influência do local de inovulação de embriões bovinos

PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE MINAS GERAIS
Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde
Departamento de Medicina Veterinária
Curso de Medicina Veterinária em Betim
Andrew Baião C. Macedo Pessoa
INFLUÊNCIA DO LOCAL DE INOVULAÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS E DO
TAMANHO DE CORPO LÚTEO SOBRE A TAXA DE PRENHEZ EM PROGRAMA DE
TETF – TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES EM TEMPO FIXO
Betim
2013
Andrew Baião C. Macedo Pessoa
INFLUÊNCIA DO LOCAL DE INOVULAÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS E DO
TAMANHO DE CORPO LÚTEO SOBRE A TAXA DE PRENHEZ EM PROGRAMA DE
TETF – TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES EM TEMPO FIXO
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao
Curso de Medicina Veterinária em Betim da
Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais,
como requisito parcial para obtenção do título de
Bacharel em Medicina Veterinária.
Orientador: Profa. Maria Isabel Vaz de Melo
Betim
2013
Andrew Baião C. Macedo Pessoa
INFLUÊNCIA DO LOCAL DE INOVULAÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS E DO
TAMANHO DE CORPO LÚTEO SOBRE A TAXA DE PRENHEZ EM PROGRAMA DE
TETF – TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES EM TEMPO FIXO
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao
Curso de Medicina Veterinária em Betim da
Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais,
como requisito parcial para obtenção do título de
Bacharel em Medicina Veterinária.
____________________________________________
Maria Isabel Vaz de Melo (orientador) – PUC Minas
____________________________________________
Everton Tadeu Negrão Pereira – Fazenda Querença
____________________________________________
Miguel Alonso de Gouvêa Valle– PUC Minas
Betim, 17 de Junho de 2013
Dedico esse trabalho a Jesus Cristo por seu amor e por ser o trilho que guia a minha vida.
Ao meu filho Arthur por ser a chama que me deixa vivo e forte para lutar.
A minha mãe Marly por nunca desistir dos seus filhos.
Você é a maior investidora de sonhos da terra.
Ao meu pai por me ensinar a nunca desistir.
Ao meu vô Agenor por me ensinar que
corajosos morrem apenas
uma vez.
AGRADECIMENTOS
A realização desse trabalho só é possível com a colaboração de muitas pessoas. E por
Deus ter colocado as pessoas certas no meu caminho.
Agradeço aos meus pais Marly e Evandro por terem me proporcionado uma formação
acadêmica e por me incentivarem incansavelmente.
Agradeço ao meus irmãos pelo companheirismo e por fazer sentir que tenho verdadeiros
amigos.
As minhas avós Florzinha e Odete que sempre rezaram e mandaram energias positivas para
mim.
A minha namorada Nádia que de colega de faculdade passou a ser uma das peças mais
importantes na minha vida. Obrigado pela sua ajuda no meu trabalho pelo seu incentivo e
pelos momentos felizes que vivo ao seu lado.
Aos meus amigos por terem me proporcionado momentos de alegria que deixaram essa
caminhada mais descontraída. Em especial meus amigos da Turma do Golo que a tantos anos
torcem um pelos outros. Aos meus amigos de Betim e de BH.
Ao meu amigo Dr. Everton (Coiote) que sempre torceu por esse momento e que abriu as
portas da sua casa e do seu trabalho para que eu realizasse essa monografia. E a todos da
fazenda Querença e seus funcionários em especial a Daiane que sempre se mostravam
disponíveis em ajudar. Aos veterinários Dr. Júlio e Dr. Silvio pela grande ajuda e conselhos.
Ao diretor Moisés e gerente Everaldo por terem permitido a realização do meu trabalho em
uma empresa séria e comprometida com a qualidade dos seus serviços.
A Prof. Bel por ter me orientado com mais que apenas sabedoria de mestre. Mas com alegria,
paciência e dedicação. Sua amizade ficará eternizada nesse trabalho.
Ao Prof. Rafael por sempre te se mostrado a disposição e por ter sido o primeiro a apostar no
meu trabalho. Espero poder continuar contando com você e com sua experiência em outros
que ainda virão.
Ao Prof. Miguel por ter aceitado o convite para avaliar o meu trabalho. Suas excelentes aulas
de fisiologia e reprodução de bovinos me inspiraram a querer dar continuidade e seguir pelo
mesmo caminho.
A minha Universidade, professores e funcionários que me ajudaram na minha formação
acadêmica e pessoal com suas excelentes aulas teóricas e experiências de vida. Em especial
Professores Alessandro, Rogério, Maria Coeli, Salim, Álvaro, Hudson, Guilherme Valle e
Vitor.
“Matar o sonho é matarmo-nos. É mutilar a nossa alma. O sonho é o que temos de realmente
nosso, de impenetravelmente e inexpugnavelmente nosso”
(Fernando Pessoa)
RESUMO
A técnica de transferência de embrião habitualmente utilizada em bovinos está bem
definida e consiste na inovulação de um embrião no trato reprodutivo de uma fêmea
receptora, previamente preparada, que irá completar a gestação. A busca por uma técnica cada
vez mais eficiente pode ser um fator determinante para o sucesso na transferência de embrião,
já que existem inúmeros fatores não ambientais envolvidos nas falhas de gestação.
Costumeiramente, a maioria dos técnicos deposita o concepto no terço cranial do corno
uterino ipsilateral ao corpo lúteo (CL). No entanto, embora esse método seja rotineiramente
utilizado, pouco se sabe em relação ao local ideal para se depositar o embrião no corno
uterino A ovulação de folículos maiores geralmente resulta no desenvolvimento de um CL
maior, capaz de produzir mais progesterona. O desenvolvimento embrionário não parece ser
devido a efeitos diretos da progesterona sobre o embrião, mas ao aumento da secreção de
vários fatores voltados para o estímulo do desenvolvimento embrionário. Durante o período
pré-ovulatório, acredita-se que o estradiol “programe” o útero, preparando-o para receber o
concepto e a principal vantagem da presença de altas concentrações pré-ovulatórias de
estradiol é a alteração do ambiente materno das vacas receptoras. O presente estudo objetivou
analisar se o local de inovulação e o tamanho do corpo lúteo interferem na taxa de prenhez em
novilhas receptoras de embriões produzidos in vitro. Foram avaliadas as transferências para
524 novilhas mestiças que foram utilizadas como receptoras dos embriões produzidos in vitro
sendo que desses 371 oriundos de embriões frescos e 153 de embriões vitrificados. A taxa de
prenhez diferiu entre os grupos de embriões frescos e vitrificados (p< 0,05). Entretanto o
tamanho do corpo lúteo (CL) e o local de inovulação no corno uterino não tiveram efeitos
significativos sobre a taxa de prenhez (p>0,05), tanto em embriões frescos como em
vitrificados.
Palavras-chave: Transferência de embriões, Local de inovulação, Tamanho de corpo lúteo,
Ambiente uterino,
ABSTRACT
Commonly used in bovines, the embryo transferring technique is well defined and
consists in the inovulation of an embryo in the reproductive tract of a previously prepared
receptive female that will complete the gestation. As there are numerous of other nonenvironmental factors involved in gestation failures, the search for a more efficient technique
can be a determining factor for the success of an embryo transfer. Usually, the majority of
technicians deposit the conceptus in the cranial third of the uterine horn ipsilateral to the
corpus lutheum (CL). However, although this method is routinely used, little is known about
the ideal location to deposit the embryo in the uterine horn. The ovulation of larger follicles
tends to result in the development of a CL greater in size, which is able to produce more
progesterone. It seems the embryo development is not due to direct effects of the progesterone
on the embryo, but to the increase in the secretion of other factors that turn to its stimulus, or,
inducement. It is believed that the estradiol “programs” the uterus during the pre-ovulating
period, preparing it to receive the conceptus. The main advantage of a high concentration of
pre-ovulatory estradiol is the change of the maternal environment of recipient cows. The
present study aimed to analyze whether the spot of inovulation and the size of the corpus
lutheum interfere in the pregnancy rate of heifers receiving in vitro produced embryos. The
transfers of 524 crossbred heifers were evaluated. The heifers were used as recipients of in
vitro produced embryos, being that 371 of these derived from fresh embryos and 153 of
vitrified ones. The pregnancy rate differed among the fresh and vitrified embryo groups
(p<0,05). The size of the corpus lutheum (CL) and the local of inovulation did not have
significant effects on the pregnancy rate (p>0,5) on neither fresh nor vitrified embryos.
Keywords: Embryo transfer, Inovulation site, Size of the Corpus Lutheum, Uterine
environment
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 -
Taxa de prenhez e de morte embrionária de 524 embriões transferidos
frescos ou congelados para receptoras novilhas..........................................30
FIGURA 2-
Taxa de prenhez e morte embrionária em transferências de embriões
frescos x tamanho de corpo lúteo............................................................... 33
FIGURA 3-
Taxa de prenhez e morte embrionária em transferências de embriões
vitrificados x tamanho de corpo lúteo.........................................................34
FIGURA 4-
Taxa de prenhez e morte embrionária em transferências de embriões
frescos x local de inovulação......................................................................37
FIGURA 5-
Taxa de prenhez e morte embrionária em transferências de embriões
vitrificados x local de inovulação...............................................................37
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 -
Taxa de prenhez em transferências de embriões frescos x embriões
vitrificados em receptoras novilhas...............................................................29
TABELA 2 -
Efeito do tamanho do corpo lúteo da receptora sobre a taxa de prenhez em
transferência de embriões frescos.................................................................32
TABELA 3-
Efeito do tamanho do corpo lúteo da receptora sobre a taxa de prenhez em
transferência de embriões vitrificados...........................................................33
TABELA 4-
Efeito do local de inovulação sobre a taxa de prenhez em transferência de
embriões frescos............................................................................................36
TABELA 5-
Efeito do local de inovulação sobre a taxa de prenhez em transferência de
embriões vitrificados.....................................................................................36
.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
CE
Cíclo estral
CL
Corpo Lúteo
FSH
hormônio folículo estimulante
PIV
Produção in vitro de embriões
FIV
Fecundação in vitro
TE
Transferência de embriões
P4
Progesterona
E2
Estrógeno
LH
Hormônio luteinizante
IFN-τ
Interferon tau
PGF2α
Prostaglandina 2 alfa
GnRH
Hormônio liberador de gonadotrofina
ESR1
Estradiol
OXTR
Oxitocina
ECP
Cipionato de estradiol
ISG
Genes estimulados por interferon
PGRs
Receptores de prostaglandinas
TETF
Transferência de embriões em tempo fixo
LPE
Longo período de proestro
SPE
Curto período de proestro
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...............................................................................................12
1.1 Problema........................................................................................................14
1.2 Hipótese..........................................................................................................14
2 REVISÃO DA LITERATURA......................................................................14
2.1 Morfologia uterina........................................................................................12
2.1.1 Ação Hormonal sobre o útero....................................................................15
2.2 Ciclo Estral....................................................................................................17
2.2.1 Fases do ciclo estral....................................................................................17
2.2.2 Foliculogênese, ovulação, luteogênese e luteólise.....................................18
2.2.3 Reconhecimento materno, migração intra-uterina
e expansão do concepto........................................................................................20
2.3 Controle hormonal sobre o ambiente uterino.............................................21
2.4 Transferência de embrião.............................................................................24
3 MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................25
3.1 Produção in vitro e transferência de embriões............................................25
3.1.1 Propriedade de realização das inovulações................................................26
3.1.2 Preparo das receptoras................................................................................26
3.1.3 Transferência de embriões PIV..................................................................26
3.1.4 Coleta de dados............................................................................................27
3.2 Diagnóstico de gestação................................................................................27
3.3 Análises estatísticas.......................................................................................28
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................28
4.1 Transferência de embriões produzidos in vitro..........................................28
4.1.1 Dados gerais................................................................................................28
4.1.2 Classificação do corpo lúteo por tamanho................................................30
4.1.3 Local de inovulação de embriões...............................................................34
5. CONCLUSÃO................................................................................................38
REFERÊNCIAS.................................................................................................38
14
1 INTRODUÇÃO
A crescente exigência mundial para produção de alimentos seguros e de forma
sustentável tem obrigado a pecuária bovina a sofrer adaptações, buscando o aumento da
eficiência reprodutiva e produtiva dos animais em áreas cada vez menores. Nesse sentido, as
biotécnicas de reprodução animal têm contribuído para a produção de animais com genótipos
superiores e com eficiência produtiva destacada. Além disso, as biotécnicas de produção de
embriões in vivo (transferência de embriões-TE) e in vitro (fecundação in vitro-FIV) são
importantes ferramentas para acelerar o melhoramento genético em rebanhos de alto valor e
encurtar o intervalo entre gerações, facilitando as observações comparativas entre os produtos
dos diferentes acasalamentos, promovendo uma rápida seleção dos animais mais produtivos.
(MARTINS, 2010).
O Brasil se consolidou como o maior produtor mundial de embriões in vitro,
respondendo por quase 80% das transferências desses embriões em 2007. Com a evolução do
uso da produção in vitro de embriões, foi observada uma diminuição do uso da transferência
de embriões in vivo, que apresentou uma variação negativa de 181% (MARTINS, 2010). Esta
atividade concentrou-se principalmente, em raças zebuínas de corte e seu sucesso se deve,
entre outros fatores, à fisiologia reprodutiva dessas raças, que apresentam maior número de
folículos disponíveis nos ovários em relação as taurinos (NEVES et al., 2010).
Apesar dos avanços obtidos nos últimos anos na produção in vitro de embriões a
produção in vitro de embriões (PIVE), a sua utilização crescente em programas de
melhoramento bovino, a proporção de embriões que atingem o estágio de blastocisto é,
raramente, superior a 40% e com índices de gestação em torno, também, de 40% (NEVES et
al., 2010).
A busca por uma técnica eficiente pode ser um fator determinante para o sucesso na
transferência de embrião, já que existem inúmeros outros fatores não ambientais envolvidos
nas falhas de gestação. As causas determinantes ou predisponentes podem ser de origem
endócrina, genética, de manejo para alta produção, infecciosas, imunológicas, aberrações
cromossômicas e nutricionais (FERREIRA, 2010).
Falha de gestação em bovinos pode ser devido à falha de fertilização do oócito ou
perda durante a gestação (BRIDGES, 2007). A falha de fertilização parece representar apenas
uma pequena proporção de falha da gestação (BRIDGES, 2007). A mortalidade embrionária
se caracteriza pela morte do óvulo fertilizado e de embriões até o final da implantação
(HAFEZ & HAFEZ, 2004).
15
Em bovinos a fixação do concepto e a placentação não ocorrem logo após a
fertilização e o concepto passa um período prolongado de tempo no lúmen uterino, antes de se
fixar ao endométrio (BRIDGES et al., 2013).
Uma proporção considerável de perdas ocorre antes da eclosão do blastocisto
(BRIDGES, 2007). A ovulação de ovócitos defeituosos e/ou a falta de suporte da tuba uterina
suficiente ao embrião em desenvolvimento, provavelmente contribuem para tais perdas.
Perdas embrionárias adicionais que podem ser atribuídas à disfunção uterina ocorrem durante
o alongamento e o período de fixação do concepto ao endométrio em bovinos (BRIDGES,
2007). Perdas da gestação são caracterizados por morte embrionária precoce, que ocorre antes
do período de manutenção do corpo lúteo (CL) ou no mesmo tempo de reconhecimento
materno, em vacas que estão no dia 15-17 do ciclo, e morte embrionária tardia, que ocorre da
manutenção do CL ao fim da fase de diferenciação, cerca de 42 dias de gestação. Depois de
50 dias de gestação, as perdas da gestação são menos freqüentes e caracterizam a morte fetal
(SANTOS et al., 2004, BRIDGES, 2007).
A técnica de TE habitualmente utilizada em bovinos está bem definida e consiste na
inovulação de um embrião no trato reprodutivo de uma fêmea receptora, previamente
preparada, que irá completar a gestação. Costumeiramente, a maioria dos técnicos deposita o
concepto no terço cranial do corno uterino ipsilateral ao corpo lúteo. No entanto, embora esse
método seja rotineiramente utilizado, pouco se sabe em relaçã ao local ideal para se depositar
o embrião no corno uterino (PIERONI, 2009). Existem poucos relatos referentes às taxas de
prenhez em relação aos locais de inovulação do corno uterino em que são inovulados os
embriões. E se a diferença morfofuncional entre as regiões cranial média ou caudal do corno
uterino pode favorecer ou comprometer a viabilidade do embrião (PIERONI, 2009).
Acredita-se que o tamanho corpo lúteo influencia positivamente a sua produção de
prgesterona (Pieroni, 2009). Baruselli et al. (2003) observaram que a área do CL influenciou a
concentração plasmática de progesterona
(P4) e a taxa de concepção de receptoras de
embrião bovino. Vasconcelos et al. (2001) observaram que os corpos lúteos que possuem
maior área secretam maiores quantidades de P4, o que pode ter efeito positivo no
reconhecimento materno da gestação e, conseqüentemente, na taxa de prenhez. Por outro
lado, outros pesquisadores não observaram incremento nos resultados reprodutivos quando
relacionaram o tamanho do corpo lúteo com a concentração de progesterona e taxas de
prenhez. Dentro desta linha de questionamento o presente trabalho tem também como
objetivo avaliar o efeito do local da inovulação e o tamanho do corpo lúteo encontrados em
16
receptoras no momento das transferências sobre as taxas de prenhez, utilizando-se embriões
frescos e vitrificados em programa de transferência de embrião em tempo fixo.
1.1 Problema
O tamanho do CL das receptoras e o local de inovulação devem ser considerados critérios
em programas de transferências de embriões bovinos frescos e vitrificados realizados em
tempo fixo?
1.2 Hipóteses
O local de inovulação no corno uterino não tem efeito sobre a taxa de prenhez em
bovinos.
O tamanho do corpo lúteo não interfere sobre a taxa de prenhez em bovinos.
Não existe diferença na taxa de prenhez nas transferências em tempo fixo utilizando-se
embriões bovinos frescos ou vitrificados.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Morfologia uterina
O útero é composto de dois cornos uterinos, um corpo e um cérvix. É do tipo bipartido
(uterus bipartitus) na vaca, ovelha e égua, pois apresenta um septo que separa os dois cornos
e um evidente corpo uterino. O útero é um órgão altamente capacitado e adaptado a
reconhecer e nutrir o produto da fertilização, desde a implantação até o parto (HAFEZ &
HAFEZ, 2004).
A parede uterina é dividida em três regiões diferentes: a mucosa ou endométrio, a
muscular ou miométrio, e a serosa ou perimétrio. O endométrio (túnica mucosa) é constituído
por duas zonas que diferem em estrutura e função. A camada mais superficial chamada de
zona funcional degenera-se parcialmente ou totalmente após a gestação ou estro. A camada
mais profunda, zona basal permanece intacta após esses eventos (MARTIN, 2003).
O endométrio é constituído por uma camada espessa na qual o epitélio varia de
simples cilíndrico a pseudo-estratificado cilíndrico. Os bordos apicais das células possuem
microvilosidades que variam de altura de acordo com a atividade secretora do epitélio,
17
apresentando-se mais longas na fase lútea em relação à fase folicular. Em todo o endométrio
estão presentes glândulas uterinas tubulares simples, enoveladas e ramificadas, sendo ausentes
na região das carúnculas em ruminantes. O epitélio glandular é similar ao luminal, exceto pela
presença de cílios na superfície livre de muitas células colunares (MARTIN, 2003).
O tecido sub-epitelial é composto por dois extratos, o compacto ou superficial e o
esponjoso ou profundo. O extrato compacto consiste de tecido conjuntivo frouxo, ricamente
vascularizado com muitos fibroblastos, macrófagos e mastócitos. A região mais profunda
(extrato esponjoso) também é compreendida por tecido conjuntivo frouxo, sendo este menos
celularizado (PIERONI, 2009).
As carúnculas são espessamentos circunscritos da lâmina própria, ricas em
fibroblastos e com extenso suprimento sangüíneo, sem, no entanto, possuírem glândulas
uterinas. Aproximadamente quatro fileiras com 15 carúnculas estão presentes em cada corno
uterino (MARTIN, 2003).
Em relação ao miométrio, este é formado por uma espessa camada circular interna e
uma camada longitudinal externa de células musculares lisas que aumentam em número e
tamanho durante a gestação. Entre as duas camadas ou profundamente na camada interna, há
uma zona vascular constituída de grandes artérias, veias, e vasos linfáticos, o extrato vascular
(MARTIN, 2003).
A terceira camada do útero, o perimétrio ou serosa é constituída de tecido conjuntivo
frouxo coberto por mesotélio peritoneal, possui numerosos vasos sanguíneos, linfáticos e
fibras nervosas (MARTIN, 2003).
2.1.1 Ação hormonal sobre o útero
Na vaca, nos três a quatro últimos dias do diestro, ocorre regressão da mucosa, com
redução na altura do epitélio luminal, e as glândulas uterinas tornam-se curtas com epitélio
baixo e sem secreção.
No proestro, sob a influência de estrógeno (E2), o endométrio é restaurado (início da
fase proliferativa), a mucosa torna-se espessa, congesta e edematosa com a predominância de
células secretoras de muco. Entretanto, a proliferação glandular limita-se a um crescimento
linear das glândulas, sem ramificação ou enovelamento. (GRUNERT & GREGORY, 1989).
Durante o estro, o edema e a hiperemia endometriais são acentuados (PIERONI,
2009). A mucosa uterina apresenta hipertrofia e hiperplasia de grau considerável, dando a esta
fase a denominação de proliferação endometrial (GRUNERT & GREGORY, 1989).
18
No metaestro, o edema diminui e ocorrem hemorragias microscópicas, caracterizando
o processo de metrorragia. Na vaca, a metrorragia tem início antes da ovulação, atinge um
máximo durante o edema endometrial, sendo mais proeminente nas regiões centrais das
carúnculas e termina abruptamente no segundo dia após o estro (PIERONI, 2009).
Com o início do diestro, sob a influência da progesterona, o endométrio passa de um
estágio proliferativo para um secretor, com espessamento do epitélio glandular, além de
ramificação, enovelamento e secreção das glândulas (GRUNERT & GREGORY, 1989).
Durante os primeiros 11 dias do diestro, a secreção glandular é grande, mas se a gestação não
acontecer ocorre regressão das glândulas juntamente com a luteólise nos últimos três dias do
diestro (MARTIN, 2003).
Alguns estudos foram realizados para descobrir se há diferenças anatômicas entre a
vascularização e morfologia uterina entre os cornos uterinos ipslaterais ao ovário que contém
o CL. Ginther (1974) suspeitou que o papel fisiológico das anastomoses das artérias
uteroováricas pudesse ser para contribuir para a preparação do oviduto e do corno ipslateral
para a gestação ou contribuir com as necessidades arteriais do CL altamente vascularizado.
Segundo Ginther e Del Campo (1974) um mecanismo de anastomose entre ramificações da
artéria uterina e ovárica é significativamente mais proeminente no lado em que o CL está
presente em relação ao lado oposto. Essa alteração pode ser dinâmica, pois ocorrem mudanças
consideráveis no calibre desses vasos quando o lado em que ocorre a ovulação se altera.
Pieroni (2009) ao analisar lâminas contendo fragmentos das porções cranial, média e caudal
dos cornos uterinos ipsilateral e contralateral ao corpo lúteo, de novilhas sete dias após a
detecção do cio, notou que havia uma aparente diferença na quantidade de vasos nesses
locais, mas sem diferença estatística na quantidade de vasos em relação aos mesmos.
Entretanto havia uma maior vascularização em relação aos mesmos locais do lado oposto ao
corno com CL. Segundo esses autores, embora houvesse variação na quantidade de vasos nos
três segmentos, não havia alteração morfofuncional que comprometessem o ambiente uterino.
Pieroni (2009) citou que a maioria dos estudos histológicos do útero refere-se somente
à porção média do corno uterino. Monteiro et al. (2003) não encontrou variações histológicas
entre as porções médias tanto de vacas como de novilhas na fase progestacional. O mesmo foi
relatado por Pieroni (2009) que não observou diferença na caracterização do epitélio em
relação às porções craniais, médias e caudais do corno uterino e com o tamanho e quantidade
das glândulas endometriais, que não diferiram em relação às três porções uterinas, tanto do
lado adjacente quanto do lado oposto ao corpo lúteo.
19
2.2Ciclo estral
2.2.1 Fases do ciclo estral
O ciclo estral (CE) corresponde a um padrão rítmico de eventos fisiológicos e a um
conjunto de modificações endócrinas que os animais apresentam em períodos ou intervalos
regulares resultando em mudanças morfológicas no sistema genital e comportamentos do
animal, ou seja, tem início no cio e finaliza no cio subseqüente, com duração média de 21 dias
(18-24 dias) na fêmea adulta bovina bem nutrida. O CE ocorre regulamente o ano inteiro em
bovinos (poliéstricos) e somente é interrompido em caso de gestação, amamentação,
subnutrição severa, e condições patológicas associadas com CL persistentes (FERREIRA,
2010). As fases do ciclo estral estão descritas a seguir, de acordo com Ferreira (2010):
O CE pode ser dividido em duas fases distintas, de acordo com as estrutura dominante
no ovário. Fase folicular (proestro e estro) que vai da regressão do CL à ovulação e
corresponde a 20% da duração de CE. E fase luteal (metaestro e diestro) que vai da ovulação
até a regressão do CL e compreende a 80% da duração do CE (FERREIRA, 2010).
Estro: se caracteriza pelos visíveis sintomas comportamentais de cio e
rececptividade sexual. O estro corresponde ao dia do cio e sua duração pode
variar de 6-21h. Os níveis circulantes de estrógeno (E2) estão muito elevados
no início e são responsáveis pelos sinais característicos do cio: útero túrgido,
cervix relaxado, vagina e vulva hipirêmicas e corrimento de muco. Este é
considerado o dia 0 do CE.
Metaestro: é o período que vai do cio até o 5° dia do CE. Pode se considerada
uma fase progesterônica, pois seguinte ao pico de LH ovulatório, já tem início
uma pequena produção de progesterona (P4). Nesta fase ocorre ovulação 2448h após o início do cio ou 10-15h. Em bovinos ocorre após ±24h após o pico
de LH. Após ovulação tem iníco a formação do CL, começando com o corpo
hemorrágico. Este não responde à prostaglandina PGF2α por falta de
receptores específicos.
Diestro: é o período em que o CL está fucionalmente ativo produzindo P4. Esta
fase vai do dia 5°-17° dia do CE, única que pode haver resposta à PGF2α. O
CL é um órgão endócrino temporário que funciona durante o diestro em
animais ciclando ou durante a gestação. Aproximadamente 70 a 80% das vacas
ciclando podem ter CL responsivo à PGF2α.
20
Proestro: é a fase que tem início com a regressão ou lise do CL e termina no
início do cio. Caracteriza pelo contínuo decréscimo dos níveis de FSH e
aumento dos níveis de LH. É a fase que antecede ao estro e na qual ocorre
crescimento folicular, com aumento gradativo de E2 circulante. Com a
regressão do CL, cai o nível de P4 e cessa o bloqueio à secreção de
gonadotropinas (FSH- LH), cujas secreções aumentando vão estimular o
crescimento folicular (FERREIRA, 2010)
2.2.2 Foliculogênese, ovulação, luteogênese e luteólise
A função gonadal em vacas depende da coordenação da síntese e secreção do GnRH
do hipotálamo induzida pela liberação pulsátil de gonadotropinas, FSH e LH pela hipófise. As
gonadotropinas agem diretamente em células específicas no ovário para induzir respostas
como a produção de estradiol pelo folículo ou progesterona pelo CL. Esses esteróides
ovarianos podem depois regular positivo ou negativamente secreção de GnRH pelo
hipotálamo e gonadotropinas pela pituitária anterior (BRIDGES, 2007).
No proestro, sob ação sinérgica de FSH e LH, o folículo cresce e aumenta
gradativamente a secreção de E2 até se tornar maduro ou pré ovulatório, quando produz alta
concentração de E2. Bridges (2007) citou que a adequada duração de estradiol durante o
período pré ovulatório pode ser um pré requisito para uma função luteal apropriada no ciclo
subsequente. O aumento do estradiol durante o proestro aumenta o número de células da
granulosa no folículo. O aumento da concentração de E2 no proestro previne apoptose dessas
células. As células esteroidogênicas grandes do CL produzem mais de 80% da progesterona e
são derivadas da granulosa. As pequenas células são derivadas da teca interna. A indução
prematura da ovulação do folículo dominante conseqüentemente diminui o número das
células da granulosa.
No início do estro após uma concentração máxima de E2 aumentam também a
secreção de inibina, que reduz a produção de FSH, devido a um feedback negativo no
hipotálamo, bem como promovem uma descarga de GnRH pela glândula, estimulando a
liberação e pico de LH responsável pela ovulação (FERREIRA, 2010).
Um grupo de folículos pequenos passa a se desenvolver nos ovários, se denominando
onda folicular. Desse grupo de folículos é escolhido um único folículo dominante para
continuar a se desenvolver enquanto os outros passam por um processo de regressão. Devido
21
à presença de CL e altas concentrações de P4, por feedback inibe a produção de GnRH no
hipotálamo, com conseqüência não haverá secreção de FSH e LH, suficientes para o
crescimento de um folículo maduro, esse primeiro folículo dominante se torna não-funcional e
se inicia uma segunda onda. Escolhe-se novamente um folículo dominante desta segunda
onda, o qual evolui para a ovulação, pois seu crescimento corresponde ao período de
regressão do CL. Algumas vacas apresentam três ondas de crescimento, de tal forma que o
segundo folículo regride e uma 3ª onda se inicia e se torna o folículo ovulatório
(WILTBANK, 2000, FERREIRA, 2010).
As células remanescentes do folículo pré-ovulatório se trasformam no CL, que
aumenta de tamanho durante a primeira parte do ciclo, atingindo então uma fase de platô que
o mantém grande (20-25 mm). O principal hormônio originado no CL é a progesterona, sendo
que seu aumento de tamanho se traduz em maiores concentrações dessas substâncias no
sangue. Se a vaca ficar prenhe, o CL mantém seu tamanho e as altas concentrações de
progesterona, impedindo que a vaca entre no cio ou tenha uma nova ovulação. O aumento da
concentração de P4 durante o estágio final do ciclo induz uma inativação nos receptores de P4
no endométrio uterino. Essa inativação de receptores associado ao aumento de estradiol
permite o aumento de receptores para ocitocina. Mesmo as baixas concentrações de estradiol
nessa fase ajudam no processo luteolítico. Estradiol estimula o hipotálamo a gerar pulsos de
oxitocina e aumenta e expressão dos receptores de oxitocina no endométrio uterino
(BRIDGES, 2007). A iberação de oxitocina armazenada na neuro-hipófise, estimula a
liberação de pequena quantidade de PGF2α no endométrio, mas é o suficiente para promover
um feedback positivo para a liberação adicinal de oxitocina e PGF2α luteal (FERREIRA,
2010). Se a vaca não ficar prenhe, o CL diminui seu tamanho por volta do 17°-20° dia do
ciclo. Isso ocorre devido à secreção de prostaglandina PGF2α no útero sem gestação. Após a
exposição à PGF2α cai a concentração de progesterona no sangue e diminui o tamanho do CL
(WILTBANK, 2000).
22
2.2.3 Reconhecimento materno, migração intra- uterina e expansão do concepto
A migração intra-uterina dos embriões é considerada uma importante estratégia para
muitas espécies já que possibilita que o embrião escolha o melhor local para sua implantação
e, em prenhezes múltiplas, permite um eficiente aproveitamento do espaço interno do útero
(PIERONI, 2009). A migração e a expansão continuam até o dia 12, quando o concepto sofre
um rápido processo de alongamento do troflobasto. A produção de histamina, estrógeno e
prostaglandina pelo concepto servem para estimular a atividade local do miométrio para
mover o concepto. A migração transuterina é rara em ovelhas e vacas monovulatórias,
entretanto, a migração ocorre em ovelhas quando há ovulações múltiplas no mesmo ovário.
Pieroni (2009) citou trabalhos em que foi observado 4,2% de taxa de migração intra-uterina
em novilhas que receberam um embrião no corno ipslateral ao CL e de 25% quando foram
inovulados dois embriões no corno adjacente ao CL. Quando foram depositados um ou dois
embriões contralateralmente, a taxa de migração foi de 28,5% e 87% respectivamente. No
entanto foi citado por Pieroni (2009) que os trabalhos achados não consideram possíveis
deslocamentos dentro do próprio corno uterino. Porém em seu trabalho, Pieroni (2009)
observa que a questão da migração intra-uterina deveria ser repensada, já que existe a
presença de cílios e microvilos ao longo do endométrio que possibilita uma movimentação do
embrião ao longo do corno uterino na espécie bovina.
No dia 14 ou 15 na vaca, o concepto sofre uma fase de crescimento e alongamento
logarítmicos. As células endodérmicas extra-embrionárias desenvolvem-se para uma
membrana contínua, que se tornará constituinte do saco vitelínico. O concepto transforma-se
de uma forma esférica de 3mm no dia 13, para uma forma filamentosa de 25cm no dia 17 e se
estende para dentro do corno contralateral ao CL no dia 18. Essa expansão do trofoblasto
permite ao concepto estender suas membranas placentárias por todo o útero e bloquear a
síntese ipsilateral de PGF2α e prevenir a luteólise. O concepto deve sinalizar sua presença
para o organismo materno e bloquear a regressão do corpo lúteo. A manutenção do corpo
lúteo é essencial para o estabelecimento da gestação em todas as espécies de animais
domésticos. O concepto sintetiza e secreta esteróides e proteínas para sinalizar sua presença
no ambiente materno (HAFEZ & HAFEZ, 2004).
O alongamento do concepto (dias 14 a 16) produz uma proteína chamada de
trofoblastina agora identificado como o tipo de I interferon ou IFNt que estende a função
luteal. Essa proteína antiluteolítica produzida pelo trofectoderma do concepto é responsável
pelo reconhecimento materno da gravidez. Autores sugeriram que em ruminantes, a luteólise
23
é impedida por inibição da secreção do endométrio PGF, bloqueando os receptores de
oxitocina endometrial e / ou induzindo o endométrio para sintetizar um inibidor de enzimas
necessárias para a síntese de PGF (BRIDGES, 2007). A produção de IFN-t pelo concepto
ocasiona uma falha nos receptores de oxitocina e liberação de oxitocina luteínica, devido à
supressão de receptores de estrógeno no endométrio. Isso reduz a liberação de PGF 2α abaixo
de um nível crítico ( HAFEZ & HAFEZ, 2004).
Além de sinalização do reconhecimento materno em ruminantes, IFNt também é
responsável por induzir a expressão de numerosos genes. Acredita-se ser importante para o
desenvolvimento e estabelecimento do concepto e pela receptividade uterina para o implante
do mesmo (BRIDGES, 2007).
2.3 Controle hormonal sobre o ambiente uterino
O útero é o local de fixação do concepto. Esse órgão passa por uma série definida de
mudanças durante o ciclo estral e a prenhez (DELLMAN, 2012). A exposição seqüencial à
progesterona antes do estro, concentrações elevadas de estradiol no momento do estro e
concentrações suficientes de progesterona no ciclo estral subseqüente são necessárias para a
obtenção de um ambiente uterino adequado à sobrevivência do concepto (BRIDGES et
al.,2013). Uma íntima relação entre o processo dinâmico do endométrio e o ovário é crítica
para o estabelecimento desse ambiente uterino adequado (HAFEZ & HAFEZ, 2004).
A falha da prenhez pode ser causada por diversos fatores, embora a causa mais comum
seja a perda embrionária durante a fase inicial da gestação. Dois fatores primordiais que
influenciam a probabilidade de perda embrionária são a qualidade do ovócito ovulado e o
suporte uterino ao desenvolvimento embrionário (KRUSE et al,, 2013).
Após a luteólise, quando as concentrações de progesterona são baixas, a maior
pulsatilidade de LH estimula o crescimento do folículo dominante o aumento da produção de
estradiol e a ocorrência de estro e ovulação. Em contraste, durante os períodos de altas
concentrações de progesterona, a baixa freqüência de pulsos de LH deixa de sustentar o
crescimento folicular, resultando em atresia do folículo dominante (KRUSE et al,, 2013).
As baixas concentrações de progesterona aumentam a secreção de LH, estimulando o
crescimento folicular e a produção de estradiol, fatores esses que influenciam as taxas de
prenhez em bovinos (VASCONCELOS et al., 2001). A ovulação de folículos maiores
geralmente resulta no desenvolvimento de um CL maior, capaz de produzir mais progesterona
(KRUSE et al,, 2013).
24
Bos indicus são mais sensíveis às concentrações circulantes de progesterona. Animais
Bos indicus apresentam taxas de prenhez mais altas quando expostos a um ambiente mais
pobre em progesterona antes da ovulação (KRUSE et al., 2013). Em contrapartida as
concentrações de progesterona são bem mais baixas em vacas leiteiras lactantes do que em
vacas leiteiras secas e novilhas leiteiras devido à maior ingestão alimentar, ao maior fluxo
sanguíneo hepático e ao maior catabolismo esteróide (KRUSE et al., 2013).
As concentrações de progesterona não influenciaram o número de ovócitos
recuperados, a qualidade desses ovócitos, sua capacidade de clivagem e desenvolvimento até
o estágio de blastocisto. Porém os embriões em estágio de blastocisto derivados de ovócitos
coletados de vacas com baixas concentrações de progesterona apresentaram desenvolvimento
mais avançado com maior número total de células (KRUSE et al., 2013).
A elevação das concentrações de progesterona e o estímulo subseqüente do
desenvolvimento do concepto no início da gestação podem favorecer o sucesso da prenhez
por melhorar a capacidade do concepto de sinalizar o reconhecimento materno da prenhez
(KRUSE et al,, 2013) . A produção insuficiente de interferon-tau (IFNt) pelo concepto foi
incriminada como o principal fator envolvido na perda embrionária precoce em bovinos
(MANN et al., 1999).
O desenvolvimento embrionário não parece ser devido a efeitos diretos da
progesterona sobre o embrião, mas ao aumento da secreção de vários fatores voltados para o
estímulo do desenvolvimento embrionário (histótrofo) desencadeado pela presença de altas
concentrações de progesterona (SATTERFIELD et al., 2006).
O principal princípio fisiológico da placenta corioalantoideana é a troca substancial
entre os sangues materno e fetal. A substância que nutre o embrião em desenvolvimento é
denominada embriótrofo. A parte do embriótrofo originada pelo sangue materno é o
hemótrofo, enquanto as secreções glandulares uterinas e fragmentos celulares formam o
histótrofo, que nutre a cria antes da implantação (DELLMAN, 2012). O histótrofo uterino é
composto por enzimas, citocinas, fatores de crescimento, íons, hormônios, glicose, frutose,
aminoácidos, proteínas de transporte e moléculas de aderência (KRUSE et al., 2013). A
manipulação das concentrações de progesterona, como no caso da alteração do tamanho e
qualidade do folículo ovulatório e do CL subseqüente, pode afetar diretamente a
probabilidade de sobrevivência do embrião (KRUSE et a.,, 2013).
Ciclos estrais regulares e o estabelecimento de um ambiente uterino propício ao
desenvolvimento do concepto dependem da expressão e localização dos receptores de
progesterona (PGR), estradiol (ESR1) e oxitocina (OXTR) no endométrio. Elevação pré-
25
ovulatória dos níveis de estradiol aumenta a expressão tanto de PGRs quanto de ESR1s no
endométrio, conforme o nível de progesterona aumenta durante a fase lútea subseqüente, a
expressão de ambos os tipos de receptores diminui. O desaparecimento dos PGRs do
endométrio é um evento indispensável para a função uterina adequada durante a gestação,
pois é fundamental para a expressão adequada de diversas proteínas e secreções endometriais
durante a gestação. O desaparecimento dos PGRs é necessário para o aumento da secreção
dos fatores uterinos necessários para o desenvolvimento do concepto, entre eles o histótrofo
(BRIDGES et al., 2013).
Durante o período pré-ovulatório, acredita-se que o estradiol “programe” o útero,
preparando-o para receber o concepto através da modificação da morfologia celular, da
preparação das organelas secretórias e da regulação da quantidade e da localização dos
receptores esteróides sugerindo que a principal vantagem da presença de altas concentrações
pré-ovulatórias de E2 é a alteração do ambiente materno das vacas receptoras (BRIDGES et
al., 2013).
Trabalhos relatados por Bridges et al. (2013) mostraram que as concentrações séricas
de estradiol em doadoras contribuem de forma significante para a probabilidade de
fertilização e que as concentrações de estradiol das receptoras no momento da indução da
ovulação com GnRH é um dos principais fatores de influência sobre a previsão do sucesso da
prenhez aos 27 dias de gestação. Outro trabalho relatado por Bridges et al. (2013) mostra que
o ciprionato de estradiol (ECP) parece aumentar as concentrações de estradiol em vacas
submetidas à indução da ovulação de folículos pequenos, melhorando a funcionalidade
uterina e aumentando as taxas de prenhez. Este autor também relatou baixas taxas de prenhez
aos 30 dias de gestação em vacas de corte com baixas concentrações pré-ovulatórias de
estradiol. Em conjunto, tais estudos demonstraram que a taxa de prenhez é menor em vacas
com baixas concentrações de estradiol antes da ovulação e que a incapacidade o útero de
sustentar o estabelecimento da prenhez é responsável pela queda da fertilidade (BRIDGES et
al., 2013).
Tais resultados citados levaram (BRIDGES et al.,2013) a investigar o efeito da
alteração das concentrações pré-ovulatórias de estradiol sobre o desenvolvimento do concepto
e concluiu que a concentração pré-ovulatória de E2 não afetou o desenvolvimento do
concepto, a produção de IFNT e a expressão de genes estimulados por IFN (ISG), apesar de
altas concentrações pré-ovulatórias de E2 terem levado ao aumento da expressão de ESR1s e
da quantidade de PGRs logo após a ovulação. Indicando que ocorrem disfunções uterinas que
levam à mortalidade embrionária em vacas com baixas concentrações pré-ovulatórias de E2 e
26
que se manifestam entre os dias 15,5 e 30 da gestação. Acredita-se que, na presença de
concentrações pré-ovulatórias inadequadas de E2 apesar da ocorrência de diferenças
marginais nas populações de receptores de esteróides uterinos, o desenvolvimento do
concepto não seja inibido durante o período de reconhecimento materno da prenhez. Portanto,
é provável que os efeitos negativos dos baixos níveis de estradiol sobre a função uterina
ocorram em estágios posteriores à fixação do concepto (BRIDGES et al.,2013).
2.4 Transferência de embrião
Em termos comerciais, a TE em bovinos teve início nos Estados Unidos durante a
década de 1970. Ainda na metade dos 1970 laboratórios desenvolveram métodos de colheita
não cirúrgica, mas apesar disso, a transferência continuava sendo realizada através de
laparotomia do flanco, fato que dinamizou a comercialização de embriões (GONÇALVES et
al.,2008).
A técnica de TE habitualmente utilizada em bovinos está bem definida e consiste na
inovulação de um embrião no trato reprodutivo de uma fêmea receptora, previamente
preparada, que irá completar a gestação (PIERONI, 2009). Gonçalves et a (2008) cita que o
embrião deve ser depositado no corno uterino ipslateral ao corpo lúteo cíclico, não relatando
como na maioria dos autores o local mais ideal do corno uterino a ser inovulado.
Costumeiramente, a maioria dos técnicos deposita o concepto no terço cranial (ápice) do
corno uterino ipslateral ao corpo lúteo (PIERONI, 2009). Pieroni (2009) acrescenta que diante
de tal fato deve considerar a maior dificuldade e demora na inovulação na porção cranial do
corno uterino em relação à deposição na porção caudal (base) o que poderia comprometer a
prenhez devido a liberação de prostaglandina PGF 2α.
A injeção de um análogo de PGF 2α ou a manipulação uterina encurta o intervalo pósparto. A liberação de PGF2α pode ser obtida atravéz da manipulação uterina (WANN E
RANDEL, 1989). Aumento da PGF na luz uterina pode interferir com o desenvolvimento
embrionário e afetam diretamente a qualidade do embrião por reduzir a capacidade embriões
pré-compactados em desenvolver para blastocisto ou desencadear uma luteólise prematura
(SCENNA et al., 2004). A administração de lisinato de ibuprofeno, o que impede a formação
de prostaglandinas pela inibição de ciclo-oxigenase, uma hora antes de transferir resultou num
aumento significante da taxa de implantação e prenhez em novilhas que receberam embriões
congelados e descongelados (ELLI et al., 2001). O mesmo não foi observado por
27
McNaughtan (2004) em que a admnistração de flunixim meglumine não alterou as taxas
globais de prenhez. O que torna esses estudos inconsistentes.
Estabelecimento da prenhez bem sucedida é dependente da presença de um embrião
viável no corno uterino ipsilateral a um corpo lúteo funcional antes do momento de
reconhecimento materno. A colocação do cateter e deposição do embrião, o mais próximo do
ápice possível parece maximizar a taxa de prenhez. No entanto, a colocação do cateter através
do lúmen do colo do útero, dentro do útero, e até o corno uterino pode ser muito desafiador
em alguns animais (MCNAUGHTAN, 2004).
Beal et al. (1998) obteve maiores taxa de prenhez quando os embriões foram
colocados no ápice do corno uterino independentemente de serem colocados no corno
esquerdo ou direito e independentemente da qualidade do embrião.
Weems et al. (1989) indicam claramente que as concentrações de progesterona não são
as mesmas dentro das regiões do corno uterino adjacente ao lado da ovulação, devido a uma
distribuição local de P4 do CL para o ápice do corno uterino ipsilateral. As concentrações de
progesterona foram maiores no tecido uterino da metade cranial do corno uterino até o ovário
adjacente ao CL que na metade caudal do mesmo corno uterino ou no tecido a partir de
qualquer do corno uterino contralateral. A concentração de progesterona não foi diferente nas
metades cranial ou caudal do corno uterino oposto ao ovário com CL (WEEMS et al., 1988).
Com o objetivo de estabelecer uma relação entre as taxas de concepção e as
características morfofuncionais, para indicar o local ideal de inovulação, Pieroni (2009)
avaliou as taxas de concepção após inovulação nos terços cranial, médio e caudal do corno
uterino ipsilateral ao corpo lúteo. Foram ultilizados embriões produzidos in vivo e in vitro e
foi analisada a morfologia dos três segmentos do corno uterino ipslateral e contralateral ao
corpo lúteo. A autora concluiu que embriões produzidos in vivo e in vitro as inovulações nas
porções cranial, média ou caudal do corno uterino ipsilateral ao CL não alteraram as taxas de
concepção das receptoras. Com esse estudo concluiu também que morfologia dos três
segmentos do corno uterino ipsilateral e contralateral ao corpo lúteo de novilhas abatidas
simulando uma receptora de embrião mostraram-se semelhantes à microscopia de luz e à de
varredura eletrônica.
28
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Produção in vitro e transferência de embriões
A produção in vitro seguiu protocolo de rotina do laboratório da empresa.
3.1.1 Propriedade de realização das inovulações
Os dados para esse trabalho foram coletados na Querença Empresa Rural Agricultura e
Pecuária LTDA situada no município de Inhaúma-MG durante o período de dezembro de
2012 a fevereiro de 2013.
Nesse período foram realizadas cerca de 1700 transferências de embriões oriundos de
oócitos aspirados de doadoras de variadas raças, manipulados e fertilizados com sêmen
sexado, em laboratório de produção in vitro (PIV) na própria empresa Querença. Neste
protocolo o laboratório encaminha os embriões frescos ou vitrificados com 7 dias de
maturação, para serem transferidos para as receptoras previamente preparadas.
As receptoras, novilhas mestiças, eram mantidas em regime de pasto de boa qualidade,
com água e sal mineral à vontade e estavam em estavam em condições corporais, sanitárias e
reprodutivas dentro do padrão de normalidade.
3.1.2 Preparo das receptoras
Essas receptoras foram tratadas para TETF através do seguinte protocolo: Inserção de
um implante vaginal CIDR + Benzoato de estradiol i.m, em dia aleatório do ciclo estral (D0);
no D7 foi administrado 2,5ml de Diniprost trometamina (Lutalyse®) i.m; a remoção do
implante foi realizada no D9 juntamente com a administração de 0,3ml de Ciprionato de
estradiol + 1,0ml de eCG (Novormon®) i.m. A TE ocorreu no dia 19 nas novilhas que
apresentaram CL.
3.1.3 Transferência de embriões PIV
Um dia antes da transferência, as receptoras foram examinadas por palpação transretal
para a detecção e classificação do corpo lúteo em I-grande (≥16mm), II- médio (>12 e
29
<16mm) e III- pequeno (≤12mm) ou seja, e respectivamente e em qual ovário se encontrava o
Cl, direito ou esquerdo.
No dia da transferência, nas receptoras que possuíam CL, realizou-se a anestesia
epidural no espaço sacro-coccígeno para relaxamento da região pélvica ultilizando-se 3ml de
cloridrato de lidocaína a 2% . Realizou-se a limpeza da região perineal e o preparo do
aplicador seguindo técnica de rotina.
No momento da inovulação os embriões foram depositados na porção cranial (ápice),
média e caudal (base) do corno ipsilateral a CL e classificados como I(ápice), II (porção
média) e III (base). Os embriões foram inovulados sempre tentando buscar a região mais
cranial procedendo-se a menor manipulação possível. Devido ao diestro os cornos estavam
mais espiralados e, portanto, nos animais mais difíceis de manipular o útero, os embriões
foram inovulados nas porções mais caudais sendo estes dados anotados em planilha própria.
3.1.4 Coleta de dados
No dia das transferências as informações como número da receptora, classificação do
CL, ovário que possuía CL e classificação do local de deposição do embrião eram compiladas
para a planilha de transferência de embriões para logo serem armazenadas no sistema da
empresa se juntando a outros dados como a data da transferência, doadora, sêmen, origem do
embrião (fresco ou vitrificado), receptora, grau de desenvolvimento do embrião, responsável
técnico, local da transferência (central Querença embriões ou cliente externo) e diagnósticos
de gestação. Estes dados foram transferidos para planilha Excel para posterior análise. Foram
computados para análise somente dados referentes a receptoras novilhas.
3.2 Diagnóstico de gestação
Os diagnósticos de gestação das receptoras foram realizados entre o dia 32 a 37 dias
após o procedimento de TE (1° diagnóstico) e a confirmação da gestação entre o dia 60 a 70
dias (sexagem), ambos por exame ultrassonografico. Foram considerados como resultado de
diagnóstico positivo o número de receptoras que obtiveram resultados positivos no 1°
diagnóstico e na sexagem (2º diagnóstico) e como resultado de diagnóstico negativo o número
de receptoras com resultados negativos no 1° diagnóstico. Foi considerada perda gestacional
quando os resultados foram positivos no 1° diagnóstico e negativo na sexagem. A taxa de
30
prenhez foi considerada a porcentagem de animais com o resultado positivo em relação ao
total de animais transferidos.
Foram avaliadas as transferências de 524 novilhas mestiças que foram ultilizadas
como receptoras dos embriões produzidos in vitro sendo que desses 371 oriundos de embriões
frescos e 153 de embriões vitrificados.
Avaliou-se a taxa de prenhez e a relação do número de animais com resultado de
diagnóstico positivo, negativo e morte embrionária nas transferência de embriões frescos e
vitrificados. A taxa de prenhez e número de animais com diagnóstico positivo, negativo e
morte embrionária de embriões frescos e vitrificados com os graus I (grande), II (médio) e III
(pequeno) de CL e local I, II e III de inovulação sendo ápice, porção média e base do corno
uterino respectivamente, foram comparados.
3.3 Análises estatísticas
Foi realizada a estatística descritiva de taxas de prenhez e morte embrionária.
Comparou-se o efeito do tipo de embrião (fresco ou vitrificado), tamanho de corpo lúteo (grau
I,II e III) e local de inovulação do embrião (grau I- apice,II-porção média, ou III- base) sobre
a taxa de prenhez. pelo teste Chi-quadrado com o nível de significância de 5% (Sampaio).
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Transferência de embriões produzidos in vitro
4.1.1 Dados gerais
A TE oferece uma série de vantagens para a seleção zootécnica com conseqüente
reflexo sobre a produção animal, existindo por isso, várias aplicações de importância
zootécnica, biotécnica e comercial. Essa é uma biotécnica de grande potencial para a seleção e
multiplicação de animais geneticamente superiores, por proporcionar um aumento
significativo da relação fêmea/descendente, podendo ser até 8 vezes maior do que a verificada
por meio da reprodução natural (GONÇALVES et al., 2008). Além disso, em casos
desprovidos de deficiência uterina, a transferência de um embrião de boa qualidade de 7 dias
para uma receptora selecionada poderia reduzir as perdas embrionárias, uma vez que a
transferência de embriões evita os problemas relacionados às deficiências de fertilização,
31
viabilidade do ovócito e função da tuba uterina. Infelizmente, perdas consideráveis de prenhez
ainda se verificam em bovinos após a transferência de embriões (BRIDGES et al., 2013).
Foram analisadas 524 transferências de embriões PIV, sendo que 371 oriundos de
embriões frescos e 153 de embriões vitrificados. A taxa de prenhez diferiu entre os grupos de
embriões frescos e vitrificados (p< 0,05) com o resultado de 47,16% (175/371) para embriões
frescos e 35,29% (54/153) para embriões vitrificados (tabela 1). O resultado de mais baixas
taxas de prenhez para embriões vitrificados estão de acordo com os resultados descritos por
Gonçalves et al, (2008) que afirmam que embriões decorrentes de PIV apresentam menor
viabilidade com índices inferiores de gestação depois da transferência comparados aos
produzidos in vivo.
Os embriões produzidos in vitro, quando submetidos ao processo de criopreservação
secretaram menos IFN-τ do que os embriões frescos. Traumatismos provenientes da
criopreservação de embriões comprometem a viabilidade das células trofoblásticas e sua
capacidade de secretar IFN-τ devido aos efeitos osmóticos dos criopretetores durante a
desidratação e reidratação do embrião. Fatores como a menor justaposição das células do
trofoblasto, das células do mesoderma, alterações nas microvilosidades das células
trofoblásticas, diferença na composição da zona pelúcida e alta porcentagem de lipídios nas
células conferem aos embriões de PIV menor resistência ao processo de congelamento. As
lesões provenientes do processo de criopreservação que ocorrem no trofoderma e na massa
celular interna são responsáveis pela diminuição do número de células trofobláticas no
blastocisto congelado. Outro fator é a interferência no DNA devido a fragmentações da
membrana nuclear. Em função disso, ocorre deficiência na expressão do gene que codifica a
produção de IFN-τ (ARAÚJO et al,. 2005).
No total de 253 embriões transferidos com diagnostico inicial de prenhez positivo, ao
diagnostico de confirmação aos 60 dias constatou-se 24 mortes embrionárias, sendo 18 (75%)
resultantes de transferência de embriões frescos e 6 (25%) de embriões vitrificados.
Entretanto, ao se avaliar estas porcentagens deve-se ressaltar que foram transferidos 371
embriòes frescos e 153 embrioes congelados, correspondendo na realidade a 9,3% de perdas
gestacionais nos embriões transferidos frescos e 9,83% em embriões congelados (figura 1).
32
Tabela 1. Taxa de prenhez em transferências de embriões bovino frescos x embriões bovino
vitrificados em receptoras novilhas.
Positivo
Negativo
FIV FRESCO
175 a
178 a
VITRIFICADO
54 b
93 b
(p <0,05)
Figura 1. Taxa de prenhez e de perdas gestacionais de 524 embriões transferidos frescos ou
congelados para receptoras novilhas.
4.1.2 Classificação do Corpo lúteo por tamanho
O tamanho do corpo lúteo (CL) não teve efeito significativo sobre a taxa de prenhez
(p>0,05), tanto em embriões frescos como em vitrificados.
Esses resultados vão de encontro aos achados por Pieroni (2009) em que as taxas de
concepção de 30 e 60 dias, e a perda gestacional não se alteraram em função da qualidade do
CL, que os autores traduzem por tamanho de corpo lúteo. Nota-se (figura 2) que existem
numericamente resultados superiores em relação à taxa de prenhez quando as receptoras
possuíam CL de grau I em relação aos de grau II e grau III com taxa de prenhez de 53,68%,
33
42,42% e 48,44% respectivamente em embriões frescos, porém em embriões congelados
houve resultado numericamente superior quando as receptoras possuíam CL de grau III em
relação aos de grau I e II com taxa de prenhez de 40%, 39,51%, 29.27% respectivamente.
No total de 193 embriões frescos transferidos com o diagnostico inicial de prenhez
positivo ao diagnostico de confirmação com 60 dias. Constatou-se que 18 (9,33%) foram de
mortes embrionárias. Nota-se que numericamente as mortes embrionárias foram menores em
TE com receptoras apresentando CL de grau I (6,42%) em relação às receptoras que
apresentavam grau II (16%) e grau III (8,82%). E em embriões vitrificados em um total de 60
embriões transferidos constatou-se que 6 (10%) foram de mortes embrionárias.
Numericamente houve menos morte embrionária nas receptoras que possuíam CL grau II
(7,69%) em relação as receptoras que possuíam CL grau I (8,57%), porém as receptoras que
possuíram CL grau III tiveram maior mortalidade embrionária. Observa-se que o tamanho do
CL não teve efeito sobre a taxa de concepção e perdas gestacionais tanto em embriões frescos
quanto vitrificados. Estes resultados também não respeitaram qualquer tendência numerica em
relação a efeito do tamanho do CL sobre a taxa de prenhez e perdas gestacionais.
Vasconcelos et al. (2001) cita (PERRY, 2005; E BRIDGES et al., 2010) que concluem
que aumento do diâmetro do folículo ovulatório e das concentrações circulantes de estradiol
antes da ovulação influenciam as concentrações de progesterona no ciclo estral subseqüente o
que também pode contribuir para a sobrevivência do embrião.
Bridges (2007) cita um trabalho de (MUSSARD et al.,2003) com grupos de vacas que
foram induzidas a ovular folículos com dimensões semelhantes após GnRH mas com uma
duração longa (LPE, 2,25 dias) e com duração curta (SPE, 1,25 dias) de proestro. As taxas de
prenhez foram menores nas de período curto de proestro SPE (1/38) em comparação com as
de longo período de proestro LPE (20/40). Os autores concluíram que a fertilidade é afetada
mais pela duração dos estímulos gonadotróficos que o folículo ovulatório recebe durante o
proestro e pela produção de progesterona pelo CL subseqüente do que pelo tamanho absoluto
do folículo ovulatório (BRIDGES, 2007). Bridges (2007) relata outro trabalho em que a
diminuição do intervalo de PGF para GnRH 36-12 h não reduziu o tamanho do folículo
ovulatório, mas resulta em diminuição de estradiol pré-ovulatório, diminuição do número de
células da granulosa do folículo ovulatório, diminuição do número de células grandes lúteas e
concentrações reduzidas de progesterona em circulação no ciclo estral subseqüente.
Bridges, (2007) cita vários autores (SMITH et al., 1994; NISWENDER et al., 1985;
MCCLELLAN et al., 1975; O’SHEA et al., 1986; GAYTAN et al., 1997; MURDOCH AND
VAN KIRK, 1998; MURDOCH AND VAN KIRK, 1998; QUIRK et al., 2004, 2006) que
34
relatam estudos comprovando que após o estro e ovulação, o folículo ovulado sofre
transformações celulares e resultam na formação do CL, que produz progesterona. Após a
ovulação, as pequenas e grandes células derivadas da teca interna e as células da granulosa
respectivamente, se transformam nas células esteroidogênicas do CL. As células grandes CL
produzem 80% da progesterona e considerando que poucas células grandes lútea sofrem
mitose, o número de células da granulosa dentro do folículo ovulatório e o número de células
grandes do CL desenvolvido são semelhantes. O aumento nos níveis de estradiol préovulatório durante proestro aumenta o número de células da granulosa no folículo. As
concentrações elevadas de estradiol durante proestro impedem a apoptose de células da
granulosa através do bloqueio de indução rápida de apoptose e melhora a progressão da célula
através do ciclo celular.
Smith et al. (2012) afirma que é a maturidade do folículo dominante e não o tamanho
do folículo dominante que afeta a taxa de prenhez. Smith et al. (2012) cita trabalhos em que é
relatado que os resultados de taxa de prenhez e morte embrionária tardia são melhores em
folículos pequenos que ovularam espontaneamente do que folículos pequenos estimulados a
ovularem, sugerindo que a redução no estabelecimento e na manutenção da prenhez é devido
a imaturidade fisiológica do folículo ovulatório ao invés do tamanho do folículo. Smith et al.
(2012) afirma que um folículo maduro possui um ovócito competente, secreta quantidades
adequadas de estradiol durante o período pré-ovulatório, e tem a habilidade de formar um CL
capaz de secretar quantidades adequadas de progesterona para o estabelecimento e
manutenção da gestação. Smith et al. (2012) conclui que existem estratégias para aumentar a
maturidade fisiológica do folículo aumentando a estimulação gonadotrópica do folículo
ovulatório durante o período pré-ovulatório, através do aumento da duração do proestro, da
remoção temporária de bezerro, e da estimulação gonadotrópica exógena (eCG)
Bridges et al, (2013) cita que o ECP parece aumentar as concentrações de estradiol em
vacas submetidas à indução da ovulação de folículos pequenos, melhorando a funcionalidade
uterina e aumentando as taxas de prenhez. E juntamente com certa subjetividade na avaliação
do tamanho do corpo lúteo podem ter interferido nos resultados.
35
Tabela 2. . Efeito do tamanho do corpo lúteo da receptora sobre a taxa de prenhez em
transferência de embriões frescos
Positivo
Negativo
Grau I (grande)
102
88
Grau II (médio)
42
57
Grau III (pequeno)
31
33
(p >0,05)
Tabela3. . Efeito do tamanho do corpo lúteo da receptora sobre a taxa de prenhez em
transferência de embriões vitrificados
Positivo
Negativo
Grau I (grande)
32
49
Grau II (médio)
12
29
Grau III (pequeno)
10
15
(p >0,05)
36
Figura 2. Taxa de prenhez e perda gestacional em transferências de embriões frescos x
tamanho de corpo lúteo
.
Figura 3. Taxa de prenhez e perda gestacional em transferências de embriões vitrificados x
tamanho de corpo lúteo
37
4.1.3 Local de inovulação de embriões
O local de inovulação não teve efeito significativo sobre a taxa de prenhez (p>0,05),
tanto em embriões frescos como em vitrificados (tabelas 4 e 5, figuras 4 e 5). Nota-se (Figura
4) que existe numericamente resultados superiores em relação à taxa de prenhez quando as
receptoras foram inovuladas com embriões frescos no ápice (I) em realação as receptoras que
foram inovuladas na porção média (II) e base (III) do corno uterino com 53,49%, 43,55% e
42,86% respectivamente. Em embriões congelados a taxa de prenhez foi numericamente
superior quando as receptoras foram inovuladas na porção média (II) do corno uterino (40%),
em relação as que foram inovuladas no ápice (I) (34,31%) e na base (III) (20%) do corno
uterino (Figura 5).
No total de 193 embriões frescos transferidos com o diagnostico inicial de prenhez
positivo ao diagnostico de confirmação com 60 dias, constatou-se que 18 (9,33%) foram de
mortes embrionárias. Numericamente os embriões transferidos para ápice (I) tiveram maior
taxa de perdas gestacionais (10,86%) em relação aos embriões transferidos para a porção
média (II) e base (III) com 6,89% e nenhuma morte respectivamente (Figura 4). Em um total
de 60 embriões vitrificados transferidos constatou-se que seis (10%).
A taxa de perda
gestacional foi numericamente menor quando as receptoras foram inovuladas no ápice (I) com
7,89% em relação às receptoras que foram inovuladas na porção média (II) e na base (III) com
taxas de mortalidade de 14,28% e nenhuma morte respectivamente (Figura 5). Observa-se que
o local de inovulação não teve efeito sobre a taxa de concepção e perdas gestacionais tanto em
embriões frescos quanto vitrificados.
Esses resultados estão de acordo com (PIERONI, 2009) que com o objetivo de
estabelecer uma relação entre as taxas de concepção e as características morfofuncionais para
indicar o local ideal de inovulação, avaliou as taxas de concepção após inovulação nos terços
cranial, médio e caudal do corno uterino ipsilateral ao corpo lúteo, utilizando embriões
produzidos in vivo e in vitro e analisou a morfologia dos três segmentos do corno uterino
ipslateral e contralateral ao corpo lúteo. A outora concluiu que para embriões produzidos in
vivo e in vitro as inovulações nas porções cranial, média ou caudal do corno uterino ipsilateral
ao CL não alteraram as taxas de concepção das receptoras. E ainda afirmou que a morfologia
dos três segmentos do corno uterino ipsilateral e contralateral ao corpo lúteo de novilhas
abatidas simulando uma receptora de embrião mostraram-se semelhantes à microscopia de luz
e à de varredura eletrônica, quanto a tipos celulares, presença de vasos sanguíneos e diferença
na superfície celular no momento de estro.
38
Weems et al. (1989) indicam claramente que as concentrações de progesterona não são
as mesmas dentro das regiões do corno uterino adjacente ao lado da ovulação, devido a uma
distribuição local de P4 do CL para o ápice do corno uterino ipsilateral. As concentrações de
progesterona foram maiores no tecido uterino da metade cranial do corno uterino até o ovário
adjacente ao CL que na metade caudal do mesmo corno uterino ou no tecido a partir de
qualquer do corno uterino contralateral. Entretanto segundo Weems et al. (1988) a
concentração de progesterona não é diferente nas metades cranial ou caudal do corno uterino
oposto ao ovário com CL (WEEMSet al., 1988). Já Beal et al. (1998) observou taxa de
prenhez maior quando os embriões foram colocados no fundo do corno uterino
independentemente de serem colocados no corno uterino
esquerdo ou direito e
independentemente da qualidade do embrião.
(PIERONI, 2009) cita o trabalho de (MCNAUGHTAN et al., 2002) que vai de
encontro com os resultados alcançados e os trabalhos mais antigos (BRAND& AKABWAI,
1978; CHRISTIE et al., 1980; WEEMS et al., 1988; BEAL et al., 1998). Esses trabalhos
relatam melhores taxas de prenhez quando os embriões foram transferidos para o ápice do
corno uterino. Os autores concluíram que esses resultados estão atribuídos a maior dificuldade
de fatores luteotróficos e antiluteolíticos produzidos pelo embrião alcançarem o ápice do
corno contendo o CL, em conseqüência de mecanismos de contra corrente para o transporte
de PGF2α. Devido a esses relatos provavelmente foram os responsáveis por disseminar a idéia
de que o local ideal para inovulação é a porção cranial do corno uterino ipsilateral ao CL.
Tabela 4. Efeito do local de inovulação sobre a taxa de prenhez em transferência de embriões
frescos
Grau I (ápice)
Grau II (porção média)
Grau III (base)
(p >0,05)
Positivo
Negativo
115
100
54
70
6
8
39
Tabela 5. Efeito do local de inovulação sobre a taxa de prenhez em transferência de embriões
vitrificados
Positivo
Negativo
Grau I (ápice)
35
64
Grau II (porção média)
18
25
1
4
Grau III (base)
(p >0,05)
Figura 4. Taxa de prenhez e perda gestacional em transferências de embriões frescos x local
de inovulação
40
Figura 5. Taxa de prenhez e perda gestacional em transferências de embriões vitrificados x
local de inovulação
5. CONCLUSÃO
O local de inovulação no corno uterino não teve efeito sobre a taxa de prenhez
em bovinos.
O tamanho do corpo lúteo não interferiu sobre a taxa de prenhez em bovinos.
A taxa de prenhez nas transferências em tempo fixo utilizando-se embriões
bovinos frescos foi maior do que com embriões vitrificados.
41
REFERÊNCIAS
ARAÚJO, M. C. C.; VALE FILHO, V. R.; FERREIRA, W. F. et al. Secreção de interferontau em embriões bovinos produzidos in vitro frescos e congelados. Arquivo Brasileiro de
Medicina Veterinária e Zootecnia. V. 57, p. 751-756, 2005.
BARUSELLI, P. S.; MARQUES, M. O.; CARVALHO, N. A. T.; BERBER, R. C. A. et al.
Dinâmica Folicular e taxa de prenhez em novilhas receptoras de embrião ( Bos taurus indicus
x Bos taurus taurus ) tratadas com o protocolo “Ovsynch” para inovulação em tempo fixo.
Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science. V. 40, p.96-106, 2003.
BEAL W.E.; HINSHAW R.H.; WHITMAN S.S. Evaluating embryo freezing method and
the site of embryo deposition on pregnancy rate in bovine embryo transfer.
Theriogenology, v.49, p.241, 1998.
BRIDGES, G. A. Impact of preovulatory estradiol concentrations on mechanisms
affecting fertility in cattle. 2007. Dissertation ( Degree Doctor of Philosophy ) – School of
the Ohio State University, Ohio.
BRIDGES, G. A.; DAY, M. L.; GEARY, T. W. et al. Função Uterina e Manutenção da
Prenhez. XVII CURSO NOVOS ENFOQUES NA PRODUÇÃO E REPRODUÇÃO DE
BOVINOS – 2013, Uberlândia.
B. HAFEZ, E.S.E. HAFEZ. Reprodução animal. 7 ed. Barueri,SP : Manole, 2004
ELLI, M.; GAFFURI, B.; FRIGERIO, A. et al. Effect of a single dose of ibuprofen lysinate
before embryo transfer on pregnancy rates in cows. Journals of Reproduction and Fertility.
V. 121, p. 151-154, 2001
EURELL,J.A.; FRAPPIER,B.L. Histologia veterinária de Dellmann. 6 ed. Barueri,SP:
Manole, 2012
FERREIRA, A.M. Reprodução da fêmea bovina: Fisiologia aplicada e problemas mais
comuns (causas e tratamentos) 1 ed. Juiz de Fora, MG: Edição do Autor, 2010.
GINTHER, O. J. Internal Regulation of Physiological Processes through. Local Venoarterial
Pathways: A Review. Journal of animal science. V. 39, p.550-564, 1974.
GRUNERT, E.; GREGORY, R.M. Diagnóstico e Terapêutica da Infertilidade na
Vaca. 2 ed. Porto Alegre: Sulina, 1989.
GONÇALVES, P.B.D.;FIGUEIREDO, J.R.; FREITAS, V.J.F. Biotécnicas aplicadas à
reprodução animal. 2 ed. São Paulo: Roca, 2008.
42
KRUSE, S. G.; ABREU, F.; CRUPPE, L. H. et al. Progesterona antes da IA (efeito no
ovócito) e após a IA (desenvolvimento do embrião) no sucesso de prenhez. XVII CURSO
NOVOS ENFOQUES NA PRODUÇÃO E REPRODUÇÃO DE BOVINOS – 2013,
Uberlândia.
MANN, G.; LAMMING, G.. The Influence of Progesterone During Early Pregnancy in
Cattle. Reproduction in Domestic Animals. V. 34, p. 269–274, 1999.
MARTINS, C. F. O impacto da transferência de embriões (TE) e da fecundação in vitro (FIV)
na produção de bovinos no Brasil. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, 2010. Disponível em:
<http://www.cpac.embrapa.br/noticias/artigosmidia/publicados/243/>. Acesso em: 15 abr.
2013.
MARTIN, I. Caracterização morfo-funcional do útero de bovinos durante o ciclo estral.
SEMINÁRIO DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA
NÍVEL MESTRADO, 2003, São Paulo. Botucatu: Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia - FMVZ /UNESP, 2003.
MCNAUGHTAN, J. The effect of prostaglandin inhibitor on pregnancy rates of heifer
embryo transfer recipients. 2004. 30f. Thesis (Master of Science) - Brigham Young
University, Department of Plant & Animal Sciences, Utah.
MONTEIRO, C. M. R.; FARIAS, E. C.; PERRI, S. H. V. et al. Estudo das características
histológicas do útero e tubas uterinas de vacas e novilhas da raça Nelore (Bos primigenius
indicus). Brazilian Journ al of Veterinary Research and Animal Science. V. 40, p. 45-54,
2003.
NEVES, J. P.; MIRANDA, K. L.; TORTORELLA, R. D. Progresso científico em
Reprodução na primeira década do século XXI. Revista Brasileira de Zootecnia. v.39,
p.414-421, 2010.
PIERONI, J. S. P. Influência do local de inovulação de embriões produzidos in vivo e in
vitro sobre as taxas de concepção de fêmeas bovinas e sua relação com a morfologia
uterina. 2009. 121f. Dissertação ( Mestrado em Medicina Veterinária ) – Universidade
Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias –
Unesp, Jaboticabal.
SAMPAIO, I.B.M. Estatística aplicada a experimentação animal. 3 ed. Belo Horizonte, MG:
FEPMVZ- Editora, 2010.
SANTOS, J. E. P.; THATCHER, W. W.; CHEBEL, R. C. et al.The effect of embryonic death
rates in cattle on the efficacy of estrus synchronization programs.Journal Animal
Reproduction Science Ed. Elsevier. V.82-83, p.513-535, 2004.
SATTERFIELD, M. C.;BAZER, F. W.; SPENCER, T. E. Progesterone Regulation of
Preimplantation Conceptus Growth and Galectin 15 (LGALS15) in the Ovine Uterus. Biology
of reproduction. V.75, p. 289–296,2006.
43
SCENNA, F. N.; EDWARDS, J. L.; ROHRBACH, N. R. et al. Detrimental effects of
prostaglandin F2 alpha on preimplantation bovine embryos. Journal Prostaglandin &
Other Lipid Mediators Ed. Elsevier. V. 73, p. 215-226, 2004.
SMITH, M.F.; POHLER, K.G.; PERRY, G.A,; ATKINS, J.A.; GEARY, T. Efeito do
diâmetro do folículo ovulatório na concepção e manutenção da gestação. XVI Novos
Enfoques na Produção e Reprodução de Bovinos- 2012- Uberlândia- MG
VASCONCELOS, J. L. M.; SARTORI, R.; OLIVEIRA, H. N. et al. Reduction in size of the
ovulatory follicle reduces subsequent luteal size and pregnancy rate.Theriogenology. v. 56, p.
307-314, 2001.
WANN, R. A.; RANDELE, R. D. Effect of uterine manipulation 35 days after parturition on
plasma concentrations of 13, 14-dihydro-15-keto prostaglandin F2 alpha in multiparous and
primiparous Brahman cows. Journal of animal science. V.68, p.1389-1394, 1990.
WEEMS, C.W.; LEE, C.N.; WEEMS, Y.S.; VINCENT, D.L. Distribution of progesterone
to the uterus and associated vasculature of cattle. Endocrinology Japon, v.35, p. 625630, 1988.
WEEMS, C.W.; WEEMS, Y.S.; LEE, C.N.; VINCENT, D.L. Progesterone in uterine and
arterial tissue and in jugular and uterine venous plasma of sheep. Biology of
reproduction, v.40, p.1-6, 1989.
WILTBANK, M. Uso eficaz de hormônios de reprodução: II. Programas de reprodução.
In: NOVOS ENFOQUES NA PRODUÇÃO E REPRODUÇÃO DE BOVINOS, IV.,
2000, Passos. Anais... Passos: CONAPEC Jr. & CBRA, 2000, p. 71-85.
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Os artigos deverão ser apresentados em Microsoft Word - Office 2003, folha formato A4, fonte
Times New Roman, tamanho 12, espaço entre linhas 1,5, margens de três centímetros, com páginas
numeradas e linhas numeradas (numeração contínua).
Mais informações em:
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Título do artigo
8
Title of the article
9
FulanoSilva1; BeltranoSouza2
10
11
12
1
13
2
14
1.081,
15
[email protected]
Graduando do Curso de Medicina Veterinária da PUC Minas Betim
Professor do Departamento de Medicina Veterinária da PUC Minas, Rua do Rosário
Bairro
Angola,
CEP
32.630-000,
Betim,
Minas
Gerais,
Brasil,
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RESUMO: Texto texto texto texto textotexto textotexto textotexto textotexto textotexto
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textotexto textotexto textotexto textotexto textotexto textotexto textotexto textotexto
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textotexto textotexto textotexto textotexto textotexto textotexto textotextotexto texto,
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Palavras-chave: palavra 1; palavra 2;palavra 3; ...
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ABSTRACT: Text text text text texttext texttext texttext texttext texttext texttext
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texttext texttext texttext texttext texttext texttext texttext texttext texttext texttext
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texttext texttext texttext texttext texttext texttext texttext texttext texttext texttext.
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27
Keywords: word 1; word 2; word 3; …
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INTRODUÇÃO
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Texto texto texto texto texto texto texto texto texto texto texto. Texto texto texto
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texto texto texto texto texto texto texto textotexto texto texto texto texto texto texto
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METODOLOGIA
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RESULTADOS E DISCUSSÃO
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CONCLUSÃO
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REFERÊNCIAS(Mesmo padrão utilizado no texto do TCC)