Tese de Mestrado - Ana Marta Pereira

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Agradecimentos
À Prof. Doutora Sílvia Coimbra e ao Prof. Doutor Luís Gustavo Pereira pelo apoio, segurança
e motivação transmitidos através da sua orientação e exigência. Por acreditarem desde o início na
minha capacidade e competência para realizar este trabalho.
À Doutora Stefanie Sprunck por todo o apoio, pela orientação e exigência, por me ensinar
que é preciso muita persistência para se fazer ciência, e pela motivação que me transmitiu.
À Lucija Soljic e à Doutora Stefanie Sprunck pela disponibilização dos resultados das
experiências de microarrays, ainda não publicados.
À minha família por todo o apoio, pela paciência, pelo mimo do bom e pela disponibilidade
nos momentos mais difíceis e de dúvidas, por sempre me terem dado forças para continuar e me
ensinarem a nunca desistir dos meus objectivos.
Aos amigos, por estarem sempre presentes, pela paciência e todo o apoio prestado, pelo
carinho e por me aturarem sempre, mesmo quando acabava a falar das minhas plantas, dos meus
PCRs azarados ou de transformações com resultados estranhos (ajudaram-me sempre a chegar à
conclusão de que não existem resultados estranhos ou azarados, mas sim resultados que nos
fazem pensar, tentar compreender, voltar atrás, rever passos, métodos… enfim, fazer ciência).
À Lucija, por todo o apoio que me deu, por tudo o que me ensinou no laboratório, pelas boas
conversas, pela boa disposição e o mais importante, pelos crepes com Nutella e gelado que
compensavam alguns dias intermináveis no laboratório. E, claro, pela amizade!
A todos os meus colegas e amigos de laboratório, do Porto e de Regensburg, por todo o
apoio que me deram, pela paciência para me aturar, mesmo quando queria pôr toda a gente a
limpar o laboratório, pelas boas conversas e discussões, por me ajudarem a compreender que para
se trabalhar em ciência é preciso saber lidar muito bem com as frustrações (as dos PCRs azarados)
e principalmente pela amizade.
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Ferramentas para o estudo da expressão de genes de proteínas arabinogalactânicas
em diferentes células e tecidos do pistilo de Arabidopsis thaliana
Sumário
Nas plantas com flor a fecundação requer o transporte dos gâmetas masculinos até aos
óvulos, que surgem profundamente envolvidos pelos tecidos esporofíticos da flor. Este transporte é
feito pelo tubo polínico que responde a sinais de direccionamento e cresce através dos diferentes
tecidos do pistilo até ao saco embrionário, conduzindo à dupla fecundação. As proteínas
arabinogalactânicas (AGPs) são proteínas altamente glicosiladas que poderão estar envolvidas no
direccionamento do tubo polínico até ao saco embrionário. Estudos prévios de imunocitoquímica,
feitos com diferentes espécies de plantas, mostraram que estas proteínas estão presentes nas
células gametofíticas, nas células do tegumento micropilar e nas células do nucelo micropilar. Estas
proteínas são óptimas candidatas a moléculas de atracção para o direccionamento do tubo polínico.
Neste trabalho foram construídas ferramentas moleculares que permitirão identificar os
epítopos destas proteínas previamente localizados por imunocitoquímica no pistilo de Arabidopsis
thaliana, determinando a localização celular das AGPs. Para a selecção das AGPs expressas nos
tecidos femininos foram analisados dados de experiências de microarrays relativos à expressão das
AGPs nas sinergídeas, na célula central e na oosfera. Foram também analisados dados de
microarrays de pólen e gâmetas masculinos. De acordo com o padrão de expressão de cada AGP
nas células gametofíticas masculinas e femininas e atendendo à similaridade entre as diferentes
proteínas, foram seleccionadas 7 AGPs (AGP1, AGP9, AGP10, AGP12, AGP 15, AGP20 e AGP23).
Foram obtidas plantas mutantes que expressam a GFP sob o controlo de sequências promotoras
destas AGPs para 6 das AGPs seleccionadas inicialmente: AGP1, AGP9, AGP10, AGP12, AGP 15 e
AGP23.
Estas ferramentas permitirão confirmar a informação obtida a partir das experiências de
microarrays bem como determinar que AGPs específicas estão presentes ao longo do trajecto
seguido pelo tubo polínico até ao saco embrionário, a nível celular. A partir deste estudo será mais
fácil analisar e determinar com uma maior precisão a função das AGPs presentes nos tecidos
femininos de Arabidopsis thaliana.
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Tools for the localization and characterization of AGP genes in Arabidopsis thaliana
pistil tissues
Abstract
Successful fertilization in flowering plants requires sperm cells guidance into the ovules,
deeply embedded in the female sporophytic tissues. The pollen tube carries the two sperm cells
trough the pistil tissues following guidance cues until it reaches the embryo sac to accomplish
double fertilization. Arabinogalactan proteins (AGPs) are highly glycosilated proteins that might be
related to pollen tube guidance into the embryo sac. Previous immunolocalization studies with
different plant species have shown a specific labelling of AGPs carbohydrate epitopes in the
gametophytic cells, the filiform apparatus of the synergids, the integument micropylar cells and the
micropylar nucellus. These proteins are excellent candidates for chemoattractants that guide pollen
tubes growth.
In this study molecular tools were developed, that will allow the specific identification of these
proteins epitopes previously identified by immunolocalization studies in Arabidopsis thaliana. Data
from microarray experiments using isolated synergids, egg cells and central cells were evaluated in
order to identify AGP genes that have the highest expression levels in these cells. These proteins’
expression was also checked in pollen and sperm cells using microarray data. According to the
expression pattern of individual AGPs in the female and male gametophytic cells, and to their
sequence similarity, 7 AGPs were selected for further analysis (AGP1, AGP9, AGP10, AGP12,
AGP15, AGP20 and AGP23). Arabidopsis transgenic plants were generated that express GFP under
the control of AGP promoter sequences for 6 (AGP1, AGP9, AGP10, AGP12, AGP15 and AGP23) of
the 7 AGPs initially identified.
The analysis of these plants will allow the verification of the data obtained from the microarray
experiments and the identification of the AGPs present along the pollen tube pathway, as well as will
permit the identification of their specific cellular location. The identification of the AGPs present in
the female reproductive tissues is of major importance to initiate future function analysis studies
regarding this large family of proteins.
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Índice
1. Introdução
1
1.1 Dupla fecundação nas plantas com flor
1
1.2. Direccionamento do tubo polínico para o saco embrionário
2
1.3. Pela estrada fora – interacções pólen–pistilo
4
1.4 AGPs – Proteínas Arabinogalactânicas
9
1.5 AGPs – moléculas de sinalização?
11
1.6 AGPs no trajecto do tubo polínico
12
1.7 Objectivos
13
2. Materiais e Métodos
15
2.1 Material vegetal e condições de crescimento
15
2.2 Alinhamento das sequências proteicas
15
2.3 Estirpes bacterianas e vectores
15
2.3.1 Meios e condições de crescimento
16
2.3.2 Preparação de células de E. coli DH5α competentes
16
2.3.3 Transformação de células de E.coli TOP10 e E. coli DH5 α
17
2.3.4 Preparação de células de A. tumefaciens gv3101::pMP90::pSOUP competentes
17
2.3.5 Transformação de A. tumefaciens
18
2.4 Técnicas de manipulação e análise de DNA
18
2.4.1 Extracção de DNA genómico de A. thaliana
18
2.4.2 Electroforese em gel de agarose
19
2.4.3 Reacção da polimerase em cadeia – PCR
19
2.4.4 Extracção de RNA de óvulos de A. thaliana
22
iv
2.4.5 RT-PCR em tempo real
23
2.4.6 Recuperação de DNA a partir de géis de agarose
25
2.4.7 Minipreparação de DNA plasmídico
25
2.4.8 Digestão de DNA plasmídico
25
2.4.9 Sequenciação
25
2.5 Produção de linhas de A. thaliana transgénicas
26
2.5.1 Ligação dos fragmentos amplificados no vector pENTR/D-TOPO
26
2.5.2 Linearização dos vectores de entrada
27
2.5.3 Obtenção das construções pAGP::NLS:3xGFP
27
2.5.4 Transformação de A. thaliana pelo método de “floral dip”
28
3. Resultados
30
3.1 Selecção das AGPs
30
3.2 Análise dos alinhamentos proteicos
30
3.3 Expressão de genes de AGPs nos óvulos
32
3.4 Amplificação dos fragmentos das regiões promotoras
36
3.5 Obtenção dos vectores de entrada pENTR/D-TOPO/pAGP
37
3.6 Obtenção das construções pAGP::NLS:3xGFP
39
4. Discussão
43
4.1 Selecção das AGPs
44
4.2 Obtenção das construções pAGP::NLS:3xGFP
45
4.3 Considerações finais
46
5. Referências Bibliográficas
48
Anexos
53
Anexo I – Representação esquemática das reacções de recombinação BP e LR que
constituem a base da tecnologia gateway
53
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Anexo II – Curvas de dissociação dos genes em estudo nas experiências de RT-PCR em
tempo real
54
Anexo III – Curvas padrão dos genes em estudo nas experiências de RT-PCR em tempo
real para determinação da eficiência das reacções
58
Anexo IV – Representação esquemática do vector pENTR/D-TOPO
64
Anexo V – Resultado da sequenciação das construções obtidas após recombinação com o
vector pENTR/D-TOPO
65
Anexo VI – Resultado da sequenciação das construções obtidas após recombinação do
vector pENTR/D-TOPO, contendo a sequência promotora de cada AGP, com o vector
pNLS3xGFPnost-pGII
79
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1. Introdução
1.1 Dupla fecundação nas plantas com flor
O ciclo de vida das plantas com flor alterna entre um organismo multicelular diplóide, o
esporófito, e um organismo multicelular haplóide, o gametófito. Os gametófitos e os esporófitos
diferem morfologicamente e funcionalmente. Após a meiose o esporófito origina 2 tipos de esporos
sexualmente diferenciados: os microsporos e os megasporos. Estes esporos dividem-se
mitoticamente e desenvolvem-se em gametófitos, cuja principal função é a produção de gâmetas. A
fusão dos gâmetas masculinos e dos gâmetas femininos (oosfera e célula central) estabelece a nova
geração esporofítica, completando assim o ciclo de vida (Drews et al., 1998; Raven et al., 2005).
Uma das características que define o desenvolvimento reprodutivo das Angiospérmicas é
exactamente esta dupla fecundação (Raghavan, 2003). Este é um processo biológico único, pelo
qual um gâmeta masculino se funde com a oosfera para produzir o embrião enquanto o outro
gâmeta se funde com a célula central para formar o endosperma, um tecido nutritivo fundamental
para o desenvolvimento do embrião (Russell, 1992). Esta forma de reprodução foi descrita pela
primeira vez nas Liliáceas Lilium martagon e Fritillaria tenella nos finais do século XIX por S.
Nawaschin em 1898. No ano seguinte L. Guinard confirmou o fenómeno observado por Nawaschin,
de forma independente, em Lilium martagon e Lilium pyrenaicum (Raghavan, 2003).
A dupla fecundação envolve uma série de interacções complexas entre o gametófito
masculino (GM), o esporófito e o gametófito feminino (GF). Os gametófitos feminino e masculino
desempenham um papel fundamental na dupla fecundação (Weterings e Russell, 2004).
O GM maduro, também designado por grão de pólen ou microgametófito, desenvolve-se no
interior do lóculo da antera e é constituído por duas ou três células haplóides: uma célula vegetativa
que transporta no seu interior uma células generativa (grão de pólen bicelular) ou dois gâmetas
masculinos (grão de pólen tricelular) (Lord e Russell, 2002; McCormick, 2004). A célula generativa
sofre uma mitose originando os dois gâmetas masculinos, esta mitose pode em algumas plantas
ocorrer no interior da antera (gramíneas e crucíferas), mas na maioria das plantas ocorre durante o
crescimento do tubo polínico (TP). A célula vegetativa é responsável pela formação do TP e pela
libertação dos dois gâmetas masculinos no GF (McCormick, 1993; McCormick, 2004).
O GF, também designado por saco embrionário ou megagametófito encontra-se
profundamente envolvido pelos tecidos do óvulo, localizado no interior do ovário. Existem cerca de
1
15 padrões diferentes de desenvolvimento do GF, sendo a forma mais comum designada por GF
tipo Polygonum, por ter sido pela primeira vez descrita em Polygonum divaricatum, sendo exibido
por espécies tão importantes como Arabidopsis thaliana ou Zea mays. O desenvolvimento do GF
tipo Polygonum ocorre em duas fases: megasporogénese (formação do megasporo) e
megagametogénese (desenvolvimento do saco embrionário). Na megasporogénese uma célula, o
megasporócito sofre uma meiose originando quatro megasporos haplóides. Os três megasporos
localizados na região do micrópilo sofrem morte celular programada e o megasporo localizado na
região da caláza torna-se o megasporo funcional. Este passa por três ciclos de mitoses originando
uma estrutura cenocítica constituída por oito núcleos. Após a 3ª mitose formam-se paredes
celulares em torno destes núcleos, e ao mesmo tempo um núcleo de cada pólo (os núcleos polares)
migra em direcção ao centro do GF e fundem-se antes ou durante a fecundação originando o núcleo
da célula central. Após todos estes eventos o GF maduro do tipo Polygonum é constituído por sete
células: três antípodas na região da caláza, uma célula central grande a ocupar toda a região central
do saco embrionário, duas sinergídeas e uma oosfera na região do micrópilo (Huang e Russell,
1992; Drews et al., 1998; Yadegari e Drews, 2004).
Todos os processos relacionados com a dupla fecundação ocorrem de forma coordenada
conduzindo ao desenvolvimento da semente. Estes processos podem ser organizados por ordem
temporal: atracção e crescimento do TP, libertação dos dois gâmetas masculinos numa sinergídea
degenerada, migração dos gâmetas masculinos até aos gâmetas femininos, reconhecimento e
fusão dos gâmetas, fusão do material genético parental durante a cariogamia e a reiniciação do
ciclo celular, transcrição e tradução conduzindo à formação e crescimento do zigoto (Berger, 2008;
Berger et al., 2008). O primeiro passo, de atracção e crescimento do TP, é um dos mais estudados
actualmente, embora ainda pouco se saiba sobre como ocorre este direccionamento do TP para o
saco embrionário.
1.2. Direccionamento do tubo polínico para o saco embrionário
O direccionamento do TP para o saco embrionário precede a dupla fecundação, sendo uma
etapa crítica para a sua ocorrência. Durante este direccionamento o TP atravessa diferentes tecidos
do pistilo (Figura 1.1a) (Johnson e Preuss, 2002). Após a adesão do grão de pólen à superfície
estigmática e sua posterior hidratação (Lord e Russell, 2002), o TP emerge e inicia o seu
crescimento através dos espaços intercelulares das células do estigma até atingir o tecido de
2
transmissão (Hülskamp et al., 1995; Johnson e Preuss, 2002; Lord e Russell, 2002). O tecido de
transmissão é um tecido especializado que faz a ligação entre o estigma, o estilete e os óvulos
suportando o crescimento do TP através de uma matriz extracelular até ao saco embrionário
(Hülskamp et al., 1995; Lennon et al., 1998; Lord, 2000).
Figura 1.1 – Representação esquemática da dupla fecundação. a) Germinação do TP à superfície do estigma e seu
crescimento ao longo do estilete e tecido de transmissão até atingir o GF. b) Entrada do TP no GF através da região
micropilar onde ocorrem interacções (setas vermelhas) entre o TP e as sinergídeas para atrair o TP até ao local de
entrada no saco embrionário. c) Libertação dos gâmetas masculinos na sinergídea receptiva, migração dos gâmetas e
fusão dos gâmetas masculinos com a oosfera e com a célula central. pe: papilas estigmáticas, e: estilete, tt: tecido de
transmissão (Adaptado a partir de Berger et al., 2008)
Em muitas espécies, como em A. thaliana, o tecido de transmissão prolonga-se através do
septo que divide o ovário em 2 compartimentos. Consequentemente nestas espécies, o TP tem de
atravessar a camada de células da placenta que envolve o tecido de transmissão, e crescer à
superfície do septo até atingir o funículo. Na região funicular o TP direcciona o seu crescimento para
a região micropilar do óvulo, crescendo à superfície das células do funiculo até entrar pelo micrópilo
e atingir o saco embrionário (Johnson e Preuss, 2002; Yadegari e Drews, 2004). Normalmente,
apenas um TP cresce em direcção a cada saco embrionário (Kandasamy et al., 1994). Uma vez na
região micropilar o TP entra no GF, mais especificamente numa das sinergídeas, entrando junto ao
aparelho filiforme (estrutura constituída por expansões da parede celular) num local de menor
resistência, rompe e aí liberta o seu conteúdo (Figura 1.1b e 1.1c). Esta sinergídea sofre morte
celular programada pouco antes da entrada do TP ou mesmo aquando a sua entrada (Faure et al.,
2002). Forma-se então uma pequena abertura na extremidade do TP ou na sua proximidade, e o
seu conteúdo é libertado para o interior do citoplasma da sinergídea degenerada de uma forma
mais ou menos explosiva (Russell, 1992). Daqui, os gâmetas masculinos migram de forma a
ocorrer fusão de um deles com a célula central, e do outro com a oosfera (Figura 1.1c), iniciando
3
assim o desenvolvimento do endosperma e do zigoto, respectivamente (Johnson e Preuss, 2002;
Weterings e Russell, 2004; Yadegari e Drews, 2004).
Todo o trajecto seguido pelo TP desde do estigma até ao saco embrionário é suportado por
uma rede molecular complexa responsável pela adesão e atracção do TP até ao seu alvo final, o
saco embrionário. Muitos destes mecanismos moleculares têm sido desvendados ao longo da
última década, permanecendo ainda várias questões por explicar (Higashiyama e Hamamura,
2008). A maioria das questões que permanece por responder diz respeito às moléculas
responsáveis pela comunicação entre o GF e o GM na região funicular e micropilar, bem como a
comunicação com os tecidos esporofíticos envolventes.
1.3. Pela estrada fora – interacções pólen–pistilo
De uma forma geral, e de acordo com os mecanismos moleculares que regulam o
crescimento e a atracção do TP, todo o processo de direccionamento do TP pode ser dividido em
duas fases: uma fase esporofítica, em que ocorre crescimento do TP inicialmente à superfície das
papilas estigmáticas e, posteriormente, crescimento intercelular ao longo do estilete, de um modo
independente do GF, e uma fase gametofítica, dependente de sinais produzidos pelo GF para
conduzir o TP até ao saco embrionário (Ray et al., 1997; Higashiyama et al., 2003).
Os dois gâmetas masculinos têm de ser transportados desde o estigma até ao saco
embrionário, que se encontra profundamente envolvido pelo nucelo e pelos tegumentos interno e
externo do óvulo, o qual, por sua vez, se encontra rodeado pelo tecido da placenta no interior do
ovário (Weterings e Russell, 2004). O TP cresce através dos diferentes tecidos do pistilo sem nunca
perder a orientação do seu crescimento e atingindo a região micropilar do saco embrionário de
forma bastante precisa (Higashyiama e Hamamura, 2008). Todo o processo de direccionamento do
TP é controlado por múltiplas interacções celulares que envolvem vários mecanismos de sinalização
quer para o reconhecimento do grão de pólen pelos tecidos da flor quer para o direccionamento do
crescimento do TP no interior do pistilo até ao GF (Sanchez et al., 2004; Dresselhaus, 2006). Estes
mecanismos têm sido, nos últimos anos, dos principais processos estudados no que diz respeito à
reprodução nas plantas com flor.
Foram estudadas mutações em Arabidopsis em que o saco embrionário e o tecido
esporofítico são afectados (bell, bel1 e short integuments1, sin1) e mutações que afectam apenas o
saco embrionário (54D12 e 47H4), verificando-se que todas estas mutações impedem o correcto
4
direccionamento do tubo polínico até ao óvulo, não afectando, no entanto, a fase anterior de
crescimento do tubo polínico, até à superfície da placenta, a fase esporofítica. Em todos estes
mutantes, após crescimento dos TPs no septo, estes não cresciam mais através do funículo em
direcção ao micrópilo do óvulo, crescendo ao acaso sobre qualquer superfície, como por exemplo as
paredes externas dos óvulos. Estes estudos indicam que diferentes sinais controlam a migração dos
tubos polínicos através do tecido de transmissão e a sua emergência deste tecido em direcção aos
óvulos (Hülskamp et al., 1995). Estudos semi in-vitro efectuados em Torenia fournieri utilizando
estiletes polinizados cortados e co-cultivados com óvulos, permitiram verificar que, quando alguns
dos óvulos eram danificados pelo calor, os tubos eram atraídos para outros óvulos viáveis
(Higashiyama et al., 1998). Neste estudo foram também feitas experiências apenas com TPs cocultivados com óvulos, verificando-se que os TPs apenas se direccionam para os óvulos quando
atravessam o estigma e o estilete. Isto demonstra a importância da passagem do TP por estes
tecidos de modo a adquirir competência para depois responder aos sinais de direccionamento para
o GF. Este estudo sugere que o GF não é necessário para o direccionamento do TP desde o estigma
até à base do estilete.
Assume-se que existem moléculas responsáveis pela atracção e crescimento do TP em todo o
seu trajecto até ao saco embrionário, tendo sido efectuados vários estudos para identificar estas
moléculas (Higashiyama e Hamamura, 2008). Inicialmente o direccionamento é controlado apenas
pelo tecido esporofítico do pistilo, sinais moleculares presentes no estigma e no estilete serão os
responsáveis por este direccionamento (McCormick e Yang, 2005).
Em Nicotiana tabacum certas proteínas arabinogalactânicas (AGPs) TTS (transmitting tissue-
specific), presentes na matriz extracelular do tecido de transmissão, foram relacionadas com o
direccionamento do tubo polínico para os óvulos. Estas proteínas estimulam o crescimento do tubo
polínico in vitro, atraem os tubos polínicos em sistemas de cultura semi-in vivo e são necessárias
para o crescimento óptimo do tubo polínico in vivo, funcionando como uma fonte de nutrientes e
moléculas de adesão para os tubos polínicos em crescimento (Cheung et al. 1995; Wu et al.,
2001). Outro estudo feito com Arabidopsis mostra que em mutantes no transmitting tract (ntt) que
apresentam um desenvolvimento anormal do tecido de trasmissão, este tecido é fundamental para
estimular o crescimento do TP. Os TP neste pistilo mutante crescem menos e mais devagar do que
nos pistilos da variedade selvagem, apresentando a planta mutante uma taxa de fecundação muito
reduzida (Crawford et al., 2007). Estes estudos comprovam que o tecido de transmissão é
fundamental para um rápido crescimento do TP ao longo do pistilo.
5
O GABA (ácido γ-aminobutírico) foi identificado como possível molécula de atracção produzida
pelos tecidos esporofíticos do pistilo de Arabidopsis. Esta molécula apresenta um gradiente de
concentração ao longo destes tecidos, com concentrações mais baixas no estigma e concentrações
mais elevadas no tegumento interno dos óvulos (Palanivelu et al., 2003). No mesmo estudo foi
verificado que o gene POP2 (pollen-pistil interaction) codifica uma transaminase que degrada o
GABA, contribuindo para o estabelecimento do gradiente de concentração desde o estigma até aos
tegumentos do óvulo. No entanto, a actividade do GABA como molécula de atracção do tubo
polínico nunca foi reproduzida in vitro, sugerindo que outras moléculas serão necessárias para
actuar em conjunto com o GABA. Na verdade, pensa-se que exista não uma molécula sinal, mas
sim várias moléculas componentes de um sistema de sinalização bastante complexo (McCormick e
Yang, 2005). Outras moléculas de atracção produzidas pelos tecidos esporofítico têm sido
descobertas tais como a quimiocianina, uma pequena proteína produzida pelos estigmas de Lilium
longiflorum (Kim et al., 2003). Glicoproteínas ricas em hidroxiprolina (HRGPs – hidroxyproline rich
glycoproteins) como as proteínas arabinogalactânicas (AGPs – arabinogalactan proteins) presentes
no pistilo foram também relacionadas com o processo de direccionamento do tubo polínico até ao
GF (Sanchez et al., 2004).
Nos estudos efectuados por Hülskamp (1995), referidos acima, os TPs não crescem em
direcção ao saco embrionário nos mutantes sin1 e 47H4, em que não se desenvolve saco
embrionário, indicando que o gametófito feminino poderá ser a fonte do sinal de atracção
responsável pelo seu direccionamento. Estudos efectuados com os mutantes magatama (maa1 e
maa3) de A. thaliana que apresentam um atraso no desenvolvimento do GF, mostram que os TPs
são direccionados para o GF, mas perdem a sua orientação imediatamente antes de entrarem no
micrópilo (Shimizu e Okada, 2000). Estes trabalhos mostram que a fase gametofítica, última fase
de direccionamento do TP, pode ser dividida em duas fases: uma fase de direccionamento funicular
e uma fase de direccionamento micropilar (Figura 1.2) (Shimizu e Okada, 2000; Higashiyama e
Hamamura, 2008).
O mecanismo de direccionamento funicular não é ainda conhecido, algumas moléculas de
atracção poderão ser libertadas directamente pelo GF maduro ou em desenvolvimento ou um sinal
do GF poderá conduzir, indirectamente, à produção de um sinal de atracção pelas células dos
tecidos esporofíticos do óvulo (Higashiyama e Hamamura, 2008).
Estes estudos não permitem relacionar estruturas específicas do saco embrionário com esta
capacidade de atracção. Mostram apenas que, durante o desenvolvimento do saco embrionário,
6
este adquire a competência para atrair o TP, sendo por isso provavelmente a fonte do sinal de
atracção para o TP.
Figura 1.2 – Fase gametofítica de direccionamento do TP em A. thaliana. As linhas azuis representam TPs a crescer a
partir dos grãos de pólen em direcção ao GF. Nas regiões rodeados por círculos a tracejado alguns TPs perdem a sua
orientação quando o GF não apresenta um desenvolvimento correcto, sugerindo que existem sinais produzidos pelo GF
responsáveis pelo direccionamento do TP nesta região. Nesta fase o direccionamento pode ser dividido numa fase
funicular e numa fase micropilar. GM: gametófito masculino, GF: fametófito feminino. (Adaptado a partir de Higashiyama
et. al., 2003).
Higashiyama e colaboradores (1998) fizeram estudos em Torenia fournieri, sugerindo que as
sinergídeas são as células responsáveis por esta atracção. Na maioria das espécies, o saco
embrionário está envolvido por várias camadas de tecido esporofítico, o que não facilita o acesso ao
saco embrionário, no entanto, Torenia apresenta um saco embrionário nu, que quando maduro, é
projectado para o exterior do óvulo através do micrópilo, permitindo assim o fácil acesso às células
do saco embrionário. Num sistema in vitro, estes autores observaram o crescimento dos TPs em
direcção a ovários dissecados, verificando que os tubos polínicos são atraídos directamente para o
saco embrionário nu, sendo que, uma vez atraídos, não mais abandonam a região micropilar do
saco embrionário. Verificaram ainda que, quando alguns dos óvulos eram danificados pelo calor, os
tubos eram atraídos para outros gametófitos femininos viáveis. Estes resultados sugerem
fortemente que o saco embrionário produz sinais de atracção para o TP. Seguidamente, os mesmos
autores (Higashiyama et al., 2001) efectuaram trabalhos de ablação com laser das diferentes
células gametofíticas, para determinar quais as células que poderiam produzir estes sinais,
7
verificando que a ablação da célula central e da oosfera não afectava o direccionamento normal do
TP, mas que a ablação das sinergídeas alterava este direccionamento. Quando as duas sinergídeas
eram eliminadas, nenhum saco embrionário atraía tubos polínicos. Se apenas uma sinergídea era
eliminada, a atracção diminuía mas não cessava, sugerindo que as duas sinergídeas são capazes
de atrair o TP e que uma sinergídea é suficiente para gerar um sinal de atracção, embora este seja
mais forte quando as duas células estão presentes. As sinergídeas foram assim identificadas como
sendo a fonte do sinal de atracção a curta distância para os tubos polínicos. O mesmo foi provado
em A. thaliana mas utilizando uma abordagem diferente. Kasahara e colaboradores (2005)
efectuaram estudos com o gene MYB98, que no óvulo é expresso exclusivamente nas sinergídeas.
O mutante myb98 apresenta um GF e sinergídeas aparentemente normais, no entanto, a estrutura
do aparelho filiforme é anormal, não possuindo as expansões da parede celular típicas desta
estrutura. Neste mutante os TPs crescem desde a placenta até ao funículo mas não daqui até ao
micrópilo. Tal como na Torenia fournieri em Arabidopsis o direccionamento micropilar do TP parece
ser controlado pelas sinegídeas (Kasahara et al., 2005; Punwani e Drews, 2008).
Até à data, os processos moleculares que regulam o desenvolvimento e as funções das
sinergídeas, tais como os sinais de atracção e factores que controlam o direccionamento do tubo
polínico até ao saco embrionário, e a libertação dos gâmetas nas sinergídeas, não são ainda
conhecidos (Punwani e Drews, 2008).
Uma das questões fundamentais acerca da reprodução nas plantas com flor é determinar
qual a base molecular para o direccionamento do tubo polínico até ao saco embrionário.
Recentemente Márton e colaboradores (2005) identificaram uma pequena proteína em Zea mays, a
ZmEA1 (Zea mays EGG APPARATUS1), produzida pelas sinergídeas e pela oosfera, necessária para
a atracção do tubo polínico até ao gametófito feminino. O gene ZmEA1 é expresso exclusivamente
nestas células antes da fecundação, após a qual a sua expressão diminui progressivamente até
desaparecer por completo nos embriões mais desenvolvidos, já com 10 dias. Esta proteína possui
um domínio transmembranar, e para determinar a sua localização foi utilizada uma proteína de
fusão ZmEA1:GFP C-terminal, observando-se expressão da ZmEA1 não só nas sinergídeas e oosfera
mas também no aparelho filiforme e nas células do nucelo micropilar, sugerindo estes resultados
que a região C-terminal do domínio transmembranar da proteína é clivada para funcionar como
molécula sinal nos tecidos circundantes. A ZmEA1 é uma proteína candidata para o sinal de
atracção produzido pelas sinergídeas em Zea mays.
8
Recentemente Okuda e colaboradores (2009) identificaram em Torenia fournieri polipéptdos
ricos em cisteína (CRPs - cysteine-rich polypeptides) pertencentes a um sub-grupo das proteínas tipo
defensinas: LURES, como moléculas de atracção produzidas pelas sinegídeas. Neste estudo foram
isoladas sinergídeas de T. fornieri e identificados transcritos que codificam proteínas candidatas a
moléculas de atracção. Foram encontradas duas CRPs abundantemente expressas nas sinergídeas,
e que são secretadas para a superfície do aparelho filiforme. Verificaram também que estas
moléculas são capazes de atrair TPs in vitro. Foi ainda demonstrado pela utilização de oligomeros
antisense para os LUREs que quando estes oligomeros são injectados no GF há uma diminuição da
atracção dos TPs para o GF. Este estudo sugere fortemente que as LUREs são as moléculas de
atracção produzidas pelas sinergídeas em T. fornieri.
Não se sabe no entanto, se existe apenas uma molécula de atracção produzida pelas
sinergídeas ou várias moléculas que poderão funcionar de forma redundante ou em conjunto
(Higashiyama e Hamamura, 2008). Será mais provável que existam várias moléculas, ou uma
complexa rede de sinalização uma vez que não há nenhum estudo em que a mutação de um gene
ou diminuição da sua expressão tenha conduzido a um bloqueio total do crescimento dos TPs para
o saco embrionário.
Até à data, nenhuma molécula sinal para o direccionamento do TP foi ainda identificada em
A. thaliana. Vários estudos apontam as proteínas arabinogalactânicas (AGPs) como candidatas a
moléculas de sinalização para o direccionamento do tubo polínico até ao saco embrionário (Coimbra
et al., 2007).
1.4 AGPs – Proteínas Arabinogalactânicas
As AGPs encontram-se amplamente distribuídas no reino das plantas, desde as Briófitas até
às Angiospérmicas, sendo particularmente abundantes nas paredes celulares, membranas
plasmáticas e secreções extracelulares (Majewska-Sawka e Nothnagel, 2000). As AGPs são uma
classe de glicoproteínas ricas em hidroxiprolina e altamente glicosiladas, estruturalmente bastante
complexas (Showalter, 2001; Johnson et al., 2003). Foram já identificados, em Arabidopsis, 47
genes que codificam as estruturas proteicas de AGPs (Schultz et al., 2000, 2002). Em Arabidopsis,
as AGPs podem ser divididas em 4 sub-famílias, de acordo com as características do seu núcleo
proteico: as AGPs clássicas, os péptidos AG, as AGPs ricas em lisina e as AGPs tipo fasciclina, FLAs
(fasciclin-like AGPs) (Johnson et al., 2003; Sun et al., 2005). As AGPs clássicas são constituídas por
9
um núcleo proteico rico em Pro, Ala, Ser e Thr, possuem uma sequência N-terminal, que é
removida da proteína madura, um domínio rico em resíduos de Prolina/Hidroxiprolina e um domínio
hidrofóbico
C-terminal
contendo
uma
sequência
sinal
para
uma
âncora
lipídica
glicosilfosfotidilinositol (GPI). Os péptidos AG possuem um núcleo proteico curto, com cerca de 10 a
15 resíduos de aminoácidos. As AGPs ricas em lisina apresentam um pequeno domínio rico em
lisina, e as FLAs são AGPs que possuem um ou dois domínios de fasciclina, podendo ou não
apresentar uma âncora GPI (Schultz et al., 2000, 2002; Sun et al., 2005; Seifert e Roberts, 2007).
Figura 1.3 – Representação esquemática da estrutura das AGPs. a) AGPs clássicas. b) AGPs ricas em lisina. c)
Péptidos AG. d) FLAs. Lys: domínio rico em lisina.
Diversos estudos mostram que as AGPs desempenham funções importantes em diferentes
aspectos do desenvolvimento e crescimento das plantas. Estão envolvidas na proliferação celular,
na expansão celular, na diferenciação celular, no reconhecimento entre células, na embriogénese
somática, no crescimento do tubo polínico e na morte celular programada (Majewska-Sawka e
Nothnagel, 2000).
As AGPs podem ser localizadas nos tecidos e células através da utilização de anticorpos
monoclonais específicos (MAbs) que se ligam a epítopos de carbohidratos estruturalmente
complexos, típicos destas glicoproteínas (Knox, 1997). O uso extensivo dos MAbs anti-AGPs pela
10
comunidade científica mostra que as AGPs são alvo de uma regulação muito refinada e são
diferencialmente expressas durante o desenvolvimento da planta, mais precisamente durante a fase
de reprodução sexuada da planta (Coimbra e Salema, 1997; Coimbra e Duarte, 2003; Pereira et
al., 2006; Coimbra et al., 2007)
No entanto, os resultados obtidos recorrendo à utilização de MAbs dirigidos para a porção
glicosídica destas proteínas, identifica grupos de AGPs com o mesmo tipo de epítopos glicosídicos,
não permitindo identificar quais as AGPs específicas que se encontram presentes num determinado
tecido.
1.5 AGPs – moléculas de sinalização?
As AGPs foram sempre consideradas fortes candidatas a mediadoras de interacções celulares
e reguladoras do crescimento celular. No entanto, o mecanismo exacto, através do qual as AGPs
poderão mediar a sinalização entre células, permanece ainda desconhecido. Um possível
mecanismo que pode explicar o funcionamento das AGPs como moléculas de sinalização poderá
estar associado à clivagem da âncora GPI.
Pensa-se que a maioria das AGPs estejam ancoradas à membrana plasmática por âncoras
lipídicas glicosilfosfatidilinositol (GPI) (Borner et al., 2002; Schultz et al., 2004). A presença desta
âncora proporciona um potencial mecanismo pelo qual as AGPs poderão estar envolvidas em
processos de sinalização e atracção polarizada, muito importante para muitas das funções
sugeridas para estas proteínas (Gaspar et al., 2001). Esta âncora poderá fornecer um mecanismo
de libertação das AGPs a partir da membrana citoplasmática, eventualmente por acção de enzimas
como as fosfolipases (C ou D), para o meio extracelular (Gaspar et al., 2001; Showalter, 2001).
Para além desta hipótese, vários outros modelos existem para explicar a possível função das AGPs
como moléculas sinal. Num outro modelo, o facto de as AGPs serem proteínas muito ricas em
carbohidratos e de muitos açúcares estarem envolvidos em diversas vias de transdução de sinal nas
plantas, sugere que as AGPs poderão ser processadas enzimaticamente para libertar
oligossacarídeos que funcionarão como sinais, que se ligam a receptores da membrana
citoplasmática relacionados com um sistema de transducção de sinal (Showalter, 2001). No
entanto, estudos mais aprofundados são necessários para compreender melhor como poderão
estas moléculas funcionar como sinais nas complexas interacções celulares. Em 2006, Lamport e
colaboradores propuseram um modelo para explicar o fluxo dinâmico de AGPs, em que a âncora
11
GPI seria clivada, permitindo que as AGPs passassem da membrana plasmática para o espaço
periplasmático, deste espaço para a parede celular e, por fim, para o espaço extracelular.
1.6 AGPs no trajecto do tubo polínico
Vários estudos identificam e sugerem o envolvimento de AGPs específicas na reprodução
sexuada das plantas. Estudos recentes de Acosta-García e Vielle-Calzada (2004) revelaram que uma
AGP clássica, a AGP18, é essencial para a iniciação da gametogénese feminina em A. thaliana. A
AGP18 é expressa não só nas células do tecido reprodutor feminino (célula mãe do megásporo,
células do nucelo adjacente, megásporo funcional e gametófito feminino), mas também no embrião
em desenvolvimento e no grão de pólen maduro. Em mutantes AGP18-RNAi, não ocorre
crescimento nem divisão mitótica do megásporo, não havendo formação do gametófito feminino,
indicando que esta AGP é fundamental para a iniciação da gametogénese feminina.
Estudos de RT-PCR mostraram que os genes de duas outras AGPs clássicas, AGP6 e AGP11,
são expressos especificamente nos grãos de pólen e tubos polínicos (Pereira et al., 2006), tendo
sido posteriormente verificado que de facto estão envolvidas no desenvolvimento do grão de pólen
(Coimbra et al., 2009) e no crescimento do tubo polínico em A. thaliana (Coimbra et al., 2009).
Em Nicotiana tabacum foram identificadas AGPs específicas do tecido de transmissão, as
proteínas TTS (transmitting tissue-specific), e relacionadas com o direccionamento do tubo polínico
para os óvulos. Este estudo mostrou que estas proteínas estimulam o crescimento do tubo polínico
in vitro, atraem os tubos polínicos em sistemas de cultura semi-in vivo e são necessárias para o
crescimento óptimo do tubo polínico in vivo, funcionando como uma fonte de nutrientes e moléculas
de adesão para os tubos polínicos em crescimento (Cheung et al., 1995).
Recentemente, Coimbra e colaboradores (2007), mostraram que as AGPs funcionam também
como marcadores moleculares durante o desenvolvimento do pistilo de Arabidopsis. A marcação
para estas proteínas surge nas células da região central do estigma e do tecido de transmissão do
estilete, ou seja, no trajecto seguido pelo tubo polínico na fase inicial do seu crescimento. O mesmo
tipo de marcação tinha sido anteriormente observado noutras espécies como Amaranthus
hypocondriacus (L.), Actinidia deliciosa (A. Chev.) (Coimbra e Duarte, 2003), Nicotiana alata (Wu et
al., 2001) e Nicotiana tabacum (Cheung et al., 1995). Ainda no mesmo estudo, Coimbra e
colaboradores (2007) observaram a presença selectiva e extremamente específica de epítopos de
AGPs nas células gametofíticas, nas células do tegumento micropilar, do nucelo micropilar e do
12
aparelho filiforme de Arabidopsis. Outros trabalhos de imunolocalização de AGPs realizados
anteriormente em A. hypochondriacus (Coimbra e Salema, 1997) e A. deliciosa (Coimbra e Duarte,
2003) revelaram um padrão de marcação dos epítopos das AGPs semelhante, ou seja, um padrão
de marcação que corresponde precisamente ao trajecto seguido pelo tubo polínico, na fase final do
seu processo de direccionamento até atingir o saco embrionário. Estes dados sugerem o possível
envolvimento das AGPs no processo de atracção e direccionamento do tubo polínico.
Em 2001, Higashiama e colaboradores identificaram as sinergídeas como fonte de moléculas
de atracção para o tubo polínico, mas nenhum estudo, até agora, identificou a natureza bioquímica
desta molécula de atracção em A. thaliana. Os resultados obtidos em Arabidospsis e noutras
espécies, e a possível função das AGPs como moléculas sinal, permitem levantar a hipótese do seu
envolvimento no processo de direccionamento do tubo polínico até ao saco embrionário. A forte
marcação, muito específica, com MAbs, da parede do saco embrionário e das sinergídeas, mais
precisamente do aparelho filiforme, é uma forte indicação de que as AGPs poderão ter alguma
função relacionada com as secreções destas células, através do micrópilo. A marcação dos
tegumentos que envolvem o micrópilo sugere que estas moléculas, ou os resíduos de açúcares por
elas libertados, poderão estar relacionados com o fenómeno de atracção do tubo polínico em
crescimento até ao saco embrionário. O mecanismo molecular de acção das AGPs é ainda
desconhecido, principalmente devido às dificuldades impostas pela estrutura bastante complexa
destas glicoproteínas. Mas, por outro lado, a estrutura complexa da sua porção glicosídica torna as
AGPs uma potencial fonte de pequenas moléculas de sinalização, como oligossacarídeos
biologicamente activos (Coimbra et al., 2007).
Será de enorme interesse determinar que sinais são percepcionados pelo tubo polínico
durante o seu direccionamento até ao saco embrionário, bem como determinar se estes sinais são
específicos para as diferentes espécies, e determinar se as AGPs ou fragmentos de AGPs estarão
entre os sinais responsáveis por este direccionamento, conforme os dados de imunocitoquímica
sugerem.
1.7 Objectivos
O objectivo central do presente trabalho é produzir ferramentas que permitam identificar os
genes de AGPs de A. thaliana que podem estar envolvidos nos mecanismos de sinalização que
13
ocorrem durante o processo de dupla fecundação, mais precisamente durante o direccionamento
do tubo polínico para o saco embrionário. Para tal:
(i) seleccionar-se-ão as AGPs expressas nos tecidos femininos por análise de dados de
experiências de microarrays relativos à expressão das AGPs nos carpelos, nas sinergídeas, na célula
central, na oosfera, no pólen e em gâmetas masculinos e atendendo-se à similaridade entre as
diferentes proteínas;
(ii) isolar-se-ão sequências da região promotora de 7 genes de AGPs previamente
seleccionadas em (i) (AGP1, AGP9, AGP10, AGP12, AGP 15, AGP20 e AGP23) e estas serão usadas
para a obtenção de construções com GFP;
(iii) por último, plantas que expressam a GFP sob o controlo de sequências dos promotores
endógenos das AGPs seleccionadas serão obtidas para futura localização destas proteínas nos
tecidos do pistilo.
14
2. Materiais e métodos
2.1 Material vegetal e condições de crescimento
Foram usadas plantas de Arabidopsis thaliana (L.) variedade selvagem (ecótipo Columbia 0
[Col 0]) (NASC, The European Arabidopsis Stock Center). As sementes foram colocadas
directamente em vasos com terra. Estes permaneceram na obscuridade, a 4ºC durante 3 dias, após
os quais foram transferidos para uma câmara de crescimento com um fotoperíodo de dias curtos
(9h de luz, 22ºC, 70% humidade relativa). Após 3 a 4 semanas, as plantas foram transferidas para
um fotoperíodo de dias longos (16h de luz, 22ºC, 70% humidade relativa).
2.2 Alinhamento de sequências proteicas
Todas as sequências proteicas foram obtidas a partir do NCBI (National Center for
Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Foi feito o alinhamento múltiplo das
sequências proteicas das diferentes AGPs de Arabidopsis thaliana, e obteve-se uma àrvore
filogenética
utilizando
o
T-Coffee
(http://www.igs.cnrs-mrs.fr/Tcoffee/tcoffee_cgi/index.cgi,
Notredame et al., 2000). Os alinhamentos daqui resultantes foram tratados utilizando o software
GeneDoc, versão 2.6 (http://www.nrbsc.org/downloads, Nicholas et al., 1997). A árvore filogenética
obtida
no
T-Coffe
foi
desenhada
utilizando
o
software
TreeView,
versão
1.4
(http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html, Page, 1996).
2.3 Estirpes bacterianas e vectores
Neste estudo foram utilizadas as seguintes estirpes bacterianas: Escherichia coli estirpe
DH5α (Hanahan, 1983), Escherichia coli estirpe TOP10 (Invitrogen) e Agrobacterium tumefaciens
estirpe GV3101::pMP90::pSOUP (Koncz e Shell, 1986), e os seguintes vectores: pENTR/D-TOPO
(Invitrogen) e pNLS3xGFPnost-pGII (Shinobu Takada, Universidade de Tübingen, modificado por
Milly Ron, Universidade da California, Berkeley).
15
2.3.1 Meios e condições de crescimento
Para as culturas de células de E. coli foi utilizado o meio de Luria Bertani (LB) (bacto-triptona
1% [p/v], extracto de levedura 0,5% [p/v] e NaCl 1% [p/v] para os meios líquidos e com agar 1,5 %
[p/v] para os meios sólidos). Todas as culturas de E. coli foram incubadas a 37ºC, durante 12 - 16
h . Para as culturas de células de A. tumefaciens foi utilizado o meio YEP (bacto-peptona 1% [p/v],
extracto de levedura 1% e NaCl 0,5% [p/v] para os meios líquidos e com agar 1,5 % [p/v] para os
meios sólidos). Todas as culturas de A. tumefaciens foram incubadas a 28ºC, durante 2 dias. Todos
os meios de cultura foram esterilizados durante 20 min a 120ºC num autoclave. Os meios sólidos
foram armazenados a 4ºC e os meios líquidos à temperatura ambiente. Em todos os meios
suplementados com antibióticos, estes foram adicionados após esterilização do meio, e estes
conservados a 4ºC. Para a conservação das bactérias contendo os plasmídeos de interesse, as
culturas bacterianas foram armazenadas em stocks de glicerol 40% a -80ºC.
2.3.2 Preparação de células de E. coli DH5α competentes
Para a preparação de células de E. coli DH5α competentes foi utilizado um método descrito
por Inoue et al. (1990), com pequenas alterações. Foi inoculada uma colónia isolada de E. coli em
5 mL de meio LB líquido e esta cultura foi incubada a 37ºC, com agitação a 250 rpm, durante 12 16 h. Esta cultura foi adicionada a 250 mL de SOB (triptona 2% [p/v], extracto de levedura 0,5%
[p/v], NaCl 10mM e KCl 2,5 mM aos quais foram adicionados, após esterilização, 20 mL de SOC
50x [glucose 1M, MgCl2 0,5 M e MgSO4 0,5 M]) e foi incubada a 18ºC, com agitação a 250 rpm, até
que o valor de absorvância a 600 nm estivesse próximo de 0,6. Atingido este valor de absorvância a
cultura foi arrefecida em gelo, com agitação durante 10 min. A partir deste ponto todos os passos
seguintes foram efectuados em gelo. As células foram depois recolhidas por centrifugação a 3000
rpm (SORVALL Evolution, rotor SLA-1500) durante 15 min a 4ºC. O sobrenadante foi removido e o
sedimento ressuspendido em 80 mL de tampão TB a 4ºC (PIPES 10 mM, MnCl2 55 mM, CaCl2 15
mM e KCl 250 mM, pH 6,7 com KOH, armazenado a 4ºC). Esta suspensão celular foi mantida em
gelo durante 10 min após os quais foi centrifugada a 3000 rpm durante 15 min a 4ºC. As células
foram ressuspendidas em 20 mL de tampão TB a 4ºC suplementado com DMSO a uma
16
concentração final de 7% (v/v). As células foram divididas por alíquotas de 150 µL, congeladas
imediatamente em azoto líquido e armazenadas a -80ºC.
2.3.3 Transformação de células de E.coli TOP10 e E.coli DH5α
A transformação de células de E. coli foi efectuada utilizando o método de choque térmico.
As células de E. coli foram descongeladas em gelo e foram adicionados 10 – 100 ng de DNA (1 - 5
µL) a uma alíquota de E. coli One Shot TOP10 (Invitrogen) ou a 150 µL de células de E. coli DH5α
competentes. Estas foram incubadas em gelo durante 30 min. De seguida foi provocado um choque
térmico transferindo as células rapidamente para um banho a 42ºC durante 30 segundos. Após o
choque térmico as células foram mantidas durante 5 minutos em gelo. Foram depois adicionados
250 µL de SOC (Invitrogen) e incubados a 37ºC durante 1 h com agitação a 150 – 200 rpm. As
células foram depois espalhadas em placas com meio LB sólido suplementado com canamicina 50
µg/mL e incubadas a 37ºC, durante 12 - 16 h.
2.3.4 Preparação de células de A. tumefaciens gv3101::pMP90::pSOUP competentes
Para a preparação de células de A. tumefaciens competentes foi inoculada uma colónia de A.
tumefaciens isolada em 5 mL de meio YEP líquido suplementado com rifampicina 50 µg/mL
(resistência cromossómica), gentamicina 25 µg/mL (resistência do plasmídeo Ti) e tetraciclina 2
µg/mL (resistência do pSOUP) e incubada a 28ºC durante 2 dias, com agitação a 150 rpm. Estes 5
mL foram inoculados em 200 mL de meio YEP líquido suplementado com rifampicina 10 µg/mL,
gentamicina 15 µg/mL e tetraciclina 2 µg/mL e incubados a 28ºC com agitação a 150 rpm até que
a absorvância a 600 nm se encontrasse entre 0,5 – 1. Após atingir a absorvância desejada a
cultura foi arrefecida em gelo durante 10 min. Esta cultura foi depois centrifugada a 5300 rpm
(rotor SLA 1500, SORVALL Evolution), durante 20 min a 4ºC. A partir deste passo as células foram
mantidas sempre em gelo. O sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspendidas em
200 mL de tampão TE (Tris-HCl 100mM e EDTA 10 mM, pH8), previamente arrefecido a 4ºC. As
células foram novamente centrifugadas a 5300 rpm (rotor SLA 1500, SORVALL Evolution), durante
20 min a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e as células ressuspendidas em 15 mL de meio LB.
17
Estas foram divididas por alíquotas de 200 µL, congeladas imediatamente em azoto líquido e
posteriormente armazenadas a -80ºC.
2.3.5 Transformação de A. tumefaciens
A transformação de células de A. tumefaciens foi efectuada utilizando o método de freeze–
thaw (Weigel e Glazebrook, 2002). As células foram descongeladas em gelo e foram adicionados
0,5 – 10 µg (10 – 30 µL). Estas células foram mantidas 5 min em gelo e depois transferidas para
azoto líquido durante 5 min. Foram depois submetidas a choque térmico por incubação num banho
a 37ºC durante 5 minutos. Após este choque térmico foram adicionados 300 µL de meio YEP
líquido às células e estes foram incubados a 28ºC, durante 4 h com agitação a 150 rpm. De
seguida, a suspensão bacteriana foi espalhada sobre meio YEP sólido suplementado com
rifampicina 10 µg/mL, gentamicina 15 µg/mL, tetraciclina 2 µg/mL e canamicina (50 µg/mL). As
placas com as bactérias foram depois incubadas a 28ºC, durante 2 dias.
2.4 Técnicas de manipulação e análise de DNA
2.4.1 Extracção de DNA genómico de A. thaliana
O DNA genómico foi extraído de acordo com o método de Li e Chory (1998) com algumas
alterações. Cerca de 300 mg de tecido foliar foram congelados em azoto líquido e macerados com
um pilão e um almofariz, pré-arrefecidos (-80ºC). O material vegetal foi transferido para um tubo
tipo Falcon e após evaporação do azoto líquido foram adicionados 5 mL de tampão de extracção
(Tris–HCl 100 mM pH 7.5, NaCl 500 mM, EDTA 50 mM, β-mercaptoetanol 10 mM e SDS 1% [v/v])
pré-aquecido a 65ºC. Após agitação vigorosa esta suspensão foi incubada a 65ºC durante 10 min,
com agitação ocasional. De seguida foram adicionados 1,67 mL de acetato de potássio 5 M, e após
agitação vigorosa a suspensão foi incubada em gelo durante 20 min. O material foi depois
centrifugado a 30000g (SORVALL Evolution, rotor SLA-1500) durante 20 min, a 4ºC. O
sobrenadante foi transferido para um novo tubo e adicionou-se um volume de isopropanol
equivalente ao volume inicial da mistura, sendo o tubo depois incubado a -20ºC durante 30 min.
18
Para recuperação dos ácidos nucleicos a mistura foi novamente centrifugada a 20000g (SORVALL
Evolution, rotor SLA-1500) durante 15 min, a 4ºC. O sobrenadante foi removido e o DNA seco com
os tubos invertidos sobre papel absorvente durante c. de 40 min. O DNA foi ressuspendido em 500
µL de tampão TE (Tris-HCL 50 mM pH 8 e EDTA 10 mM pH8), transferido para um tubo Eppendorf
e centrifugado durante 10 min a 4500 rpm. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo ao
qual se adicionou RNAse 0,1 mg/mL, tendo esta mistura sido incubada a 37ºC durante 1 h. Foram
adicionados 500 µL de fenol:clorofórmio (1:1) e toda a solução foi centrifugada durante 10 min a
4500 rpm. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo Eppendorf e o passo de extracção
com fenol:clorofórmio foi repetido. A fase aquosa foi transferida para um novo tubo e foram
adicionados 50 µL de acetato de sódio 3 M, pH 4,8 e 350µL de isopropanol. Esta mistura foi
incubada a -20ºC durante 12 – 16 h. No dia seguinte o DNA foi centrifugado durante 10 min a
4500 rpm. Após remoção do sobrenadante foram adicionados 500 µL de etanol 75% a -20ºC. O
etanol foi removido e o DNA foi seco num Speed-Vac durante 5 min e ressuspendido em 100 µL de
tampão TE, sendo armazenado a 4ºC.
2.4.2 Electroforese em gel de agarose
Os géis de agarose (0,8 - 1% [p/v] em tampão TAE 1x [Trizma-base 40 mM, ácido acético
glacial 10% e EDTA 10 mM]) continham brometo de etídio 250 ng/mL. A separação electroforética
foi feita em tampão TAE 1x. Após electroforese os fragmentos de DNA foram visualizados utilizando
um transiluminador de UV e fotografados com o Gene Genius Bio Imaging System (Syngene). Como
marcadores de tamanhos moleculares foram utilizados o GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder
(Fermentas) e o Lambda DNA/Eco 471 (AvaII) - Marker13 (Fermentas).
2.4.3 Reacção da polimerase em cadeia – PCR
Todos os PCRs foram efectuados num UNO-Thermoblock Thermal Cycler ou no TGradient
Thermal Cycler (ambos da Biometra), quer para as reacções de PCR com Taq DNA polymerase
(Fermentas) quer para as reacções de PCR com Phusion High Fidelity DNA polymerase
(Finnzymes). Todos os testes de oligonucleótidos de iniciação e confirmação de bactérias que
contêm o plasmídeo recombinante por PCR de colónias foram efectuados com a Taq DNA
19
Polymerase. Para a amplificação dos fragmentos de regiões promotoras das diferentes AGPs foi
utilizada a Phusion High Fidelity DNA Polymerase, de forma a minimizar a incorporação de erros
nas sequências amplificadas. O gene da actina3 (ACT3) foi utilizado como gene de referência para
todos os PCRs. Os programas de PCR para a Taq DNA polymerase consistiram num primeiro passo
de desnaturação (2 min, 95ºC) seguido por 30 a 35 ciclos de desnaturação (45 segundo, 95ºC), de
emparelhamento (45 segundos, Ta do par de oligonucleótidos iniciadores) e de extensão (1 min por
1kb de amplificado, 72ºC) seguidos por um passo de extensão final (5 - 10 min, 72ºC) e um passo
de arrefecimento (4ºC). Foram utilizadas misturas de reacção de 25 µL cujos componentes estão
descritos na tabela 2.1.
Tabela 2.1: Componentes das reacções de PCR utilizadas para testes de oligonucleótidos de iniciação e
PCR de colónias de bactérias.
Reagentes
Volume por 25 µL de reacção
Concentração final
até 25 µL Vf
-
Tampão 10x com KCl
2,5 µL
1x
Mistura de nucleótidos (dNTPs) 10 mM
0,5 µL
0,2 mM
Oligonucleótido iniciador 5’ 10 µM
0,5 µL
0,2 µM
Oligonucleótido iniciador 3’ 10 µM
0,5 µL
0,2 µM
2 µL
2 mM
-
-
0,15 µL
0,75 U
H2O estéril
MgCl2 25 mM
DNA molde
Taq DNA polymerase 5 U/µL
Vf – volume final
Para os testes de oligonucleótidos de iniciação foram usados c. de 0,5 - 1 µL de DNA molde que
correspondem a cerca de 50-100 ng de DNA. Para as reacções de PCR de colónias foi utilizada
uma pequena porção da colónia a testar. A temperatura de emparelhamento ou annealing (Ta) para
todos os oligonucleótidos de iniciação foi determinada por PCR com gradiente de temperatura. A
temperatura de cada par de oligonucleótidos de iniciação foi calculada com base na equação 2.1, e
em todos os PCR com gradiente de temperatura foram utilizadas temperaturas 5ºC acima e 5ºC
abaixo da Tm de cada oligonucleótido de iniciação:
Tm  4G  C   2 A  T 
(2.1)
20
Foram amplificados fragmentos das regiões promotoras de 7 AGPs: da AGP1, da AGP9, da
AGP10, da AGP12, da AGP15, da AGP20 e da AGP23 utilizando os oligonucleótidos de iniciação
descritos na tabela 2.2, a partir de DNA genómico extraído de folhas de A. thaliana (2.4.1). As
sequências promotoras foram isoladas, sempre que possível, desde o final da UTR do gene mais
próximo situado a montante, até ao codão de iniciação do gene de interesse. Para os genes que
apresentavam regiões promotoras com mais do que cerca de 3000 bp foram isoladas sequências
desde 3000 – 3200 bp a montante do codão de iniciação da tradução do gene de interesse até ao
respectivo codão de iniciação. A todos os oligonucleótidos de iniciação à direita foi adicionada uma
sequência CACC (ver oligonucleótidos representados a negrito na tabela 2.2) à extremidade 5’ de
modo a permitir a clonagem direccional destas sequências de DNA no vector pENTR/D-TOPO
(Invitrogen).
Tabela 2.2: Sequências dos oligonucleótidos de iniciação utilizados para amplificação dos fragmentos
das regiões promotoras das AGPs (representados no sentido 5’→3’).
Nome
Locus
Sequências dos oligonucleótidos de iniciação
AGP1
At5g64310
F CACCGTCATATTGACTCTGAGCCATAAACTC
R CAAAAAAGAGAGAGATTCGAATTTAGC
AGP9
At2g14890
F CACCATTGGCCACAGTTCACCTGC
R TTTTGCTTTTGCTTTTTCTCTCTG
AGP10
At4g09030
F CACCAAGTGGATAATCTGGCGCGA
R GAAGGATCTTGTTTCGAGCAGAG
AGP12
At3g13520
F CACCGTTGGGGCCACATTTGTAGT
R CTTCTAAGTGCAAAAGAGGAG
AGP15
At5g11740
F CACCCCATTTTCTTTGATTGTAGCAAGTTAG
R TTCAAAGATTTTGTTGTGAGAGATAAAG
AGP20
At3g61640
F CACCGAGCAGTAGTAAGTGTTGGCACGT
R CTCAAGATTTTACGGAGGACAAAAT
AGP23
At3g57690
F CACCCATCGTGAATATTTATAGGACAAGTTTATG
R GAGACCTGAAAGGCTTTTCTTTTC
ACT3
At2g37620
F GATTTGGCATCACACTTTCTACAATG
R GTTCCACCACTGAGCACAATG
F – oligonucleótido de iniciação direito; R – oligonucleótido de iniciação esquerdo.
21
Os programas de PCR para a Phusion High Fidelity DNA Polymerase consistiram num
primeiro passo de desnaturação (30 segundos, 98ºC) seguido por 30 a 35 ciclos de desnaturação
(5 - 10 segundos, 98ºC), de emparelhamento (30 segundos, Ta do par de oligonucleótideos
iniciadores) e de extensão (15 - 30 segundos por 1kb de amplificado, 72ºC) seguidos por um passo
de extensão final (5 - 10 min, 72ºC) e um passo de arrefecimento (4ºC). Foram utilizadas misturas
de reacção de 50 µL cujos componentes estão descritos na tabela 2.3.
Tabela 2.3: Componentes das reacções de PCR utilizadas para a amplificação dos fragmentos de
regiões promotoras das diferentes AGPs.
Reagentes
Volume por 50 µL de reacção
Concentração final
até 50 µL Vf
-
Tampão Phusion HF 5x
10 µL
1x
Mistura de nucleótidos (dNTPs) 10 mM
1 µL
0,2 mM
Oligonucleótido iniciador 5’ 10 µM
1,5 µL
0,3 µM
Oligonucleótido iniciador 3’ 10 µM
1,5 µL
0,3 µM
DNA molde
1,5 µL
100 – 150 ng
Phusion DNA polymerase 2 U/ µL
0,5 µL
0,02 U/ µL
H2O
Vf – volume final
Todos os produtos de PCR foram analisados por electroforese em gel de agarose (2.4.2). No
caso das reacções para a síntese dos fragmentos de DNA correspondentes às regiões promotoras,
todo o volume de reacção (50 µL) foi carregado no gel e as bandas de interesse foram excisadas o
mais rápido possível de modo a evitar a danificação dos fragmentos de DNA (2.4.6).
2.4.4 Extracção de RNA de óvulos de A. thaliana
Os óvulos foram isolados a partir de flores nos estados de desenvolvimento 12 e 13 (Smyth
et al., 1990). As flores foram cortadas pelo receptáculo e as sépalas, pétalas e estames foram
removidos. Os óvulos foram extraídos utilizando agulhas hipodérmicas e colocados imediatamente
em tampão de lise RLT do RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen), em gelo. Em cada novo processo de
extracção o material vegetal foi colocado em novo tampão de lise RLT. No final de cada extracção
todo o material foi armazenado a -20ºC. As amostras foram descongeladas apenas para a extracção
22
do RNA. O RNA de todas as amostras foi extraído utilizando o RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)
seguindo as instruções do fabricante. As amostras de RNA foram tratadas com DNaseI (Promega)
para evitar a contaminação com DNA. Para analisar a quantidade e a qualidade do RNA extraído
uma alíquota desta amostra, 5 µL, foi separada por electroforese em gel de agarose 1,5% (2.4.2).
2.4.5 RT-PCR em tempo real
As reacções de transcrição reversa foram feitas com o Reverse Transcription System
(Promega), a 42ºC (30 min), usando como oligonucleótido de iniciação oligo(dT)15. O cDNA dos
óvulos de A. thaliana foi amplificado utilizando o iQ™ SYBR® Green Supermix no termociclador iQ™
5 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad). A expressão do gene da ubiquitin-conjugating enzyme
(UBC9) foi utilizada como controlo e para a normalização dos resultados. Foram efectuados
duplicados de todas as reacções de RT-PCR em tempo real para todos os genes. As misturas de
reacção foram feitas para 25 µL de volume total em placas de polipropileno para 96 reações
(Microseal Semi-Skirted 96-well PCR Plates, Bio-Rad) fechadas com adesivos para microplacas
(Optical Sealing Tape, Bio-RAd), contendo os componentes descritos na tabela 2.4. Os
oligonucleótidos de iniciação utilizados nesta experiência estão listados na tabela 2.5.
Tabela 2.4: Componentes das reacções de RT-PCR em tempo real utilizadas para amplificação
do cDNA de óvulos de A. thaliana
Volume por 25 µL de
reacção
Concentração final
H2O estéril
10,5 µL
-
iQ™ SYBR® Green Supermix 2x
12,5 µL
1x
Oligonucleótido iniciador 5’ 10 µM
0,5 µL
0,2 µM
Oligonucleótido iniciador 3’ 10 µM
0,5 µL
0,2 µM
1 µL
-
Reagentes
cDNA molde
Vf – volume final
Os programas de PCR utilizados consistiram num primeiro passo de desnaturação. Os
programas de PCR utilizados consistiram num primeiro passo (4 min, 94ºC), seguido por 40 ciclos
de desnaturação (30 segundos, 94ºC), de emparelhamento (30 segundos, Ta do par de
oligonucleótidos iniciadores) e de extensão (30 segundos, 72ºC). Obtiveram-se as curvas de
23
dissociação para cada gene, aquecendo as amostras de 55ºC até 95ºC para verificar a
especificidade da amplificação de forma a confirmar a ausência de formação de dímeros de
oligonucleótidos de iniciação ou de qualquer outro produto inespecífico. Foram obtidas curvas
padrão utilizando uma série de diluições (10-1, 10-2, 10-3) de cDNA de óvulos para todos os genes, em
duplicados, de modo a determinar a eficiência dos oligonucleótidos de iniciação. Foram obtidas as
curvas de amplificação e valores de CT (threshold cycle), número de ciclos em que se acumula uma
quantidade de produto amplificado suficiente para gerar um sinal de fluorescência detectável) para
cada gene. Os dados foram analisados utilizando o programa iQ5 2.0, Standard Edition Optical
System Software versão 2.0 (Biorad). Todos os valores de C foram exportados para o MS Excel
T
(Microsoft) e analisados utilizando o método  CT ( Livak e Schmittgen, 2001).
Tabela 2.5: Sequências dos oligonucleótidos de iniciação utilizados para amplificação do cDNA
de óvulos de A. thaliana (representados no sentido 5’→3’).
Nome
Locus
Sequências dos oligonucleótidos de iniciação
AGP1
At5g64310
F AATCCTCTGCTTCACCAC
R CTTCAGTCGGAGAATCGG
AGP9
At2g14890
F ATCTGTATCGTCCTCATCG
R ATGTTGTGACTGGTGGTG
AGP10
At4g09030
F CTCGCTGCTGGATCTTTAG
R CGCTAACTCAATTCTTAATACAAC
AGP12
At3g13520
F CACAACTCATCATTCGCACCAAAG
R CCACAATAGCCACCATCAACACC
AGP15
At5g11740
F CACCAGCACCAAGTCCTAC
R ACGAAATCACCATCACAGTAAC
AGP16
At2g46330
F TCATCATTTTCGTCGGATCA
R ACCACCATTAGCAAATACGC
AGP20
At3g61640
F GGTTTTTGGTTGTCCGTGTC
R AGCGAATAAAGCGATTACGG
AGP21
At1g55330
F TCATCACAACACAAATCAAAACA
R TGGTACAAACATGGCAGCAT
UBC9
At4g27960
F GTTTCACCACCCTTTCTTC
R AAATCCCACGATCAAATTCC
F – oligonucleótido de iniciação direito; R – oligonucleótido de iniciação esquerdo.
24
2.4.6 Recuperação de DNA a partir de géis de agarose
Todas as bandas contendo DNA de interesse foram rapidamente excisadas do gel de agarose
de forma a minimizar os danos causados pela exposição aos raios UV. O DNA foi recuperado
através do QIAquick Gel Extraction Kit (Quiagen), seguindo as normas do fabricante.
2.4.7 Minipreparação de DNA plasmídico
Todas as extracções de DNA plasmídico para rastreio de clones positivos e utilização nos
processos de sub-clonagem foram realizadas recorrendo ao High-Speed Plasmid Mini kit (Avegene)
seguindo as instruções do fabricante.
2.4.8 Digestão de DNA plasmídico
A digestão de DNA plasmídico para rastreio após clonagem e para clonagem no vector de
destino foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante das enzimas de restrição
utilizadas (Fermentas e New England BioLabs). Os resultados das restrições foram analisadas por
electroforese em gel de agarose (2.3.2), e no caso das clonagens, a banda que continha o
fragmento de DNA de interesse foi excisada e purificada conforme descrito acima (2.3.6).
2.4.9 Sequenciação
Todas as sequenciações foram efectuadas pela empresa 4 Base Lab (Alemanha). Todos os
dados provenientes das sequenciações foram analisados utilizando os programas Chromas versão
1.45
(Conor
McCarthy,
Griffith
University)
e
o
Clustal
w
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html, Larkin et al., 2007).
25
2.5 Produção das linhas de A. thaliana transgénicas
2.5.1 Ligação dos fragmentos amplificados no vector pENTR/D-TOPO
As construções proAGP::NLS:3xGFP utilizadas para a produção de linhas de A. thaliana que
expressam a GFP sob o controlo dos promotores endógenos das diferentes AGPs foram obtidas
utilizando o sistema de clonagem Gateway (Invitrogen). A tecnologia Gateway é um sistema
universal de clonagem e sub-clonagem de sequências de DNA. Uma vez inseridas neste sistema as
sequências de DNA podem ser facilmente transferidas entre diferentes vectores utilizando locais
específicos de recombinação. O vector pENTR/D-TOPO permite uma clonagem fácil e rápida de
fragmentos de DNA com extremidades cegas, constituindo uma forma de entrada no sistema
Gateway. Estes vectores possuem locais de recombinação específicos attL para recombinação do
vector de entrada com um vector de destino, um local de clonagem direccional que permite a
ligação de produtos de PCR de extremidades cegas e possuem o gene de resistência à canamicina
para selecção em E. coli (ver anexo I para representação esquemática das reacções de
recombinação). As sequências das regiões promotoras das diferentes AGPs foram obtidas por PCR
(2.4.3) e purificadas a partir de géis de agarose (2.4.6). Estas sequências foram clonadas no vector
de entrada pENTR/D-TOPO (Gateway, Invitrogen) utilizando o pENTR Directional TOPO Cloning Kit
(Gateway, Invitrogen), seguindo as instruções do fabricante, com algumas alterações. As reacções
de ligação constituídas pelos componentes descritos na tabela 2.6 foram incubadas durante 5 min
à temperatura ambiente e depois transferidas para gelo.
Tabela 2.6: Componentes das reacções de ligação para o vector pENTR/D-TOPO.
Volume por 3 µL de
reacção
Concentração final
Produto de PCR
0,25 - 2 µL
razão molar 1:1
Solução Salina
0,5 µL
NaCl 0,2 M e MgCl2 0,01M
até 3 µL Vf
-
0,5 µL
1,25 ng/µL
Reagentes
H2O estéril
Vector pENTR/D-TOPO
Vf – volume final
26
De seguida procedeu-se à transformação de uma alíquota de E. coli One Shot TOP10
(Invitrogen) por cada construção (2.3.3). Os clones positivos foram seleccionados primeiro através
de PCR de colónias (2.4.3), e depois confirmados por análise de restrição (2.4.8), utilizando para
isso duas enzimas de restrição que fazem a excisão do fragmento de inserção. Todos os vectores
obtidos foram sequenciados (2.4.9) utilizando o oligonucleótidos de iniciação universal M13
Forward e o oligonucleótido de iniciação esquerdo utilizado para amplificação de cada uma das
sequências por PCR (tabela 2.2), de modo a confirmar a presença do fragmento de inserção no
local e na orientação correctos.
2.5.2 Linearização dos vectores de entrada
Após sequenciação dos vectores obtidos em 2.5.1 procedeu-se à introdução das sequências
inseridas no vector pENTR/D-TOPO no vector de destino. Antes deste passo foi necessário linearizar
estes vectores com enzimas de restrição adequadas, uma vez que o vector de destino possui o
mesmo gene de resistência que o vector de entrada, a canamicina, evitando-se assim o
aparecimento de falsos positivos nesta segunda clonagem. Foram usadas diferentes enzimas para
os diferentes vectores de modo a evitar o corte do fragmento de interesse e o corte dos locais de
recombinação attL (2.4.8). Todas as digestões foram efectuadas durante 12 - 16 h, de modo a
garantir que todos os vectores presentes na solução eram linearizados. Os resultados das restrições
foram analisadas por electroforese em gel de agarose (2.3.2), e a banda correspondente ao vector
linearizado foi excisada e purificada conforme descrito acima (2.3.6).
2.5.3 Obtenção das construcções pAGP::NLS:3xGFP
Para a localização celular das AGPs seleccionadas foi utilizado o vector de destino
pNLS3xGFPnost-pGII de Shinobu Takada (Universidade de Tübingen, Alemanha) no qual foi
introduzida uma cassete Gateway (Invitrogen) utilizando os locais de corte da enzima de restrição
Sal I, (Milly Ron, Universidade da Califórnia, Berkeley). As sequências promotoras foram transferidas
para o vector de destino através de uma reacção para cada uma das inserções (Gateway,
Invitrogen) utilizando o Gateway LR Clonase II Enzyme Mix (Invitrogen), seguindo as instruções do
27
fabricante, com algumas alterações. As reacções de ligação constituídas pelos componentes
descritos na tabela 2.7 foram incubadas durante 1 h a 25ºC.
Tabela 2.7: Componentes das reacções LR.
Volume por 4 µL de
reacção
Concentração final
Vector de entrada
0,5 – 3,5 µL
50 – 150 ng
Vector de destino
0,5 µL
150 ng/µL
Tampão TE, pH 8
até 4 µL Vf
1x
1 µL
1x
Reagentes
LR Clonase II enzyme mix
Vf – volume final
Estas reacções foram terminadas pela adição de 1 µL de solução de proteinase K 2 µg/µL
(Invitrogen) e incubação a 37ºC durante 10 min. De seguida procedeu-se à transformação de 100
µL de E. coli DH5α por cada construção (2.3.3) e selecção das colónias que contêm o plasmídeo
recombinante por análise de restrição (2.4.8). Depois de efectuadas todas as reacções LR, os
plasmídeos contendo as construções pAGP::NLS:3xGFP foram inseridos em A. tumefaciens estirpe
GV3101::pMP90::pSOUP por (2.3.5). Como o A. tumefaciens produz poucas cópias dos plasmídeos
que contém, primeiro procedeu-se à extracção dos plasmídeos das bactérias transformadas (2.4.7),
depois à tranformação de E. coli DH5α (2.3.3) com estes plasmídeos e por fim os clones positivos
foram selecionados por análise de restrição (2.4.8). Esta análise de restrição foi feita utilizando as
mesmas enzimas de restrição utilizadas para o rastreio de clones positivos após a reacção LR.
2.5.4 Transformação de A. thaliana pelo método de “floral dip”
Todas as transformações de A. thaliana foram efectuadas de acordo com o método descrito
por Clough e Bent (1998), com algumas alterações. Foram utilizadas plantas de A. thaliana que
apresentavam o maior número possível de gomos florais, de modo a aumentar a eficiência da
transformação. A estas plantas foram removidas a maioria das silíquas e flores abertas. Quando as
plantas apresentavam poucos gomos florais, 4 a 8 dias antes da transformação das plantas, as
inflorescências primárias eram removidas de modo a eliminar o efeito de dominância apical e
promover assim a produção de um maior número de inflorescências secundárias. Três dias antes
28
da transformação das plantas, as células de A. tumefaciens contendo os clones de interesse foram
inoculadas em 5 mL de meio YEP suplementado com rifampicina 10 µg/mL, gentamicina 15
µg/mL e tetraciclina 2 µg/mL e canamicina (50 µg/mL). Estas culturas foram incubadas durante 2
dias, a 28ºC, com agitação a 150 rpm. Após os dois dias, as diferentes culturas de A. tumefaciens
contendo os clones de interesse foram inoculadas em 200 mL de meio líquido YEP suplementado
com os mesmos antibióticos, e foram incubadas a 28ºC, com agitação a 150 rpm, durante 24 h.
Após as 24 h de incubação, as células foram centrifugadas a 6000 rpm durante 10 min, à
temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspendidas em 200
mL de meio de infiltração (sacarose 5% e Silwet L-77 0,005% [OSi Specialties, Inc., Danbury, CT,
USA]). As flores foram depois mergulhadas nesta solução de infiltração contendo as células de A.
tumefaciens durante cerca de 30 segundos a 1 min, com alguma agitação, de modo a facilitar a
entrada da solução nos óvulos dos gomos florais. As plantas transformadas foram resguardadas
com sacos de plástico durante 12 - 16 h. No dia seguinte estes sacos foram removidos, e três
semanas depois procedeu-se à recolha das sementes.
29
3. Resultados
3.1 Selecção das AGPs
Num primeiro passo seleccionaram-se as AGPs com níveis de expressão génica relativa mais
elevados nos ovários. Para tal, recorreu-se a bases de dados disponíveis on-line, o Genevestigator
(http://genevestigator.ethz.ch; Zimmermann et al., 2004) e à base de dados Arabidopsis eFP
Browser (http://bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi; Winter et al., 2007). Foram ainda
utilizados dados de experiências de microarrays relativos à expressão das AGPs nas sinergídeas, na
célula central e na oosfera de Arabidopsis thaliana, resultados não publicados, gentilmente cedidos
pelo Laboratório do Prof. Dresselhaus, Universidade de Regensburg, e resultados de microarrays
obtidos com pólen com os gâmetas masculinos de Arabidopsis thaliana (Borges et al., 2008). Com
base nos dados de microarrays disponíveis on-line foram seleccionadas 3 AGPs clássicas: AGP1,
AGP9 e AGP10, e 5 péptidos AG: AGP12, AGP15, AGP16, AGP20 e AGP21. Os dados relativos às
experiências de microarrays nas sinergídeas, na célula central e na oosfera, bem como os dados de
microarrays de pólen e dos gâmetas masculinos permitiram fazer uma selecção mais específica,
sendo assim seleccionadas 4 AGPs clássicas: AGP1, AGP5, AGP9 e AGP10, e 6 péptidos AG:
AGP12, AGP15, AGP16, AGP20, AGP21 e AGP23. Nesta última selecção, escolheram-se as AGPs
que estavam presentes na célula central, na oosfera e nas sinergídeas, reduzindo-se assim o
número de proteínas candidatas para este estudo e tornando esta selecção mais específica.
3.2 Análise dos alinhamentos proteicos
Foi obtida uma árvore filogenética a partir do alinhamento múltiplo das sequências proteicas
das AGPs clássicas: AGP1, AGP2, AGP3, AGP4, AGP5, AGP6, AGP7, AGP9, AGP10, AGP11, AGP
25, AGP26 e AGP27, dos péptidos AG: AGP12, AGP13, AGP14, AGP15, AGP16, AGP20, AGP21,
AGP22, AGP23 e AGP24 e das AGPs ricas em lisina: AGP17, AGP18 e AGP19 (figura 3.1) através
do programa T-Coffee. As AGPs com domínios tipo-fasciclina (FLAs) foram excluídas desta análise
por não terem sido seleccionadas para este estudo, e, para além disso, estas AGPs possuem não só
domínios típicos das AGPs, mas também domínios de adesão celular, sendo por isso consideradas
30
AGP17
*
*
AGP5
AGP1
AGP18
AGP2
*
AGP10
AGP19
AGP7
AGP4
*
AGP9
AGP11
AGP6
AGP3
*
AGP21*
AGP12
AGP13
AGP14
AGP22
*
AGP20*
AGP16
AGP24
AGP15
*
AGP26
AGP25
*
AGP23
AGP27
Figura 3.1: Árvore filogenética obtida a partir do alinhamento múltiplo das sequências proteicas das AGPs clássicas,
dos péptidos AG e das AGPs ricas em lisina de Arabidopsis thaliana, utilizando o programa T-Coffee. AGPs clássicas:
AGP1, AGP2, AGP3, AGP4, AGP5, AGP6, AGP7, AGP9, AGP10, AGP11, AGP 25, AGP26 e AGP27; péptidos AG: AGP12,
AGP13, AGP14, AGP15, AGP16, AGP20, AGP21, AGP22, AGP23 e, AGP24; AGPs ricas em lisina: AGP17, AGP18 e
AGP19. As AGPs seleccionadas para este estudo, com base nos dados de microarrays, estão assinaladas com um
asterisco. A clade formada pelas AGP1 e AGP5 está realçada a amarelo, a clade formada pelas AGP12 e AGP21 está
realçada a roxo, e a clade formada pelas AGP16 e AGP20 está realçada a verde.
31
AGPs quiméricas (Johnson et al., 2003), podendo diminuir a exactidão do alinhamento obtido. A
análise da similaridade entre as diferentes sequências proteicas das AGPs poderá ajudar a prever se
duas ou mais proteínas poderão ou não exercer funções semelhantes devido ao elevado ou baixo
grau de similaridade das sequências, respectivamente.
Das AGPs seleccionadas a partir dos dados de microarrays, apenas algumas das sequências
apresentavam maior similaridade entre si, encontrando-se associadas no mesmo grupo. As
sequências proteicas da AGP1 e da AGP5, da AGP12 e da AGP21 e da AGP 16 e da AGP20, são as
que apresentam um maior grau de similaridade entre si. Já as restantes AGPs, AGP9, AGP10,
AGP15 e AGP23 não apresentam similaridades relevantes entre si. A AGP9 apresenta uma maior
similaridade com a AGP4, proteína não seleccionada para este estudo, e a AGP23 revela
similaridades elevadas com a AGP27, também não seleccionada para este trabalho.
3.3 Expressão de genes de AGPs nos óvulos
Uma vez que o objectivo deste trabalho é estudar os genes de AGPs presentes nos tecidos e
células gametofíticas femininas que estivessem possivelmente envolvidos no direccionamento do
tubo polínico até ao saco embrionário, todas as flores utilizadas nesta experiência foram recolhidas
num estado de desenvolvimento em que ainda não tivesse ocorrido polinização, mas em que o
pistilo já estivesse totalmente desenvolvido. Sendo assim, todas as flores que foram recolhidas
encontravam-se nas fases finais de desenvolvimento do estado 11, em que o pistilo já está bem
desenvolvido, embora ainda não se distingam os estiletes, e as anteras ainda não estão maduras,
no estado de desenvolvimento 12, em que o pistilo está totalmente desenvolvido e as anteras ainda
não estão maduras e nas fases iniciais de desenvolvimento do estado 13, imediatamente antes da
fase em que o estigma já está receptivo e a polinização pode ocorrer (Smyth et al., 1990). Após a
recolha das flores, os pistilos foram isolados e devidamente dissecados de modo a separar apenas
os óvulos. Todos estes procedimentos foram efectuados de modo a evitar ao máximo a injúria
provocada nos tecidos e a consequente alteração do programa de expressão génica.
A análise da expressão génica foi efectuada por RT-PCR em tempo real para os genes da
AGP1, AGP9, AGP10, AGP12, AGP15, AGP16, AGP20 e AGP21 como forma de confirmação dos
dados obtidos a partir dos microarrays de óvulos. No entanto, para os genes da AGP16 e da AGP21,
apesar de terem sido testadas diferentes condições de PCR, os oligonucleótidos de iniciação destes
dois genes não apresentaram eficiências adequadas para a realização das experiências de RT-PCR
32
em tempo real e as experiências efectuadas para o gene da AGP21 possuíam curvas de dissociação
que apresentavam mais do que um pico, indicando a formação de dímeros de primers.
Para todos os restantes genes foram obtidas as respectivas curvas de dissociação (anexo II).
Para todos os genes amplificados estas curvas apresentavam um único pico. Curvas padrão foram
também obtidas para todos os genes em estudo, determinando-se assim a eficiência dos pares de
oligonucleótidos iniciadores para amplificação dos diferentes genes de interesse. A eficiência de
todos os oligonucleótidos encontrava-se entre os 93–105 % (anexo III). Para a obtenção destas
curvas foi utilizada uma série de diluições (10-1, 10-2, 10-3) de cDNA de óvulos, para todos os genes.
Para a obtenção das curvas de amplificação foram utilizadas as diluições 10-2 de cDNA dos óvulos.
Uma vez que os diferentes oligonucleótidos de iniciação necessitavam de diferentes condições de
PCR para funcionaram em condições óptimas, reacções independentes tiveram de ser efectuadas
para cada um destes genes. Após a obtenção das curvas de dissociação e das curvas padrão para
cada um dos genes em estudo procedeu-se à aquisição das curvas de amplificação para todos os
genes. A partir destas curvas foram determinados os CT para cada um dos genes e a partir destes
valores foram obtidos os níveis de expressão relativa destes genes, utilizando o gene da UBC9 para
a normalização dos resultados através do método  CT (Livak e Schmittgen, 2001).
Os resultados dos níveis de expressão relativas dos genes em estudo estão apresentados nas
figuras 3.2 a 3.7. Os resultados não revelaram diferenças significativas entre os níveis de expressão
dos genes em estudo e a expressão do gene de referência UBC9. Os níveis de expressão relativa do
gene da AGP1 são muito semelhantes aos níveis de expressão do gene de referência (figura 3.2).
Os genes da AGP9 e da AGP12 apresentam níveis de expressão relativa um pouco mais baixos do
que o gene de referência (figuras 3.3 e 3.5, respectivamente). Por sua vez os genes da AGP10 e da
AGP20 apresentam níveis de expressão relativa mais baixos do que o gene de referência (figura 3.4
e 3.7, respectivamente). O gene da AGP15 apresenta níveis de expressão relativa apenas
ligeiramente reduzidos em relação aos níveis de expressão do gene da UBC9 (figura 3.6).
33
Níveis de expressão relativa
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
UBC9
AGP1
Genes
Figura 3.2: Gráfico representativo dos níveis de expressão relativa do gene da AGP1 utilizando como gene
de referência o gene da UBC9. As linhas indicam o erro padrão.
Níveis de expressão relativa
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
UBC9
AGP9
Genes
Figura 3.3: Gráfico representativo dos níveis de expressão relativa do gene da AGP9 utilizando como gene
de referência o gene da UBC9. As linhas indicam o erro padrão.
Níveis de expressão relativa
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
UBC9
AGP10
Genes
Figura 3.4: Gráfico representativo dos níveis de expressão relativa do gene da AGP10 utilizando como gene
de referência o gene da UBC9. As linhas indicam o erro padrão.
34
Níveis de expressão relativa
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
UBC9
AGP12
Genes
Figura 3.5: Gráfico representativo dos níveis de expressão relativa do gene da AGP12 utilizando como gene
de referência o gene da UBC9. As linhas indicam o erro padrão.
Níveis de expressão relativa
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
UBC9
AGP15
Genes
Figura 3.6: Gráfico representativo dos níveis de expressão relativa do gene da AGP15 utilizando como gene
de referência o gene da UBC9. As linhas indicam o erro padrão.
Níveis de expressão relativa
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
UBC9
AGP20
Genes
Figura 3.7: Gráfico representativo dos níveis de expressão relativa do gene da AGP20 utilizando como gene
de referência o gene da UBC9. As linhas indicam o erro padrão.
35
3.4 Amplificação dos fragmentos das regiões promotoras
Os fragmentos das regiões promotoras para os genes da AGP1, da AGP9, da AGP10, da
AGP12, da AGP15, da AGP20 e da AGP23 foram amplificados por PCR a partir de DNA genómico
de folha de Arabidopsis thaliana. Estes fragmentos foram posteriormente separados por
electroforese em gel de agarose (figuras 3.8 e 3.9).
m
1
2
3
4
5000 bp
1500 bp
500 bp
Figura 3.8: Separação electroforética dos produtos de PCR correspondentes aos fragmentos das regiões promotoras
das AGPs: (1) AGP1; (2) AGP15; (3) AGP20 e da (4) AGP23.
m – marcador de tamanhos moleculares (GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, Fermentas).
Após a separação electroforética dos diferentes produtos de PCR, foi observada a formação
de uma banda evidente e com o tamanho esperado para todos os fragmentos das regiões
promotoras amplificados para as diferentes AGPs em estudo. Para o gene AGP1 foi obtido um
fragmento com 828 bp (figura 3.8, pista 1). Para o gene da AGP15 obteve-se um fragmento com
1526 bp (figura 3.8, pista 2). Para o gene AGP20 foi obtido um fragmento com 1873 bp (figura 3.8,
pista 3). Para o gene da AGP23 obteve-se um fragmento com 622 bp (figura 3.8, pista 4). Para o
gene da AGP12 obteve-se um fragmento com 1600 bp (figura 3.9 b, pista 1). Para o gene da AGP9
obteve-se um fragmento com 1491 bp (figura 3.9 a, pista 1) e para o gene da AGP 10 foi obtido um
fragmento com 3135 bp (figura 3.9 c, pista1).
36
a)
m
5000 bp
1
b)
m
c)
1
m
1
5000 bp
5000 bp
1500 bp
1500 bp
500 bp
1500 bp
500 bp
500 bp
Figura 3.9: Separação electroforética dos produtos de PCR correspondentes aos fragmentos das regiões promotoras
de AGPs. a) Produtos de PCR amplificado a partir da região promotora da AGP9. b) Produto de PCR amplificado a partir
da região promotora da AGP12. b) Produto de PCR amplificado a partir da região promotora da AGP10.
m – marcador de tamanhos moleculares (GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, Fermentas).
As bandas correspondentes aos fragmentos de interesse foram excisadas dos géis e
purificadas para clonagem no vector pENTR/D-TOPO.
3.5 Obtenção dos vectores de entrada pENTR/D-TOPO/pAGP
Os fragmentos de DNA amplificados por PCR e posteriormente purificados, correspondentes
às regiões promotoras das diferentes AGPs, foram separadamente clonados por recombinação no
vector pENTR/D-TOPO (anexo IV). Os produtos das reacções de recombinação foram utilizados
separadamente para a transformação de uma alíquota de E.coli TOP10 por cada reacção. Dos
transformantes obtidos foram seleccionados os clones recombinantes por PCR de colónias. Os
clones recombinantes seleccionados foram cultivados em meio líquido e o DNA plasmídico foi
extraído para confirmação da presença da inserção por análise de restrição. A confirmação da
presença das inserções nos diferentes clones recombinantes foi feita por clivagem do DNA com as
enzimas de restrição AscI e NotI, que permitem efectuar a excisão do fragmento de inserção do
vector pENTR/D-TOPO.
37
a)
m
1.1
1.2
2.1
2.2
b)
m
1.1
1.2
5000 bp
5000 bp
1500 bp
1500 bp
500 bp
500 bp
c)
m
1.1
c)
1.2
1.1
5000 bp
1.2
m
5000 bp
1500 bp
1500 bp
500 bp
500 bp
c)
m
1.1
1.2
6000 bp
3000 bp
1000 bp
Figura 3.10: Separação electroforética dos fragmentos de DNA palsmídico obtidos a partir das análises de restrição de
várias construções em pENTR/D-TOPO: a) fragmento da região promotora da AGP1 em pENTR/D-TOPO não digerido
(1.1) e digerido pelas enzimas de restrição (1.2) e fragmento da região promotora da AGP15 em pENTR/D-TOPO não
digerido (2.1) e digerido pelas enzimas de restrição (2.2); b) fragmento da região promotora da AGP20 em pENTR/DTOPO não digerido (1.1) e digerido pelas enzimas de restrição (1.2); c) fragmento da região promotora da AGP23 em
pENTR/D-TOPO não digerido (1.1) e digerido pelas enzimas de restrição; (continuação da legenda na próxima página)
38
(continuação da legenda da figura 3.10 da página anterior) d) fragmento da região promotora da AGP9 em pENTR/DTOPO não digerido (1.1) e digerido pelas enzimas de restrição; e) fragmento da região promotora da AGP12 em
pENTR/D-TOPO não digerido (1.1) e digerido pelas enzimas de restrição. m – marcador de tamanhos moleculares
(GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, Fermentas e GeneRuler 1 KB DNA Ladder).
Os resultados da análise de restrição feita aos clones recombinantes foram os esperados, ou
seja, após a separação electroforética dos fragmentos obtidos observa-se uma banda
correspondente ao vector, com cerca de 2580 bp, e uma banda com o tamanho aproximado do
fragmento de inserção (figura 3.10). De acordo com os resultados obtidos seleccionou-se um clone
recombinante por cada uma das construções obtidas, e estes foram sequenciados de modo a
confirmar a presença do fragmento de inserção no local e na orientação correctos. Todos estes
clones foram sequenciados utilizando o oligonucleótido de iniciação universal M13 Forward e o
oligonucleótido de iniciação esquerdo utilizado para amplificação de cada uma das sequências por
PCR, pelo que o fragmento sequenciado corresponde apenas ao local de recombinação attL1 e a
uma pequena porção de cada uma das inserções. Após alinhamento dos fragmentos sequenciados
com a sequência esperada para cada uma das construções (anexo V) verificou-se que os clones
recombinantes seleccionados estavam no local e na orientação correctos.
3.6 Obtenção das construções pAGP::NLS:3xGFP
Todas as sequências promotoras, excepto a da AGP20, foram transferidas dos respectivos
vectores de entrada para o vector de destino pNLS3xGFPnost-pGII. Este é um vector binário que
permite a expressão de GFP direccionada para o núcleo, possuindo 3 repetições da molécula de
GFP ligadas a uma sequência de localização nuclear (NLS), sob o controlo de sequências
promotoras endógenas (figura 3.11). Os vectores de entrada foram linearizados com enzimas de
restrição apropriadas, de modo a evitar o corte dos diferentes fragmentos de inserção e dos locais
de recombinação, uma vez que os vectores de entrada, pENTR/D-TOPO e o vector de destino
pNLS3xGFPnost-pGII possuem um gene de resistência ao mesmo antibiótico, a canamicina. Este
passo permitiu evitar a formação de falsos clones positivos nesta segunda clonagem. Através de
uma reacção de recombinação para cada uma das diferentes construções, as sequências
promotoras foram transferidas a partir dos respectivos vectores de entrada para o vector de destino
pNLS3xGFPnost-pGII.
39
pAGP
NLS
GFP
GFP
GFP
nost
Figura 3.11 – Representação esquemática das construções pAGP::NLS:3xGFP. pAGP - fragmento da região promotora
da AGP; NLS – sinal de localização nuclear; GFP – proteína de flurescência verde; nost – terminador da nopalina
sintetase.
Os produtos das reacções de recombinação foram utilizados separadamente para a
transformação de uma alíquota de E.coli DH5α por cada reacção. Dos transformantes obtidos foram
seleccionados os clones recombinantes por análise de restrição. Para a análise de restrição foram
utilizadas enzimas de restrição que cortassem o fragmento de inserção e o plasmídeo. Sendo
assim, diferentes enzimas de restrição foram utilizadas para as diferentes cosntruções. Para as
construções pAGP1::NLS:3xGFP, pAGP9::NLS:3xGFP, pAGP10::NLS:3xGFP e pAGP15::NLS:3xGFP
utilizou-se a HindIII. Para a construção pAGP12::NLS:3xGFP utilizaram-se as enzimas de restrição
SalI e BamHI e para a construção pAGP23::NLS:3xGFP utilizaram-se as enzimas de restrição SalI e
SpeI. Após a análise electroforética esperavam-se diferentes padrões de bandas resultantes da
separação dos fragmentos de DNA plamídico clivados pelas enzimas de restrição (tabela 3.1).
Tabela 3.1: Tamanho dos fragmentos de DNA plasmídico esperados para cada construção
pAGP::NLS:3xGFP após análise de restrição.
Construções
Enzimas de
restrição
Tamanho dos fragmentos esperados
após restrição enzimática
pAGP1::NLS:3xGFP
HindIII
7500 bp, 550 bp
pAGP9::NLS:3xGFP
HindIII
8200 bp, 610 bp, 340 bp, 390 bp
pAGP10::NLS:3xGFP
HindIII
7890 bp, 1020 bp, 800 bp, 420 bp
pAGP12::NLS:3xGFP
SalI e BamHI
7670 bp, 1260 bp, 800 bp
pAGP15::NLS:3xGFP
HindIII
7660 bp, 1080 bp, 805 bp
pAGP23::NLS:3xGFP
SalI e SpeI.
7100 bp, 800 bp, 670 bp
Foram testados vários clones e detectados clones recombinantes que apresentam o padrão
de
bandas
esperado
para
as
construções
pAGP1::NLS:3xGFP,
pAGP9::NLS:3xGFP,
pAGP10::NLS:3xGFP e pAGP15::NLS:3xGFP (figura 3.12).
40
a)
m
1
2
b)
3000 bp
3000 bp
1000 bp
1000 bp
500 bp
500 bp
c)
m
1
2
d)
m
1
1
2
2
m
3000 bp
3000 bp
1000 bp
1000 bp
500 bp
500 bp
Figura 3.12: Separação electroforética dos fragmentos de DNA palsmídico obtidos a partir das análises de restrição de
várias construções em pNLS3xGFPnost-pGII: a) pAGP1::NLS:3xGFP não digerido (1.1) e digerido pelas enzimas de
restrição (1.2); b) pAGP9::NLS:3xGFP não digerido (1.1) e digerido pelas enzimas de restrição (1.2); c)
pAGP10::NLS:3xGFP não digerido (1.1) e digerido pelas enzimas de restrição (1.2); d) pAGP15::NLS:3xGFP não
digerido (1.1) e digerido pelas enzimas de restrição (1.2) m – marcador de tamanhos moleculares (GeneRuler DNA
Ladder Mix, Fermentas).
Para as construções pAGP12::NLS:3xGFP e pAGP23::NLS:3xGFP o padrão de bandas
detectado foi diferente do esperado para todos os clones testados. O cálculo do tamanho dos
diferentes fragmentos esperados da análise de restrição é apenas aproximado, uma vez que ainda
não está disponível a sequência completa deste plasmídeo. Sendo assim, após análise de restrição
seleccionou-se um clone recombinante por cada uma das construções obtidas confirmadas por
41
análise de restrição e um clone por cada uma das construções obtidas mas não confirmadas pela
análise de restrição e estes foram sequenciados de modo a confirmar a presença do fragmento de
inserção no local e na orientação correctos. Todos estes clones foram sequenciados utilizando o
oligonucleótido de iniciação universal M13 Forward. Após alinhamento dos fragmentos
sequenciados com a sequência esperada para cada uma das construções (anexo VI) verificou-se
que todos clones recombinantes seleccionados estavam no local e na orientação correctos. Os
resultados relativos à sequenciação da construção pAGP1::NLS:3xGFP não foram os esperados,
devido a erros no processo de sequenciação, no entanto, como os resultados da análise de restrição
foram os esperados, prosseguiu-se com o estudo para esta proteína, bem como para todas as
outras.
Foram seleccionados clones recombinantes para cada uma das construções obtidas para a
transformação de Agrobacterium tumefaciens. A selecção dos transformantes foi efectuada em
meio de cultura selectivo, utilizando canamicina, tetraciclina, rifampicina e gentamicina. Os clones
recombinantes seleccionados nestas culturas foram submetidos a análise de restrição utilizando as
mesmas enzimas de restrição descritas acima, de forma idêntica à apresentada para rastreio dos
clones transformantes pAGP::NLS3xGFP. Como o A. tumefaciens produz poucas cópias dos
plasmídeos que contém, não é aconselhado efectuarem-se os ensaios de restrição com este DNA
plasmídico. Sendo assim, primeiro procedeu-se à extracção dos plasmídeos das bactérias
transformadas, depois à transformação de E. coli DH5α com estes plasmídeos e por fim os clones
positivos foram seleccionados por análise de restrição. Os clones positivos foram utilizados para a
transformação de Arabidopsis thaliana por floral dip.
42
4. Discussão
A análise molecular e funcional de todos os mecanismos envolvidos na dupla fecundação
constitui uma área de estudo muito importante na biologia vegetal, uma vez que este processo
representa um aspecto central do ciclo de vida das Angiospérmicas. O direccionamento do TP até
ao saco embrionário é um mecanismo fundamental para que ocorra a dupla fecundação, e este
direccionamento, na última fase de crescimento do TP, está dependente de interacções que
ocorrem entre o TP e os tecidos do pistilo que rodeiam o GF e as diferentes células que o
constituem (Yadegari e Drews, 2004).
A maior parte destes mecanismos de interacção eram até há pouco tempo desconhecidos.
No entanto, durante os últimos anos vários estudos utilizando diferentes espécies de plantas
permitiram elucidar alguns dos mecanismos envolvidos no direccionamento do TP. (Higashyama e
Hamamura, 2008). Mas, apesar dos numerosos trabalhos efectuados a nível das interacções que
ocorrem entre o tubo polínico e os tecidos e células femininas, estes estudos tornam-se bastante
difíceis uma vez que todos estes processos ocorrem em estruturas profundamente envolvidas pelos
tecidos esporofíticos da flor. Recentemente, o desenvolvimento de novas abordagens genéticas e
moleculares e o aperfeiçoamento das técnicas de microdissecção permitiram um rápido avanço
nesta área de estudo, permanecendo, no entanto, ainda muitos mecanismos por compreender.
Com este trabalho pretendeu-se contribuir para o esclarecimento da função das AGPs nas
diferentes células e tecidos do pistilo. A presença destas proteínas foi detectada nestes tecidos
através de estudos de imunocitoquímica, com um padrão de distribuição muito específico (Coimbra
et al., 2007): nas células gametofíticas, nomeadamente no aparelho filiforme, nas células do
tegumento micropilar e do nucelo micropilar. A presença das AGPs nestas células e tecidos, que
representam o trajecto que o TP segue quando direccionado para o saco embrionário, sugere o seu
envolvimento no processo de atracção do tubo para o saco embrionário. Neste trabalho, de modo a
permitir a identificação de AGPs de A. thaliana que podem estar envolvidos neste processo, foram
obtidas construções que permitem efectuar a localização celular destas proteínas. Estas AGPs
foram previamente seleccionadas por análise de dados de microarrays e RT-PCR em tempo real.
Foram assim obtidas construções que permitem a expressão do gene repórter NLS:3xGFP sob o
controlo dos promotores endógenos de 6 AGPs: AGP1, AGP9, AGP10, AGP12, AGP15 e AGP23.
Estas construções foram designadas, de um modo geral, por pAGP::NLS:3xGFP.
43
4.1 Selecção das AGPs
Foram seleccionadas 3 AGPs clássicas: AGP1, AGP9, AGP10, 5 péptidos AG: AGP12, AGP15,
AGP16, AGP20 e AGP21 com base em dados de microarrays correspondentes a experiências
efectuadas com ovários de Arabidopsis thaliana. No entanto, a nível da flor, os dados de expressão
génica disponíveis em bases de dados actualmente apenas permitem estabelecer padrões de
expressão para os estames, o pólen, para o estigma e para os ovários. Sendo assim, e como o
principal objectivo deste trabalho consiste no estudo de genes de AGPs presentes no GF, foram
também analisados dados relativos a experiências de microarrays nas sinergídeas, na célula central
e na oosfera (dados não publicados, Laboratório do Prof. Dresselhaus, Universidade de Regensburg)
bem como os dados de microarrays relativos a experiências feitas com pólen e com os gâmetas
masculinos (Borges et al., 2008). Esta análise permitiu tornar a selecção mais específica, obtendose 4 AGPs clássicas: AGP1, AGP5, AGP9 e AGP10, 6 péptidos AG: AGP12, AGP15, AGP16, AGP20,
AGP21 e AGP23 como sendo as que possuem níveis de expressão génica relativa mais elevados
nas sinergídeas, na célula central e na oosfera. Com estes dados foram seleccionadas mais 2 AGPs,
a AGP5 e a AGP23. Nas experiências relativas aos ovários é analisada a expressão dos genes em
todos os tecidos do carpelo, sendo que AGPs que poderiam apresentar níveis de expressão elevada
nas células do GF, aqui podem revelar níveis de expressão relativa mais baixos, e o inverso pode
também acontecer. Daí que algumas das AGPs não tenham sido seleccionadas na primeira análise.
Foram também utilizados dados de microarrays relativos a experiências feitas com pólen e
gâmetas masculinos (Borges et al., 2008) de forma a verificar se existiria algum padrão de
expressão comum dos genes das diferentes AGPs nas células do GF e no pólen e gâmetas
masculinos. No entanto isto não se observou.
Relativamente à expressão génica relativa das AGPs nas células do GF, verificou-se que a
AGP16, a AGP20, AGP12, a AGP21, a AGP 23 e a AGP24 apresentam padrões de expressão
semelhantes, sendo expressas na oosfera, nas sinergídeas e na célula central.
De modo a complementar esta selecção baseada em dados de experiências de microarrays
fez-se uma análise das similaridades existentes entre as sequências proteicas das AGPs clássicas,
dos péptidos AG e das AGPs ricas em lisina. As FLAs não foram incluídas nesta análise uma vez que
constituem um grupo bastante heterogéneo, podendo apresentar um ou dois domínios típicos das
AGPs e um ou dois domínios tipo-fasciclina, sendo que estes domínios, por sua vez, apresentam
uma similaridade entre as sequências muito reduzida (Johnson et al., 2003). Isto poderia diminuir a
44
exactidão do alinhamento, e uma vez que estas FLAs não foram seleccionadas para este estudo
optou-se por exclui-las desta análise.
Esta análise revelou que existe uma maior similaridade entre as sequências proteicas da
AGP16 e da AGP20, da AGP12 e da AGP21 bem como da AGP1 e da AGP5, reunindo estas AGPs
em 3 grupos. Estas similaridades poderão sugerir que estas proteínas desempenham funções
semelhantes nos tecidos em que se encontram. Estudos prévios, com AGPs, sugerem que poderá
existir uma relação entre a formação de grupos evolutivos e a similaridade funcional destes grupos
(Faik et al., 2006). Curiosamente a AGP16 e a AGP20 bem como a AGP21 e a AGP12, aqui
agrupadas, apresentam um padrão de expressão génica relativa semelhante, conforme referido
acima, o que poderá indicar que estas duas proteínas desempenham funções semelhantes. As
AGPs constituem uma grande família de proteínas, e nestes casos é comum existir alguma
redundância funcional. Esta redundância funcional foi já verificada recentemente para a AGP6 e a
AGP11 no pólen (Coimbra et al., 2009).
A expressão dos genes das AGP1, AGP9, AGP10, AGP12, AGP15, AGP16, AGP20 e AGP21
foi analisada por PCR em tempo real de modo a confirmar os dados obtidos a partir das
experiências de microarrays. Esta análise foi efectuada antes de se ter acesso aos dados de
microarrays relativos a experiências com as células do GF, por isso foi efectuada com as primeiras
AGPs seleccionadas. Os resultados obtidos permitiram confirmar a expressão destes genes nos
óvulos, e mostraram que os genes da AGP9 e da AGP12 apresentam níveis de expressão relativa
um pouco mais altos do que o gene de referência e que os genes da AGP10 e da AGP20
apresentam níveis de expressão relativa mais baixos do que o gene de referência. Quanto aos genes
da AGP1 e da AGP15, verificou-se que os seus níveis de expressão relativa estão muito próximos
dos nineis de expressão relativa do gene de referência. Uma vez que tiveram de ser efectuadas
reacções independentes para cada um dos genes em estudo, os resultados obtidos para cada gene
foram comparados apenas com o gene de referência utilizado em cada uma das experiências, não
se comparando a expressão dos diferentes genes de AGPs em estudo entre si.
4.2 Obtenção das construções pAGP::NLS:3xGFP
Para o prosseguimento deste estudo optou-se por obter construções pAGP::NLS:3xGFP para
as AGP1, AGP9, AGP10, AGP12, AGP15, AGP20 e AGP23, deixando as restantes AGPs, AGP5,
AGP21 e AGP16 para estudos posteriores. Este plasmídeo, aqui utilizado, permite efectuar a
45
observação da expressão do gene repórter NLS:3xGFP sob o controlo de promotores endógenos das
AGPs em estudo. O sinal de localização nuclear (NLS) permitirá concentrar a localização da GFP no
núcleo das células, facilitando assim a visualização do transgene e tornando o sinal de fluorescência
mais nítido. Foram obtidas as construções pAGP::NLS:3xGFP para todas as AGPs, excepto para a
AGP20. No entanto, o promotor da AGP20 encontra-se inserido no vector pENTR/D-TOPO o que
permitirá, mais tarde a sua recombinação com o vector de destino pNLS3xGFPnost-pGII e a
obtenção da respectiva construção. Foram já transformadas plantas de Arabidopsis thaliana com
estas construções. As sementes destas plantas serão colhidas, sementeiras serão feitas em terra e
as plantas devidamente seleccionadas para estudos de localização de AGPs. Os óvulos destas
plantas serão observados ao microscópio confocal (CLSM).
Estas construções permitirão localizar a nível celular as AGPs em estudo e confirmar os
dados obtidos a partir das experiências de microarrays. A obtenção destas construções é
extremamente importante para se prosseguir com futuros estudos funcionais das AGPs. Todos os
estudos de imunocitoquímica (Coimbra e Salema, 1997; Coimbra e Duarte, 2003; Pereira et al.,
2006; Coimbra et al., 2007) permitem apenas verificar a presença de AGPs, uma vez que
reconhecem apenas epítopos de carbohidratos presentes em todas estas proteínas, e não
determinam que AGPs específicas estão presentes ao longo deste trajecto. Estas construções
permitirão identificar a localização celular de AGPs específicas e determinar se algumas destas
AGPs são as que se encontram presentes ao longo do trajecto seguido pelo TP na sua fase final de
direccionamento, identificadas em estudos anteriores (Coimbra et al., 2007).
4.3 Considerações finais
As AGPs constituem uma grande família de proteínas, tendo sido já identificados 47 genes
que codificam estruturas proteicas de AGPs (Schultz et al., 2000, 2002). O estudo das AGPs, que
se encontram presentes nas células do saco embrionário, no nucelo micropilar e no próprio
micrópilo dos óvulos de Arabidopsis thaliana, torna-se bastante difícil uma vez que estes se
encontram profundamente envolvidos pelos restantes tecidos do óvulo, no interior dos ovários. Estas
moléculas possuem um padrão de distribuição bastante específico nestes tecidos (Coimbra et al.,
2007). Sendo assim, o desenvolvimento de ferramentas que permitam identificar cada AGP
específica presente nestas células e/ou tecidos reveste-se de enorme importância para que futuros
46
estudos funcionais possam ser efectuados de forma a esclarecer se estas proteínas estão
envolvidas nos processos de direccionamento do TP para o saco embrionário.
Neste trabalho determinaram-se quais as AGPs candidatas a estarem envolvidas no processo
de direccionamento do TP. As AGPs são óptimas candidatas a moléculas de sinalização para este
processo de direccionamento em Arabidopsis thaliana.
Vários estudos consideram as pequenas proteínas e péptidos como os principais candidatos
para a mediação dos diferentes eventos de comunicação que ocorrem durante a reprodução
sexuada das plantas com flor (Dresselhaus, 2006). Pelo que os péptidos AG poderão funcionar
como estas moléculas de sinalização.
As AGPs possuem várias características que as tornam boas candidatas a moléculas de
atracção. Para além da sua presença nestes tecidos, com um padrão de distribuição bastante
específico (Coimbra et al., 2007), estas proteínas possuem várias características que as tornam
boas candidatas a moléculas de atracção. Encontram-se presentes no aparelho filiforme das
sinergídeas, podendo estar relacionadas com as secreções produzidas por estas células através do
micropilo (Coimbra et al., 2007) e estão ancoradas à membrana através de uma âncora GPI o que
lhes fornece um possível mecanismo de libertação a partir da membrana citoplasmática para o
meio extracelular (Borner et al., 2002; Schultz et al., 2004). Para além de tudo isto, as AGPs são
proteínas altamente glicosiladas, e vários estudos sugerem que uma das principais funções da
glicosilação é facilitar a secreção das proteínas (Borner et al., 2002).
No entanto, desconhece-se se as moléculas de atracção produzidas pelas sinergídeas serão
apenas uma substância ou um conjunto de substâncias. Estas substâncias poderão funcionar de
forma redundante ou em conjunto, num complexo (Higashiyama e Hamamura, 2008). É possível
que existam várias moléculas de atracção redundantes, o que dificultará o estudo de mutantes, e
mesmo a identificação prévia de moléculas de atracção (McCormick e Yang, 2005).
As ferramentas obtidas com a realização deste trabalho permitirão localizar a nível celular as
AGPs específicas presentes nos tecidos do pistilo. Sabendo-se que AGPs específicas estão presentes
nestes tecidos, será possível prosseguir com estudos funcionais de mutantes knock-out e knock-
down, de forma a esclarecer a função destas proteínas nos tecidos femininos, determinando se
estão envolvidas no processo de direccionamento do TP até ao saco embrionário.
47
5. Referências Bibliográficas
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52
Anexos
Anexo I - Representação esquemática das reacções de recombinação BP e LR que
constituem a base da tecnologia Gateway
Reacção BP - facilita a recombinação dos produtos de PCR que contêm os locais de recombinação
específicos attB com um vector dador que contenha os locais de recombinação específicos attP,
como o pENTR/D-TOPO, de modo a originar um vector de entrada que contenha os locais de
recombinação específicos attL.
Reacção LR - facilita a recombinação de um vector de entrada que contenha os locais de
recombinação específicos attL com um vector de destino que contenha os locais de recombinação
específicos attR, como por exemplo o pNLS3xGFPnost-pGII, de modo a originar um vector de
expressão que contenha os locais de recombinação específicos attB.
(Adaptado a partir de Gateway® Technology: A universal technology to clone DNA sequences for
functional analysis and expression in multiple systems. Nº de catálogo: 12535-019 e 12535-027)
53
Anexo II - Curvas de dissociação dos genes em estudo nas experiências de RT-PCR em
tempo real
Curva de dissociação – UBC9
Figura 1: Resultado da curva de dissociação para o gene da UBC9. A curva demonstra as temperaturas de
emparelhamento e a pureza dos fragmentos gerados neste ensaio. A curva foi realizada utilizando o programa iQ5 2.0,
Standard Edition Optical System Software versão 2.0 (Biorad).
Curva de dissociação – AGP1
Figura 2: Resultado da curva de dissociação para o gene da AGP1. A curva demonstra as temperaturas de
emparelhamento e a pureza dos fragmentos gerados neste ensaio. A curva foi realizada utilizando o programa iQ5 2.0,
Standard Edition Optical System Software versão 2.0 (Biorad).
54
Curva de dissociação – AGP9
Figura 3: Resultado da curva de dissociação para o gene da AGP9. A curva demonstra as temperaturas de
emparelhamento e a pureza dos fragmentos gerados neste ensaio. A curva foi realizada utilizando o programa iQ5 2.0,
Standard Edition Optical System Software versão 2.0 (Biorad).
Curva de dissociação – AGP10
Figura 4: Resultado da curva de dissociação para o gene da AGP10. A curva demonstra as temperaturas de
emparelhamento e a pureza dos fragmentos gerados neste ensaio. A curva foi realizada utilizando o programa iQ5 2.0,
Standard Edition Optical System Software versão 2.0 (Biorad).
55
Curva de dissociação – AGP12
Figura 5: Resultado da curva de dissociação para o gene da AGP12. A curva demonstra as temperaturas de
emparelhamento e a pureza dos fragmentos gerados neste ensaio. A curva foi realizada utilizando o programa iQ5 2.0,
Standard Edition Optical System Software versão 2.0 (Biorad).
Curva de dissociação – AGP15
Figura 6: Resultado da curva de dissociação para o gene da AGP15. A curva demonstra as temperaturas de
emparelhamento e a pureza dos fragmentos gerados neste ensaio. A curva foi realizada utilizando o programa iQ5 2.0,
Standard Edition Optical System Software versão 2.0 (Biorad).
56
Curva de dissociação – AGP20
Figura 7: Resultado da curva de dissociação para o gene da AGP20. A curva demonstra as temperaturas de
emparelhamento e a pureza dos fragmentos gerados neste ensaio. A curva foi realizada utilizando o programa iQ5 2.0,
Standard Edition Optical System Software versão 2.0 (Biorad).
57
Anexo III - Curvas padrão dos genes em estudo nas experiências de RT-PCR em tempo
real para determinação da eficiência das reacções
Curva Padrão – AGP1
Figura 1: Resultado da curva padrão para o gene da AGP1. O declive é de -3,201 sendo a eficiência da reação de
105,3%, e o R=0,999. A curva foi realizada utilizando o programa iQ5 2.0, Standard Edition Optical System Software
versão 2.0 (Biorad).
Curva Padrão – UBC9
Figura 2: Resultado da curva padrão para o gene da UBC9. O declive é de -3,262 sendo a eficiência da reação de
102,6%, e o R=0,992. A curva foi realizada utilizando o programa iQ5 2.0, Standard Edition Optical System Software
versão 2.0 (Biorad).
58
Curva Padrão – AGP9
Figura 3: Resultado da curva padrão para o gene da AGP9. O declive é de -3,525 sendo a eficiência da reação de
92,2%, e o R=1. A curva foi realizada utilizando o programa iQ5 2.0, Standard Edition Optical System Software versão
2.0 (Biorad).
Curva Padrão – UBC9
Figura 4: Resultado da curva padrão para o gene da UBC9. O declive é de -3,511 sendo a eficiência da reação de
92,7%, e o R=0,972. A curva foi realizada utilizando o programa iQ5 2.0, Standard Edition Optical System Software
versão 2.0 (Biorad).
59
Curva Padrão – AGP10
Figura 5: Resultado da curva padrão para o gene da AGP10. O declive é de -3,504 sendo a eficiência da reação de
92,9%, e o R=1. A curva foi realizada utilizando o programa iQ5 2.0, Standard Edition Optical System Software versão
2.0 (Biorad).
Curva Padrão – UBC9
Figura 6: Resultado da curva padrão para o gene da UBC9. O declive é de -3,444 sendo a eficiência da reação de
95,1%, e o R=0,999. A curva foi realizada utilizando o programa iQ5 2.0, Standard Edition Optical System Software
versão 2.0 (Biorad).
60
Curva Padrão – AGP12
Figura 7: Resultado da curva padrão para o gene da AGP12. O declive é de -3,370 sendo a eficiência da reação de
98%, e o R=0,998. A curva foi realizada utilizando o programa iQ5 2.0, Standard Edition Optical System Software
versão 2.0 (Biorad).
Curva Padrão – UBC9
Figura 8: Resultado da curva padrão para o gene da UBC9. O declive é de -3,239 sendo a eficiência da reação de
103,6%, e o R=0,998. A curva foi realizada utilizando o programa iQ5 2.0, Standard Edition Optical System Software
versão 2.0 (Biorad).
61
Curva Padrão – AGP15
Figura 9: Resultado da curva padrão para o gene da AGP15. O declive é de -3,517 sendo a eficiência da reação de
92,4%, e o R=0,998. A curva foi realizada utilizando o programa iQ5 2.0, Standard Edition Optical System Software
versão 2.0 (Biorad).
Curva Padrão – UBC9
Figura 10: Resultado da curva padrão para o gene da UBC9. O declive é de -3,239 sendo a eficiência da reação de
103,6%, e o R=0,998. A curva foi realizada utilizando o programa iQ5 2.0, Standard Edition Optical System Software
versão 2.0 (Biorad).
62
Curva Padrão – AGP20
Figura 11: Resultado da curva padrão para o gene da AGP20. O declive é de -3,284 sendo a eficiência da reação de
101,6%, e o R=0,982. A curva foi realizada utilizando o programa iQ5 2.0, Standard Edition Optical System Software
versão 2.0 (Biorad).
Curva Padrão – UBC9
Figura 12: Resultado da curva padrão para o gene da UBC9. O declive é de -3,239 sendo a eficiência da reação de
103,6%, e o R=0,998. A curva foi realizada utilizando o programa iQ5 2.0, Standard Edition Optical System Software
versão 2.0 (Biorad).
63
Anexo IV – Representação esquemática do vector pENTR/D-TOPO
64
Anexo V – Resultado da sequenciação das construções obtidas após recombinação
com o vector pENTR/D-TOPO
Alinhamento da sequência esperada para o fragmento da região promotora para o gene da AGP1 inserido no
vector pENTR/D-TOPO (TOPOAGP1) com o resultado da sequenciação, com o oligonucleótido universal
M13uni, da construção obtida após recombinação da sequência promotora como vector pENTR/D-TOPO
(TOPOAGP1_M13uni). O alinhamento das sequências foi efectuado recorrendo ao programa ClustalW2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html).
65
Alinhamento da sequência esperada para o fragmento da região promotora para o gene da AGP1 inserido no
vector pENTR/D-TOPO (TOPOAGP1) com o resultado da sequenciação, com o oligonucleótido de iniciação
esquerdo utilizado para amplificação da sequência por PCR, da construção obtida após recombinação da
sequência promotora como vector pENTR/D-TOPO (TOPOAGP10_pAGP1rv). O alinhamento das sequências
foi efectuado recorrendo ao programa ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html).
66
Alinhamento da sequência esperada para o fragmento da região promotora para o gene da AGP9 inserido no
vector pENTR/D-TOPO (TOPOAGP9) com o resultado da sequenciação, com o oligonucleótido universal
M13uni, da construção obtida após recombinação da sequência promotora como vector pENTR/D-TOPO
(TOPOAGP9_M13uni). O alinhamento das sequências foi efectuado recorrendo ao programa ClustalW2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html).
67
Alinhamento da sequência esperada para o fragmento da região promotora para o gene da AGP9 inserido no
vector pENTR/D-TOPO (TOPOAGP9) com o resultado da sequenciação, com o oligonucleótido de iniciação
esquerdo utilizado para amplificação da sequência por PCR, da construção obtida após recombinação da
sequência promotora como vector pENTR/D-TOPO (TOPOAGP9_pAGP9rv). O alinhamento das sequências foi
efectuado recorrendo ao programa ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html).
68
Alinhamento da sequência esperada para o fragmento da região promotora para o gene da AGP10 inserido
no vector pENTR/D-TOPO (TOPOAGP10) com o resultado da sequenciação, com o oligonucleótido universal
M13uni, da construção obtida após recombinação da sequência promotora como vector pENTR/D-TOPO
(TOPOAGP10_M13uni). O alinhamento das sequências foi efectuado recorrendo ao programa ClustalW2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html).
69
Alinhamento da sequência esperada para o fragmento da região promotora para o gene da AGP10 inserido
no vector pENTR/D-TOPO (TOPOAGP10) com o resultado da sequenciação, com o oligonucleótido de
iniciação esquerdo utilizado para amplificação da sequência por PCR, da construção obtida após
recombinação da sequência promotora como vector pENTR/D-TOPO (TOPOAGP10_pAGP10rv). O
alinhamento
das
sequências
foi
efectuado
recorrendo
ao
programa
ClustalW2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html).
70
Alinhamento da sequência esperada para o fragmento da região promotora para o gene da AGP12 inserido
no vector pENTR/D-TOPO (TOPOAGP12) com o resultado da sequenciação, com o oligonucleótido universal
M13uni, da construção obtida após recombinação da sequência promotora como vector pENTR/D-TOPO
(TOPOAGP12_M13uni). O alinhamento das sequências foi efectuado recorrendo ao programa ClustalW2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html).
71
Alinhamento da sequência esperada para o fragmento da região promotora para o gene da AGP12 inserido
no vector pENTR/D-TOPO (TOPOAGP12) com o resultado da sequenciação, com o oligonucleótido de
iniciação esquerdo utilizado para amplificação da sequência por PCR, da construção obtida após
recombinação da sequência promotora como vector pENTR/D-TOPO (TOPOAGP12_pAGP12rv). O
alinhamento
das
sequências
foi
efectuado
recorrendo
ao
programa
ClustalW2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html).
72
Alinhamento da sequência esperada para o fragmento da região promotora para o gene da AGP15 inserido
no vector pENTR/D-TOPO (TOPOAGP15) com o resultado da sequenciação, com o oligonucleótido universal
M13uni, da construção obtida após recombinação da sequência promotora como vector pENTR/D-TOPO
(TOPOAGP15_M13uni). O alinhamento das sequências foi efectuado recorrendo ao programa ClustalW2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html).
73
Alinhamento da sequência esperada para o fragmento da região promotora para o gene da AGP15 inserido
no vector pENTR/D-TOPO (TOPOAGP15) com o resultado da sequenciação, com o oligonucleótido de
iniciação esquerdo utilizado para amplificação da sequência por PCR, da construção obtida após
recombinação da sequência promotora como vector pENTR/D-TOPO (TOPOAGP15_pAGP15rv). O
alinhamento
das
sequências
foi
efectuado
recorrendo
ao
programa
ClustalW2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html).
74
Alinhamento da sequência esperada para o fragmento da região promotora para o gene da AGP20 inserido
no vector pENTR/D-TOPO (TOPOAGP20) com o resultado da sequenciação, com o oligonucleótido universal
M13uni, da construção obtida após recombinação da sequência promotora como vector pENTR/D-TOPO
(TOPOAGP20_M13uni). O alinhamento das sequências foi efectuado recorrendo ao programa ClustalW2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html).
75
Alinhamento da sequência esperada para o fragmento da região promotora para o gene da AGP20 inserido
no vector pENTR/D-TOPO (TOPOAGP20) com o resultado da sequenciação, com o oligonucleótido de
iniciação esquerdo utilizado para amplificação da sequência por PCR, da construção obtida após
recombinação da sequência promotora como vector pENTR/D-TOPO (TOPOAGP20_pAGP20rv). O
alinhamento
das
sequências
foi
efectuado
recorrendo
ao
programa
ClustalW2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html).
76
Alinhamento da sequência esperada para o fragmento da região promotora para o gene da AGP23 inserido
no vector pENTR/D-TOPO (TOPOAGP23) com o resultado da sequenciação, com o oligonucleótido universal
M13uni, da construção obtida após recombinação da sequência promotora como vector pENTR/D-TOPO
(TOPOAGP23_M13uni). O alinhamento das sequências foi efectuado recorrendo ao programa ClustalW2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html).
77
Alinhamento da sequência esperada para o fragmento da região promotora para o gene da AGP23 inserido
no vector pENTR/D-TOPO (TOPOAGP23) com o resultado da sequenciação, com o oligonucleótido de
iniciação esquerdo utilizado para amplificação da sequência por PCR, da construção obtida após
recombinação da sequência promotora como vector pENTR/D-TOPO (TOPOAGP23_pAGP23rv). O
alinhamento
das
sequências
foi
efectuado
recorrendo
ao
programa
ClustalW2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html).
78
Anexo VI – Resultado da sequenciação das construções obtidas após recombinação do
vector pENTR/D-TOPO, contendo a sequência promotora de cada AGP, com o vector
pNLS3xGFPnost-pGII
Alinhamento da sequência esperada para o fragmento da região promotora para o gene da AGP1 inserido no
vector pNLS3xGFPnost-pGII (pAGP1NLS3GFP) com o resultado da sequenciação, com o oligonucleótido
universal M13uni, da construção obtida após recombinação do vector pENTR/D-TOPO, contendo a sequência
promotora da AGP1, com o vector pNLS3xGFPnost-pGII (pAGP1NLS3GFP_M13uni). O alinhamento das
sequências
foi
efectuado
recorrendo
ao
programa
ClustalW2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html).
79
Alinhamento da sequência esperada para o fragmento da região promotora para o gene da AGP9 inserido no
vector pNLS3xGFPnost-pGII (pAGP9NLS3GFP) com o resultado da sequenciação, com o oligonucleótido
universal M13uni, da construção obtida após recombinação do vector pENTR/D-TOPO, contendo a sequência
promotora da AGP9, com o vector pNLS3xGFPnost-pGII (pAGP9NLS3GFP_M13uni). O alinhamento das
sequências
foi
efectuado
recorrendo
ao
programa
ClustalW2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html).
80
Alinhamento da sequência esperada para o fragmento da região promotora para o gene da AGP10 inserido
no vector pNLS3xGFPnost-pGII (pAGP10NLS3GFP) com o resultado da sequenciação, com o oligonucleótido
universal M13uni, da construção obtida após recombinação do vector pENTR/D-TOPO, contendo a sequência
promotora da AGP10, com o vector pNLS3xGFPnost-pGII (pAGP10NLS3GFP_M13uni). O alinhamento das
sequências
foi
efectuado
recorrendo
ao
programa
ClustalW2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html).
81
Alinhamento da sequência esperada para o fragmento da região promotora para o gene da AGP12 inserido
no vector pNLS3xGFPnost-pGII (pAGP12NLS3GFP) com o resultado da sequenciação, com o oligonucleótido
universal M13uni, da construção obtida após recombinação do vector pENTR/D-TOPO, contendo a sequência
promotora da AGP12, com o vector pNLS3xGFPnost-pGII (pAGP12NLS3GFP_M13uni). O alinhamento das
sequências
foi
efectuado
recorrendo
ao
programa
ClustalW2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html).
82
Alinhamento da sequência esperada para o fragmento da região promotora para o gene da AGP15 inserido
no vector pNLS3xGFPnost-pGII (pAGP15NLS3GFP) com o resultado da sequenciação, com o oligonucleótido
universal M13uni, da construção obtida após recombinação do vector pENTR/D-TOPO, contendo a sequência
promotora da AGP15, com o vector pNLS3xGFPnost-pGII (pAGP15NLS3GFP_M13uni). O alinhamento das
sequências
foi
efectuado
recorrendo
ao
programa
ClustalW2
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html).
83