Isolamento e Caracterização Bioquímica e Molecular de Bactérias

Anais do VIII Seminário de Iniciação Científica e V Jornada de Pesquisa e Pós-Graduação
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS
10 a 12 de novembro de 2010
Isolamento e Caracterização Bioquímica e Molecular
de Bactérias do Gênero Herbaspirillum de Raízes
de Plantas de Milho (Zea mays)
Aluno(a)s: Rodrigo Nunes de Sousa1 (PIBIC/CNPq),
Marina Firmino da Silva2 (PBIC/UEG)
Colaboradores(as): Valdirene Neves Monteiro (UEG); Enderson Petrônio Ferreira
(Embrapa Arroz e Feijão); Agostinho Dirceu Didonet (Embrapa Arroz e Feijão)
Orientador(a): Claudia Cristina G. M. Didonet3
Universidade Estadual de Goiás, 75132-903, Brasil
1
[email protected];[email protected]; [email protected]
Palavras-chave: (Zea mays), bactérias diazotróficas, Herbaspirillum.
1
INTRODUÇÃO
Na alimentação, o milho (Zea mays) é um dos cereais mais cultivados e
consumidos no Brasil. Das plantas cultivadas, o milho é o mais importante do
continente americano, tanto na alimentação como na economia (LOPES et al.,
2008).
O nitrogênio é o macronutriente mais exigido pela cultura do milho, isto
pelo fato de exercer importantes funções nos processos bioquímicos da planta,
sendo o constituinte de proteínas, enzimas, coenzimas, ácidos nucléicos, fitocromos
e da clorofila do vegetal, sendo um fator limitante na produção e nos rendimentos
dos grãos de milho (CANTARELLA, 1993; MACHADO, 1997).
Porém o nitrogênio pode ser perdido de várias maneiras no sistema e
uma alternativa é sua adição ao solo é por meio do uso de fertilizantes nitrogenados,
mas estes podem ter efeitos desfavoráveis em uma cultura, pelo aumento da
poluição ambiental causada pela lixiviação e eutrofização e pelos gastos gerados
(SALA et al., 2007; ROESCH et al., 2005).
Uma maneira de fixar o N atmosférico é através de bactérias que realizam
a Fixação Biológica do Nitrogênio (FBN). Estas convertem o nitrogênio atmosférico
(N2) em amônia (NH3), com gasto de energia na forma de ATP (BHATTACHARJEE;
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SINGH; MUKHOPADHYAY, 2008). Com a FBN as bactérias diazotróficas ajudam a
suprir a necessidade de nitrogênio para as plantas, além de interferirem no
crescimento por uma série de mecanismos. Dentre eles, a capacidade de produzir
fitohormônios, estimular a absorção de nutrientes e aumentar a resistência à
doenças atuando como promotor de crescimento vegetal (BASHAN; HOLGUIN; DEBASHAN, 2004; REIS JUNIOR et al., 2004; SALA et al., 2005).
Dentre uma diversidade de bactérias diazotróficas, há descrição do
gênero Herbaspirillum o qual compreende atualmente 11 espécies, sendo que
somente cinco representam bactérias fixadoras de nitrogênio, são elas: H.
seropedicae (BALDANI et al., 1986), H. rubrisubalbicans (BALDANI et al., 1996), H.
frisingense (KIRCHHOF et al., 2001), H. lusitanum (VALVERDE et al., 2003) e H.
hiltneri (ROTHBALLER et al., 2006). As bactérias deste gênero são gram-negativas,
geralmente vibrióides e às vezes helicoidais. Elas podem ter de dois a três flagelos
polares em um ou ambos os pólos (BALDANI et al., 1986).
H. seropedicae foi a primeira espécie a ser isolada de raízes de plantas
de milho, sorgo e arroz. (BALDANI et al., 1986). Existem outros trabalhos que
indicam presença dessa espécie em outros tipos de vegetais como a cana-deaçúcar na Austrália (BODDEY et al., 1998). H. rubrisubalbicans foi encontrada em
associações com a cana-de-açúcar (Saccharum spp.) principalmente nas raízes,
caules, folhas (BALDANI et al., 1996). Também, já foi relatada a ocorrência desta
espécie em abacaixizeiros e bananeiras (CRUZ et al., 2001). H. frisingense foi
isolada de tecidos de capim-elefante (Pennisetum purpureum), e das gramíneas
Spartina pectinata, Miscanthus sinensis, Miscanthus sacchariflorus (KIRCHHOF et
al., 2001). Já H. lusitanum foi descrita em associação com Phaseolus vulgaris em
Portugal (VALVERDE et al., 2003).
No Brasil, principalmente em Goiás há poucos estudos enfocando o
isolamento e a caracterização de bactérias diazotróficas e, ou, promotoras de
crescimento associadas à raiz de plantas de milho. O isolamento de bactérias
associadas ao milho é uma etapa essencial para a realização de trabalhos
posteriores de testes de genótipos responsivos à inoculação.
O presente trabalho foi realizado com o objetivo de isolar e caracterizar
bioquímica e molecularmente bactérias do gênero Herbaspirillum spp. de raízes de
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plantas de milho. Tal caracterização é importante por ser o primeiro passo para a
identificação de bactérias diazotróficas, com potencial para promover benefícios à
planta.
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MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Material Vegetal e Preparo de Extratos
As plantas de milho utilizadas neste trabalho foram obtidas de campos
experimentais de sistema orgânico de produção mantido pela Embrapa Arroz e
Feijão em Santo Antônio de Goiás, GO. As coletas foram feitas em junho de 2009,
com plantas de milho da variedade Sol da Manhã na fase vegetativa, com cerca de
35 dias após a germinação. Para o preparo do extrato as raízes de milho foram
retiradas das plantas, lavadas em água estéril e submetidas à esterilização
superficial através da imersão por 3 minutos em solução de hipoclorito de sódio
(2,5%) (DÖBEREINER; BALDANI; BALDANI, 1995) seguido de 10 lavagens em
água estéril. Depois as raízes esterilizadas foram maceradas em gral, na proporção
1g de raiz para 10 mL de água estéril e este consistiu o extrato que foi utilizado para
as contagens em placas e para os isolamentos das bactérias.
2.2 Bactérias
Foram utilizadas em todos os testes bactérias padrões obtidas da coleção
de culturas da Embrapa Agrobiologia (Seropédica, RJ). A estirpe padrão utilizada
para o gênero Azospirillum foi estripe Y2 de A. amazonense. Para o gênero
Herbaspirillum a estripe SmR1 da espécie H. seropedicae.
2.3 Contagem e Isolamento dos Microorganismos e Coleção de Culturas
O extrato foi submetido à diluição seriada (de 10-2 a 10-6 em água estéril)
em placas contendo meio sólido NA (nutriente ágar) segundo NEJAD & JOHNSON
(2000) para contagem de bactérias totais. Também foram inoculados no meio semi-
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sólido JNFb, sendo este semi seletivo para o gênero Herbaspirillum e realizado a
contagem
do
número
mais
provável
(NMP)
de
bactérias
diazotróficas
(DÖBEREINER; BALDANI; BALDANI, 1995). Foi avaliado o crescimento após 96h,
sendo todas as contagens realizadas em triplicatas (DOBEREINER; BALDANI;
BALDANI, 1995). As colônias isoladas do meio (LGI) foram coletadas e mantidas em
glicerol 30% estéril, a -20 C no respectivo meio seletivo das bactérias, para serem
utilizadas nos experimentos posteriores. Estas fazem parte da Coleção de Culturas
de Bactérias isoladas de plantas de milho, e foram catalogadas com os dados
gerados neste trabalho.
2.4 Caracterização Bioquímica/Fisiológica
Para as caracterizações bioquímica/fisiológica foram utilizados 25
isolados testados quanto a capacidade de utilização de 6 fontes de carbono:manitol,
inositol, arabinose, glicose, ácido málico e ácido nicotínico na concentração de
5mmol.L-1 sendo adicionadas por filtração utilizando o meio LGI base (sem fonte de
carbono), sendo as placas avaliadas após 7 dias de crescimento a temperatura
ambiente.
O crescimento intrínseco em 6 antibióticos: ampicilina, tetraciclina, ácido
nalidíxico, rifampicina, cloranfenicol, amoxicilina foi realizado segundo Araújo (1994).
Os testes de presença de enzima peroxidase e a urease foi realizado
segundo (TORTORA; FUNKE; CASE, 2000). Estes testes foram realizados para
auxiliar a classificação taxonômica das bactérias.
2.5 Caracterização Molecular
2.5.1 Extração de DNA
O método utilizado para extração do DNA dos isolados bacterianos,
utilizados como molde para as amplificações específicas via PCR, foi o de lise
alcalina das células, adaptado por Audy e colaboradores (1996).
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2.5.2 Amplificação da Região Intergênica 16S-23S DNAr e Região BOX
A reação de amplificação da região intergênica 16S-23S DNAr por
ARTURO et al. (1995) e a reação de amplificação da região BOX foi realizada de
acordo com as condições descritas por KASCHUK et al. (2006).
2.6 Análise de Dados
A partir dos resultados da caracterização morfológica, peroxidase,
crescimento em fontes de carbono, crescimento intrínseco em antibióticos, fixação
de nitrogênio foi construída uma matriz binária para análise de dados usando o
programa NTSYS (“Numerical Taxonomy System”) versão 2.02i (ROHLF, 1988), o
qual utiliza o coeficiente de Jaccard para obtenção de uma matriz de similaridade
seguido por agrupamento pela metodologia UPGMA.
3
RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Contagem e Isolamento
Pela contagem de bactérias totais em meio NA, utilizando NMP como
método de contagem foi obtido 1,66x108 UFCs (Unidades formadoras de colônias)
por mL de extrato utilizado. Na contagem de bactérias diazotróficas utilizando os
meios de cultivo semi-seletivos NFb (Azospirillum brasilense, A. lipoferum, A.
amazonense e Herbaspirillum seropedicae) e JNFb (Herbaspirillum spp.) foi obtido
os valores de 2,73x107 UFCs e 2,03x107 UFCs respectivamente por mL de extrato
de raiz de milho.
Das placas utilizadas para contagem (meio JNFb) foram coletadas cerca
de 90 colônias que foram estocadas em glicerol 30% a -20°C e posteriormente foram
selecionadas 20 isolados que tiveram aspectos morfológicos semelhantes às
colônias de bactérias do gênero Herbaspirillum em meio JNFb
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Caracterização Bioquímica/Fisiológica e Molecular
3.2.1 Crescimento em fonte de carbono
Os isolados foram avaliados quanto à capacidade de crescimento em seis
diferentes fontes de carbono. A estirpe utilizada como padrão para o crescimento
nas diferentes fontes de carbono foi Smr1 (H. seropedicae) a qual obteve
crescimento em 4 fontes arabinose, inositol, ácido nicotínico e glicose. Foi possível
detectar que 85% dos isolados obtidos cresceram em mais de uma fonte de
carbono. Os isolados J8, J11, J13, J15 e J25 apresentaram crescimento em todas
as fontes de carbono, representando 25% dos isolados estudados. Estas bactérias,
portanto apresentam alta capacidade metabólica de adaptação a diversos
ambientes, pela utilização de variadas fontes de carbono (TORTORA; FUNKE;
CASE, 2000).
3.2.2 Teste de peroxidase
Todos os isolados obtidos quando em contato com o peróxido de
hidrogênio a 5%, apresentaram formação de bolhas iguais a da estirpe Smr1
(Herbaspirillum seropedicae), são então denominados peroxidase positivos.
Devido à ação tóxica de espécies reativas de oxigênio sobre as células,
dentre elas o peróxido de hidrogênio, produzidas durante a respiração aeróbica
normal, os microorganismos sintetizam enzimas capazes de neutralizarem esta
ação. A enzima peroxidase é facilmente detectada quando uma gota de peróxido de
hidrogênio é colocada sobre uma colônia bacteriana, havendo liberação de O 2
(TORTORA; FUNKE; CASE, 2000). A enzima catalase é da classe enzimática das
peroxidases que é encontrada em Herbaspirillum seropedicae (BALDANI et al.,
1986). A presença de peroxidase indica a presença de maquinaria metabólica para a
detoxificação da célula, porém não é critério de definição de grupos entre famílias de
microorganismos, sendo necessários outros testes bioquímicos aliados para
definição taxonômica dos isolados.
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3.2.3 Resistência Intrínseca a Antibióticos (RIA)
No teste de tolerância intrínseca a antibióticos foram utilizados os
controles Smr1 (H. seropedicae), Y2 (A. amazonense).
Juntamente com as estirpes Smr1 e Y2 90% dos isolados cresceram na
concentração de 500 µg.mL-1 de amoxicilina, e somente J4 e J21 mostraram
sensibilidade para este antibiótico. Em ácido nalidíxico 65% dos isolados (J2, J4,
J13, J14, J15, J18, J19, J21, J24, J29, J32, J34, J35) cresceram na concentração de
60 μg.mL-1. As estirpes Smr1 e Y2 tiveram crescimento a 100μg.mL -1 para este
antibiótico. A maioria dos isolados se mostrou sensível a ampicilina (75%) e
cloranfenicol (60%) nas concentrações testadas de 100 μg.mL -1 e 200 μg.mL-1
respectivamente
3.2.4 Análise de Similaridade
Pelo dendrograma (Figura 1) resultante da análise dos dados de fontes de
carbono, capacidade de crescimento em antibiótico e o teste de peroxidase pelo
método de agrupamento dos 20 isolados e estirpes controles (Smr1 e Y2), foi
possível observar a formação de 8 grupos (I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII) com
similaridade maior ou igual a 68%.
O grupo I se destaca por possuir um maior número de isolados
compreendido por: J18, J19, J29, J32, J34 e por ser o único grupo que compreende
a estirpe Smr1 (H. seropedicae). Os isolados desse grupo representam 25% das
bactérias avaliadas possuindo uma similaridade de aproximadamente 70% entre si e
com a estirpe padrão Smr1 (Figura 1).
Ainda no grupo I, os isolados J18, J19 e J29 possuem similaridade com a
estirpe padrão de 84%. Tal similaridade entre os isolados citados, e a estirpe de H.
seropedicae permite supor que há possibilidade dos isolados do grupo I pertencer ao
gênero
Herbaspirillum
ou
gêneros
afins,
porém
é
necessário
dados
de
seqüenciamento de DNA e testes mais aprimorados para comprovar esta afirmação.
O grupo II é composto pelos isolados: J8, J11, J13, J15 e J25. Possuem
uma similaridade de aproximadamente 75% entre si de acordo com os dados
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analisados. Os grupos III, V e VI compreendem respectivamente aos isolados J21 e
J24 e a estirpe Y2 (Figura 1). Pela análise do dendrograma é possível afirmar que
não há, dentre os 20 isolados selecionados, isolados com características
semelhantes a estirpe padrão Y2 de A. amazonense, pois este ficou em um
agrupamento isolado no grupo VI (Figura 1).
Figura 1. Dendrograma de similaridade, gerado pelos testes de fontes de carbono, em meio
de cultura líquido JNFb, e teste da peroxidase pelos 20 isolados obtidos de cultivares de
milho (Zea mays) da variedade sol-da-manhã, e as estirpes padrões Smr1 (H. seropedicae),
FP2 (A. brasilense) e Y2 (A. amazonense). Foi utilizado o programa NTSYS (Numerical
Taxonomy System) versão 2.02i, utilizando o coeficiente de Jaccard para obtenção de uma
matriz de similaridade seguido por agrupamento pela metodologia UPGMA. I, II, III, IV, V, VI
e VII: grupos formados com 68% de semelhança entre os mesmos.
O grupo IV compreende os isolados J16, J17 e estirpe FP2, propondo
similaridade de aproximadamente 70% da estirpe de Azospirillum brasilense (FP2)
com os isolados citados (Figura 1).
Os isolados J2, J4, J14 e J35 compreendem o grupo VII, e de acordo com
o agrupamento feito pelas características determinadas, estes isolados possuem
similaridade entre si de 70% aproximadamente (Figura 1).
O grupo VIII é formado pelos isolados J12 e J33, possuindo 84% de
similaridade entre eles (Figura 1).
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Os isolados J18, J19 e J13, J15 foram considerados pela análise de
agrupamento com 100% de similaridade. Todos esses agrupamentos propostos pela
análise deverão ser confirmados após seqüenciamento da região 16S do rDNA.
3.3 PCR da região intergênica (16S-23S DNAr) e região BOX
A utilização da amplificação da região intergênica (16S-23S DNAr) e da região
BOX (regiões repetitivas) vem sendo utilizada para obtenção de heterogeneidade de
tamanho dos amplificados e assim obter informações taxonômicas sobre a bactérias
até ao nível de espécies e subespécies (LOUWS et al., 1998; SMITH ;HENNESSY;
STEAD, 2001).
Pela amplificação da região intergênica houve a presença de 1 banda
para 9 isolados (J4, J14, J16, J17, J18, 19, J24, J32, e J33) e 2 bandas para os
demais. Este resultado indica que a região espaçadora entre os genes 16S e 23S
DNAr são na sua maioria de 2 tipos (Figura 2). Os isolados onde apenas uma banda
foi observada, o tamanho foi de aproximadamente 1kpb.
Os isolados possuindo 2 bandas foi observado uma é maior de tamanho
variando entre 1,2 e 1 kpb e uma banda de menor tamanho com variando de 1 a 0,9
kpb (Figura 2). Os isolados que apresentaram perfis semelhantes formam 3 tipos
sendo os isolados J2, J8, J11, J12, J15, e J21 semelhantes no perfil das bandas,
outro tipo foi observado para os isolados J25 e J29 e outro para o isolado J13 e a
estirpe padrão Smr1 (H. seropedicae). Este dado pode indicar que este isolado pode
pertencer a esta espécie (Figura 2).
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Figura 2 Eletroforese em gel de agarose 1% da amplificação por PCR da região intergênica
16S-23S DNAr com os primers pHR e p23 . Linha 1- Kb ladder mark; linha 2- isolado J2;
linha 3- isolado J4 ; linha 4- isolado J8; linha 5- isolado J11 ; linha 6- isolado J12; linha 7isolado J13; linha 8- isolado J14; linha 9- isolado J15; linha 10- isolado J16 ; linha 11isolado J17; linha 12- 1kb ladder marker; linha 13 – isolado J18; linha 14- isolado J19; linha
15- isolado J21 ; linha 16- isolado J24; linha 17- isolado J25; linha 18 - isolado J25; linha 19 1kb ladder marker ; linha 20 isolado J29; linha 21- isolado J32 ; linha 22 - isolado J33; linha
23 – isolado J34; linha 24 – estirpe Smr1 (H. seropedicae).
Se os produtos de amplificação da região espaçadora dos genes DNA
ribossomais apresentam apenas um fragmento, existe a possibilidade de que no
genoma desta bactéria esteja presente apenas uma seqüência alvo ou que, pelo
menos, o tamanho das múltiplas cópias seja semelhante (DOLZANI et al., 1995).
Esta região pode apresentar grande da variabilidade no tamanho e no número de
cópias, como o observado por Lagatolla et al. (1996). Neste trabalho os autores
observaram que diferentes sorotipos de Salmonella são caracterizados por
diferentes padrões de espaços intergênicos (LAGATOLLA et al., 1996).
Pelos produtos de amplificação do BOX-PCR dos 20 isolados, foram
observados 12 perfis, indicando a heterogeneidade das bactérias isoladas da raiz de
plantas de milho (Figura 3).
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Figura 3 Análise por eletroforese em gel de agarose 1% da amplificação por PCR utilizando
o primer BOX AIR . Linha 1- kb ladder marker; linha 2- isolado J2; linha 3- isolado J4 ; linha
4- isolado J8; linha 5- isolado J11 ; linha 6- isolado J12; linha 7- isolado J13; linha 8- isolado
J14; linha 9- isolado J15; linha 10- isolado J16 ; linha 11- Kb ladder mark ; linha 12- isolado
J17; linha 13 – isolado J18; linha 14- isolado J19; linha 15- isolado J21 ; linha 16- isolado
J24; linha 17- isolado J25; linha 18 - isolado J29; linha 19 – isolado 32; linha 20 - isolado J33
;linha 21 - isolado J34; linha 22 –estirpe Smr1 (H. seropedicae); linha 23 -1 kb ladder
marker.
Os isolados que apresentaram perfis semelhantes foram 1) J2 e J14; 2)
J8 e J11; 3) J15, J16, e J18; 4) J29 e J32; os demais isolados apresentaram perfis
exclusivos. Quando se observa o perfil de bandas por BOX-PCR obtido para a
estirpe padrão Smr1 (H. seropedicae), apenas o isolado J25 se mostrou semelhante,
indicando que este pode ser da mesma espécie de Herbaspirillum.
4
CONCLUSÃO
Foram isoladas 90 bactérias diazotróficas em meio semi-seletivo JNFb, e
estas depositadas na Coleção de Culturas de bactérias endofíticas de raízes de
milho (Zea mays).
A partir dos dados bioquímicos foi elaborado um dendrograma com
similaridade média entre os grupos de 70%. Um grupo de 5 isolados (J18, J18, J29,
J32 e J34) juntamente com a estirpe Smr1 se destacou dentre os oito grupos
obtidos,
por
possuírem
uma
similaridade
com
a
estirpe
padrão
Smr1
(Herbaspirillum).
A análise por PCR da região intergênica revelou a presença de uma ou
duas regiões espaçadora e 5 diferentes tipos de perfis, com variação de tamanho
entre 1,2 a 0,8 kpb.
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A presença de regiões repetitivas foi observada pelo BOX-PCR e foram
definidos 12 tipos de bandamento para os isolados analisados, indicando uma
grande variação genética dos isolados.
Os testes bioquímicos e as análises por PCR indicaram grande
diversidade metabólica e genética das bactérias fixadoras de nitrogênio isoladas de
raízes de milho, demonstrando a necessidade de maiores estudos para a
determinação mais acurada da diversidade destas bactérias associadas a plantas
cultivadas no Cerrado.
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