or Thr
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Leu Ser Tyr Ser Xaa Gly Ala Leu Ala
5
1
<210> 2
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Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu
1
5
Thr
Tyr
10
Val Leu Ser
Ile Ile Pro
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Ser Gly Pra Leu Lys Ala Glu Ile Ala
25
20
Gln
Arg Leu Glu Asp Val Phe
30
Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Val Leu Met Glu Trp Leu Lys
45
40
35
Ary Pra Ile Leu Ser
50
Thr
65
Pro Leu Thr Lys
55
Leu Thr Val Pro Ser
70
Gln Asn Ala
Glu
Arg
Gly Leu Gln Arg Arg Arg Phe Vai
75
80
85
Lys Glu
Gly Ile Leu Gly Phe Vai Phe
60
Leu Asn Gly Asn Gly Asp Pro Asn
Val Lys Leu Tyr Arg Lys
100
Thr
Leu Lys Arg
90
Asn Met Asp Lys Ala
95
Glu Ile
Thr Phe Mis Gly Ala
105
Ile Ser Leu Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Leu Ala
125
120
115
110
Ser Cys Met
00 - 3
2/6
Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met 61y Aia Val
135
130
Thr Thr Glu Val Ala Phe
140
Gly Leu Vai Cys Ala Thr Cys Giu Gln Ile Ala Asp
155
150
145
Ser Gln His Arg
160
Ser His Arg Gln Met Val Thr Thr Thr Asn Pra Leu Ile Arg His Glu
175
170
165
Asn Arg Met Val Leu Aia Ser
180
Thr Thr Ala Lys Ala Met Giu Gln Met
185
190
Ala Gly Ser Ser Glu Gln Ala Ala Glu Ala Met Glu Val Ala Ser Gln
205
195
200
Ala Arg Gln Met Vai Gln Ala Met
215
210
Arg Thr Ile Gly Thr His Pro Ser
220
Ser Ser Ala Gly Leu Lys Asn Asp Leu Leu Glu Asn Leu Gln
235
230
225
Gln Lys
Arg Met Gly Vai Gln Met Gln Arg Phe Lys
245
250
<210> 3
<211>
<212> PRT
<213>
Vírus Influenza
<400>
3
Gly Ile Leu Gly Phe Vai Phe Thr Leu
5
1
<210>
4
<211> 10
<212> PRT
<213>
Vírus Influenza
4
<400>
Ile Leu Gly
1
Phe Vai Phe Thr Leu Thr Vai
5
<210>
5
<211> 9
<212> PRT
<213>
Vírus Influem
<400>
5
Ser Ile Ile Pro Ser Gly Pra Leu Lys
5
1
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213>
Vírus Influenza
<400> 6
Met Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met
5
1
<210>
<211>
<212>
<213>
7
8
PRT
Vírus Influenza
<400> 7
Aia Ser Cys Met Gly Leu Ile Tyr
10
Ala Tyr
240
3/6
1
<210>
<211> 9
<21 2>
PRT
<213>
Vírus Influenza
<400> 8
Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile
5
1
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213>
Vírus Influenza
<400>
9
Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu
10
5
1
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
< 213 > Vírus Influenza
<400>
10
Ala Tyr Gln Lys Arg Met Gly Vai Gln Met Gln Arg
10
5
1
<210> II
<211>
Ia
<212> PRT
<213> Vírus Influenza
<400>
11
Leu Glu Asn Leu Gln Ala Tyr Gln Lys Arg
10
5
1
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> Vírus Influenza
<400> 12
Gly Prol Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Arg Leu Glu
10
1
5
<210>
13
<211> 9
<212>
Pg'r
<213>
Vírus Influenza
<400>
13
Arg Lys Leu Lys Arg Glu Ile Thr Phe
5
1
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213>
Vírus Influenza
<400>
14
Arg Lys Leu Lys Arg Glu Ile Thr Phe Mis
10
<210> 15
<2II> 10
4/ 6
<212> PRT
<213>
Vírus Influenza
<400> 15
Ser Leu Leu Thr Glu Vai Glu Thr Tyr Val
10
1
5
<210> 16
<211>
8
<212> PRT
<213> Vírus Influem
<400> 16
Ile Ile Pra, Ser Gly Pro Leu Lys
5
1
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213>
Vírus Influenza
<400>
17
Leu Glu Asp Vai Phe Ala Gly Lys
1
5
<210> 18
<211> 12
<212>
PRT
<213>
Vírus Influenza
<400>
18
Glu Ile Ser Leu Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Leu Ala
1
5
10
<210> 19
<211> 50
<212> PRT
<21S> Vírus Influenza
<400> 19
Glu Ile Ser Leu Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Leu Aia Ser Cys Met Gly
15
1
5
10
Leu Ile Tyr Asn Arg Met Gly Ala Val Thr Thr Giu Val Ala Phe Gly
25
20
30
Leu Val Cys Aia Thr Cys Glu Gin Ile Ala Asp Ser Gln His Arg Ser
35
40
45
His Arg
50
<21D> 20
<211> 47
PRT
<212>
<213>
Vírus Influenza
<400>
20
Giu Ile Ser Leu Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met Gly
5
1
10
15
Leu Ile Tyr Asn Arg Met Gly Ala Val Thr Thr Giu Val Ala Phe Gly
20
25
30
Leu Vai Cys Ala Thr Cys Giu Gln Ile Ata Asp Ser Gln His Arg
35
45
40
5/6
<210> 21
<211> 9
<212>
PRT
<213>
Vírus Influenza
<400> 21
Leu Ser Tyr Ser Thr Gly Ala Leu Ala
1
5
<210> 22
<211>
9
<212> PRT
Vírus Influenza
<213>
<400> 22
Leu Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Leu Ala
1
5
<210> 23
<211>
9
<212> PRT
Vírus Influenza
<213 >
<400>
23
Leu Asn Tyr Ser Thr Gly Ala Leu Ala
1
5
<210> 24
<211> 9
<212>
PRT
<213>
Vírus Influenza
<400> 24
Leu Gly Tyr Ser Thr Gly Ala Leu Ala,
1
5
<210> 25
9
<211>
<212> PRT
<213>
Vírus Influenza
<400>
25
Leu Ser Tyr Ser Thr Gly Ala Leu Thr
1
5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<219>
Vírus Influenza
<400> 26
Phe Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Leu Ala
1
5
<210> 2?
<211> 6
<212> PRT
<213>
Vírus Influenza
<220>
<221> misc_feature
<222> 3
<223> Xaa is Ala or Thr
<400> 2?
Tyr Ser Xaa Gly Ala Leu
5
1
6/ 6
<210>
28
<211> 75
<212> PRT
<213>
Vírus Influenza
<400> 28
Ser Leu Leu Thr Giu Vai Glu Thr
5
1
Tyr Vai Leu Ser Ile Ile Pro Ser
105
10
Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Arg. Leu Glu Asp Val Phe Ala
30
25
20
Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Vai Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr Arg
45
40
35'
Pra Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe Vai Phe Thr
60
55
50
Leu Thr Val Pro Ser Giu Arg Gly Leu Gln Arg
75
65
70
<210> 29
<211> 76
<212> PRT
<213>
Vírus Influenza
<400>
29
Ser Leu Leu Thr Glu Vai Glu Thr Tyr Val Leu Ser Ile Tia Pro Ser
1
10
5
15
Gly Pro Leu Lys Aia Glu lia Ala Gin Arg Leu Giu Asp Vai Phe Ala
20
25
30
Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Vai Leu Met Giu Trp Leu Lys Thr Arg
35
45
40
Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr
50
53
60
Leu Thr Vai Pra Ser Giu Arg Gly Leu Gln Arg Arg
70
75
65
<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213>
Vírus Influenza
<400> 30
Ser Leu Leu Thr Giu Vai Glu Thr Tyr Vai Leu Ser
5
10
1
1/ 5
REIVINDICAÇÕES
1.
Composição
imunogênica,
caracterizada
por
compreender hemaglutinina e proteínas da matriz do vírus
influenza, não como um vírion inteiro, preparada a partir
5 de vírus desenvolvido em cultura de células.
2.
Composição
imunogênica,
caracterizada
por
compreender hemaglutinina e proteínas da matriz do vírus
influenza, não como um vírion inteiro, em que a composição
não contém ovalbumina.
10
3.
Composição
imunogênica,
caracterizada
por
compreender hemaglutinina e proteínas da matriz do vírus
influenza, em que: a proteína da matriz possui um peso
molecular de menos de 20 kDa e compreende uma seqüência de
aminoácidos que possui pelo menos 50% de identidade para o
15
ID. DE SEQ. N°: 1.
4.
Composição
imunogênica,
caracterizada
por
compreender hemaglutinina e proteínas da matriz do vírus
influenza, em que: a proteína da matriz possui um peso
molecular de menos de 20 kDa e compreende uma seqüência de
20
aminoácidos que possui pelo menos 75% de identidade para o
ID. DE SEQ. N°: 28.
5.
Método para a preparação de uma composição
imunogênica,
(i)
25
caracterizado por compreender as etapas de:
crescimento do vírus influenza em cultura de
células;
(ii) preparação de uma composição de antígeno a partir
de vírus desenvolvidos na etapa (i), em que a composição de
antígeno compreende hemaglutinina e proteínas da matriz não
como um vírion inteiro; e
30
(iii) combinação da composição de antígeno com um
2/5
veículo farmacêutico, para gerar a composição imunogênica.
6. Composição ou método, de acordo com qualquer uma
das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5,
caracterizado pelo fato
de que a proteína da matriz compreende uma seqüência de 20
5 aminoácidos que possui pelo menos 80% de identidade para o
ID. DE SEQ. N°:
2.
7. Composição ou método, de acordo com qualquer uma
das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6,
caracterizado pelo
fato de que a proteína da matriz compreende um epítopo de
10 célula T da proteína M1 do vírus influenza.
8. Composição ou método, de acordo com qualquer uma
das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7,
caracterizado
pelo fato de que a proteína da matriz compreende uma ou
15
mais das seguintes seqüências de aminoácidos:
ID. DE SEQ.
N°: 1; ID. DE SEQ. N°:
21;
N°:
23;
ID. DE SEQ. N°:
24;
N°:
26;
ID. DE SEQ. N°:
27.
ID. DE SEQ. N°:
22;
ID. DE SEQ.
ID. DE SEQ. N°:
25;
ID. DE SEQ.
9. Composição ou método, de acordo com qualquer uma
das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8,
caracterizado
20 pelo fato de que a proteína da matriz possui uma seqüência
de aminoácidos que é um fragmento de uma seqüência de
aminoácidos da proteína da matriz M1 de comprimento total.
10. Composição ou método, de acordo com qualquer uma
das reivindicações 1,
25
2,
3, 4,
5,
6,
7,
8 ou 9,
caracterizado pelo fato de que a proteína da matriz é
desprovida da metionina do terminal N da seqüência de Ml
natural.
11.
Composição ou método,
reivindicação 10,
de acordo com a
caracterizado pelo fato de que a proteína
30 da matriz possui uma seqüência do terminal
N SLLTEVETYVLS
3/5
(ID. DE SEQ. N°: 30).
12.
Composição ou método,
reivindicação 11,
de acordo com a
caracterizado pelo fato de que a serina
do terminal N do ID. DE SEQ. N°: 30 é modificada de forma
5 covalente, por exemplo, acetilada.
13. Composição ou método, de acordo com qualquer uma
das reivindicações 1,
2,
3, 4,
5,
6,
7,
8 ou 9,
caracterizado pelo fato de que a proteína da matriz possui
uma seqüência do terminal N EISLSYSAGALA (ID. DE SEQ.
10
N°:
18).
14. Composição ou método, de acordo com qualquer uma
das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou
13, em que a composição é
caracterizada pelo fato de
compreender: (i) uma primeira proteína da matriz que possui
15 uma seqüência do terminal N SLLTEVETYVLS (ID. DE SEQ.
30);
N°:
e (ii) uma segunda proteína da matriz que possui uma
seqüência do terminal N EISLSYSAGALA (ID. DE SEQ. N°: 18).
15. Composição ou método, de acordo com qualquer uma
das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
20 13 ou 14,
caracterizado pelo fato de que a proteína da
matriz está presente em uma concentração entre 1 pg/ml e 15
pg/ml.
16. Composição ou método, de acordo com qualquer uma
das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
25 13, 14 ou 15,
caracterizado pelo fato de compreender vírus
influenza dividido ou antígenos de superfície de influenza
purificado.
17. Composição ou método, de acordo com qualquer uma
das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
30 13, 14, 15 ou 16,
caracterizado pelo fato de que a
4/ 5
hemaglutinina é de um subtipo Hl, H2, H3, H5, H7 ou H9 do
vírus influenza A.
18. Composição ou método, de acordo com qualquer uma
das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
5 13, 14, 15, 16, ou
17,
caracterizado pelo fato de que as
proteínas do vírus influenza são preparadas a partir de um
vírus influenza desenvolvido em uma cultura de uma célula
hospedeira, e de que a composição contém menos de 10 ng de
DNA celular da célula hospedeira.
10
19. Composição ou método, de acordo com qualquer uma
das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
13, 14, 15, 16, 17 ou 18,
caracterizado pelo fato de que a
composição contém entre 0,1 e 20 lig de hemaglutinina por
cepa viral.
15
20. Composição ou método, de acordo com qualquer uma
das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19,
caracterizado pelo fato de
que a composição inclui um adjuvante.
21.
Composição ou método,
20 reivindicação 20,
de acordo com a
caracterizado pelo fato de que o
adjuvante compreende um ou mais sais de alumínio.
22.
Composição ou método,
reivindicação 20,
de acordo com a
caracterizado pelo fato de que o
adjuvante compreende uma emulsão óleo-em-água.
25
23. Composição imunogênica caracterizada pelo fato de
compreender: (i) hemaglutinina e proteínas da matriz do
vírus influenza, não como um vírion inteiro, e (ii) um
adjuvante.
24. Composição imunogênica caracterizada pelo fato de
30 compreender hemaglutinina e proteínas da matriz do vírus
5/5
influenza, não como um vírion inteiro, em que a
hemaglutinina possui um subtipo selecionado de: H2, H4, H5,
H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 ou H16.
25. Composição imunogênica caracterizada pelo fato de
5 compreender hemaglutinina e proteínas da matriz do vírus
influenza, em que a concentração de hemaglutinina na
composição é de 29 lig/m1 por cepa ou menor.
26.
Ensaio imunológico para análise de uma vacina
contra influenza,
caracterizado pelo fato de que uma
10 amostra da vacina é analisada para determinar a presença de
um fragmento de proteína M1 da matriz.
1/2
Figu ra 1
M l 2 3 4 5
- 250
•
11A1
H A2 ->
*
- 150
- 100
- 75
- 50
- 37
- 10
2/2
Fi gura
2
Ml
Ml
2501501007650-
,1501007550-
37-
37-
2620-
; 2520-
-HA
-N
-M1
-M2
15-
10-
10-
1/1
COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, MÉTODO PARA PREPARAÇÃO DA MESMA E
ENSAIO IMUNOLÓGICO PARA ANÁLISE DE UMA VACINA CONTRA
INFLUENZA
Uma
composição
imunogênica
que
compreende
5 hemaglutinina e proteínas da matriz do vírus influenza.
Estas podem ser de vírus influenza desenvolvidos em cultura
de células, e não em ovos. A proteína da matriz pode ser um
fragmento de uma proteína da matriz viral de comprimento
total, por exemplo, um fragmento M1 da matriz, com um peso
10 molecular de menos de 20 kDa. A composição pode ser uma
vacina de subunidade que compreende glicoproteínas de
superfície purificadas.