AVALIAÇÃO DOS EFEITOS FARMACOLÓGICOS DO

1
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
JOSÉ AFONSO CORRÊA DA SILVA
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS FARMACOLÓGICOS DO ÓLEO
ESSENCIAL DE Chenopodium ambrosioides
SOBRE O SISTEMA NERVOSO CENTRAL
Itajaí 2015
2
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
AREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
JOSÉ AFONSO CORRÊA DA SILVA
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS FARMACOLÓGICOS DO ÓLEO
ESSENCIAL DE Chenopodium ambrosioides
SOBRE O SISTEMA NERVOSO CENTRAL
Dissertação submetida à Universidade do Vale do
Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção
do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Drª. Márcia Maria de Souza
Co-orientadora: Prof. Drª. Angela Malheiros
Itajaí, Março 2015
3
FICHA CATALOGRÁFICA
S38a
Silva, José Afonso Corrêa da, 1989Avaliação dos efeitos farmacológicos do óleo essencial de
chenopodium ambrosioides sobre o sistema nervoso central /
José Afonso Corrêa da Silva, 2015.
113f. ; il.; fig.
Cópia de computador (Printout(s)).
Dissertação (Mestrado) Universidade do Vale do Itajaí,
Mestrado em Ciências Farmacêuticas.
“Orientadora : Profª . Drª Márcia Maria de Souza”
Bibliografia : p. 90-113p.
1. Química farmacêutica. 2. Produtos naturais. 3. Fitoterapia.
4. Estratos vegetais – Uso terapêutico. 5. Preparação de plantas.
6. Chenopodium ambrosioides. I. Título.
CDU: 615.32
Josete de Almeida Burg – CRB 14.ª 293
4
Dedico esta dissertação a todos que me apoiaram, principalmente aos
meus pais, Jadete Maria C. da Silva e Amarante C. da Silva,
à minha esposa, Michele A. C. da Silva e a meu filho,
o pequeno Joaquim que, com apoio
constante, proporcionaram mais essa vitória.
5
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todas as pessoas que, de alguma forma, contribuíram para a
realização deste trabalho, especialmente:
À minha orientadora, Drª Márcia Maria de Souza, exemplo de cientista e
professora, que me ajudou a superar todas as adversidades e dificuldades, sempre
entregando o que qualquer aluno há de querer, como atenção, carinho e
responsabilidade. Certamente, o que aprendi fez-me crescer, não apenas como
pesquisador mas, principalmente, como pessoa.
À professora Drª Angela Malheiros, pela orientação que me foi dada quanto
ao procedimento de obtenção do Óleo essencial e pelo respeito e companheirismo
que sempre trata todos à sua volta.
Aos alunos e colegas, Ana Elisa Gonçalves, Camila Cazarin, Fernando
Lanziotti, Ruth Tomasoni Degenhardt e Iandra Holzmann, pela ajuda e dedicação no
laboratório.
Agradeço à Coordenação e Secretaria do Curso de Mestrado em Ciências
Farmacêuticas da UNIVALI, em especial à Drª Tania M. B. Bresolin, a Juliano e à
Helenize, sempre prontos a ajudar.
À minha colega, Maristela Girardi, que sempre me apoiou e incentivou,
demonstrando o verdadeiro significado da amizade, vejo você como o maior
exemplo de profissional e farmacêutico ético e apaixonado pela profissão.
6
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS FARMACOLÓGICOS DO ÓLEO
ESSENCIAL DE Chenopodium ambrosioides
SOBRE O SISTEMA NERVOSO CENTRAL
José Afonso Corrêa da Silva
Orientação: Márcia Maria de Souza, Drª.
Co-orientação: Angela Malheiros, Drª.
Área de concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas.
Chenopodium ambrosioides L. (Chenopodiaceae), popularmente conhecida como “Erva de Santa
Maria” ou “Mastruz”, é uma das plantas utilizadas na medicina popular como agente vermífugo,
antirreumático, anti-infeccioso, antitussígeno, analgésico e anti-inflamatório. Também tem sido
reportado seu uso em patologias do SNC, sem a devida comprovação científica. No presente estudo,
o óleo essencial da C. ambrosioides L. (OECA) foi investigado em diversos modelos farmacológicos
“in vivo” sobre o sistema nervoso central (SNC). Foram utilizados camundongos Swiss Webster (25 a
30 g/ n=8-10, machos), em modelos como: modelo de ansiedade, teste do labirinto de cruz elevado
(LCE); modelo de depressão, nado forçado (MNF); modelo de convulsão, induzida por
pentilenotetrazol (MCP); modelo de sono induzido por barbitúrico (MSB); modelo de avaliação
motora, o teste de campo aberto (TCA) e o Rotarod. Considerando que o efeito ansiolítico do OECA
(50mg/kg, 100mg/kg, 150mg/kg, v.o.) no LCE, foi semelhante ao resultado obtido pelo tratamento
com o diazepam (75mg/kg, i.p.), utilizou-se o mesmo aparato para testar as diversas vias de
mecanismo de ação. Observou-se que, com o pré-tratamento com haloperidol (0,2mg/kg, i.p.,
antagonista dopaminérgico não seletivo), baclofeno (2,0mg/kg, i.p., antagonista de receptores
GABAB), bicuculina (1,0mg/kg, i.p., antagonista de receptores GABAA) e flumazenil (3mg/kg, i.p.,
antagonista benzodiazepínico) ocorreu o bloqueio total do efeito do OECA (50mg/kg, v.o.) e parcial
pelo pré-tratamento com pimozide (0,5mg/kg, i.p., antagonista D2), SCH23390 (0,5mg/kg, i.p.,
antagonista D1), quetanserina (5mg/kg, i.p., antagonista de receptores 5-HT2A/2C) e NAN-190
(0,5mg/kg, i.p., antagonista de receptores 5-HT1A), influenciando apenas o número de entradas nos
braços do aparato. O OECA promoveu o aumento do tempo de sono e diminuição da latência para o
mesmo no teste de sono induzido por barbitúricos (MSB), comprovando seu efeito hipnótico. Na
avaliação do efeito do OECA sobre a depressão pelo modelo de MNF, não foi constatado uma
diferença significativa nos grupos testados. Na avaliação do efeito do OECA sobre a convulsão
(MCP), observou-se uma potencial proteção (150mg/kg, v.o.) dos camundongos, que corrobora com
os resultados já obtidos. O conjunto de resultados demonstram que o óleo testado apresenta ação
depressora do SNC, possivelmente através da via GABAérgica de transmissão, com influencia da via
dopaminérgica e serotoninérgica, exibindo os efeitos clássicos da classe dos benzodiazepínicos,
sugerindo que o óleo extraído de C. ambrosioides tem efeito hipnótico, anticonvulsivo e ansiolítico.
Palavras-chave: Chenopodium ambrosioides, SNC, Óleo essencial.
7
EVALUATION OF THE PHARMACOLOGICAL EFFECTS OF THE
ESSENTIAL OIL Chenopodium ambrosioides
ON THE CENTRAL NERVOUS SYSTEM
José Afonso Corrêa da Silva
Orientation: Márcia Maria de Souza, Drª.
Co-orientation: Angela Malheiros, Drª.
Concentration area: Natural Products and Bioactive Synthetic Substances.
Chenopodium ambrosioides L. (Chenopodiaceae), popularly known as "Herb of Saint Marie" or
"Mastruz", is one of the plants used in traditional medicine as a vermifuge, antirheumatic, antiinfective, antitussive, analgesic and anti-inflammatory agent. Its use has also been reported in
diseases of the CNS, though there is no proper scientific evidence of its effectiveness for this purpose.
In the present study, the essential oil of C. ambrosioides L. (OECA) was investigated in several
pharmacological models "in vivo" on the central nervous system (CNS). Swiss Webster mice were
used (25-30 g / n = 8-10 males), in models such as: anxiety model, elevated plus maze test (EPM);
model of depression, forced swimming (FSM); model of convulsion induced by pentylenetetrazol
(MIP); model of sleep induced by barbituric (MSB); motor assessment model, the open field test (OFT)
and the Rotarod test. Considering that the anxiolytic effect of OECA (50 mg/kg, 100 mg/kg, 150
mg/kg, v.o.) in the EPM was similar to the results obtained for treatment with diazepam (75 mg / kg,
ip), the same device was used to test several routes of action mechanism. It was observed that
pretreatment with haloperidol (0.2 mg/kg, i.p., non-selective dopamine antagonist), baclofen (2.0 mg /
kg, i.p., antagonist of GABAB receptors), bicuculline (1.0 mg/kg, i.p., antagonist of GABAA receptors)
and flumazenil (3 mg/kg, i.p., benzodiazepine antagonist) led to total blocking of the OECA effect
(50mg/kg, v.o.), while pretreatment with pimozide (0.5 mg/kg, i.p., D2 antagonist), SCH23390 (0.5
mg/kg, i.p., D1 antagonist), ketanserin (5 mg/kg, i.p., antagonist of 5-HT2A/2C receptors) and NAN-190
(0.5 mg/kg, i.p., antagonist of 5-HT1A receptors) resulted in partial blocking, influencing only the
number of entries to the arms of the plus maze. OECA promoted an increase in sleeping time and a
decrease in sleep latency in the sleeping test induced by barbiturates (MSB), proving its hypnotic
effect. In the evaluation of the effect of OECA on depression in the FSM model, no significant
difference was observed between the tested groups. In the evaluation of the effect of OECA effect on
convulsions (MIP), a potential protection of the mice was observed, confirming the results already
obtained. Taken together, the results demonstrate that the tested oil presents depressant action on
the CNS, possibly through the GABAergic pathway, and influences the dopaminergic and
serotoninergic pathways, exhibiting the classic effects of the benzodiazepine class, such as lethargy
and sleep, suggesting that the extracted oil of C. ambrosioides, has hypnotic, anticonvulsant and
anxiolytic effects.
Keywords: Chenopodium ambrosioides, CNS, essential oil.
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: (A) Fotografia das partes aéreas da Chenopodium ambrosioides (B)
Detalhamento da folha da C. ambrosioides......................................................... 22
Figura 2: Mecanismo de formação de ascaridol e outros monoterpenos no gênero
Chenopodium. ..................................................................................................... 24
Figura 3: (A) Óleo essencial de C. ambrosioides; (B) Partes aéreas da Chenopodium
ambrosioides..............................................................................................................35
Figura 4: (A) Cromatograma obtido por CG-FID (180ºc) do óleo essencial de
Chenopodium ambrosioides (OECA); (B) Estrutura dos compostos majoritários
presentes no óleo essencial. ............................................................................... 36
Figura 5: Esquema representativo da investigação do efeito do OECA sobre a
deambulação dos animais através do TCA. ........................................................ 39
Figura 6: Esquema representativo da investigação do efeito do OECA sobre o
sistema motor de animais através do Rota rod. .................................................. 40
Figura 7: Esquema representativo da investigação do efeito do OECA sobre a
depressão através do MNF. ................................................................................ 41
Figura 8: Esquema representativo da investigação do efeito do OECA sobre o MSB.
............................................................................................................................ 42
Figura 9: Esquema representativo da investigação do efeito do OECA sobre a
convulsão induzida por PTZ. ............................................................................... 43
Figura 10: Esquema representativo da investigação do efeito do OECA sobre a
ansiedade através do LCE. ................................................................................. 44
Figura 11: Esquema representativo da investigação do mecanismo de ação da
propriedade ansiolítica do OECA. ....................................................................... 45
Figura 12: Efeito da administração aguda do OECA (50, 100 e 150 mg/kg),
administrados pela via oral sobre os parâmetros: número de cruzamentos
(crossing) (A) e número de levantadas (rearings) (B). Cada coluna representa a
média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média
(E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância anova seguido pelo
teste de Bonferroni. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas
com o grupo veículo. *** p < 0,001. ..................................................................... 49
Figura 13: Efeito da administração aguda do OECA (50, 100 e 150 mg/kg),
administrados pela via oral no teste do rotarod. Tempo de permanência dos
animais no aparelho Rotarod (A) e número de quedas dos animais do aparelho
(B). Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais
indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à
9
análise de variância anova seguido pelo teste de Bonferroni. os asteriscos
indicam diferenças significantes comparadas com o grupo veículo.. .................. 50
Figura 14: Efeito da administração aguda do OECA (50, 100 e 150 mg/kg) e de
diazepam (0,75 mg/kg), administrados pela via oral e intraperitoneal,
respectivamente, no modelo LCE. Freqüência de entrada nos braços abertos (A),
tempo de permanência nos braços abertos (B), freqüência de entradas nos
braços fechados (C) e tempo de permanência nos braços fechados (D). cada
coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os
erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de
variância anova seguido pelo teste de bonferroni. os asteriscos indicam
diferenças significantes comparadas com o grupo controle (veículo). *** p <
0,001. .................................................................................................................. 52
Figura 15: Efeito da administração aguda do OECA (50, 100 e 150 mg/kg) e do
diazepam (1 mg/kg), administrados pela via oral e intraperitoneal,
respectivamente no MSB. Tempo de latência para o sono (A) e o tempo total do
sono (B). Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras
verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram
submetidos à análise de variância anova seguido pelo teste de bonferroni. Os
asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle
(veículo). *** p < 0,001. ....................................................................................... 54
Figura 16: Efeito da administração de OECA (50, 100 e 150 mg/kg, v.o.) e da
Imipramina (50 mg/kg, i.p.). Tempo de imobilidade (A), tempo de escalada (B),
tempo de nado (C). cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as
barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram
submetidos à análise de variância anova seguido pelo teste de Bonferroni. Os
asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle
(veículo). ** p < 0,01; *** p < 0,001. ..................................................................... 56
Figura 17: Efeito da administração aguda do OECA (50, 100 e 150 mg/kg, v.o.) e de
fenobarbital (50 mg/kg, i.p.), no modelo de convulsão induzida por ptz. a figura
indica o tempo de latência para primeira crise convulsiva com PTZ. Cada coluna
representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros
padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância
anova seguido pelo teste de Bonferroni. Os asteriscos indicam diferenças
significantes comparadas com o grupo controle (veículo). *** p < 0,001............. 58
Figura 18: Efeito do pré-tratamento dos camundongos com ioimbina (1 mg / kg, ip,
um antagonista α2-adrenérgico) e prazosina (1 mg / kg, ip, um antagonista α1adrenérgico) e OECA (50 mg / kg, v.o.), no modelo LCE. frequência de entradas
nos braços abertos (A), tempo de permanência nos braços abertos (B). cada
coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os
erros padrões da média (E.P.M.). os dados foram submetidos à análise de
variância ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni. Os valores são expressos
como média ± S.E.M. (n = 8-10). *** p<0.001, em comparação com o grupo
controle................................................................................................................ 60
10
Figura 20: Efeito do pré-tratamento dos camundongos com pimozide (0,5 mg / kg,
i.p., antagonista de receptores dopamina d2), haloperidol (10µg/kg, i.p.,
antagonista não seletivo de receptores de dopamina), SCH23390 (0,5 mg / kg,
i.p., antagonista de receptores de dopamina d1), metoclopramida (1mg/kg, i.p.,
antagonista de receptores 5HT3/d1) e OECA (50 mg / kg, v.o.), no modelo LCE.
Frequência de entradas nos braços abertos (a), tempo de permanência nos
braços abertos (b). Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as
barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram
submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni. Os
valores são expressos como média ± s.e.m. (n = 8-10). *** p<0.001, em
comparação com o grupo controle. ### p<0.001, comparação do grupo prétratados com antagonistas e o grupo tratado somente com oeca. ...................... 64
Figura 21: Efeito do pré-tratamento dos camundongos com bicuculina (1,0 mg / kg,
i.p., antagonista de receptores gabaA), baclofeno (2,0 mg / kg, i.p., antagonista
do receptor gabaB) e flumazenil (3mg/kg, i.p., antagonista dos
benzodiazepínicos), diazepam (1mg/kg, i.p., agonistas gabaérgico) e OECA (50
mg / kg, v.o.), respectivamente, no modelo LCE. Frequência de entradas nos
braços abertos (a), tempo de permanência nos braços abertos (b). Cada coluna
representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros
padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância
ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni. Os valores são expressos como média
± s.e.m. (n = 8-10). *** p<0.001, em comparação com o grupo controle. ###
p<0.001, comparação do grupo pré-tratados com antagonistas e o grupo tratado
somente com OECA. (a) p<0.001, comparação do grupo pré-tratado com
diazepam+flumazenil e o grupo tratado somente com diazepam. ...................... 66
Figura 22: Esquema representativo de possíveis sistemas de neurotransmissão
afetados nos testes do OECA. ............................................................................ 80
11
LISTA DE ABREVIAÇÕES
ADT – Antidepressivo tricíclico
ATV – Área tegmental ventral
α1-ARs - α1-adrenoreceptores
AMPc - Monofosfato de adenosina cíclico
BDNF – Fator neurotrófico derivado do cérebro
BDZ – Benzodiazepínico
CG-EM - Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas
CG-FID - Cromatografia gasosa acoplada à detector de ionização de chama
Cl- – Cloreto
DA – Dopamina
DPZ – Diazepam
EPM – Erro Padrão médio
FEA – Freqüência de entrada do braço aberto
FEF – Freqüência de entrada no braço fechado
FLU – Flumazenil
GABA – Ácido γ-aminobutírico
GAD-65 – Glutamato descarboxilase - 65
GMP – Guanosina mono fosfato
IMAO – Inibidores da enzima monoamina-oxidase
i.p. – Intraperitoneal
ISO - International Standard Organization
ISRS – Inibidores seletivos da recaptação de serotonina
i.v. - Intravenosa
LCE – Labirinto em cruz elevado
LS – Latência para o sono
MAO – Monoamina-oxidase
MCP – Modelo de convulsão induzido por pentilenotetrazol
MNF – Modelo de natação forçada
MSB – Modelo de indução do sono por barbitúrico
NaC – Nucleus accumbes
NAN-190 – 1-(2-metoxifenil)-4-[2-ftalimido)butil]piperazina- antagonista 5HT1A)
NDR – Núcleo dorsal da rafe
12
NMR – Núcleo mediano da rafe
NMDA – N-metil-D-aspartato
NOR – Noradrenalina
OECA – Óleo essencial de Chenopodium ambrosioides
OMS – Organização Mundial da Saúde
PKC – Proteína quinase C
PTZ – Pentilenotetrazol
%FEA – Percentagem da freqüência de entrada no braço aberto
%TPA – Percentagem do tempo de permanência no braço aberto
SCH23390 - (R(+)-7-Chloro-8-hydroxy-3-methyl-1-phenyl-2,3,4,5-tetrahydro-1H-3benzazepine hydrochloride) - antagonista D1
SIB – Sono induzido por barbitúrico
SNC – Sistema Nervoso Central
TCA – Teste campo aberto
TPA – Tempo de permanência no braço aberto
TPF– Tempo de permanência no braço fechado
TST – Tempo de sono total
5-HT – Serotonina
VLPO - Núcleo pré-óptico ventrolateral
v.o. – Via oral
WHO – World Health Organization
13
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 15
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 17
2.1 Objetivo Geral:..................................................................................................... 17
2.2 Objetivos Específicos: ......................................................................................... 17
3 REVISÃO DE LITERATURA.................................................................................. 18
3.1 Uso de plantas medicinais na promoção da saúde ............................................. 18
3.2 Família Chenopodiaceae e o gênero Chenopodium ........................................... 19
3.3 Estudos sobre Chenopodium ambrosioides ........................................................ 21
3.4 Óleos essenciais e a composição de terpenos.................................................... 24
3.5 Plantas que atuam no Sistema Nervoso Central ................................................. 27
3.5.1 Plantas medicinais com propriedades ansiolíticas ........................................... 27
3.5.2 Plantas medicinais com propriedades hipnóticas ............................................. 29
3.5.3 Plantas medicinais com propriedades antidepressivas .................................... 30
3.5.4 Plantas medicinais com propriedades anticonvulsivantes ................................ 32
4 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 35
4.1 Material vegetal ................................................................................................... 35
4.2 Extração do óleo essencial.................................................................................. 35
4.3 Ensaios Farmacológicos:..................................................................................... 37
4.3.1 Animais ............................................................................................................. 37
4.3.2 Drogas e tratamentos ....................................................................................... 37
4.3.3 Grupos experimentais....................................................................................... 38
4.3.4 Ensaios farmacológicos .................................................................................... 38
4.3.4.1 Avaliação do efeito do OECA sobre o sistema motor e depressor através do
teste de campo aberto (TCA) e Rota rod .................................................................. 38
4.3.4.2 Avaliação do efeito do OECA sobre a depressão através do modelo da
natação forçada (MNF) ............................................................................................. 40
4.3.4.3 Avaliação do efeito do OECA sobre o sono induzido por barbitúrico (MSB) . 41
4.3.4.4 Avaliação
do
efeito
do
OECA
sobre
a
convulsão
induzida
por
pentilenotetrazol (MCP) ............................................................................................. 42
4.3.4.5 Avaliação do efeito do OECA sobre a ansiedade dos animais através do
modelo de labirinto em cruz elevado (LCE) .............................................................. 43
14
4.3.4.6 Determinação do mecanismo de ação da propriedade ansiolítica do OECA 45
4.4 Análise estatística................................................................................................ 47
5 RESULTADOS ....................................................................................................... 48
5.1 Avaliação do efeito do OECA sobre a deambulação dos animais através do TCA
e da capacidade motora pelo teste Rota rod. ............................................................ 48
5.2 Avaliação do efeito do OECA sobre a ansiedade dos animais através do modelo
LCE. .......................................................................................................................... 51
5.3 Avaliação do efeito do OECA sobre o sono induzido por barbitúricos (MSB). .... 53
5.4 Avaliação do efeito do OECA sobre a depressão através do Modelo de Nado
Forçado (MNF). ......................................................................................................... 55
5.5 Avaliação do efeito do OECA sobre a convulsão induzida por PTZ. ................... 57
5.6 Determinação do mecanismo de ação da propriedade ansiolítica do OECA ...... 59
5.6.1 Influencia do sistema adrenérgico sobre o mecanismo de ação da propriedade
ansiolítica do OECA .................................................................................................. 59
5.6.2 Influencia do sistema serotoninérgico sobre o mecanismo de ação da
propriedade ansiolítica do OECA .............................................................................. 61
5.6.3 Influência do sistema dopaminérgico sobre a propriedade ansiolítica do OECA..
................................................................................................................... 63
5.6.4 Influencia do sistema GABAérgico sobre o mecanismo de ação da propriedade
ansiolítica do OECA .................................................................................................. 65
6 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 67
7 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 81
8 REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 82
15
1 INTRODUÇÃO
Como uma prática enraizada na cultura popular, o uso de plantas medicinais
transpassa milhares de anos e, atualmente tem ganhado ênfase como forma
alternativa aos tratamentos com medicamentos sintéticos (CALIXTO, 2005; DIASSOUZA et al., 2014).
Muitas plantas encontradas na natureza exibem efeitos psicotrópicos e são
capazes de atuar no Sistema Nervoso Central (SNC), modificando comportamento,
humor, pensamentos e sensações. Portanto, o entendimento de suas funções
psicofarmacológicas é importante no que tange à segurança na utilização das
mesmas (CARLINI et al., 2006).
Chenopodium ambrosioides (Chenopodiaceae) é uma planta herbácea,
originária da América do Sul e México, e utilizada por povos indígenas dessas
regiões. No Brasil, essa espécie tem ampla distribuição, com ocorrência em quase
todo o território nacional, onde recebe vários nomes. Os mais populares são
“mastruz” e “erva de santa maria” (SOUZA et al., 2011). Das folhas e flores desta
planta pode-se extrair um óleo essencial constituído principalmente de uma mistura
de ascaridol, α-terpineno, isoascaridol e p-cimeno (ZHU et al., 2012).
Recentemente, o governo brasileiro lançou um programa conhecido como a
Relação Nacional de Plantas de Interesse do SUS (RENISUS), que lista 71 plantas
utilizadas com ênfase na medicina popular brasileira. O programa tem como objetivo
apoiar a fitoterapia como tratamento alternativo de doenças e também incentivar
pesquisadores brasileiros para validar as propriedades farmacológicas destas
plantas, incluindo a sua eficácia e segurança (BRASIL, 2012). É importante salientar
que, C. ambrosioides (L) (Amaranthaceae) pertence a esta lista.
A planta triturada é comumente utilizada em processos inflamatórios,
aliviando a dor e proporcionando o aumento da cicatrização, sendo empregada no
tratamento de feridas, fraturas e contusões, problemas respiratórios como bronquite
e tuberculose (LORENZI; MATOS, 2002). Entretanto, é a sua ação anti-helmíntica
que a caracteriza como erva medicinal e que faz com que seja um dos remédios
mais tradicionais utilizados pelo mundo (MONZOTE et al., 2007).
Como citado acima, várias pesquisas já realizadas contemplam o histórico
farmacológico da C. ambrosioides, porém o foco na atividade farmacológica no SNC
16
apresenta-se restrita a citações de empregos terapêuticos, sem fundamentação
experimental.
Apesar disso vários estudos têm como foco elucidar terapeuticamente o
emprego de plantas medicinais no SNC (SILVA et al, 2007; ISAAC; LARSON, 2014;
SWART et al., 2014). Desde o tratamento de doenças neurodegenerativas, até
distúrbios neuropsiquiátricos como ansiedade, depressão e insônia, demonstrando
que algumas plantas apresentam os mesmos mecanismos de ação que as drogas
padrão utilizadas na terapêutica atual. Nos estudos de ansiedade e insônia, destacase
a
Pluchea
sagittalis,
benzodiazepínicos,
voltado
com
para
mecanismo
o
sistema
de
de
ação
semelhante
transmissão
ao
dos
GABAérgico,
apresentando-se como ótimo ansiolítico e, assim como a Valeriana officinalis,
detentora de um grande potencial para o tratamento de distúrbios do sono
(RODRIGUES, 2011; SARRIS et al., 2011). O Hypericum perforatum, utilizado
popularmente para o tratamento de depressão, experimentalmente apresenta
atuação na recaptação de serotonina e inibição da enzima MAO-A, mecanismo de
ação de diversos antidepressivos (CHANG; WANG, 2010).
Desta forma o presente estudo se propõe a avaliar os efeitos do óleo
essencial da planta em estudo, nos modelos farmacológicos específicos, a fim de
fundamentar experimentalmente a ação da C. ambrosioides no SNC.
17
2 OBJETIVOS
2.1
Objetivo Geral:
Estudar possíveis propriedades farmacológicas no SNC do óleo essencial
obtido de Chenopodium ambrosioides, em diversos modelos farmacológicos “in
vivo”, utilizados no screening de substâncias psicoativas.
2.2
Objetivos Específicos:
Avaliar os efeitos do óleo essencial sobre o sistema motor dos animais
através dos testes do Open Field e Rotarod;
Verificar os efeitos do óleo essencial sobre parâmetros comportamentais de
ansiedade dos animais, através do modelo do labirinto em cruz elevado;
Determinar os efeitos do óleo essencial em parâmetros comportamentais de
depressão dos animais através do modelo do nado forçado;
Determinar os efeitos do óleo essencial na convulsão induzida por
pentilenotetrazol.
Avaliar os efeitos hipnóticos do óleo essencial através do modelo do sono
induzido por barbitúricos;
Comparar o efeito do óleo essencial com fármacos utilizados na terapêutica
de patologias do SNC, utilizados como controles-positivos;
Identificar o efeito farmacológico mais significativo e estudar os mecanismos
de ação envolvidos nesse efeito.
18
3
3.1
REVISÃO DE LITERATURA
Uso de plantas medicinais na promoção da saúde
O uso de plantas medicinais advém do conhecimento empírico acumulado de
milhares de anos e transmitido pelo uso popular. Entendida como uma das práticas
mais antigas e presentes na história da humanidade, essa pratica tem se perpetuado
e alcançado os dias atuais, apesar dos avanços tecnológicos e científicos no âmbito
dos
produtos
sintéticos
(PETRONILHO
et
al.,
2012).
A
descoberta
e
desenvolvimento de novos produtos farmacêuticos (MAHANNA; LEE, 2010), assim
como a utilização de produtos naturais como matéria-prima para diversos
medicamentos, produtos da indústria química, alimentícia e cosméticos (MARTINS
et al., 1994; GOSSLAU et al., 2011; MISHRA; TIWARI, 2011), é o que fomenta o
investimento na descrição e caracterização de um número cada vez mais expressivo
de plantas (ANTONIO; TESSER; MORETTI, 2014).
Por esses e outros motivos as plantas tornaram-se recursos permanentes de
compostos biologicamente ativos, utilizados por cerca de 80% da população
mundial, tanto na forma natural de chás, como de fitoterápicos e/ou fitofármacos
(HORN; VARGAS, 2008). Esta cultura é utilizada por mais de 2/3 da população do
planeta que opta pelo uso de produtos naturais pelo alto custo que os medicamentos
sintéticos agregam, evidenciando a importância destes no combate e na prevenção
de doenças na população com baixas condições financeiras (FRIAS; COSTA; FRIAS
et al., 2011). Acredita-se também que os produtos naturais tenham uma baixa
incidência de efeitos adversos e contraindicações (MONTANARI; BOLZANI, 2001),
entretanto, isto é questionável, havendo a necessidade de que os mesmos princípios
de produção do medicamento sintético sejam empregados nos medicamentos
naturais.
A cura através de plantas e seus produtos têm resistido às inovações que
vem ocorrendo. Com o passar dos tempos, as ervas têm conseguido sustentar sua
importância e a confiança das populações atuais. É importante ressaltar que, mesmo
diante dos progressos tecnológicos atuais, existem locais em que a fitoterapia
representa o único recurso de tratamento (MACIEL; PINTO; VEIGA, 2002), muitas
vezes sem cunho científico e experimental (ANTONIO; TESSER; MORETTI, 2014).
19
O Brasil, nos seus três milhões e quinhentos mil quilômetros quadrados de
florestas, representa o país mais biodiverso do planeta, abrigando entre 10 e 20%
das espécies e 30% das florestas tropicais do mundo (LEWINSOHN; PRADO, 2012).
As práticas naturais de utilização de ervas estão presentes em todo o território,
independente das diferenças regionais e culturais, inserindo grande influência na
manutenção das condições de saúde das pessoas (RIBEIRO et al, 2014).
3.2
Família Chenopodiaceae e o gênero Chenopodium
A família Chenopodiaceae, sinonímia Amaranthaceae apresenta grande
diversidade de estrutura foliar, com plantas de anatomia Kranz e não-Kranz, com
numerosas variações destes dois arranjos anatômicos. O mesofilo varia de
dorsiventral a cêntrico, podendo apresentar parênquima aquífero. Esta grande
diversidade está relacionada ao habitat dos membros da família. Muitas espécies da
família são características de regiões marítimas e solos salinos (COSTA; TAVARES,
2006).
Com relação aos gêneros, a família Amaranthaceae tem 169 gêneros e cerca
de 2.360 espécies, sendo os maiores gêneros: Atriplex L. (300 spp.), Gomphrena L.
(120 spp.), Salsola L. (120 spp.), Alternanthera Forssk. (100 spp.), Chenopodium L.
(120 spp.), Ptilotus R. Br. (100 spp.), Suaeda Forssk (100 spp.), Iresine R. (80 spp.),
Amaranthus L. (60 spp.), Corispermum L. (60 spp.) e Celosia L. (50 spp.) (FANK-DECARVALHO; MARCHIORETTO; BÁO, 2010).
O gênero Chenopodium L. compreende cerca de 120 espécies, perenes ou
anuais. O nome genérico é de origem grega “chen” (ganso) e “podus” (pé), pela
semelhança que as folhas têm com os pés de um ganso. O nome específico
“ambrosioides” refere-se à semelhança de suas inflorescências com as de Ambrosia
sp. A maioria destas plantas são cosmopolitas e estão distribuídas principalmente
nas regiões subtropicais e temperadas (KOKANOVA-NEDIALKOVA et al., 2011).
Esse gênero é cultivado há séculos como verdura (Chenopodium album, ou
simplesmente “fedegoso”) e como fornecedora subsidiária de grãos (C. quinoa e C.
album) para o consumo humano e animal, em razão da sua quantidade elevada de
proteína e, por fornecer aminoácidos essenciais de forma equilibrada. As folhas são
alternas, as flores são pequenas e andróginas ou ainda unissexuadas. As sementes
livres ou aderentes e frutos envoltos totalmente, ou em parte, pelo cálice.
20
O gênero é abundante nos trópicos e regiões adjacentes especialmente na
América Tropical e África, onde pode ser encontrada uma grande variedade de
espécies com propriedades medicinais (GRASSI et al., 2013).
Investigações fitoquímicas sobre as espécies do gênero Chenopodium
revelaram grande variedade de compostos orgânicos sendo eles: terpenos,
esteroides,
saponinas
triterpênicas,
flavonoides
e
alcaloides
(KOKANOVA-
NEDIALKOVA; NEDIALKOV; NIKOLOV, 2009). Recentemente foi publicado um
estudo fitoquímico da planta conduzido por Song e colaboradores (2014) os quais
evidenciaram onze compostos e as suas estruturas, pela primeira vez, isolados a
partir da planta C. ambrosioides: campferol-3,7-di-O-alfa-L-ramnopiranosídeo,
patuletin, quercetina-7-O-alfa-L-ramnopiranosídeo, granofer cetona, 4-hidroxi-4metil-2-ciclo-hexen-1-ona,
siringaresinol,
benzil-beta-D-glucopiranósido,
dendranthemoside B, N-trans-feruloil tiramina, N-trans-feruloil 4'-O-metildopamina e
4-hidroxi-N-[2 (4-hidroxifenil) etil] benzamida.
Algumas espécies deste gênero possuem várias aplicações tradicionais, que
têm sido testadas frente a diferentes atividades farmacológicas (YADAV et al.,
2007). Dentre essas espécies podemos ressaltar:
Chenopodium foliosum, é usada na forma de decocção para tratamento de
câncer através de sua capacidade citotóxica e suas partes aéreas foram
testadas como estimulante do sistema imune, através da ativação da
interleucina-2 (KOKANOVA-NEDIALKOVA et al., 2011; NEDIALKOV et al,
2012);
Chenopodium quinoa, atualmente muito estudada, possui a semente dotada
de alto teor de proteínas e carboidratos apresentando valor nutricional com
qualidade superior a de muitos cereais, como o milho, aveia, trigo e arroz
(KULJANABHAGAVAD et al., 2008). As sementes têm sido usadas para a
prevenção de enfermidades crônicas como a osteoporose, atividade
cicatrizante, antimicrobiana e agem como imunomoduladoras. (MUJICA;
JACOBSEN, 2006; KULJANABHAGAVAD et al., 2008). As propriedades
farmacológicas como antioxidante (TANG et al., 2015), antineoplásica
(GAWLIK-DZIKI et al., 2013), hipoglicemiante (GRAF et al., 2014),
antinflamatória (YAO et al., 2014) e gastroprotetora (ZEVALLOS et al., 2014),
dentre outras, tem sido comprovadas.
21
Chenopodium album, é uma erva daninha anual, o pó seco da planta foi
diluído e testado frente a diversos microrganismos apresentando atividade
antibacteriana (SINGH; DWEVEDI; DHAKRE, 2011), anti-helmíntica, laxativa,
antinociceptiva e antioxidante (YADAV et al., 2007). O extrato etanólico da
planta foi testado em leveduras e demonstrou conferir proteção a
determinadas formas de DNA, frente e ao contato com peróxido de
hidrogênio, um agente altamente nocivo para as mesmas (KORCAN et al.
2013).
Chenopodium murale, conhecida pela alta concentração de ascaridol no
extrato de sua folha fresca e pela sua ação antioxidante e antibacteriana
frente a microrganismos como o Staphylococcus aureus (ABDEL-AZIZ et al.,
2014).
Chenopodium formosanum, caracterizada por ser utilizada para a produção
de bioetanol, através de processos de hidrolise enzimática, sacarização e
fermentação (YANG et al., 2014), também já foi confirmado seu efeito
antioxidante (TSAI et al., 2010).
3.3
Estudos sobre Chenopodium ambrosioides
C. ambrosioides L., (Figura 1) apresenta sinônimos como C. abovatum Moq.,
C. ambrosioides var. typicum Speg., Ambrina spathulata Moq., Blitum ambrosioides
(L). Ela é conhecida popularmente como “Erva de Santa Maria”, “Mastruço”,
“Ambrosina”, “Mastruz”, “Erva-de-Bicho”, “Mestruz” ou “Erva-do- Formigueiro”, sendo
muito empregada na medicina caseira na região centro oeste, sul e sudeste do
Brasil (BLANCKAERT et al., 2007).
É uma planta originária da América Central e do Sul, ocorre em todos os
países tropicais e temperados de forma silvestre ou cultivados sendo também
considerada com planta invasora (LORENZI; MATOS, 2002). É reconhecida pela
Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS (RENISUS), como
uma das 71 espécies ou gêneros, tradicionalmente utilizados no Brasil, sendo
possivelmente utilizado como planta medicinal em diversas regiões brasileiras
(VERISSIMO et al., 2011).
Lorenzi e Matos (2002) descreveram-na botanicamente como planta perene
ou anual, muito ramificada, podendo atingir até 1 m de altura. Possui folhas simples,
22
alternadas, pecioladas, de tamanho diferente, sendo menores e mais finas nas
extremidades superiores. As flores são pequenas, verdes, dispostas em espigas
axilares densas. Os frutos são muito pequenos e do tipo aquênio, esféricos, pretos,
ricos em óleo e muito numerosos, geralmente confundidos com sementes. Toda a
planta tem um odor forte e característico o qual é decorrente de alta concentração
de óleos essenciais (LORENZI; MATOS, 2002), com maior teor nas sementes, que
apresentam um alto grau de dormência e um baixo poder germinativo (MARTINS;
SILVA; ALMASSY JÚNIOR, 2010).
A população brasileira utiliza C.ambrosioides na forma de chás, infusões ou
xaropes,
no
tratamento
de
afecções
pulmonares
e
distúrbios
intestinais
(CHEVALLIER, 1996), hemorroidas (MASUCCI, 1992), infecções fúngicas e
helmínticas (KAMEL; EL-EMAM; MAHMOUD, 2011; MONZOTE et al., 2014), úlceras
(ZHU
et
al.,
2012),
contusões,
equimoses
(LORENZI;
MATOS,
2002),
gastroproteção (ZHU et al., 2012), hipotensão (ASSAIDI et al., 2014) e na resposta
imunológica (SHARMA; BALA; KUMAR, 2012). Entretanto, apesar da larga
utilização, alguns relatos de toxicidade têm sido encontrados, podendo causar
convulsão, vômito, dor de cabeça, vertigem (PEREIRA et al., 2010) e
hepatotoxicidade (DERRAJI et al., 2014), quando utilizada por tempo mais
prolongado.
Figura 1: (A) Partes aéreas da C. ambrosioides (GRASSI et al., 2013). (B) Detalhamento da folha da
C. ambrosioides (CARVALHO, 2013).
23
A composição química do óleo essencial de C. ambrosioides difere de acordo
com o cultivo e preparação do material, sempre variando nas concentrações dos
mesmos componentes. Cavalli e colaboradores (2004) identificaram no óleo de C.
ambrosioides: ascaridol (41.8%), isoascaridol (18.1%), p-cimeno, α-terpineno e
limoneno. Jardim e colaboradores (2008), através de análises de cromatografia
gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM), identificaram treze
compostos, sendo os quatro mais importantes: (Z)-ascaridol (61,4%), (E)-ascaridol
(18,6%), carvacrol (3,9%) e ρ-cimeno (2%).
Degenhardt e colaboradores (2013) estudaram o efeito citotóxico do extrato
etanólico e óleo essencial de C. ambrosioides em células tumorais, mesmo óleo
testado no presente estudo, demonstrando um potencial antitumoral em linhagens
de células K562 e RAJI.
Grassi e colaboradores (2013) estudaram o efeito antiinflamatório, cicatrizante
e antinoceptivo do extrato bruto C. ambrosioides e isolaram dois monoterpenos:
ascaridol (0,089%, em relação à planta seca); e 1,2,3,4-tetrahidroxi-p-mentano
(0,045%, em relação a planta seca).
A síntese enzimática do dieno α-terpineno, resulta na biossíntese do zascaridol. Este é encontrado em maior concentração na espécie C. ambrosioides,
sugerindo esta via como a principal para obtenção do ascaridol. O componente pcimeno origina-se da reação do γ-terpineno, este, pouco encontrado na espécie
(DEMBITSKY; SHKROB; HANUS, 2008). A biossíntese das formas do ascaridol
presentes no gênero Chenopodium, encontra-se descrito na Figura 2.
Vários autores verificaram que os ascaridois são os principais compostos
responsáveis por propriedades antiparasitárias da planta (tanto do óleo quanto do
extrato) destacando-se seu efeito contra a leishmaniose (DE QUEIROZ et al., 2014;
SONG et al., 2014). Em altas doses o ascaridol pode causar diversos efeitos
adversos, os quais são relacionados ao abuso no uso medicinal da planta C.
ambrosioides (RUFFA et al., 2002).
24
Figura 2: Mecanismo de formação de Ascaridol e outros monoterpenos no gênero Chenopodium
(DEMBITSKY, SHKROB, HANUS, 2008).
3.4
Óleos essenciais e a composição de terpenos
A International Standard Organization (ISO) define óleos essenciais como
produtos obtidos de partes de plantas através de destilação por arraste a vapor ou
pela expressão dos pericarpos de frutos cítricos. A mesma define que os óleos
essenciais são matéria-prima para produtos de higiene, para a indústria de
alimentos, indústria química, farmacêutica, para perfumaria e cosméticos, que hoje
ocupam 15 % do mercado desta área, no Brasil (AHBIPEC, 2012).
Essas substâncias orgânicas, que hoje representam números expressivos
para a indústria de produtos naturais, são consideradas a “alma” da planta e são os
principais componentes bioquímicos responsáveis pela ação terapêutica das plantas
medicinais, principalmente aquelas que são aromáticas. As suas propriedades físicoquímicas, como por exemplo, a aparência oleosa à temperatura ambiente é o que dá
a designação de óleo, uma mistura complexa de substâncias, lipofílicas e
25
geralmente odoríferas, porém com a principal característica de alta volatilidade,
diferente de óleos fixos oriundos de sementes (SIMÕES et al., 2003).
A importância da maioria dos metabólitos secundários vegetais (componentes
de óleos essenciais) era desconhecida por muitos anos e foram considerados
produtos sem função, meramente resultantes do metabolismo comum da planta, já
que os metabolitos primários (lipídios, proteídeos e glicídios), detinham a definição
de serem essenciais para a vida e para a manutenção das funções vitais das
espécies vegetais. Porém, químicos orgânicos passaram a ter interesse nas vias da
biossíntese, à custa de energia, as quais originavam micro moléculas de estruturas
complexas, biologicamente ativas e de baixo peso molecular, conhecidas como
metabólitos secundários e, que eram encontradas em concentrações relativamente
baixas em determinadas plantas. Primeiramente, para essas moléculas foram
desenvolvidos ensaios com o propósito de produzir venenos, aromatizantes e
materiais industriais (TAIZ; ZEIGER, 2004) e posteriormente, no século XX, esses
compostos passaram a ser utilizados com matéria-prima de medicamentos e
cosméticos (VANISREE; HSIN-SHENG, 2007).
Várias espécies de plantas são utilizadas para extração de óleos essenciais,
os quais se encontram concentrados em certos órgãos vegetais, tais como nas
flores, folhas ou ainda nas cascas dos caules, madeira, raízes, rizomas, frutos ou
sementes, variando segundo a localização (SIMÕES et al., 2003). Por exemplo:
Citrus sinensis L., Mentha arvensis L., Eucalyptus globulus L., Citrus limon L.,
Syzygium aromaticum L., são comercializadas mundialmente pelos aromas de
laranja, menta, eucalipto, limão e cravo-da-índia, respectivamente, graças à
característica volátil das mesmas (BIZZO et al., 2009). O conhecimento terapêutico
vem de encontro e novas caracterizações e técnicas utilizadas atualmente, que
possibilitam a determinação especializada de um maior número de substâncias.
Os óleos essenciais são constituídos principalmente de hidrocarbonetos como
os monoterpenos, sesquiterpenos, fenilpropanóides, e compostos oxigenados como
os ésteres, álcoois, aldeídos, cetonas, lactonas, fenóis entre outras substâncias de
baixo peso molecular, tendo os terpenos como maioria. As diversas substâncias
desta classe são, em geral, insolúveis em água e sintetizadas a partir do Acetil-CoA
ou de intermediários glicolíticos (SOUZA et.al., 2010).
Estudos demonstram a possibilidade da utilização dos constituintes dos óleos
essenciais como analgésicos, pela composição rica em terpenos como o isopreno e
26
o linalool (SOUZA, 2011), espasmolíticos (PULTRINI; GALINDO; COSTA, 2006),
anticonvulsivante (ALMEIDA; MOTTA; LEITE, 2003), antidepressivo (COSTA et al.
2011) e ansiolítico (LIS-BALCHIN; HART, 1999). O efeito analgésico é encontrado
adjuvante aos efeitos antioxidantes e antiinflamatórios em determinado óleos
essenciais (QUEIROZ et al., 2014), assim como, de maneira selecionada, o efeito
ansiolítico encontra-se relacionado à presença de determinados monoterpenos
(MOREIRA et al., 2014) em ensaios com o óleo testado por via oral ou por inalação
(CHIOCA et al., 2013).
A capacidade hipoglicemiante e antidiabética de determinados óleos
essenciais, pela regulação de receptores de lipoproteínas vem sendo estudada
(JOO et al., 2013). A versatilidade que determinadas espécies vegetais apresentam,
permitindo a análise de seus componentes por administração do óleo essencial,
extrato e infusão, avança na elucidação dos efeitos adversos e tóxicos dos
preparados. Em ensaios controlados foi demonstrado que os óleos essenciais,
apesar de demonstrarem eficiência na regulação da glicemia, pelos princípios ativos
hipoglicemiantes, não apresentam efeitos tóxicos, como no extrato e infusão da
mesma planta (ANAYA-EUGENIO et al., 2014).
O tratamento empírico de doenças infeciosas e inflamatórias, margeava
apenas o uso popular. Hoje, no entanto, encontramos comprovações científicas
referentes aos efeitos farmacológicos dos óleos essenciais para diversos fins, os
quais podem ser constatados pela inibição in vitro de fungos como Trichosporon
mucoides, Malassezia furfur, Candida albicans, Candida tropicalis e bactérias como
Staphylococcus
aureus,
Streptococcus
sobrinus,
Streptococcus
mutans
e
Escherichia coli (CHEN et al., 2014). Assim como infecções com Trypanosoma
evansi (BALDISSERA et al., 2014) e Haemonchus contortus (KATIKI et al. 2012).
Com a estimativa de que o Brasil possua mais de 50.000 espécies de plantas
superiores, produtoras de madeiras, celulose, fibras, alimentos e óleos essenciais,
percebe-se a possibilidade de novas descobertas dentro da gama de substâncias
aromatizantes já documentadas e de tantas outras que ainda não foram elucidadas
e/ou avaliadas cientificamente.
27
3.5
Plantas que atuam no Sistema Nervoso Central
Várias são as desordens que acometem o SNC, segundo a Organização
Mundial da Saúde (OMS), mais de 450 milhões de pessoas são acometidas por
alguma
dessas
desordens,
dentre
elas
as
neuropsiquiátricas
e
as
neurodegenerativas. Fazem parte das primeiras a ansiedade, a depressão, a
esquizofrenia, a epilepsia, os distúrbios de sono dentre outras (ISAAC; LARSON,
2014). No segundo grupo encontramos principalmente a Doença de Alzheimer e a
Doença de Parkinson, dentre outras (SILVA et al, 2007; SWART et al., 2014).
A hipótese de que as plantas poderiam ter efeitos sobre o SNC tem origem
histórica e remontam das observações do uso das mesmas em rituais religiosos,
durante os quais a percepção e o comportamento das pessoas poderiam sofrer
alterações com o uso de determinadas espécies (DOS SANTOS, 2013). No Brasil,
especificamente, as comunidades indígenas usam diversas plantas nesse sentido
(NEVADO et al., 2010).
O habito do uso de plantas medicinais com propriedades psicoativas também
é um dos legados deixados por nossos colonizadores europeus e cada vez mais se
tem investigado a composição química de algumas delas, a fim de elucidar o efeito
no SNC (MARQUES et al., 2013). Algumas espécies de plantas da família
Solanaceae, por exemplo, são fontes de alcaloides tropânicos, com importantes
ações farmacológicas. Na Europa da Idade Média e do Renascimento, os cultos
praticados por feiticeiras e mágicos estavam intimamente ligados ao consumo de
beladona (Atropa belladona), meimendro (Hyosciamus niger) e mandrágora
(Mandragora officinarum) (HOSTETTMANN; QUEIROZ; VIEIRA et al., 2013).
3.5.1 Plantas medicinais com propriedades ansiolíticas
De acordo com o manual diagnóstico e estatístico de doenças mentais (DSMV) a ansiedade é um estado emocional, com componentes psicológicos e
fisiológicos, naturalmente encontrado na existência humana, geralmente é uma
reação normal a uma situação de desconforto e estresse (MACKENZIE et al., 2011).
Fisiologicamente, está relacionada à antecipação de um evento esperado, ou às
vezes, inesperado. Confunde-se eventualmente a ansiedade com o medo, que se
manifesta quando existe a presença de um perigo real, na falta do mesmo sente-se
28
ansiedade, que é a antecipação do medo de estar exposto a este perigo (HAN et
al.,2007).
A ansiedade pode passar de uma ocorrência normal para um quadro
patológico quando é desproporcional a circunstância que a causa, ou quando não
existe um motivo aparente para a sua instalação (HAN et al., 2007). Farb e Ratner
(2014) reportam que os mesmos circuitos neurológicos envolvidos na ansiedade
patológica estão relacionados a outras patologias do SNC e é provável que
acometam o paciente concomitantemente (FARB; RATNER, 2014).
Os benzodiazepínicos (BDZ) continuam sendo os medicamentos mais
prescritos para o tratamento da ansiedade patológica (SIRDIFIELD et al., 2013). São
considerados fármacos seguros quando comparados aos barbitúricos, os fármacos
de escolha até a década de 60. Seu mecanismo de ação se dá através da mudança
alostérica no receptor GABAA promovendo um aumento da afinidade do
neurotransmissor ácido γ-aminobutírico (GABA), pelo seu sítio ativo no receptor
(UZUN et al., 2010). Nos últimos 45 anos os BDZs foram os fármacos psicoativos
mais estudados, sendo um dos motivos para esses estudos as reações adversas
como sedação, dependência, amnesia anterógrada e tolerância em alguns casos
(CUNNINGHAM; HANLEY; MORGAN, 2010; HOOD et al., 2014).
Estudos recentes apontam para o efeito positivo da utilização de inibidores
seletivos de recaptação de serotonina para o tratamento de tais desordens, e que, o
aumento nos níveis de serotonina pode modular o sinal neuroquímico que desloca o
sistema nervoso para estados de ansiedade (TSAPAKIS et al., 2012; FITZGERALD;
BRONSTEIN, 2013). É considerável o número de evidências de que a fisiopatologia
da ansiedade está relacionada a neurotransmissores como serotonina (5-HT),
norepinefrina (NOR) e dopamina (DA) (LEGOABE et al., 2011).
As desordens de ansiedade são a classe mais prevalente das doenças
psiquiátricas no mundo (KESSLER et al., 2010). Estimativas feitas pela OMS
indicam que 0,1 a 16,9% das pessoas no mundo sofrem com algum tipo de distúrbio
de ansiedade e/ou depressão (ADAMS; GMÜNDER; HAMBURGUER, 2007). A alta
incidência desta patologia e o alto nível de possíveis reações adversas sugerem
cada vez mais investigações de compostos naturais para o tratamento e controle
dos sistemas envolvidos.
Bowdichia virgilioides K., mais comumente utilizada na medicina popular
como antiinflamatório, atua como ansiolítico, pela presença de triterpenos, alcalóides
29
e flavonoides em sua composição, sem comprometer a capacidade motora de
camundongos testados no labirinto em cruz elevada (LCE) e posteriormente no teste
de campo aberto (VIEIRA et al., 2013). Possivelmente pela composição química da
planta, ocorra modulação serotoninérgica e alteração da transmissão GABAérgica
no sistema nervoso (GIRISH et al., 2013), assim como na Gastrodia elata (JUNG et
al., 2006), na Pluchea sagittalis (RODRIGUES, 2011) e na Cecropia glazioui
(ROCHA; LAPA; LIMA, 2002), plantas de composição semelhante.
Os monoterpenos da Myrtus communis L., são os fitoconstituintes que
conferem o efeito ansiolítico da mesma, destacado através de modelos animais LCE
e caixa claro-escuro (MOREIRA et al., 2014). Outros constituintes como linalol,
quercetina e ácido cafeico, promissores agentes com potencial ansiolítico (KUMAR
et al., 2011), foram isolados da Angelica archangelica L., com o efeito comprovado
através de modelos animais (KUMAR et al., 2013). Sinnathambi e colaboradores
(2013) comprovaram o envolvimento do sistema dopaminérgico no estado de
ansiedade, através de testes comportamentais utilizando o extrato etanólico de
Alstonia scholaris L., a qual demonstrou alta eficácia ansiolítica e capacidade de
aumentar os níveis de dopamina no cérebro.
Os quadros de ansiedade podem ser revertidos pelo uso de Curcuma longa,
que atua promovendo aumento das concentrações de serotonina nos sistemas
neuronais de estruturas límbicas (BENAMMI et al., 2014).
3.5.2 Plantas medicinais com propriedades hipnóticas
Sofrer de insônia, um dos distúrbios do sono, tornou-se uma queixa comum
da população mundial e mais particularmente, na brasileira. Cerca de 10-15% das
pessoas adultas sofrem de insônia crônica e adicionalmente de 25-35%, sofrem de
uma insônia transitória (SOMMER et al., 2014).
A incidência é tanta que essa
patologia, já considerada a doença da população ocidental, geralmente está ligada a
condições externas e internas como estresse, depressão e processos dolorosos
intensos (ASPLUND, 2012; ROTH; ROEHRS, 2013).
Várias são as hipóteses que circundam o estado fisiopatológico do individuo
com quadros de insônia. Um dos mais aceitos é a “hipervigilância” oriunda da
exacerbação do sistema neuroendócrino, ligada a anormalidades do ritmo circadiano
(envolvendo genes regulatórios), a secreção de melatonina (LAUDON; FRYDMAN-
30
MAROM, 2014) e receptores de adenosina (CARÚS-CADAVIECO; DE ANDRÉS,
2012) assim como irregularidades na transmissão GABAérgica, alta concentração
de cortisol e na secreção de neurotransmissores excitatórios com glutamato e
aspartato
(ROTH; ROEHRS; PIES, 2007; PORKKA-HEISKANEN; ZITTING;
WIGREN, 2013) por esse motivo, os tratamentos farmacológicos convencionais para
insônia
incluem
benzodiazepínicos,
agonistas
dos
receptores
GABAA,
antidepressivos, como os antagonistas dos receptores 5-HT2 e anti-histamínicos
(BORJA; DANIEL, 2006).
A insônia e a ansiedade estão diretamente ligadas à modulação da via do
GABA, não obstante quadros de ansiedade podem desencadear insônia por
estresse, e o tratamento é de forma concomitante, para as duas patologias, já que
compartilham vias comuns de regulação neurológica. Devido a isso, várias são as
plantas que apresentam esse efeito dúbio sobre o SNC, como Zizyphus jujuba e
Valeriana officinalis, utilizadas na cultura popular como soníferos, mas também
usados para o tratamento de ansiedade, assim como Scutellaria lateriflora, Withania
somnifera, Passiflora spp., Piper methysticum, Matricaria recutita, Eschscholzia
californica (SARRIS et al., 2011).
Em um estudo desenvolvido por Cho e colaboradores (2010), foram testadas
15 plantas asiáticas, destacando-se Glycyrrhiza uralensis e Albizzia julibrissin,
comumente utilizadas no tratamento popular de insônia, cujo mecanismo parece
ocorrer através da ativação do receptor GABAA, e a ligação com os receptores 5HT2c. Os extratos aquosos demonstraram perda do efeito ansiolítico com a dose de
10mg/ml de Flumazenil. O sono induzido por barbitúrico é um teste muito utilizado
para a avaliação comportamental da insônia, através do cálculo da latência do sono
(LS) e também do tempo total de sono, estes, alterados com a utilização de diversas
plantas, com o óleo essencial de Dennettia tripetala (OYEMITAN et al., 2013),
Eucommia ulmoides (LI et al. 2014), Matricaria chamomilla (SHINOMIYA et al.,
2005), Actinidia deliciosa e Actinidia chinensis (YANG et al., 2013), Valeriana
officinalis , Valeriana prionophila, dentre outras (DEY; DEY, 2013)
3.5.3 Plantas medicinais com propriedades antidepressivas
As desordens depressivas atingem, cerca de 350 milhões de pessoas em
todo o mundo e, estima-se que até o ano de 2020, a depressão se tornará a
31
segunda
doença
com
maior
aumento
na
morbidade,
após
as
doenças
cardiovasculares (WHO, 2012).
A fisiopatologia da doença é complexa, e parece ser desencadeada por um
número expressivo fatores biológicos. Nos últimos anos a principal premissa sobre a
doença foi a de uma disfunção na expressão de monoaminas e seus receptores, ou
de segundos mensageiros oriundos da cascata bioquímica derivada da ativação dos
receptores (SARRIS et al., 2011). Porém, hoje já se é conhecido que anormalidades
neuroendócrinas como o excesso de cortisol, a disfunção dos opióides endógenos e
as
mudanças
na
transmissão
Glutamatérgica
e
GABAérgica,
podem
ser
acrescentadas como causas da depressão (MILLER; HEN, 2014; SINGH; GOTILIB,
2014).
O aumento do nível de serotonina, pela diminuição de sua recaptação, leva a
melhorias no estado depressivo do paciente, assim como a diminuição dos níveis e
da atividade da enzima monoamina oxidase (MAO-A), a qual diminui a quantidade
de monoaminas, melhora o estado do paciente deprimido.
A fitoterapia também é feita na terapêutica da depressão. Várias plantas
utilizadas na medicina popular têm a capacidade de melhorar sensivelmente os
quadros depressivos leves como, por exemplo, Hypericum perforatum (CHANG;
WANG, 2010) e outras espécies de Hypericum (CCANA-CCAPATINTA et al., 2014),
Rhodiola rosea (MATTIOLI; FUNARI; PERFUMI, 2009) e Crocus sativusinibir
(HOSSEINZADEH; NORAEI, 2009). Os estudos atuais sugerem que tais plantas,
quando atuam inibem a recaptação de monoaminas, aumentam a ligação aos
receptores de serotonina e inibem a ação da MAO-A (SAABY; RASMUSSEN;
JÄGER, 2009).
Jäger e colaboradores (2013) demonstraram a ação antidepressiva de
diversas plantas, através da análise de afinidade com o transportador de serotonina
e a capacidade de inibição da MAO-A. Borago officinalis, uma planta rica em
alcalóides pirrolizidínicos e ácidos graxos insaturados, foi uma das plantas com
efetividade. Nesse mesmo estudo, no ensaio de inibição da enzima MAO-A, os
extratos mais ativos foram obtidos de sementes de Trigonella foenum-graecum e
folhas de Apium graveolens e das partes aéreas de Calluna vulgaris.
A Cecropia glaziovii, popularmente conhecida como Embaúba e encontrada
facilmente na costa de sudeste brasileira, contém como fitoconstituintes catequinas,
procianidinas e flavonoides, compostos estes possivelmente responsáveis pelo
32
efeito antidepressivo da planta (TANAE et al., 2007). Kielmeyera coriacea,
popularmente conhecida como “pau-santo”, é empregada na medicina popular
brasileira como um remédio antidepressivo. Sua ação se deve possivelmente em
função das xantonas as quais constituem os compostos majoritários (ZAGOTO et al.,
2006).
Pela diversidade de mecanismos que envolvem o tratamento da depressão,
encontramos plantas como: Canavalia brasiliensis, que tem seu mecanismo
direcionado para os receptores Glutamatérgicos-NMDA, redução de Óxido Nítrico
(NO) e a síntese de GMP-cíclico (RIEGER et al., 2014); Nelumbo nucifera, que em
sua composição possui substâncias que assemelham-se aos antidepressivos típicos
antagonizando receptores serotoninérgicos 5-HT1A
(SUGIMOTO et al., 2010); e
Apocynum venetum, que através de seus flavonoides tem seu efeito antidepressivo
anulado com a administração de antagonistas como sulpirida e SCH23390
(antagonistas D1 e D2, respectivamente), demonstrando um mecanismo de ação
ligado a via dopaminérgica de transmissão (ZHENG et al., 2013).
3.5.4 Plantas medicinais com propriedades anticonvulsivantes
A Epilepsia é a condição neurológica mais comum no mundo, mais de
cinquenta milhões de pessoas sofrem dessa doença e oitenta por cento dos
pacientes estão vivendo nos países desenvolvidos, onde, 3/4 dos pacientes não
estão recebendo tratamento adequado (WHO, 2012).
Essa patologia neuropsiquiátrica é caracterizada por uma predisposição
persistente a gerar crises epilépticas e desequilíbrio no centro de atividade elétrica
do cérebro, comumente correlacionada com a perda de consciência ou memória
(DETYNIECKI; BLUMENFELD, 2014).
A falta de tratamento de quadros de epilepsia pode levar o indivíduo uma
diminuição progressiva da função cognitiva, danos cerebrais e outros défices
neurológicos. O tratamento mais eficaz para quadros de epilepsia são obtidos com
fármacos antiepilépticos, porém, quase todas as drogas usadas atualmente têm
significativos défices de segurança (PERUCCA; MULA, 2012). Diante disso, muitos
neurocientistas não medem esforços para descoberta de novos tratamentos, viáveis
e seguros para o paciente.
33
A base da fisiopatologia da doença está relacionada com a atividade elétrica
descontrolada no SNC, que pode ocorrer pela redução da via de neurotransmissão
inibitória (através do neurotransmissor GABA, principalmente), aumento da via de
transmissão excitatória (através do neurotransmissor Glutamato, principalmente, ou
alterações iônicas de condutância através das membranas neuronais (OBNISKA et
al., 2010).
Além das vias clássicas de inibição e excitação neuronal, o sistema
serotoninérgico também modula uma variedade de tipos de epilepsia, através dos
receptores 5-HT1A, 5-HT2C, 5-HT7, mais relacionados com o aumento do limiar
convulsivo e com a inibição de descargas elétricas no hipocampo (MARLET et al.,
2004; OBNISKA et al., 2006). Diante disso, vários compostos são estudados para
essa função de modulação (SAPA et al., 2014).
Várias plantas já foram documentadas com propriedades anticonvulsivantes.
Essas espécies podem servir como fontes de medicamentos eficazes, mais
acessíveis e baratos, melhorando o estado atual do tratamento dessa patologia
(KUMAR; BHAT; KUMAR, 2012).
Acorus calamus, além de ter seu óleo essencial bastante empregado no
tratamento de infecções fúngicas e bacterianas, tem ação anticonvulsivante
aumentando a latência de camundongos para a convulsão, após a administração de
um agente convulsivo, o pentilenotetrazol (PTZ) (JAYARAMAN; ANITHA; JOSHI,
2010). O mesmo método foi utilizado para avaliar ação anticonvulsiva de Ziziyphus
nummularia (GOYAL; SASMAL, 2013). Gladiolus dalenii, uma planta medicinal
comumente utilizada na África, nos modelos de convulsão induzida eletricamente
(“eletrochoque”) e convulsão induzida PTZ, protegeu 100% e 83,3% dos
camundongos, respectivamente testados (NGOUPAYE et al., 2013). Bacopa
monnieri, possui efeito muito semelhante à fenitoína, droga antiepilética padrão,
induziu melhora significativa em todas as fases da convulsão (GIRAMKAR et al.,
2013).
Paederia
scandens,
através
do
ácido
paredeosídico,
teve
efeito
anticonvulsivo comprovado, resultando no aumento da concentração do ácido gamaaminobutírico (GABA), no cérebro dos animais testados e diminuição do ácido
glutâmico (Glutamato), o qual foi evidenciado através da técnica de Western Blot
(YANG et al., 2013).
A ação anticonvulsiva mediada pelo GABA, é mecanismo de ação de outras
plantas como a Sutherlandia frutescens (OJEWOLE, 2008) e Morus alba (GUPTA et
34
al., 2014), demonstrando que o aumento nos níveis desse neurotransmissor, pode,
de maneira eficaz proteger o cérebro de crises convulsivas assim como através do
bloqueio direto de canais de cálcio (GILANI et al., 2000).
O canabidiol, um fitocanabinóide extraido da Cannabis, demonstra efeito
protetor nos testes de eletro-choque e na administração do PTZ, mediado pelos
canais de potássio (SHIRAZI-ZAND et al., 2013). Coletivamente vários estudos
comprovam uma modulação terapêutica eficaz da epilepsia, através do sistema
endocanabinóide (HOFMANN; FRAZIER, 2013).
35
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Material vegetal
C. ambrosioides foi coletada no município de Cáceres, estado de Mato Grosso,
Brasil, em março de 2010. A espécie foi identificada pelo botânico M. SC. Oscar
Benigno Iza e uma exsicata de nº HBR 52802 encontra-se depositada no Herbário
Barbosa Rodrigues, Itajaí, SC.
4.2 Extração do óleo essencial
A extração e identificação do óleo essencial foram realizadas pela aluna Ruth
T. Degenhardt em seu trabalho de conclusão de curso sob a orientação da Prof.
Angela Malheiros conforme descrito abaixo.
Para a obtenção do óleo essencial foi utilizado o método por arraste de vapor
de água pelo método de hidro destilação com aparato de Clevenger. O óleo
essencial obtido foi denominado OECA com rendimento de 1,15% (Figura 3).
Figura 3: (A) Óleo essencial de C. ambrosioides; (B) Partes aéreas da C. ambrosioides (GRASSI et
al., 2013).
O óleo essencial obtido das folhas secas de C. ambrosioides foi analisado por
cromatografia gasosa com detector de ionização de chama (CG-FID) e por
cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG/EM Shimadzu,
QP2010 S). A análise realizada por CG-FID, com coluna capilar Rtx-1 (30 m x 0,25
mm x 0,10 µm), teve o gás Helio como carreador (0,8 mL/min); temperatura do
injetor: 180 ºC e interface: 250 ºC, Split: 1:50, no programa de temperatura: 80 °C
36
(80 ºC até 200 ºC em 20 ºC/min; 200 ºC até 300 ºC em 15 ºC/min; 300 ºC até 310 ºC
em 12 ºC/min); FID (310 ºC) H2: 40 mL/min.
O óleo essencial foi também analisado por CG/EM, com temperatura do
injetor de 250ºC; programa de temperatura de 80 ºC até 200 ºC em 20 ºC/min; 200
ºC até 300 ºC em 15 ºC/min; tendo as demais condições iguais às do CG-FID. A
identificação da composição química do óleo essencial e das frações foi realizada
pela comparação dos espectros de massas obtidos com os dados da biblioteca
disponível no aparelho (versão NIST 8.0).
O óleo essencial apresentou dois compostos majoritários, com tempos de
retenção de 3,614 e 5,064 minutos. Os compostos foram identificados como: 1isopropil-4-metil-benzeno
(p-Cimeno)
dioxabiciclo[2.2.2]oct-5-eno
(ascaridol)
(42,32%)
(49,77%)
e
1-isopropil-4-metil-2,3-
(Figura
4),
respectivamente
(Degenhardt, 2014).
Figura 4: (A) Cromatograma obtido por CG-FID (180ºC) do óleo essencial de Chenopodium
ambrosioides (OECA); (B) Estrutura dos compostos majoritários presentes no óleo essencial
(DEGENHARDT, 2013).
(A)
uV (x1,000,000)
3.0 Chromatogram
5,064
3,614
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
(B)
O
O
Ascaridol
p-Cimeno
8.0
9.0
min
37
4.3
Ensaios Farmacológicos:
4.3.1 Animais:
Para os experimentos foram utilizados camundongos Swiss machos (25 a
30g), oriundos do Biotério Central da Univali. Os animais foram mantidos no biotério
setorial em caixas com maravalha, com no máximo 20 animais/caixa com ciclo
claro/escuro de 12 horas, aclimatados a temperatura de 22 +/- 2 ºC e tratados com
água e ração ad libitum, exceto durante os experimentos. As caixas foram trocadas
em dias alternados pelo técnico responsável conforme rotina interna do biotério. Os
animais permaneceram no biotério por no máximo 3 dias. Durante os experimentos,
os mesmos foram conduzidos para a sala experimental e permaneceram em
ambientação por um período mínimo de uma hora. Após os experimentos os animais
foram eutanaziados pela equipe responsável, com CO2 (conforme prática local da
instituição) e as carcaças foram descartadas em sacos de lixo hospitalar, para futuro
processo de incineração, também conforme pratica local.
Os protocolos foram
submetidos ao comitê de Ética para uso de animais (CEUA) na UNIVALI sendo
aprovado com parecer número 014/13.
4.3.2 Drogas e tratamentos:
Nos ensaios farmacológicos foram utilizadas as seguintes drogas e
reagentes: A imipramina, pentilenotetrazol, pentobarbital, prazosina, ioimbina,
haloperidol, SCH2390 (R(+)-7-Cloro-8-hidroxi-3-metil-1-phenil-2,3,4,5-tetrahidro-1H3-benzazepino hidrocloreto), pindolol, metoclopramida, NAN-190 (1-(2-Metoxifenil)-4[4-(2-ftalimido) butil] piperazine hidrobrometo), quetanserina, pimozide e bicuculina,
baclofeno, foram obtidos de Sigma Chem. Co. (St. Louis , EUA); e, Flumazenil,
diazepam e ondansetrona de Cristália Prod. Química Farm. Ltda , São Paulo, Brasil.
As doses utilizadas foram baseadas em artigos científicos do grupo de pesquisa
(TOLARDO et al., 2010).
O óleo essencial de C. ambrosioides, foi dissolvido em DMSO e
administradas v.o. pelo método de gavagem, 60 minutos antes dos testes. As outras
drogas foram dissolvidas em solução salina isotônica (NaCl a 0,9%), imediatamente
antes da aplicação, exceto o flumazenil que foi dissolvido em solução de 10% de
38
Twen 80. As drogas foram aplicadas por via intraperitoneal (i.p.), 30 minutos antes
dos testes. O veiculo utilizado como controle negativo é o mesmo meio no qual foi
dissolvido o óleo essencial.
4.3.3 Grupos experimentais:
Para os experimentos comportamentais os animais foram divididos em 5
grupos 3 deles tiveram o tratamento com o óleo essencial da planta nas doses de
50mg/kg, 100mg/kg e 150mg/Kg (ARAÚJO et al., 2005; TOLARDO et al., 2010).
Para a análise do mecanismo de ação os animais foram divididos de acordo com o
número de antagonistas utilizados. O N por grupo experimental foi de 10 animais.
Todas as administrações dos tratamentos e/ou controles negativos foram feitas uma
única vez por via oral (v.o.), os antagonistas e controles positivos foram
administrados por via intraperitoneal (i.p.), de uma única vez. Os tratamentos foram
solubilizados e um volume de 0.10mL/peso corporal para serem administrados nos
animais.
4.3.4 Ensaios farmacológicos
4.3.4.1 Avaliação do efeito do OECA sobre o sistema motor e depressor
através do teste de campo aberto (TCA) e Rota rod:
O
aparato
utilizado
para
os
experimentos
com
camundongos
foi
confeccionado em madeira (30 x 30 x 15 cm) com a frente de vidro para melhor
visualizar os animais. O interior do aparato foi subdividido em 9 quadrantes. Neste
modelo, dois grupos foram testados como controle: positivo (haloperidol 2,5 mg/kg),
e negativo (veículo). O OECA (50, 100 e 150 mg/Kg) bem como o controle negativo
foram administrados por via oral, 60 minutos antes do experimento. Os testes
avaliaram os efeitos inespecíficos sobre o SNC, sobretudo sobre o sistema motor
dos animais. Foram observados os seguintes parâmetros: número de cruzamentos
dos quadrantes (crossing) e número de atividades exploratórias caracterizadas por
tentativas de levantar o corpo, apoiando-se sobre as patas traseiras (rearings)
conforme descrito por OLIVEIRA et al. (2006). O tempo de observação foi de 6
minutos (Figura 5).
39
O aparato utilizado para o teste do Rotarod consiste em uma barra de 2,5cm
de diâmetro, subdividida em quatro compartimentos por discos de 25cm de
diâmetro. A barra gira a uma velocidade constante de 12 rotações por minuto (rpm).
Os animais foram colocados no aparato e treinados com intervalos de 60 segundos,
durante três tentativas, os que não conseguiram se manter na barra por esse tempo
foram descartados. Após 24 horas os animais foram divididos em grupos e tratados
com OECA (50, 100, 150 mg/kg) e controle negativo (veículo) (Figura 6), após foram
levados ao aparato e foi observado o tempo de permanência na barra (em
segundos) e o número de quedas dos animais (TOLARDO et al., 2008).
Figura 5: Esquema representativo da investigação do efeito do OECA sobre a deambulação dos
animais através do TCA.
40
Figura 6: Esquema representativo da investigação do efeito do OECA sobre o sistema motor de
animais através do Rotarod.
4.3.4.2 Avaliação do efeito do OECA sobre a depressão através do modelo da
natação forçada (MNF):
Para a investigação do efeito antidepressivo utilizou-se o MNF. Os
experimentos foram realizados conforme descrito por Rodrigues et al. (2002). Dois
grupos de animais foram testados como controle: o positivo (imipramina 50 mg/kg,
i.p.), e o negativo (veículo, v.o.). O OECA foi administrado oralmente, 60 minutos
antes dos testes. Após esse tempo, os animais foram colocados individualmente
num tanque de vidro (25 cm de altura e 10 cm de diâmetro), cheio com água a uma
temperatura de 24 a 25°C. Durante 6 minutos (Figura 7). Foi cronometrado o tempo
de imobilidade dos animais, o qual foi usado como parâmetro comportamental de
anedonia, comportamento este, que indica o estado de desesperança do animal
após perceber que a fuga do recipiente não será possível, o tempo de nado
41
(mobilidade) e de escalada (tentativa de escape) também foram parâmetros
avaliados no teste (SÁNCHEZ-MATEO et al., 2005).
Figura 7: Esquema representativo da investigação do efeito do OECA sobre a depressão através do
MNF.
4.3.4.3 Avaliação do efeito do OECA sobre o sono induzido por barbitúrico
(MSB):
Para investigação de um possível efeito hipnótico do OECA, foi utilizado o
MSB conforme descrito por Devi et al. (2003) com pequenas modificações. Como
controle positivo foi utilizado o diazepam (1mg/Kg, i.p.) e negativo, o veículo (v.o.).
Os animais receberam os tratamentos com o OECA nas concentrações de 50, 100 e
150 mg/Kg (v.o). Após 60 minutos, foi administrado pentobarbital (50 mg/Kg, i.p.).
Imediatamente os animais foram colocados individualmente sob funis de vidro
(Figura 8). A latência para o sono e o tempo total de sono foi cronometrado e
representado respectivamente pela perda e recuperação do reflexo postural (DEVI et
al., 2003; QUINTANS-JÚNIOR; ALMEIDA; ANTONIOLLI, 2005).
42
Figura 8: Esquema representativo da investigação do efeito do OECA sobre o MSB.
4.3.4.4 Avaliação do efeito do OECA sobre a convulsão induzida por
pentilenotetrazol (MCP):
O efeito anticonvulsivante do OECA foi avaliado através do antagonismo das
convulsões induzidas por pentilenotetrazol (PTZ), conforme descrito por Kasture;
Kasture; Chopde (2002). Os animais receberam os tratamentos com o OECA nas
concentrações de 50, 100 e 150mg/Kg (v.o.), bem como, com os controles: positivo
(fenobarbital 0,5mg/Kg, i.p.) e negativo (veículo, v.o.). Transcorridos 60 minutos
após os tratamentos com OECA e controle negativo e 30 minutos após o tratamento
com o controle positivo, os animais receberam PTZ (100mg/Kg, v.o.). Imediatamente
após a aplicação do PTZ, os animais foram colocados sob funis de vidro e
observados num período de 60 minutos subsequentes (Figura 9), para verificação do
tempo de latência para primeira crise convulsiva (KASTURE; KASTURE; CHOPDE,
2002).
43
Figura 9: Esquema representativo da investigação do efeito do OECA sobre a convulsão induzida por
PTZ.
4.3.4.5 Avaliação do efeito do OECA sobre a ansiedade dos animais através do
modelo de labirinto em cruz elevado (LCE):
Para a avaliação do efeito ansiolítico do OECA, o modelo de ansiedade
utilizado foi o LCE, e os procedimentos foram feitos conforme descrito por Pellow et
al. (1985), com pequenas modificações. O aparato utilizado é constituído de
madeira, em forma de cruz grega, com dois braços abertos (30 x 5 x 2,5 cm), e dois
fechados (30 x 5 x 15 cm), os braços são conectados por uma área central aberta (5
x 5 cm). O aparato será elevado a uma altura de 50 cm sobre o chão
(EMAMGHOREISHI; KHASAKI; AAZAM, 2005). Dois grupos foram testados como
controle: positivo (diazepam 0,75 mg/kg, i.p.) e o controle negativo (veículo, v.o.). O
OECA, foi administrado por via oral, em três concentrações diferentes 50, 100 e 150
mg/Kg. Decorridos 60 minutos após a administração do OECA, os animais foram
colocados individualmente no centro do aparato com a cabeça voltada ao braço
44
fechado e observados durante 5 minutos (Figura 10). Durante esse tempo, foi
observado e registrado a frequência de entrada e o tempo de permanência nos
braços abertos (FEA e TPA, respectivamente), e nos fechados (FEF e TPF,
respectivamente). As entradas nos braços do aparato foram definidas quando o
animal esteve com todas as quatro patas no braço visitado.
Para análise estatística, as percentagens das frequências de entradas nos
braços abertos (%FEA) e tempo permanência nesses braços (%TPA) foram
calculados de acordo com as fórmulas: %FEA = FEA / FEA + FEF X 100 e %TPA =
TPA / TPA + TPF X 100, para a análise estatística nos braços fechados foram
seguidas da mesma maneira (SOUZA et al., 1998).
Figura 10: Esquema representativo da investigação do efeito do OECA sobre a ansiedade através do
LCE.
45
4.3.4.6 Determinação do mecanismo de ação da propriedade ansiolítica do
OECA
Para avaliação do envolvimento de sistemas serotonérgico, adrenérgico e
dopaminérgico no mecanismo de ação da propriedade ansiolítica do OECA, o
protocolo experimental foi delineado conforme mostrado na Figura 11, modificando
somente o antagonista específico conforme o sistema a ser estudado.
Figura 11: Esquema representativo da investigação do mecanismo de ação da propriedade ansiolítica
do OECA.
a) Avaliação do sistema GABAérgico sobre o efeito ansiolítico do OECA:
Para a avaliação do possível envolvimento do receptor dos benzodiazepínicos
no mecanismo de ação e propriedade ansiolítica do OECA, os animais foram prétratados com Flumazenil (3 mg/Kg, i.p., antagonista GABAA/benzodiazepínico
específico) e após 15 minutos foram administrados em grupos diferentes: o
46
Diazepam (0,75mg/kg, i.p., Benzodiazepínico padrão), o Veículo e o OECA (50mg,
v.o.). Decorrido mais 30 (dos tratamentos i.p.) e 60 (dos tratamentos v.o) os animais
foram submetidos ao LCE.
Para avaliar o possível envolvimento dos receptores GABAA e GABAB os
animais foram pré-tratados com Baclofeno (2 mg/kg, i.p., antagonistas seletivo dos
receptores GABAB) e Bicuculina (1mg/kg, i.p., antagonista seletivo de receptores
GABAA), após 15 minutos, foi administrado o OECA (50mg/kg, v.o.) e veículo. Foram
aguardados 60 minutos para a observação no LCE. Avaliou-se o tempo de
permanência nos braços abertos e a frequência de entrada nos braços abertos.
b) Avaliação do sistema Serotoninérgico sobre o efeito ansiolítico do
OECA:
Para investigar o possível envolvimento de receptores serotonérgicos, no
efeito antidepressivo do OECA os animais foram pré-tratados com NAN-190 (0,3
mg/kg, i.p., antagonista dos receptores 5-HT1A), Quetanserina (5 mg/kg, i.p.,
antagonista seletivo dos receptores 5-HT2A/2C), Ondansetrona (0,3 mg, i.p.,
antagonista seletivo dos receptores 5-HT3), e Pindolol (10mg/kg, i.p., antagonista
seletivo dos receptores 5-HT1A/1B), após 15 minutos, foi administrado o OECA
(50mg/kg, v.o.), e aguardado 60 minutos para a observação dos efeitos no Labirinto
em Cruz Elevada. Neste modelo, foram analisados o tempo de permanência nos
braços abertos e a frequência de entrada nos braços abertos do aparato,
respectivamente (Figura 11).
c) Avaliação do sistema Dopaminérgico sobre o efeito ansiolítico do OECA:
Para a avaliação do possível envolvimento do sistema dopaminérgico, os
animais
foram
pré-tratados
com
Haloperidol
(10µg/kg,
i.p.,
antagonista
dopaminérgico não seletivo), Pimozide (0,5 mg/kg, i.p., antagonista seletivo de
receptores D2), SCH23390 (0,5mg/kg, i.p., antagonista seletivo de receptores D1) e
Metoclopramida (1mg/kg, i.p., antagonista seletivo de receptores 5-HT3/D1). Após 15
minutos, foi administrado o OECA (50mg/kg, v.o.), e aguardado 60 minutos para a
observação dos efeitos no Labirinto em Cruz Elevada. Foram analisados o tempo de
47
permanência nos braços abertos e a frequência de entrada nos braços abertos do
aparato (Figura 11).
d) Avaliação do sistema Adrenérgico sobre o efeito ansiolítico do OECA
Para a avaliação do possível envolvimento do sistema adrenérgico, os
animais foram pré-tratados com Prasozina (1mg/Kg, i.p., antagonista seletivo de
receptores α1) e Ioimbina (1mg/kg, i.p., antagonista seletivo de receptores α2). Após
15 minutos, foi administrado o OECA (50mg/kg, v.o.), e aguardado 60 minutos para
a observação dos efeitos no Labirinto em Cruz Elevado. Foram analisados o tempo
de permanência nos braços abertos e a frequência de entrada nos braços abertos
do aparato (Figura 11).
4.4
Análise estatística
Os dados obtidos foram apresentados com médias seguidas pelos
respectivos erros padrões médio (EMP), e os dados foram submetidos às análises
de variância (ANOVA), quando necessários, foram seguidos de teste de múltipla
comparação a partir dos modelos pos hoc de Bonferroni, utilizando o software
GraphPad INSTAT®.
Os resultados foram apresentados como medianas seguidas dos intervalos
interquadil. Foram considerados estatisticamente significantes os valores de p menor
do que 0,05 (p < 0,05) (MANSOURI et al., 2014).
48
5 RESULTADOS
5.1 Avaliação do efeito do OECA sobre a deambulação dos animais através do
TCA e da capacidade motora pelo teste Rota rod.
A Figura 12 ( A/B) mostra o efeito do tratamento dos animais com OECA
(50mg, 100mg, 150mg), administrados por via oral no teste de campo aberto (TCA).
Observa-se que o OECA não promoveu alteração dos parâmetros do teste, não
havendo diferença significativa entre o número de cruzamentos (crossing) e
levantadas (rearings), quando comparadas as doses do OECA com o controle
negativo [F(4,42) = 361,3, p>0,05]; [F(4,35) = 484,7, p>0,05], respectivamente. Como
esperado o haloperidol (2,5mg/kg, i.p.), diminuiu significativamente os dois
parâmetros observados, demonstrando seu efeito letárgico no sistema motor dos
animais.
A Figura 13 (A), representa o tempo de permanência dos animais no teste do
Rota rod (12rpm), o qual não apresentou alteração com a administração do OECA
em todas as doses utilizadas quando comparadas com o controle (F(3,34) = 0,6443,
p>0,05). Da mesma forma, o número de quedas não foi alterado no teste, quando
comparado às doses administradas de OECA e o controle negativo, não se
observou diferença significativa (F(3,36) = 1,311, p>0,05) (Figura 13B).
49
Número de Cruzamentos
"Crossing"
Figura 12: Efeito da administração aguda do OECA (50, 100 e 150 mg/Kg), administrados pela via
oral sobre os parâmetros: número de cruzamentos (crossing) (A) e número de rearings (B). Cada
coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média
(E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de
Bonferroni. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo veículo. *** p <
0,001.
150
Veículo
OECA
Haloperidol
A
100
***
50
0
Controle
50
100
150
2,5
Tratamento (mg/kg)
Número de Levantadas
"Rearing"
100
B
80
60
40
***
20
0
Controle
50
100
150
2,5
Tratamento (mg/kg)
50
Tempo de permanência (s)
Figura 13: Efeito da administração aguda do OECA (50, 100 e 150 mg/Kg), administrados pela via
oral no teste do Rotarod. Tempo de permanência dos animais no aparelho Rotarod (A) e número de
quedas dos animais do aparelho (B). Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras
verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de
variância ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni.
60
Controle
OECA
A
40
20
0
Controle
50
100
150
Tratamento (mg/kg)
Número de quedas
4
B
3
2
1
0
Controle
50
100
150
Tratamento (mg/kg)
51
5.2 Avaliação do efeito do OECA sobre a ansiedade dos animais através do
modelo LCE.
Os resultados da Figura 14 (A) demonstram que o tratamento dos animais
com OECA nas concentrações de 50mg, 100mg e 150mg (F(4,40) = 27,69, p<0,001),
promoveu um maior número de entradas nos braços abertos, quando comparados
com o grupo controle (veículo), assim como uma diminuição das entradas nos
braços fechados, em todas as doses testadas (F(4,39) = 27,24, p<0,001) (figura 14C).
Também se observou que o tempo de permanência nos braços abertos é
significativamente maior quando administrado o OECA. Essa diferença é constatada
nas doses de 50mg, 100mg e 150mg (F(4,46) = 51,73, p<0,001) (Figura 14B). Em
contrapartida ao tempo nos braços abertos que aumentou com a administração do
OECA, ocorreu à diminuição do tempo nos braços fechados, em todas as doses
utilizadas (F(4,36) = 58,76, p<0,001) (Figura 14D).
Também foi observado nesse experimento o efeito ansiolítico clássico do
diazepam. O medicamento promoveu aumento do tempo de permanência (F(4,46) =
51,73, p<0,001) e frequência de entradas (F(4,40) = 26,69, p<0,001), nos braços
abertos (Figuras 14A e 14B), uma diminuição dos mesmos parâmetros de tempo e
frequência nos braços fechados do aparato (Figuras 14C e 14D) [F(4,36) = 58,76,
p<0,001]; [F(4,39) = 27,24, p<0,001], respectivamente.
52
Frequencia de entrada
nos braços abertos (%)
Figura 14: Efeito da administração aguda do OECA (50, 100 e 150 mg/Kg) e de diazepam (0,75
mg/Kg), administrados pela via oral e intraperitoneal, respectivamente, no modelo LCE. Freqüência
de entrada nos braços abertos (A), tempo de permanência nos braços abertos (B), freqüência de
entradas nos braços fechados (C) e tempo de permanência nos braços fechados (D). Cada coluna
representa a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média
(E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de
Bonferroni. Os asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle
(veículo). *** p < 0,001.
80
Controle
OECA
Diazepam
A
60
***
***
***
100
150
***
40
20
0
Controle
50
0,75
Tempo de permanência
nos braços abertos (%)
Tratamento (mg/kg)
80
B
***
60
***
***
***
150
0,75
40
20
0
Controle
50
100
Frequencia de entrada
nos braços fechados (%)
Tratamento (mg/kg)
80
C
60
***
***
***
***
40
20
0
Controle
50
100
150
0,75
Tempo de permanência
nos braços fechados (%)
Tratamento (mg/kg)
80
D
60
***
***
40
***
***
150
0,75
20
0
Controle
50
100
Tratamento (mg/kg)
53
5.3 Avaliação do efeito do OECA sobre o sono induzido por barbitúricos (MSB).
Os resultados representados na Figura 15 demonstram que o tratamento dos
animais com OECA, em todas as doses testadas, promoveu significativamente
redução do tempo de latência para o sono (Figura 15A) [F(4,35) = 228,7, p<0,001],
quando comparado com o grupo controle negativo (veículo).
No mesmo experimento verificou-se que o tempo total de sono (Figura 15B)
[F(4,35) = 63,66, p<0,001], quando comparadas com o grupo controle negativo
(veículo). Foi observado também que, conforme esperado, o tratamento dos animais
com diazepam (1 mg/kg, i.p.) promoveu, um aumento significativo no tempo total de
sono (F(4,35) = 63,66, p<0,001) e diminuição da latência para o sono (F(4,35) = 228,7,
p<0,001), quando comparado com o controle negativo (veículo), produzindo seu
característico efeito hipnótico.
54
Latência para o sono (s)
Figura 15: Efeito da administração aguda do OECA (50, 100 e 150 mg/Kg) e de diazepam (1 mg/Kg),
administrados pela via oral e intraperitoneal, respectivamente no MSB. Tempo de latência para o
sono (A) e o tempo total do sono (B). Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras
verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de
variância ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni. Os asteriscos indicam diferenças significantes
comparadas com o grupo controle (veículo). *** p < 0,001.
1500
Veículo
OECA
Diazepam
A
***
1000
500
0
***
Controle
50
100
***
***
150
1
Tratamento (mg/kg)
Tempo de sono (s)
4000
B
***
***
***
100
150
1
***
3000
2000
1000
0
Controle
50
Tratamento (mg/kg)
55
5.4 Avaliação do efeito do OECA sobre a depressão através do Modelo de
Nado Forçado (MNF).
No MNF, apresentado na Figura 16A, está demonstrado que o OECA não
promoveu mudanças significativas no padrão comportamental dos animais em
nenhum dos parâmetros comportamentais observados no teste (imobilidade,
escalada, mobilidade), em nenhuma das doses utilizadas, quando comparadas com
o veículo.
Em dois dos parâmetros observados (Figura 16A e 16B), a imipramina
(50mg/kg, i.p.), administrada como droga antidepressiva de escolha, exibiu efeito
antidepressivo, promovendo um aumento significativo no tempo de escalada (F(4,38) =
34,76, p<0,001) e diminuição do tempo de imobilidade (F(4,36) = 93,06, p<0,001),
quando comparada com o controle (veículo).
56
Figura 16: Efeito da administração de OECA (50, 100 e 150 mg/Kg, v.o.) e da imipramina (50 mg/Kg,
i.p.). Tempo de Imobilidade (A), Tempo de escalada (B), Tempo de nado (C). Cada coluna representa
a média de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os
dados foram submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni. Os
asteriscos indicam diferenças significantes comparadas com o grupo controle (veículo).*** p < 0,001.
Veículo
OECA
Imipramina
Imobilidade (s)
200
A
150
100
50
0
***
Controle
50
100
150
50
Tratamento (mg/kg)
250
B
Escalada (s)
200
***
150
100
50
0
Controle
50
100
150
50
Tratamento (mg/kg)
Mobilidade (s)
200
C
150
100
50
0
Controle
50
100
150
50
Tratamento (mg/kg)
57
5.5 Avaliação do efeito do OECA sobre a convulsão induzida por PTZ.
Na Figura 17 está representa os resultados obtidos com animais avaliados no
modelo de antagonismo da convulsão induzida por PTZ, e tratados com OECA.
Neste modelo os animais que receberam tratamento com OECA, na dose de
150mg/kg tiveram aumento significativo da latência para a primeira crise convulsiva
(F(4,40) = 1280, p<0,001), quando comparado com os animais tratados com o
veículo. Porém, o tratamento não protegeu os animais contra a letalidade induzida
pelo PTZ, uma vez que os animais não sobreviveram às crises tônicas induzidas
pelo PTZ (resultados não mostrados). O fenobarbital, utilizado como controle
positivo apresentou seu efeito anticonvulsivante (F(4,40) = 1280, p<0,001),
aumentando significativamente a latência para a convulsão, quando comparado com
o veículo.
58
Latência para convulsão (s)
Figura 17: Efeito da administração aguda do OECA (50, 100 e 150 mg/Kg, v.o.) e de fenobarbital (50
mg/Kg, i.p.), no modelo de convulsão induzida por PTZ. A figura indica o tempo de latência para
primeira crise convulsiva com PTZ. Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras
verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de
variância ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni. Os asteriscos indicam diferenças significantes
comparadas com o grupo controle (veículo). *** p < 0,001.
Veículo
OECA
Fenobarbital
1500
***
1000
500
***
0
Controle
50
100
150
500
Tratamento (mg/kg)
59
5.6
Determinação do mecanismo de ação da propriedade ansiolítica do
OECA:
5.6.1 Influencia do sistema adrenérgico sobre o mecanismo de ação da
propriedade ansiolítica do OECA
A Figura 18, mostra que o pré-tratamento dos camundongos com os
antagonistas, α1-adrenérgico, prazosina (1 mg/kg, i.p) ou α2-adrenérgico, ioimbina
(1 mg/kg, i.p.), quando comparados ao grupo tratado apenas com o OECA:, não
foram capazes de reverter o efeito ansiolítico do OECA: (50 mg / kg) no teste do
labirinto de cruz elevada) considerando os parâmetros de: Tempo de permanência
nos braços abertos [F(5,45) = 40,64, p>0.05], Figura 18(B) e, Frequência de entrada
nos braços abertos [F(5,48) = 69,55, p>0,05], Figura 18(A). Os animais tratados
apenas com o OECA (50mg/kg, v.o.), apresentaram diferença significativa em
comparação com o controle (veículo), demonstrando o efeito ansiolítico do óleo.
60
Frequencia de entradas
nos braços abertos (%)
Figura 18: Efeito do pré-tratamento dos camundongos com Ioimbina (1 mg / kg, ip, um antagonista
α2-adrenérgico) e Prazosina (1 mg / kg, ip, um antagonista α1-adrenérgico) e Óleo essencial de C.
ambrosioides (50 mg / kg, v.o.), respectivamente, no modelo LCE. Frequência de entradas nos
braços abertos (A), tempo de permanência nos braços abertos (B). Cada coluna representa a média
de 8 a 10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram
submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni. Os valores são
expressos como média ± S.E.M. (n = 8-10). *** p<0.001, em comparação com o grupo controle.
80
A
60
Ioimbina
Prasozina
Veículo
OECA 50mg
***
40
20
0
Tempo de permanência
nos braços abertos (%)
OECA 50mg/Kg
80
60
B
***
40
20
0
OECA 50mg/Kg
61
5.6.2 Influencia do sistema serotoninérgico sobre o mecanismo de ação da
propriedade ansiolítica do OECA
Os resultados apresentados na Figura 19 mostram que o pré-tratamento dos
animais com os antagonistas de serotonina 5HT1A, o NAN-190 (0,5mg/Kg, i.p.) e
antagonista 5-HT2A, a Quetanserina (5mg/kg, i.p.), foram capazes de reverter o efeito
ansiolítico do OEA representado pela diminuição do número de entradas nos braços
abertos [F(8,401) = 9,78 p<0,001], porém não apresentaram efeito no tempo
desprendido pelos animais nesses respectivos compartimentos do LEC [F(9,73) =
10,73 p>0,05]; Além disso, a Figura 19 mostra que o pré-tratamento dos
camundongos com antagonista de receptores 5-HT3, ondansetrona (0,3mg/kg, i.p.) e
o antagonista dos receptores 5-HT1A/1B, pindolol (10mg/kg, i.p.), não foram capazes
de reverter o efeito ansiolítico do OECA (50mg/kg, v.o.) no labirinto de cruz elevada.
Os animais tratados apenas com o OECA (50mg/kg, v.o.), apresentaram diferença
significativa em comparação com o controle (veículo), demonstrando o efeito
ansiolítico do óleo.
62
Frequencia de entradas
nos braços abertos (%)
Figura 19: Efeito do pré-tratamento dos camundongos com NAN-190 (0,5 mg, i.p., antagonista de
receptores 5-HT1A), Ondansetrona (0,3 mg, i.p., antagonista de receptores 5-HT3), Quetanserina
(5mg/kg, i.p., antagonista de receptores 5-HT2A/2C), Pindolol (10 mg / kg, i.p., antagonista de
receptores 5-HT1A/1B) e OECA (50 mg / kg, v.o.), no modelo LCE. Frequência de entradas nos braços
abertos (A), tempo de permanência nos braços abertos (B). Cada coluna representa a média de 8 a
10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram
submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni. Os valores são
expressos como média ± S.E.M. (n = 8-10). *** p<0.001, em comparação com o grupo controle. ###
p<0.001, comparação do grupo pré-tratados com antagonistas e o grupo tratado somente com OECA.
80
A
Ondansetrona
Quetanserina
Pindolol
Veículo
OECA 50mg
NAN-190
***
60
### ###
40
20
0
Tempo de permanência
nos braços abertos (%)
OECA 50mg/Kg
80
60
B
***
40
20
0
OECA 50mg/Kg
63
5.6.3 Influência do sistema dopaminérgico sobre a propriedade ansiolítica do
OECA.
Todos
os
antagonistas
dopaminérgicos
específicos
utilizados
neste
experimento com o intuito de investigar a influencia do sistema sobre a propriedade
ansiolítica do OECA, reverteram seu efeito ansiolítico. A Figura 20 nos mostra que o
pré-tratamento dos animais com: SCH23390, antagonista dos receptores D1;
Pimozide, antagonista dos receptores D2; e Haloperidol, antagonista não seletivo
dos receptores de dopamina diminuíram a frequência de entradas nos braços
abertos (F
(9,75)
= 19,59, p<0.001)(Figura 20A), porém apenas o pré-tratamento com
Haloperidol interferiu no tempo de permanência dos animais nos braços abertos (F
(9,72)
= 11,72, p<0.001) quando comparado com o OECA administrado isoladamente.
e D). O pré-tratamento dos animais com Metoclopramida, antagonista 5-HT3/D1, não
promoveu alterações significativas em nenhum dos parâmetros avaliados.
64
Frequencia de entradas
nos braços abertos (%)
Figura 20: Efeito do pré-tratamento dos camundongos com Pimozide (0,5 mg / kg, i.p., antagonista de
receptores dopamina D2), Haloperidol (10µg/kg, i.p., antagonista não seletivo de receptores de
dopamina), SCH 23390 (0,5 mg / kg, i.p., antagonista de receptores de dopamina D1),
Metoclopramida (1mg/kg, i.p., antagonista de receptores 5HT3/D1) e OECA (50 mg / kg, v.o.),
respectivamente, no modelo LCE. Frequência de entradas nos braços abertos (A), tempo de
permanência nos braços abertos (B),. Cada coluna representa a média de 8 a 10 animais e as barras
verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram submetidos à análise de
variância ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni. Os valores são expressos como média ± S.E.M.
(n = 8-10). *** p<0.001, em comparação com o grupo controle. ### p<0.001, comparação do grupo
pré-tratados com antagonistas e o grupo tratado somente com OECA.
80
A
Pimozide
Haloperidol
Metoclopramida
Veículo
OECA 50mg
SCH23390
***
60
###
### ###
40
20
0
Tempo de permanência
nos braços abertos (%)
OECA 50mg/Kg
80
60
40
B
***
###
20
0
OECA 50mg/Kg
65
5.6.4 Influencia do sistema GABAérgico sobre o mecanismo de ação da
propriedade ansiolítica do OECA
O efeito ansiolítico do óleo essencial de C. ambrosioides parece envolver
diretamente o sistema GABAérgico. Os resultados apresentados na Figura 21
demonstraram que o tratamento prévio dos animais com Flumazenil (3mg/kg, i.p.)
reverteu o efeito do Diazepam (1mg/kg, i.p.), droga ansiolítica padrão, assim como
ocorreu com a administração de Bicuculina (1mg/kg, i.p.) e Baclofeno (2mg/kg, i.p.),
que reverteram o efeito do OECA, nos parâmetros de tempo de permanência nos
braços abertos do aparato (F(9,75) = 26,59, p<0.001) e frequência de entradas nos
braços abertos (F(9,79) = 19,35, p<0.001). Os resultados comprovaram o efeito
antagonista do flumazenil, frente à administração concomitante de diazepam,
demonstrando a característica ansiogênica da droga.
66
Frequencia de entradas
nos braços abertos (%)
Figura 21: Efeito do pré-tratamento dos camundongos com Bicuculina (1,0 mg / kg, i.p., antagonista
de receptores GABAA), Baclofeno (2,0 mg / kg, i.p., antagonista do receptor GABAB) e Flumazenil
(3mg/kg, i.p., antagonista dos benzodiazepínicos), Diazepam (1mg/kg, i.p., agonistas GABAérgico) e
ÓECA (50 mg / kg, v.o.), respectivamente, no modelo LCE. Frequência de entradas nos braços
abertos (A), tempo de permanência nos braços abertos (B). Cada coluna representa a média de 8 a
10 animais e as barras verticais indicam os erros padrões da média (E.P.M.). Os dados foram
submetidos à análise de variância ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni. Os valores são
expressos como média ± S.E.M. (n = 8-10). *** p<0.001, em comparação com o grupo controle. ###
p<0.001, comparação do grupo pré-tratados com antagonistas e o grupo tratado somente com OECA.
(a) p<0.001, comparação do grupo pré-tratados com diazepam+flumazenil e o grupo tratado somente
com diazepam.
80
A
***
60
Baclofeno
Dizepam
Diazepam+Flumazenil
Veículo
OECA 50mg
Bicuculina
Flumazenil
a
***
###
### ###
40
20
0
OECA 50mg/Kg
Tempo de permanência
nos braços abertos (%)
80
60
40
B
***
***
a
###
###
###
20
0
OECA 50mg/Kg
67
6 DISCUSSÃO
Os óleos essenciais compreendem uma mistura de substâncias voláteis
extraída de plantas. Podem se revelar como matérias-primas de importância para as
indústrias cosmética, farmacêutica e alimentícia, sendo geralmente os componentes
de ação terapêutica de plantas medicinais aromáticas (EL HADI et al., 2013)
Desde muitos séculos, os óleos essenciais são explorados, embora ainda
hoje não se tenha completamente documentado o início exato. Acredita-se que os
primeiros usos para estes, tenha sido através de bálsamos, ervas aromáticas e
resinas que eram usadas para embalsamar cadáveres em cerimônias religiosas há
milhares de anos atrás. Há relatos do uso de óleos essências em 2.700 a.C pelos
chineses, no mais antigo livro de ervas do mundo, Shen Nung. Algumas das plantas
citadas eram o cravo (Syzygium aromaticum) e a papoula (Papaver somniferum).
Outro uso documentado de óleos essencias é datado em 2.000 a.C. em livros
escritos em sânscrito, pelos hindus. A partir dos séculos XVI e XVII, a
comercialização destes óleos se popularizou pelo mundo, devido ao nível de
tecnologia e também conhecimento de suas propriedades jamais explorado e
divulgado no mundo (VIGAN, 2010).
Os óleos essenciais exibem muitas propriedades farmacológicas já reportadas
na literatura, dentre elas destaca-se atividade antimicrobiana (BILIA et al., 2004,
SEOW et al., 2014), anti-inflamatória (SILVEIRA et al., 2014), analgésica (SOUSA,
2011), antioxidante (AMORATI et al., 2013) entre outras (LEE et al., 2012), mas,
reside na aromaterapia a maior aplicabilidade dos óleos essenciais. Estudos de
algumas patologias do SNC apontam seus efeitos na terapêutica, por exemplo, na
ansiedade (KASPER, 2013), depressão (YIM et al., 2009), insônia e demência
(PERRY et al., 2003).
No presente estudo avaliou-se, num primeiro momento, os efeitos centrais do
óleo essencial de C. ambrosioides administrados em animais os quais foram
submetidos a modelos específicos, utilizados para o screening de substancias
psicoativas. Posteriormente, optou-se por aprofundar o estudo de uma das
propriedades farmacológicas detectadas.
O teste do campo aberto (TCA) pode ser utilizado para vários fins
farmacológicos, dependendo do protocolo adotado. Esse teste utiliza a aversão do
68
animal a ambientes claros e abertos, como mecanismo para determinar o grau de
ansiedade do mesmo. O conflito causado pela situação faz com que os animais
fisiologicamente entrem num estado de ansiedade, aumentando a exploração do
local (rearings) e o numero de cruzamentos (crossings). Drogas com efeito
ansiolítico tendem a diminuir ambos os parâmetros, apesar de ser considerado por
alguns autores como um teste pouco sensível para ansiedade, e sim para detectar
uma atividade depressiva inespecífica no SNC (BLANCO et al., 2009). Por outro
lado, o teste revela também as drogas que afetam o sistema motor do animal
(SAUDOU et al., 1994), pois a deambulação e o número de levantadas “rearings”
estão relacionados a uma coordenação motora eficaz (ALMEIDA; OLIVEIRA, 2006).
O teste possibilita excluir o viés da capacidade motora, pois se a droga utilizada
afeta o movimento, pode interferir e mascarar resultados em outros aparatos
(GOMES et al., 2010).
Os resultados obtidos no presente estudo sugerem que o óleo essencial não
exibiu um efeito importante sobre o sistema motor do animal, nas doses utilizadas,
quando comparado com o controle (veículo). Esses resultados corroboram com os
obtidos por Grassi e colaboradores (2013), que utilizaram as mesmas doses do
extrato das folhas de C. ambrosioides, não observando efeitos motores. No teste
realizado pelos pesquisadores o Diazepam (2mg/Kg, i.p.), benzodiazepínico
empregado como controle positivo, promoveu a diminuição da motricidade, efeito
relacionado à sedação e relaxamento muscular que causa no organismo (GOMES et
al., 2010; MOREIRA et al., 2014).
Os experimentos também demonstraram a diminuição nos dois parâmetros
observados no campo aberto (crossings e rearings), com a administração de
haloperidol (2,5mg/kg, i.p.). Tal resultado é de fato esperado, já que o haloperidol
exibe como efeito adverso uma disfunção motora, relacionado com o antagonismo
de receptores dopaminérgicos D2 em regiões cerebrais chamadas de nucleus
accumbens e sistema nigroestriatal. O medicamento age como antagonista
inespecífico dos receptores dopaminérgicos causando efeito neuroléptico, utilizado
na terapêutica de algumas psicoses (CONCEIÇÃO; FRUSSA-FILHO, 1996). Em
animais o medicamento promove estados catalépticos (DANTAS et al., 2014;
SHIMIZU et al., 2014), efeito semelhante ao de outras drogas utilizadas para
tratamento de esquizofrenia (DE SANTIS et al., 2014).
69
Os resultados acima mencionados completam os encontrados no teste Rota
rod. Trata-se de um clássico modelo animal utilizado para avaliar bloqueio
neuromuscular periférico e perda da coordenação motora dos animais (DUNHAM,
MIYA, 1957), efeito promovido por agentes como os benzodiazepínicos e os
anestésicos (PULTRINI et al, 2006). Quando o desempenho dos animais tratados
com uma determinada substância é investigado usando a barra rotativa do Rota rod,
o resultado mostra-se semelhante ao do grupo controle, sugere-se que a
coordenação motora não foi prejudicada (BLANCO et al., 2009). Em nossos estudos,
o tempo de permanência no aparato não foi diminuído com a administração de
nenhuma das três doses do OECA (50mg, 100mg, 150mg), como o encontrado com
o controle positivo, um BDZ, os quais têm dentre seus efeitos colaterais estados de
ataxia e sedação (CHARNEY et al., 2001).
O teste do labirinto em cruz elevado (LCE) é utilizado para avaliar a eficácia
sobre o perfil neurocomportamental de animais, tratados com agentes ansiogênicos
e/ou ansiolíticos. Este modelo animal para ansiedade é um dos mais utilizados e
populares atualmente em uso. Sua utilização não requer altos custos e o teste é
realizado de forma rápida, onde o pesquisador não precisa de um treinamento
prolongado para desenvolvê-lo (ALMEIDA et al., 2012). O modelo foi validado para
utilização em camundongos e ratos (PELLOW et al, 1985; LISTER, 1987). O modelo
representa uma tarefa aversiva dos roedores. Quando os animais permanecem nos
braços abertos, manifestam o paradigma etológico de apresentar comportamentos
espontâneos, é baseado no conflito natural entre a necessidade de explorar um novo
ambiente e a tendência a evitar um potencial perigo na área, permanecendo mais
nos braços fechados do aparato (KUMAR et al., 2013). Além disso, os animais
exibem aversão nos braços abertos pela falta de tigmotaxia. Roedores se orientam
espacialmente pelas vibrissas, e nos braços abertos eles não possuem as colunas
laterais para se orientarem (LISTER, 1987).
Os índices de ansiedade neste teste como o percentual de entradas nos
braços abertos e tempo gasto nesses braços são sensíveis a agentes que
geralmente podem atuar através do complexo receptor de GABAA, justificando o uso
de diazepam como um controle positivo no estudo (DONALDSON; HEN, 2014;
CAMPOS et al., 2013). Porém, assim como na depressão, na ansiedade ocorre o
envolvimento do sistema monoaminérgico e serotonérgico, diretamente relacionados
com os sintomas neurovegetativos desta patologia (SHIN; LIBERZON, 2010) e
70
presentes em estruturas cerebrais ligadas a ansiedade como os núcleos da rafe e
locus coeruleus. Os sistemas GABAérgico e Glutamatérgico, responsáveis pelo
controle de estados de ansiedade, estão presentes em quantidades consideráveis
em regiões ligadas ao sistema emocional do sistema límbico (BERTOGLIO;
GUIMARÃES; ZANGROSSI JR, 2006).
Os resultados obtidos no presente estudo demonstram que o óleo essencial
de C. ambrosioides teve perfil farmacológico semelhante ao diazepam, como um
agente ansiolítico, diminuindo o tempo de permanência nos braços fechados do
aparato e aumentando o tempo desprendido nos braços abertos, característica de
compostos com capacidade de diminuir o comportamento aversivo natural do
animal, como encontrado em diversos trabalhos onde o principal constituinte do óleo
essencial era um terpeno atuante sobre o SNC (GUIMARÃES et al., 2010; SOUSA,
2011; MACHADO et al., 2013; MOREIRA, et al., 2014) e que apresenta efeito
ansiolítico no LCE, semelhante ao efeito clássico do diazepam (ALMEIDA et al.,
2012; KUMAR; BHAT; KUMAR, 2012; COSTA et al., 2014).
Assim como no controle da ansiedade, o sistema GABAérgico é a principal via
de controle do circuito do sono, composto de uma série de núcleos chave no tronco
cerebral e no hipotálamo, porém esse processo recebe a entrada de diversos
sistemas sensoriais somáticos e viscerais, dentre outros. Alguns centros, dentro
dessa rede de controle, incluem o locus coeruleus (dominada pelo neurotransmissor
norepinefrina), dorsal e núcleos da rafe (dominada pelo neurotransmissor dopamina)
e núcleos túbero mamilar (dominada pelo neurotransmissor histamina), estes,
projetam-se pelo hipotálamo e prosencéfalo basal, ao córtex, demonstrando que não
só o GABA é responsável pelo controle do sono (ESPANA et al., 2004).
No caso de acontecer uma inibição destes centros de excitação ocorre o
sono. Tal inibição é gerada principalmente pelos núcleos hipotalâmicos, dominados
pelo GABA (BIANCHIN et al., 2004).
Fujimori e Cobb (1995), propõem que o aumento da hipnose barbitúrica é um
bom indicador de atividade depressora do SNC, como exemplo, o pentobarbital que
quando administrado com outro agente com propriedades depressoras promovem
diminuição da latência do sono e também aumento do tempo total do sono dos
animais durante o experimento, sendo um ótimo método para caracterizar a
propriedade hipnótica de alguns compostos (MA et al. 2009; FANG et al., 2010).
71
Vários estudos têm relatado que o prolongamento da hipnose barbitúrica
pode estar relacionado com a inibição metabólica do barbitúrico pela substânciateste ou, por uma ação central nos mecanismos de neurotransmissores envolvidos
com a regulação do sono (KAUL; KULKAMI, 1978).
Os presentes resultados demonstraram que o óleo de C. ambrosioides,
aumentou o tempo de sono dos animais em todas as doses testadas e da mesma
forma diminuiu a latência para o mesmo, assemelhando-se na dose de 150mg/kg,
ao efeito previsto da administração do diazepam, benzodiazepínico padrão. Estes
resultados comprovam a eficácia sedativa do óleo, em concordância aos testes já
utilizados de ansiedade. Compostos terpênicos menores como o linalol (COELHO et
al., 2011) e o mirceno (VALE et al., 2002), os quais estão presentes nos óleos
essenciais, já foram comprovadamente categorizados como sedativos.
Outra propriedade farmacológica avaliada nesse estudo foi a propriedade
antidepressiva. A utilização de óleos essenciais na terapêutica da depressão como
terapia alternativa tem sido uma constante nos últimos anos. (PERRY; PERRY,
2006; YI et al., 2013; FIßLER; QUANTE, 2014) e os efeitos antidepressivos dos
mesmos têm sido validados em vários modelos farmacológicos de depressão, como
por exemplo, o modelo do nado forçado (MEHTA et al., 2013; MACHADO et al.,
2013)
O teste de nado forçado (MNF) é o teste farmacológico mais amplamente
utilizado em roedores, na pesquisa para avaliar compostos com potencial
antidepressivo (SILVA et al., 2006). Quando os animais são expostos ao MNF
geralmente exibem uma postura imóvel que é considerada reflexo de um estado de
“desespero comportamental”, no pressuposto de que o animais perderam a
esperança de escapar (PORSOLT et al., 1977). Portanto, a exposição ao estresse
de nadar produz uma mudança de comportamento que é tido como um fenótipo
comportamental semelhante ao da depressão (VALVASSORI et al., 2013; CRYAN
et al, 2002). Está bem estabelecido que o tratamento subagudo com a maioria das
classes de antidepressivos, incluindo inibidores seletivos da serotonina (SSRIs),
inibidores seletivos de recaptação de noradrenalina (IRSN), antidepressivos
tricíclicos (ADT) e os inibidores da monoamina oxidase (IMAO), reduzem o tempo de
imobilidade no MNF (GUAN et al., 2014).
O sistema monoaminérgico é um dos alvos mais importantes para o
tratamento da depressão, onde a deficiência das aminas biogênicas, particularmente
72
serotonina (5-HT), noradrenalina (NOR) e dopamina (DO) é um dos fatores
responsáveis pelo surgimento dessa doença (MILLAN, 2004). Nos quadros de
depressão ocorre uma diminuição na quantidade de neurotransmissores liberados,
mas a bomba de recaptação e a enzima continuam trabalhando normalmente
(ELHWUEGI, 2004).
Vários estudos demonstram que o aumento da mobilidade no teste de nado
forçado (MNF), pelo emprego de compostos orgânicos, pode ser resultado de
mecanismos de ação diferentes, relacionada à ativação de receptores de serotonina,
como 5-HT1A (SUGIMOTO et al., 2010), glutamatérgicos, como o NMDA (RIEGER et
al., 2014) e dopaminérgicos (ZHENG et al., 2013), diversificando e dificultando a
construção de uma linha de atuação única entre as drogas e compostos testados.
Atualmente, a depressão e o emprego de substâncias antidepressivas, têm se
relacionado ao fenômeno de neurogênese (SCORZA et al., 2005), paralelo às
alterações morfológicas existentes na formação hipocampal (SHELINE, 2000),
associada a neurotoxicidade mediada pela liberação excessiva de glicocorticóides,
em momentos de estresse. A relação entre a diminuição da neurogênese, causada
pelo estresse (aumento de glicocorticóides) e o surgimento de quadros depressivos,
foi estudada pela primeira vez por Jacob e colaboradores (2000), tendo em vista que
em estudos anteriores, já se havia previsto que em casos de adrenolectomia, onde é
suprimido os esteróides adrenais, ocorria o aumento da neurogênese no giro
dentado de ratos adultos (CAMERON; GOULD, 1994).
Em
seguida,
novos
estudos
demonstraram
que
não
apenas
os
corticosteróides poderiam interferir na neurogênese e com isso na depressão e sim,
outros mediadores da inflamação (SONG; WANG, 2011; WU et al., 2013), como as
citocinas e interleucinas, reforçando o papel da modulação que a imunidade
desempenha nos processos de neuroplasticidade (YIRMIYA; GOSHEN, 2011).
A persistência do estado fisiopatológico da depressão e a exposição a
situações de estresse contínuo podem diminuir gradualmente o volume do
hipocampo, e alterar a síntese de fatores de crescimento neuronal, principalmente o
BDNF (do inglês, brain-derived neurothophic fator), este, atividade relacionado à
gênese da depressão (MANJI; DREVETS; CHARMEY, 2001).
A redução dos níveis de BDNF em pacientes deprimidos está relacionada
com a gravidade da depressão ao passo de drogas que atuam ativando o BDNF,
73
aumentam as formações dendríticas e a neurogênese, diminuindo a vulnerabilidade
celular (PERITO; FORTUNATO, 2012).
Óleos essências de Perilla frutescens, mostraram ter um mecanismo de ação
ligado à expressão de proteínas hipocampais e ao aumento dos níveis de BDNF,
equiparado ao efeito da administração de Fluoxetina (antidepressivo padrão) (YI, et
al., 2013). Derivados da Allium macrostemon, apresentam da mesma forma
capacidade de aumenta os níveis de BDNF, diminuídos após testes como o nado
forçado e a suspensão pela cauda, ambas as situações que expõem o camundongo
a um alto nível de estresse (LEE et al., 2010).
Como demonstrado no teste de MNF, o tratamento dos animais com OECA,
não alterou os parâmetros comportamentais, no teste do nado forçado quando
comparado o tempo de imobilidade encontrado na administração do controle e o
tempo nas aplicação das doses do OECA, não observamos diferenças significativas,
sugerindo que o mesmo não exibe perfil antidepressivo neste modelo .
Em busca de completar o screening farmacológico, observou-se a convulsão
induzida quimicamente no modelo do PTZ, largamente utilizado para avaliar
possíveis efeitos anticonvulsivantes de substâncias estudadas (BHOSLE, 2013).
Trabalhos têm demonstrado que a ação convulsivante do PTZ se dá pela
inibição dos canais de cloreto do receptor GABAA (GIRAMKAR et al., 2013;
HOSSEINZADEH et al., 2013; GOYAL; SASMAL, 2014; NGOUPAYE et al., 2014) e
consequentemente, a ação do neurotransmissor GABA.
As convulsões contínuas são o estado fisiopatológico que caracteriza a
epilepsia, que pode ser controlada com a utilização de inibidores de canais de cálcio
ou moduladores da resposta do GABAérgica e Glutamatérgica, neurotransmissores
inibitório e excitatório do SNC, respectivamente (GIRAMKAR et al., 2013;
HOSSEINZADEH et al., 2013). É reportado na literatura que mais de 70% dos
pacientes tem suas crises convulsivas controladas com a utilização de drogas que
modulam
os
canais
iônicos
ou
atuam
na
transmissão
desses
dois
neurotransmissores (NASSIRI-ASL; ZAMANSOLTANI; TORABINEJAD, 2009).
No presente estudo foi demonstrado que o OECA não promoveu de maneira
dose dependente, inibição das crises convulsivas induzidas pelo PTZ, sobretudo na
dose de 150mg/kg. Esses resultados corroboram com a hipótese da participação da
via GABAérgica, uma vez que se mostrou ansiolítico e hipnótico, não só diminuindo
a latência de sono dos animais como também aumentando tempo total de sono,
74
característica de plantas com perfil farmacológico benzodiazepínico (YANG et al.,
2013; CHINDO et al., 2014; GOYAL; SASMAL, 2014; GUPTA et al., 2014;
NGOUPAYE
et
al.,
2014)
que
pelas
características
apresentam
ação
anticonvulsivante. Além disso, trabalhos realizados anteriormente demonstraram que
a classe de constituintes como os terpenos, são a parte responsável pelo efeito
sedativo, ansiolítico, anticonvulsivante e analgésico de diversas plantas da medicina
natural (WIJEWEERA
et al., 2006) ainda, sendo promissoras fontes de
anticonvulsivantes de amplo espectro de atividade, através de modificações na
estrutura química.
O segundo foco do estudo foi o de escolher uma das propriedades
farmacológicas detectadas no screening farmacológico do OECA e, aprofundar os
estudos avaliando o mecanismo de ação da propriedade farmacológica escolhida.
Neste contexto, optou-se pela avaliação do mecanismo de ação da propriedade
ansiolítica do OECA, avaliando a influencia de vários sistemas de neurotransmissão,
utilizando como modelo farmacológico o LCE.
O hipocampo é a principal região de ação do sistema adrenérgico no SNC,
recebendo inervação noradrenérgica no locus coeruleus e podendo estar presente
em terminais nervosos não-noradrenérgicos, nas células gliais e nos núcleos da rafe
modulando a transmissão serotoninérgica, por exemplo. Os α1-adrenoreceptores (α1ARs) são principalmente pós-sinápticos, enquanto os α2-adrenoreceptores (α2-ARs)
estão localizados tanto pré-sináptica quanto pós-sinapticamente (STUCHLIK;
PETRASEK; VALES, 2009). Os α1-ARs são geralmente acoplados a proteínas Gq,
que ativa a fosfolipase C e o fosfotidil inositol intracelular, sinalizando a ativação da
proteína quinase C (PKC), e a liberação de cálcio intracelular através do inositol
1,4,5-trifosfato. Os α2-ARs estão acoplados a proteínas Gi, o que pode reduzir
intracelularmente o monofosfato de adenosina cíclico (AMPcíclico) inibindo algumas
isoformas da adenilil ciclase (RAMOS; ARNSTEN, 2007).
A ativação dos α1-ARs no hipocampo pode atenuar a neurotransmissão
Glutamatérgica ou pode potenciar os efeitos celulares dos receptores NMDA, além
disso, despolariza uma subpopulação de interneurônios GABAérgico (HILLMAN;
DOZE; PORTER, 2007).
O motivo de utilizar na pesquisa do mecanismo de ação ansiolítica do OECA,
o α2-antagonista, Ioimbina, fundamenta-se na ação que a mesma promove
diminuindo a queima e liberação de serotonina nas áreas terminais do controle da
75
ansiedade, tendo em vista que esses receptores modulam não só o sistema
serotoninérgico, mas também o noradrenérgico e dopaminérgico (WEIKOP et al.,
2004), podendo interferir nos resultados de ensaio de ansiedade, como no labirinto
em cruz elevada (BRAUN et al., 2011). A implicância dos α2-antagonista na
ansiedade foi comprovada, mas com certa confusão ainda, sobre qual o real papel
dos agonistas e antagonistas da via (MILLAN, 2003).
Estudos de
microdiálise
in vivo do cérebro sugerem que os α1-
adrenoreceptores estão envolvidos no controle dos níveis de serotonina extracelular
(DO-MONTE; ALLENSWORTH; CAROBREZ, 2010; TAKAMURA et al., 2012) e a
administração de prazosina, uma antagonista seletivo α1-adrenérgico diminui os
níveis de serotonina extracelular no hipocampo, córtex pré-frontal e o núcleo da rafe
(PUDOVKINA et al, 2003).
Como demonstram os resultados obtidos a utilização de antagonistas de αadrenoceptores não alterou o efeito do óleo de C. ambrosioides, evidenciando que
não há envolvimento da via adrenérgica no mecanismo de ação ansiolítica do óleo.
A dose de 50mg/kg, continuou significativamente efetiva no aparato, quando
comparada com o controle (veículo), o que não se alterou quando administrada
concomitantemente aos antagonistas prazosina e ioimbina, responsáveis por
antagonizar o sistema α-adrenérgico, como encontrado em outros estudos (BOURIN
et al., 2005).
Evidências apoiam o envolvimento da serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT)
na fisiopatologia e na origem dos transtornos de ansiedade (FAJEMIROYE et al,
2012; BRÜNING et al., 2009) e muitos fármacos ansiolíticos que são utilizados
atualmente tem seu mecanismo de ação relacionado com a recaptação de 5-HT
e/ou diretamente ligado aos receptores 5-HT (BARNES; SHARP, 1999; KODISH;
ROCKHILL; VARLEY, 2011), porém ainda há muitas controvérsias em relação a
especificidade do papel da 5-HT na fisiopatologia da ansiedade (KODISH;
ROCKHILL; VARLEY, 2011).
O núcleo dorsal da rafe (NDR) e os núcleos medianos da rafe (NMR)
fornecem quase toda a inervação da 5-HT para a prosencéfalo e núcleo pré-frontal
(ANDRADE, 2011; BIAGIONI et al., 2013), suas projeções são organizadas de tal
maneira que algumas áreas do prosencéfalo recebem projeções mistas da NDR e
NMR, enquanto outras regiões recebem feixes seletivos de NDR ou NMR (ADELL et
al., 1997).
76
Graeff e Deakin propuseram que o sistema serotoninérgico, proveniente do
núcleo dorsal da rafe (NDR), está envolvido no comportamento de ansiedade e na
inibição do pânico. Além disso, tem sido mostrado que as vias de transmissão da 5HT que partem do NMR desempenham um papel importante no processamento da
ansiedade, com implicações em patologias como o transtorno de ansiedade
generalizada, stress e depressão (GRAEFF et al., 1996; PAUL et al., 2014).
Os receptores de serotonina 5-HT1A, são expressos tanto em neurônios présinápticos da rafe, quanto em neurônios pós-sinápticos nas regiões límbicas,
envolvidos na ansiedade (BARNES; SHARP, 1999). Estão relacionados com a
região
dos
núcleos
basolaterias
da
amigdala,
local
responsável
pelos
comportamentos defensivos, de medo e ansiedade, sendo que a ativação desses
receptores modula essa transmissão nervosa, diminuindo estados como o de pânico
e agitação (ZANGROSSI JR; GRAEFF, 1994; GONZALEZ; ANDREWS; FILE, 1996;
STRAUSS; VICENTE; ZANGROSSI JR, 2013).
Outros receptores de serotonina estão relacionados com a ansiedade, visto
que ao avaliar o comportamento de camundongos “knock out” para receptores 5HT2A, observa-se comportamentos ansiosos (WEISSTAUB et al., 2006), assim como
a utilização de Quetanserina como antagonista do receptor demonstra capacidade
de antagonizar o efeito ansiogênico de drogas injetadas no septo lateral de
camundongos (DE PAULA et al., 2012).
Hoje está bem definido o papel dos receptores de serotonina 5-HT1A e 5-HT2A,
nas regiões dos núcleos da rafe e córtex pré-frontal, assim como o papel dos
receptores 5-HT3, únicos receptores de serotonina ligados aos canais de cátions
(RAJKUMAR; MAHESH, 2010), na aprendizagem orientada por recompensa (FRICK
et al., 2014), nos circuitos do controle do medo (HÖFELMANN et al., 2013) e no
controle da ansiedade (GUPTA et al., 2014).
No presente estudo os resultados demonstram que a inibição dos receptores
5-HT3, através da administração do antagonista ondansetrona, não foi capaz de
diminuir o efeito ansiolítico do óleo de C. ambrosioides, não afetando nem o tempo
desprendido nos braços abertos, do labirinto em cruz elevada, nem a frequência de
entrada nos mesmos. Assim como ocorreu na administração do antagonista nãoseletivo 5-HT1A/1B, pindolol, demonstrando que na presença de ambos os
antagonistas o OECA é capaz de ter seu efeito ansiolítico de costume.
77
A fim de elucidar de maneira mais seletiva, utilizou-se o antagonista seletivo
de receptores 5-HT1A, NAN-190, muito empregado em ensaios de ansiedade em
camundongos (HERCULANO; MAXIMINO, 2014; TÕNTSON et al., 2014), o mesmo,
não alterou o tempo de permanência nos braços abertos do aparelho, porém
diminuiu a frequência de entradas nos mesmos, antagonizando parcialmente o efeito
do óleo. O mesmo resultado foi encontrado na utilização do antagonista não-seletivo
5-HT2A/2C, quetanserina, o qual alterou o efeito do óleo no número de entradas nos
braços, porém não no tempo desprendido pelo camundongo.
Os resultados encontrados apresentam uma inibição parcial do efeito do
OECA quando antagonizada a transmissão serotoninérgica pelos receptores 5-HT1A
e 5-HT2A/2C.
Outra via pesquisada foi à via de transmissão dopaminérgica. O sistema
dopaminérgico tem um papel importante nos mecanismos que influenciam os
comportamentos de ansiedade, tanto em seres humanos quanto em animais
(AHMADI et al, 2011; ZARRINDAST et al., 2011), modulando a atividade neuronal
envolvida na excitabilidade do cérebro, na percepção do medo e no controle motor
(PEZZE; FELDON, 2004). A dopamina exerce os seus efeitos através de duas
subfamílias de receptores conhecidos como “D1-like” (D1 e D5) e receptores “D2like” (D2, D3 e D4).
Os comportamentos de ansiedade são regulados por várias regiões do
cérebro e vias neuronais, dentre as vias ligadas à dopamina, encontramos as saídas
dopaminérgicas da área tegmental ventral (ATV) para o nucleus accumbens (Nac)
(AHMADI et al, 2011; PEZZE; FELDON, 2004). Demonstrando uma interação
estreita no processo de regulação da ansiedade (SINNATHAMBI et al., 2013;
ZARRINDAST et al., 2011). O nucleus accumbens (Nac) em particular, é um núcleo
profundo que modula algumas funções cognitivas e não-cognitivas, tais como os
comportamentos de ansiedade (AHMADI et al, 2011; LOPES et al, 2012), a emoção
(DAVIDSON; IRWIN, 1999), comportamentos defensivos (DA CUNHA et al., 2008), a
locomoção (MARTINEZ et al, 2002), a depressão (CHAKI; YOSHIKAWA;
OKUYAMA, 2006) e as respostas de recompensa (MARTINEZ et al, 2002).
Estudos demonstram o efeito ansiolítico da administração do antagonista de
receptores de D1, SCH23390, na região do nucleus accumbens (AHMADI, et al.,
2013) e amígdala basolateral (ZARRINDAST, et al., 2011). O antagonismo da
ansiedade através da modulação do sistema dopaminérgico é acompanhado em
78
algumas plantas por comprometimento motor (SINNATHAMBI et al., 2013) e é
antagonizado pela utilização de haloperidol. O antagonista seletivo D2, pimozide foi
capaz de antagonizar o efeito ansiolítico (RANGEL-BARAJAS et al., 2014).
Como demonstram os resultados o haloperidol (antagonista de dopamina, não
seletivo), foi a única droga capaz de reverter o efeito do óleo essencial de C.
ambrosioides no tempo e na frequência de entradas nos braços abertos do aparato.
Pimozide e SCH23390 (antagonista D2 seletivo, antagonista D1 seletivo,
respectivamente), interferiram na frequência de entradas, porém não alteraram o
tempo de permanência nos braços do aparato. A utilização da metoclopramida,
antagonista 5-HT3/D1, não interferiu no efeito do óleo essencial de C. ambrosioides
em nenhum dos parâmetros avaliados.
Os resultados encontrados apresentam uma inibição parcial do efeito do
OECA quando antagonizada a transmissão dopaminérgica pelos receptores de
dopamina.
A última via pesquisada do estudo foi a via de transmissão GABAérgica. O
ácido γ-aminobutírico (GABA) é o principal neurotransmissor inibitório no sistema
nervoso central (SNC) e está amplamente distribuído em todas as regiões cerebrais.
Há dois subtipos de receptores GABA bem documentados, GABAA e GABAB.
(KURIYAMA, et al., 1993).
O GABAA é acoplado a um canal iônico de cloreto,
modulado alostericamente por outros receptores, que fazem parte de um mesmo
complexo macromolecular. Este complexo receptor media várias atividades do SNC
e é o alvo de ação de vários fármacos, tais como: anticonvulsivantes, ansiolíticos,
hipnótico/sedativos e relaxantes musculares. O antagonismo do mesmo é alcançado
pela administração da bicuculina e a sua ativação induz um potencial pós-sináptico
inibitório rápido, principal efeito dos fármacos da classe dos benzodiazepínicos
possui atividade ansiolítica e hipnótico/sedativa, além dos anticonvulsivantes e
relaxantes musculares (STAHL et al. 2013). O GABAB é insensível ao antagonismo
da bicuculina e sensível ao baclofeno (ZARRINDAST et al., 2001), foi revelado, que
sua estrutura é da classe dos receptores metabotrópicos ligado a proteína GTP, sua
ativação induz um potencial pós-sináptico inibitório lento. Ambos os receptores têm
função inibitória na região central do sistema nervoso (KURIYAMA et al., 1993).
Estudos demonstram que a utilização da baclofeno e bicuculina como
antagonistas dos receptores GABAB e GABAA, respectivamente, apresentam efeito
em diferentes regiões do organismo, como no trato colón retal, aumentando o
79
peristaltismo (AUTERI et al., 2014), em aplicações no septo lateral (MITRA;
LENGLOS; TIMOFEEVA, 2014), intrahipocampais (LIU et al., 2014) e diretamente
na região do nucleus accumbens (LOPES et al., 2012).
Várias plantas e substâncias são testadas, quando apresentam característica
ansiolítica, através da administração concomitante de Flumazenil, antagonista de
receptores dos benzodiazepínicos (FAJEMIROYE et al., 2012; ISHOLA et al., 2012).
A tendência de apresentar um mecanismo de ação ansiolítico relacionado
com o sistema GABAérgico, vem se confirmado a cada teste comportamental do
OECA. Visto que plantas com mecanismo semelhante aos benzodiazepínicos, ou
seja, baseado no sistema GABAérgico, demonstram efeito letárgico e hipnótico nos
camundongos, antagonizados pela aplicação de Flumazenil. Não excluindo a
participação do sistema serotoninérgico e dopaminérgico no mecanismo de inibição
do SNC.
Os resultados encontrados no estudo da via GABAérgica, demonstram que o
Flumazenil foi capaz de reverter o efeito ansiolítico do diazepam, droga padrão,
diminuindo a frequência de entradas e tempo nos braços abertos, resultado
esperado e amplamente discutido na literatura (FAJEMIROYE et al., 2012; ISHOLA,
et al., 2012). Da mesma forma o Flumazenil reverteu o efeito do óleo de C.
ambrosioides, resultado previsto como em testes de outras plantas ansiolíticas (REX
et al., 2002; KIM et al., 2004; GRUNDMANN et al., 2007). Consequentemente, nas
administrações dos antagonistas GABAA, bicuculina e GABAB, baclofeno, houve
bloqueio da ação do OECA, demonstrando uma alta afinidade do óleo com o
mecanismo GABAérgico de transmissão neuronal.
Sumarizando, através dos testes realizados foi possível delimitar o efeito do
óleo essencial de C. ambrosioides (OECA) no SNC, elucidando pelo menos em
parte, o mecanismo de ação da propriedade ansiolítica e estabelecer certa
semelhança ao efeito ansiolítico clássico dos benzodiazepínicos. Foi representado
no esquema na Figura 22 um resumo dos resultados encontrados e as possíveis
vias de neurotransmissores ligadas ao mecanismo de ação do óleo essencial de C.
ambrosioides. O esquema demonstra que OECA tem efeito hipnótico, ansiolítico, e
anticonvulsivante (mas não antidepressivo e depressor motor), tendo o sistema
GABAergico ligado ao seu mecanismo de ação.
Finalizando
a
discussão
dos
resultados
obtidos
sobre
a
possível
aplicabilidade do uso dessa planta como remédio para tratamento da ansiedade, não
80
poderíamos deixar de comentar sobre sua segurança. A possibilidade de emprego
terapêutico em doenças do SNC limita-se, visto que o ascaridol (principal
componente do óleo), em altas concentrações ou na utilização por um longo
período, pode induzir toxidade com sintomas de convulsão, vômito, dor de cabeça,
vertigem (PEREIRA et al., 2010) e hepatotoxicidade (DERRAJI et al., 2014). Dessa
forma, estudos toxicológicos com o OECA devem ser conduzidos. Entretanto, outro
componente majoritário do óleo, o p-cimeno apresenta relatos de baixa toxicidade na
literatura (KOBA et al., 2010), abrindo a possibilidade de isolamento e testes
posteriores, a fim de identificar os efeitos de cada componente no SNC.
Figura 22: Esquema representativo de possíveis sistemas de neurotransmissão afetados nos testes
do OECA.
Planta
Chenopodium ambrosioides L.
OECA
Sistema
motor
Ansiedade
Sistema
Monoaminérgico
GABAA
Hipnose
Depressão
Sistema
Gabaérgico
GABAB
BDZ-R
--- Parcialmente ligada à ação do óleo de C. ambrosioides
- Diretamente lidada à ação do óleo de C. ambrosioides
Convulsão
81
7 CONCLUSÕES
Os resultados obtidos durante o desenvolvimento no presente estudo
confirmam os efeitos centrais C. ambrosioides através de estudo pré-clinicos e
validam em parte o uso do OECA em distúrbios do SNC, sobretudo os distúrbios do
sono e a ansiedade.
Os experimentos demonstraram que o óleo essencial de C. ambrosioides tem
propriedade ansiolítica e hipnótica, assim como um potencial neuroprotetor contra
crises convulsivas.
O mecanismo de ação da propriedade ansiolítica do OECA, parece envolver
o sistema GABAérgico e ser parcialmente mediado pelo sistema monoaminérgico.
No entanto, estudos adicionais de toxicologia são necessários para a avalição
da segurança do uso do OECA para fins terapêuticos.
82
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