Padronização de uma técnica molecular para quantificação do vírus

Deusilene Souza Vieira
Padronização de uma técnica molecular para
quantificação do vírus da hepatite C em amostras de
pacientes atendidos no Ambulatório de Hepatites Virais
do Centro de Pesquisa em Medicina Tropical de
Rondônia – CEPEM
Doutorado em Biologia Experimental
Porto Velho - 2010
UNIR - UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA
IPEPATRO – INSTITUTO DE PESQUISAS EM PATOLOGIAS TROPICAIS
CEPEM – CENTRO DE PESQUISA EM MEDICINA TROPICAL DE RONDÔNIA
Padronização de uma técnica molecular para
quantificação do vírus da hepatite C em amostras de
pacientes atendidos no Ambulatório de Hepatites Virais
do Centro de Pesquisa em Medicina Tropical de
Rondônia – CEPEM
Deusilene Souza Vieira
Tese apresentada ao Programa de Pósgraduação em Biologia Experimental
como requisito para obtenção do título de
Doutor em Ciências.
Área do Conhecimento: Hepatites Virais
Orientador: Dr. Juan Miguel Villalobos Salcedo
Co-orientadora: Dra. Glaucia Paranhos Baccalà
Co-orientador: Dr. Eduardo Resende Honda
Porto Velho - 2010
“O nosso valor está intimamente ligado ao que de bom e de bem proporcionamos
a humanidade.” Marco
Dedico a todos que passaram pela minha vida e contribuíram de forma direta e
indireta para meu desenvolvimento pessoal e profissional, especialmente minha
mãe Simíria Marques Vieira.
Ao meu esposo Marco Dall’Acqua, amigo e companheiro. Agradeço
pelo amor, carinho, estímulo e incansável ajuda e apoio que dedica a mim.
A minhas irmãs, Leny e Dulce e ao meu cunhado Carlos Augusto
pelo incentivo e força.
A Ondina Terezinha Mateus que sempre está comigo, principalmente
nos meus momentos mais difíceis, e com sua sabedoria de vida mostrou-me que
o amanhã sempre será melhor, só depende de nós.
A Andrea, Adriane, Robson, Samara, Ana Camila, Giovana, Glenda
e Rômulo pela alegria que compartilharmos e por me disponibilizarem um
ambiente estimulante e agradável em família.
Ao meu Amigo e irmão, Eduardo Honda, que me ensinou os primeiros
passos para a biotecnologia aplicada, sendo importante para o desenvolvimento
da minha experiência científica, além de sempre esta comigo em todos os
momentos. Obrigada pela oportunidade, confiança e apoio.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Ao Professor Dr. Luiz Hildebrando Pereira da Silva, pela oportunidade,
incentivo e confiança que foram imprescindíveis para meu crescimento
profissional.
Ao Dr. Juan Miguel Villalobo Salcedo, pela orientação, profissionalismo e
carinho, dedicado ao desenvolvimento e conclusão deste trabalho que muito
contribuiu para minha formação.
A Dra. Glaucia Paranhos Baccalà, minha co-orientadora e colaboradora deste
trabalho. Que me recebeu em seu Laboratório em Lyon-França, dando valiosos
ensinamentos e suporte necessário para novos conhecimentos.
A equipe do Laboratório Plataforma Técnica, Alcione, Quéssia, Carina, Luan,
Mayara, Rudson, Leandro e Fábio, pela amizade, incentivo e apoio nas
discussões
sobre resultados
obtidos
e perspectivas futuras
contribuíram para o desenvolvimento deste trabalho.
que muito
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus.
A Professora Dra. Vera Engracia, pela seriedade na coordenação do Mestrado e
Doutorado em Biologia Experimental da UNIR.
Ao Diretor Científico Dr. Rodrigo Guerino Stábeli, pelas oportunidades
concedidas.
Ao Diretor do CEPEM Dr. Mauro Shugiro Tada, pela credibilidade concedida.
A todos os amigos e colegas do CEPEM e IPEPATRO, que contribuíram
diretamente ou indiretamente para o desenvolvimento deste trabalho.
Aos médicos e toda equipe técnica do Ambulatório de Hepatites Virais do
CEPEM que colaboraram com desenvolvimento deste trabalho.
A Dr. Edson Rondinelli e toda sua equipe do Laboratório de Metabolismo
Macromolecular Firmino Torres de Castro da UFRJ que contribuíram para
comparação dos resultados obtidos, solidificando este trabalho.
A Dr. Marco Aurélio Krieger e toda sua equipe que contribuíram para os
primeiros ensinamentos sobre PCR em tempo real.
A Dr. Paulo Eduardo M. Ribolla e toda sua equipe pelo apoio e ensinamento
concedido.
A todos, que contribuíram de forma direta ou indiretamente para a realização
deste trabalho, o meu mais profundo agradecimento.
RESUMO
O vírus da hepatite C (VHC) atualmente é considerado um problema de saúde
pública mundial. Devido às limitações dos testes sorológicos, para confirmar o
estado do portador de VHC é feito o diagnóstico molecular para detecção direta
do RNA viral considerada uma ferramenta essencial. A metodologia de PCR em
tempo real é um teste molecular que permite a detecção do produto à medida que
vai sendo formado, permitindo a resolução de uma ampla faixa de carga viral,
mostrando ser uma alternativa para a detecção e quantificação do RNA do VHC.
Neste trabalho padronizamos um método para identificar, quantificar e genotipar o
vírus da hepatite C em amostras de soro de pacientes atendidos no ambulatório
de hepatites virais do Centro de Pesquisa em Medicina Tropical de RO – CEPEM.
Foram analisadas 100 amostras de soro de pacientes com hepatite C crônica,
com confirmação clínica e laboratorial. A obtenção do RNA foi feita através do kit
QIAamp® viral RNA, seguida de transcrição reversa. A PCR em tempo real foi
utilizada de forma qualitativa e quantitativa. A quantificação foi feita através da
produção de transcrito para geração de uma curva padrão externa. Os resultados
referentes à padronização do processo de extração e RT foram observados na
PCR em tempo real de acordo com ciclo de amplificação (Ct), utilizando a
plataforma ABI 7500 SDS®. Para a quantificação do RNA do VHC foram
produzidos transcritos quantificados por espectofotometria, caracterizados como
transcrito RO (TRO) e transcrito controle positivo (TCont+), respectivamente. Os
cDNAs do transcrito diluído seriadamente foram amplificados por PCR em tempo
real utilizou uma curva de sete pontos (sete diluições) para o transcrito TRO, uma
curva de seis pontos (seis diluições) e uma curva de seis pontos (seis diluições)
para o kit comercial. A reprodutibilidade dos testes foi observada através do
coeficiente de variação (CV) produzido por cada diluição analisada, enquanto que
a especificidade dos testes pela não obtenção de sinal em nenhum dos controles
negativos adicionados em cada corrida. Não houve diferença significativa entre as
médias do coeficiente de variação (CV) de cada transcrito com p = 0,107. Na
comparação dos testes encontrou-se um coeficiente de correlação semelhantes
com r2 = 0,96 para TRO, TCont+ com r2 = 0,98 e o kit comercial (Acrometrix) r2 =
0,99, obtidos da curva linear de regressão que foi usada para correlacionar o
número de cópias/µL ou UI/ µL x Ct. Sondas foram utilizadas para caracterização
dos genótipos, sendo que a melhor eficiência de detecção foi para o genótipo 1. O
método utilizado neste estudo para os processos de detecção, quantificação e
genotipagem apresentou um custo final de aproximadamente R$ 100,00. Este
custo é praticamente cinco vezes menor do que os valores praticados tanto nos
laboratórios particulares quanto o valor pago pelo Sistema Único de Saúde (SUS).
A metodologia molecular aplicada neste estudo englobou características positivas,
permitindo detectar, quantificar e genotipar o VHC. Considerando que a
prevalência do VHC na região norte é de 0,62%, sendo o Estado de Rondônia o
segundo maior em casos positivos, a implantação desses testes atenderia a
demanda de Rondônia e Estados vizinhos reunindo características moleculares
essenciais, com custo mais acessível, liberação do resultado em um menor tempo
e a orientação terapêutica a ser instituída.
ABSTRACT
The hepatitis C virus (HCV) is considered a public health problem worldwide. Due
to the limitations of serological tests to confirm the carrier state of HCV is made
molecular diagnosis for direct detection of viral RNA considered an essential tool.
The methodology of real-time PCR is a molecular test that allows detection of the
product as it is being formed, permitting the resolution of a wide range of viral load,
which is considered an alternative for the detection and quantification of HCV
RNA. In this work we standardized a method to identify, quantify and genotype the
hepatitis C virus in serum samples of patients of the viral hepatitis clinic of the
Center for Research in Tropical Medicine RO - CEPEM. We analyzed 100 serum
samples from patients with chronic hepatitis C with clinical and laboratory
confirmation. Obtaining RNA was performed using the kit QIAamp ® viral RNA,
followed by reverse transcription. The real-time PCR was used to qualitatively and
quantitatively. The quantification was done through the production of transcript to
generate an external standard curve. The results concerning the standardization of
the process of extraction and RT were observed in real-time PCR according to the
amplification cycle (Ct) using the ABI 7500 SDS platform ®. For the quantification
of HCV RNA transcripts produced were quantified by spectrophotometry,
characterized as transcribed RO (TRO) and transcribed positive control (TCont +),
respectively. The cDNAs were serially diluted transcript amplified by real-time PCR
used a curve of seven points (seven dilutions) for the transcript TRO, a curve of
six points (six levels) and a curve of six points (six dilutions) for the kit commercial.
The reproducibility of results was observed through a coefficient of variation (CV),
produced by each dilution tested, whereas the specificity of the tests by not getting
the signal in any of the negative controls added in each race. There was no
significant difference between the average coefficient of variation (CV) of each
transcript with p = 0.107. In comparison tests found a similar correlation coefficient
r2 = 0.96 for TRO, TCont + r2 = 0.98 and a commercial kit (AcroMetrix) r2 = 0.99,
obtained from the linear regression curve that was used to correlate the number of
copies / mL or IU / mL x Ct. Probes were used for characterization of genotypes,
and the better efficiency of detection was for genotype 1. The method used in this
study for the processes of detection, quantification and genotyping presented a
final cost of approximately $ 100.00. This cost is almost five times lower than
those charged in both the private laboratories and the amount paid by the Unified
Health System (SUS). The molecular approach applied in this study included
positive characteristics, to detect, quantify and genotype HCV. Whereas the
prevalence of HCV in the northern region is 0.62%, and the state of Rondonia in
the second largest positive cases, the implementation of these tests would meet
the demand of Rondonia and the neighboring states together essential molecular
characteristics, with more affordable, release of results in a shorter time and
favoring the guide treatment to be instituted.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Estrutura do vírus da hepatite
4
Figura 2A: Organização do genoma do VHC
4
Figura 2B: Topologia das proteínas do VHC
5
Figura 3: Ciclo do VHC
10
Figura 4: Árvore filogenética da região NS5 do HCV
11
Figura 5: Distribuição dos genótipos do VHC no mundo
13
Figura 6: Distribuição dos genótipos do VHC no Brasil.
14
Figura 7: Resultado do PCR em tempo real
24
Figura 8: Real time sistema TaqMan
25
Figura 9: Vetor pTZ57R/T utilizado para produção da curva padrão
45
Figura 10: Alinhamento realizado no BLAST com “primer” VHC F
52
Figura 11: Alinhamento realizado no BLAST com “primer” VHC R
53
Figura 12: PCR em tempo real utilizando o sistema SYBR
55
Figura 13a: Amostras de VHC amplificadas por SYBR Green
56
Figura 13b: Dissociação das amostras de VHC amplificadas
57
Figura 14: Gradiente de temperatura dos “primers” VHC F e VHC R
58
Figura 15: “amplicons” da RT-PCR
58
Figura 16: Digestão enzimática com Bam HI e Eco RI
59
Figura 17: Digestão enzimática do plasmideo controle
59
Figura 18: plasmídeo pTZ Linearizado
60
Figura 19: plasmídeo controle Linearizado
60
Figura 20: Transcrito do RNA de VHC
61
Figura 21: Regressão linear da curva padrão para o transcrito TRO
64
Figura 22: Regressão linear da curva padrão para o controle positivo
64
Figura 23: Regressão linear da curva padrão para o kit de quantificação
65
Figura 24: Amostras amplificadas juntamente com os controles
66
Figura 25: PCR em tempo real utilizando o sistema TaqMan
67
Figura 26a: Amostras de VHC amplificadas caracterizando o genótipo 1
69
Figura 26b: Amostras de VHC amplificadas caracterizando o genótipo 2
70
Figura 26c: Amostras de VHC amplificadas caracterizando o genótipo 3
71
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Seqüência dos “primers” e sondas do VHC
40
Tabela 2: Ct de amplificação
40
Tabela 3: Valores dos Cts de amplificação das amostras
56
Tabela 4: Diluição seriada dos transcritos de VHC
62
Tabela 5: Avaliação da reprodutibilidade da curva padrão
63
Tabela 6: Média do Coeficiente de Variação
64
Tabela 7: Quantificação do transcrito TRO, TCont+ e o kit comercial
65
Tabela 8: Valores dos Cts para as concentrações de “primers” e sonda
68
LISTA DE ABREVIATURAS
AIDS – Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
ARFP – Proteína alternativa de leitura
AVE – Tampão de eluição
AVL – Tampão de lise
AW1 – Tampão de lavagem 1
AW2 – Tampão de lavagem 2
C - Proteína do core ou nucleocapsídio
c100-3 – Antígeno derivado da região NS4 do vírus
c22-3 - Antígeno região capsídeo ou core
c33c – Antígeno da região não NS3
CD81 – Célula de defesa 81
CDC – Centro de Controle de Doenças
cDNA – DNA complementar
CEPEM – Centro de Pesquisa em Medicina Tropical de Rondônia
CGLAB – Coordenação Geral de Laboratórios de Saúde Pública do Brasil
CPMP -
Comite
europeu
para propriedades
de produtos
bDNA - branched DNA
Ct – Ciclo de amplificação
DEIA - DNA enzima imunoensaio
DNA – Acido desoxirribonucleico
dNTPs – Desoxinucleotídeos
E1 – Envelope 1
E2 – Envelope 2
eIF - Fator de iniciação eucarioto
ELISA – Ensaio imunoenzimático
F - “Frameshift”
FRET - Transferência de energia da ressonante da fluorescência
HIV – Vírus da Imunodeficiência
HVR1 - Região hipervariável 1
HVR2 - Região hipervariável 2
IB - Técnica de immunoblot
medicinais
IFN – Interferon
IFN-α – Interferon alfa
IL-2 – Interleucina 2
INF-PEG - Interferon Peguilato
IRES - Sítio interno de entrada do ribossomo
ISDR - Região determinante da sensibilidade ao interferon
LDL - Lipoproteína de baixa densidade
log – logaritimo
Min – Minuto
mL – Mililitro
MS - Ministério da Saúde
NANB - Hepatite não-A e não-B
NAT – Teste de ácido nucléico
NCR - Região não-codificadora
NIH - Instituto Nacional de Saúde dos Estados Unidos
NS - Não-estrutural
NS2 – Proteína não estrutural 2
NS3 – Proteína não estrutural 3
NS4 - Proteína não estrutural 4
NS5 - Proteína não estrutural 5
ORF – Cadeia aberta de leitura
p21 - Polipeptídeo
p7 – Proteína 7
QG – Tampão de Solubilização
RE - Retículo endoplasmático
RFLP - Polimorfismo de tamanho de fragmento de restrição
RNA – Ácido ribonucléico
RO - Rondônia
RPM – Rotação por minuto
RpRd - RNA-polimerase RNA-dependente
RT-PCR - Transcrição Reversa – Reação em Cadeia da Polimerase
SINAM - Sistema de Informação Nacional de Agravo de Notificação
SR-BI - Receptores escavanger, classe B tipo I (SR-BI)
TCLE - Termo de consentimento livre esclarecido
Th1 – Linfócito T auxiliar 1
Tm - Temperatura de “melting”
TMA – Amplificação mediada por transcrição
UI – Unidade Internacional
VHA - Vírus da hepatite A
VHB - Vírus da hepatite B
VHC - Vírus da hepatite C
VHC F – Primer vírus da Hepatite C sense
VHC R - Primer víirus da Hepatite C anti-sense
VLDL – Lipoproteínas muito baixa densidade
ε - Cálculo da eficiência da amplificação,
µL – Microlitro
1. INTRODUÇÃO
1.1 - Aspectos Gerais e Históricos do Vírus da Hepatite C
As hepatites causadas pelos vírus hepatotrópicos apresentam grande
importância devido sua abrangência mundial. Estes vírus apresentam uma
característica
em
comum,
o
tropismo
pelos
hepatócitos,
porém
com
características biológicas diversas (Focaccia, 2007). Em 1970, testes sorológicos
utilizados para investigações do vírus da hepatite A (VHA) e B (VHB), revelaram
que 25% dos casos de hepatite, associados à transfusão sanguínea, estavam
relacionados com o VHB. Os casos remanescentes 75% foram considerados
como hepatite não-A e não-B (NANB), sugerindo a existência de um terceiro vírus
(Focaccia, 2007).
Em 1989, Choo e colaboradores obtiveram um clone de cDNA a partir de
um paciente com hepatite NANB, denominado vírus da hepatite C (VHC). Foi o
primeiro vírus a ser descoberto por técnicas exclusivamente moleculares, constitui
um marco na história da virologia. A metodologia de identificação iniciou-se com a
extração do RNA viral, seguida de transcrição reversa e clonagem do ácido
nucléico e expressão do antígeno viral in vitro, tornando-se fundamento dos
ensaios de triagem do VHC. A partir desta descoberta, foram desenvolvidos os
primeiros testes capazes de detectar anticorpo contra o VHC (Choo et.al., 1989;
Donahue et.al., 1992).
Kuo e colaboradores (1989) desenvolveram um teste imunoenzimático para
detecção do causador da hepatite NANB, pelo método ELISA (Enzyme-linked
immunosorbent assay). O Instituto Nacional de Saúde dos Estados Unidos (NIH)
utilizou este teste para diagnosticar casos de icterícia aguda pós-transfusional e
identificou cerca de 70 a 90% de positividade para hepatite NANB (Kuo
et.al.,1989; Levi et.al., 2002).
O cultivo do VHC só tornou-se possível recentemente, e apenas para um
genoma único (JFH1), obtido de um paciente com hepatite aguda fulminante no
Japão (Kato et.al., 2001). A maior parte do conhecimento sobre o VHC é
proveniente de sistemas replicativos in vitro (replicons), capazes de proporcionar
a replicação genômica, sub-genômica e expressão protéica (Bartenschlage et.al.,
2003). Desde então, o foco das pesquisas das áreas básicas e clínicas tem sido
entender
melhor
a
biologia
do
VHC
com
diferentes
objetivos,
como
desenvolvimento de testes diagnósticos de grande sensibilidade e especificidade,
maior conhecimento dos mecanismos patogenéticos, melhor caracterização da
historia natural do VHC e melhorar a eficiência dos tratamentos (Tellinghuisen
et.al., 2004).
Atualmente o VHC é considerado um problema de saúde pública mundial.
Um dos fatores é a sua alta prevalência, estima-se que aproximadamente, 170
milhões de pessoas estejam infectadas, ou seja, 3% da população global. Outro
fator esta relacionado com elevado grau de cronificação, podendo evoluir para
cirrose hepática e carcinoma hepatocelular (Alter et.al., 2000; McHutchison,
2004).
A infecção aguda causada pelo VHC é na maioria dos casos, benigna e
assintomática dificultando, assim, o seu diagnóstico. Entretanto, cerca de 80%
destes evoluem para a infecção crônica, podendo progredir ao estágio de cirrose,
doença hepática terminal e até para carcinoma hepatocelular (Corbet et.al., 2003;
Cantaloube et.al., 2005). Existem vários estudos sugerindo os possíveis fatores
que parecem influenciar a evolução da hepatite crônica, podendo ser de caráter
viral, relacionado ao hospedeiro e ambiental. Dentre dos fatores virais, incluem
carga viral, genótipo do VHC e multiplicidade de quasiespécies. Os fatores
relacionados ao hospedeiro incluem: idade, quando ocorreu a infecção, duração
da infecção, sexo, deficiência imune, susceptibilidade genética, co-infecção com
outros vírus, co-morbidade com hemocromatose, sobrecarga de ferro ou
obesidade. Fatores ambientais incluem alcoolismo crônico, dieta, cigarro,
medicamentos, hepatotoxinas e contaminantes ambientais (Martinot-Peignoux
et.al., 2000; e Di Biceglie, 2000).
1.2 – Genoma do VHC
O VHC pertence à Família Flaviviridae, gênero Hepacivírus apresentando
uma única fita de ácido ribonucléico (RNA) com polaridade positiva, medindo
50nm de diâmetro. A partícula viral é composta por um envoltório derivado da
membrana celular hospedeira contendo as glicoproteínas virais E1 e E2 inseridas.
O nucleocapsídeo é formado pela proteína C (Core) e envolve o RNA viral (Figura
1) (Thomsom et.al., 2005; Murphy et.al., 2007).
Cor
Glicoproteínas de E1
RNA
Viral
Figura 1: Estrutura do vírus da hepatite C. Fonte: James, 2001, modificada.
O genoma do VHC possui cerca de 9600 nucleotídeos, apresentando duas
regiões não-codificadores em suas extremidades 5` NCR e 3` NCR (Simmonds,
2004; Arumugaswami et.al., 2008). A região codificadora contém uma única fase
de leitura aberta (ORF – “open reading frame”) que codifica para uma poliproteína
com aproximadamente 3000 aminoácidos (dependendo do genótipo), que sob
ação autoproteolítica e proteolítica da célula hospedeira (hepatócito) origina
proteínas estruturais (C, E1, E2) e não-estruturais (p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B,
NS5A, NS5B) (Figura 2A) (Penin et.al., 2004; Moradpour et.al., 2007; Drexler
et.al., 2009). As proteínas estruturais e o polipetídeo p7 são processados pelo
retículo endoplasmático (RE) através de peptidases, enquanto que as proteínas
não estruturais são processadas por duas proteases virais: protease NS2-3 e a
protease serina NS3-4 (Figura 2B) (Moradpour et.al., 2007).
Figura 2A: Organização do genoma do VHC. Fonte: Moradpour et.al., 2007,
modificada.
B
Figura 2B: Topologia das proteínas do VHC associada à membrana celular. Fonte:
Moradpour et.al., 2007, modificada.
Estudos recentes relatam a existência de uma proteína adicional designada
ARFP (“alternative reading frame protein”) ou F (“Frameshift”). Esta proteína é
produzida a partir de uma fase de leitura alternativa (-2/+1) encontrada na porção
terminal da região codificante da proteína do core (ainda não está confirmada a
sua expressão na infecção natural pelo vírus C) (Branch et.al., 2005; McMullan
et.al., 2007).
O genoma do VHC possui duas regiões não codificadoras (NCR): a região
5` NCR é composta por 341 nucleotídeos, sendo cerca de 100 nucleotídeos maior
que a dos outros Flavivírus. Esta região é a mais conservada entre os diferentes
isolados do VHC, em comparação as outras regiões codificadoras (Simmonds,
2004). A região 5` NCR é composta de 4 domínios, I a IV. Os domínios II, III e IV
junto com os primeiros 24-40 nucleotídeos da região do core constituem o sítio
interno de entrada do ribossomo (IRES). A tradução da poliproteína do VHC
inicialmente ocorre através da formação de um complexo binário entre o IRES e a
subunidade 40S do ribossomo e a iniciação da tradução de uma forma cap
(proteína ativadora do catabolismo) – independente do RNA viral (Spahn et.al.,
2001). O complexo IRES-40S recruta o fator de iniciação eucarioto (eIF) 3 e o
complexo Met-tRNA-eIF 2 GTP para a associação com subunidades 60S
formando o complexo ativo 80S (Otto and Puglisi., 2004).
A região 3`NCR é formada por uma seqüência de nucleotídeos variável,
seguido por região poli U e uma seqüência de 98 nucleotídeos bem conservada,
denominada região X, importante para a replicação e infecciosidade do VHC
(Tanaka et.al., 1996; Imbert et.al., 2004). Ambas as regiões são altamente
conservadas e essenciais para a tradução protéica e para a replicação do
genoma viral (Tanaka et.al., 1996).
1.2.1 – Proteínas Virais Estruturais
As proteínas estruturais do VHC derivam do segmento N-terminal da
poliproteína, formando a proteína do core e as proteínas E1 e E2 que se destinam
ao envoltório viral (Marapdour et.al., 2007).
A proteína do core (C) ou nucleocapsídio é a primeira proteína estrutural
codificada pela ORF do VHC. Quando clivada da poliproteína por proteases
celulares forma um polipeptídeo denominado, p21. Clivagens secundárias
originam proteínas menores (p19 e p16), sendo encontrada nas membranas do
retículo endoplasmático (RE) e na sua superfície por possuir resíduos de lipídios.
Existem evidências de que a interação da proteína do C com os resíduos de
lipídios pode afetar o metabolismo destes, contribuindo para o desenvolvimento
da esteatose hepática, descrita principalmente em pacientes infectados com o
genótipo 3 (Asselah et.al., 2006). Este proteína tem papel na formação do
nucleocapsídeo, na modulação do gene da transcrição, na proliferação celular,
morte celular e nos mecanismos de sinalização celular (Penin et al., 2004).
As glicoproteínas do envelope E1 (gp35) e E2 (gp70) são liberadas da
poliproteína precursora, por peptidases celulares e tem características de
glicoproteínas transmembrânicas do tipo I (Deleersnyder et.al., 1997; Op De
Beeck et.al., 2004). Existem evidências de que as glicoproteínas são essenciais
para entrada da partícula viral na célula hospedeira, pela ligação com o receptor
celular CD81, encontrado em membranas de linfócitos e hepatócitos e indução da
fusão com a membrana celular (Bartosh et.al., 2003).
A glicoproteína E2 pode ser encontrada junto a uma pequena proteína de
membrana, conhecida como p7. A clivagem da p7 ainda não esta bem definida,
mais existem relatos sugerindo que sua origem pode ser derivada de uma
clivagem ineficiente da E2 (Mizushima et.,al., 1994). A função das diferentes
formas E2, E2/p7 e p7 ainda não está clara, entretanto, acredita-se que estejam
envolvidas na infectividade do vírus (Sakai et.al., 2003).
A E2 possui, na sua porção amino, uma região de 34 aminoácidos que
apresenta a maior variabilidade dentro do genoma, denominada região
hipervariável 1 (HVR1), sendo que estes aminoácidos podem diferir entre si em
mais de 80% nos diferentes genótipos do VHC e entre os subtipos do mesmo
genótipo (Griffin et.al., 2003; Sakai et.al., 2003). Esta região parece desempenhar
um importante papel na determinação do curso evolutivo da doença. Alguns
casos que se resolvem na fase aguda apresentam menor variabilidade nesta
região, conforme relatados em pesquisas comparando pacientes de fase aguda
que curaram, com aqueles que evoluíram para a fase crônica da doença.
Acredita-se que esse resultado possa estar relacionado com a maior pressão
imunológica, não permitindo o aparecimento de variantes virais capazes de
escapar em caso de uma resposta imunológica ineficiente, fato que poderia levar
a uma infecção crônica (Farci et.al., 2000). Uma região hipervariável 2 (HVR2) já
foi descrita, mas sua importância ainda permanece um enigma (Kato et.al., 1992).
1.2.2 – Proteínas Virais Não-Estruturais
As proteínas não estruturais são traduzidas a partir do códon 810 e
compreendem várias proteínas: p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B, com
diversas atividades enzimáticas (Penin et.al., 2004).
A p7 é uma proteína hidrofóbica pequena composta por 63 aminoácidos, e
está envolvida na permeabilidade de membrana funcionando como um canal
iônico (Pavilovic et.al., 2003).
A proteína não estrutural 2 (NS2) possui como única função conhecida, a
mediação de sua própria clivagem em “cis” da proteína NS3 e parece ser uma
metaloprotease, uma vez que é estimulada por zinco e inibida por EDTA (Yamaga
et.al., 2002).
A proteína não estrutural 3 (NS3) é multifuncional com atividade de
serinoprotease na região amino terminal e atividades nucleotidase (NTPase) e
helicase, na extremidade carboxila (Hijikata et.al.,1991; Suzich et.al., 1993).
Estudos de transcrição e tradução “in vitro” demonstraram que a extremidade
amino apresenta atividade serino-protease e quando associada a NS4A (cofator)
promove a clivagem dos sítios NS4A/4B, NS4B/5A e NS5A/5B da poliproteína
viral (De Francesco et.al., 2000). A extremidade carboxila apresenta as atividades
RNA helicases e NTPase. A função de helicase ainda não é totalmente
conhecida, mas parece estar envolvida na iniciação da replicação do RNA viral
(Pang et.al., 2002; Frick et.al., 2004). Estudos demonstram a capacidade da NS3
em interagir com componentes celulares (a proteína quinase A e C, a p53 e as
histonas H2B e H4) (Tellinghuisen et.al., 2002). Outros estudos referentes à NS3
mencionam sua capacidade de induzir a transformação celular e oncogênese em
cultura de células (Wolk et.al., 2000).
A proteína não estrutural 4 (NS4) codifica duas proteínas NS4A e NS4B. A
NS4 tem função de cofator para NS3 e também participa na hiperfosforilação da
NS5A. O papel de NS4B é uma proteína de membrana de 27KDa que tem papel
na alteração da membrana e na formação do complexo de replicação do VHC
(Gosert et.al.,2003). Estudos recentes demonstraram que a NS4B organiza o
denominado complexo de replicação que promove estabilidade das proteínas do
VHC (estruturais e não-estruturais) e do RNA durante a replicação viral (Egger
et.al.,2002; Einav et.al., 2004).
A proteína não estrutural 5 (NS5) codifica duas proteínas a NS5A e NS5B.
A NS5A é uma proteína fosforilada em resíduos de serina, que pode ser
hiperfosforilada na presença de NS4A, e recentemente foi demonstrado que a
fosforilação modula a eficiência da replicação do RNA do VHC (Evans et.al.,
2004). Vários estudos evidenciam que a proteína NS5A esteja envolvida
diretamente e/ou por interação com proteínas celulares, no processo de
replicação viral (Blight et.al.,2000; Bartenshlager R, 2002). Outras funções são
atribuídas à proteína NS5A, incluindo a ativação da transcrição, regulação da
proliferação celular e a participação nos mecanismos de sinalização celular.
Entretanto, seu papel na patogênese da hepatite C permanece desconhecido
(Tellinghuisen et.al., 2002; Dimitrova et.al., 2003). Outro papel atribuído a proteína
NS5A do VHC está relacionado com a modulação da resposta ao interferon tem
sido objetivo de diversos estudos. Em 1995, Enomoto e colaboradores
identificaram em pacientes japoneses infectados com o genótipo 1b e não
respondedores ao interferon, uma seqüência conservada de 40 aminoácidos na
região carboxi-terminal da proteína NS5A. Por outro lado, pacientes que
responderam a terapia apresentaram mutações nesta região, que passou a ser
designada como região determinante da sensibilidade ao interferon (ISDR)
(Enomoto et.al., 1996). A proteína NS5A interage com a PKR tornando-a inativa, o
que poderia explicar a resistência do VHC a terapia com interferon (Gale et.al.,
1998).
A proteína NS5B é uma RNA-polimerase RNA-dependente (RpRd)
responsável pela replicação viral. Esta região possui uma seqüência GDD
característico de uma RNA replicase, presente em diferentes vírus de RNA
(Hijikata et.al.,1993). Estudos mostram que esta enzima pode se tornar o principal
alvo para intervenção antiviral (Maradpour et.al., 2007).
1.3 – Ciclo Celular
Ainda que não determinado ao certo o mecanismo da entrada da partícula
viral na célula do hospedeiro, recentes estudos demonstram que é um processo
complexo que envolve diferentes passos. Os hepatócitos são o principal alvo, mas
outras células como células B, células dendríticas podem ser infectadas (Flint
et.al., 2001). Recentemente, manipulações genéticas do virions de RNA tem
resultado em altos níveis de replicação em linhagens de células derivadas dos
hepatócitos, melhorando a compreensão para o estudo RNA viral e síntese de
proteínas virais do HCV (Blight et.al., 2000) Um dos principais receptores descrito
é CD81 que provavelmente se liga com a glicoproteína E2 (Pileri et.al., 1998) ,
uma proteína encontrada na superfície de diferentes tipos de células como
hepatócitos, receptores escavanger, classe B tipo I (SR-BI) (Scarselli et.al., 2002)
e mais recentemente “claudin-I” (Evans et.al.,2004).
O VHC circula de várias formas nas células infectadas do hospedeiro e
pode estar associado também com lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e de
muito baixa densidade (VLDL). Ambas representam a fração que circula como
viríons ligados as imunoglobulinas ou como viríons livres (Andre et.al.,2005).
Através destes, os vírus se ligam nas superfícies das células do hospedeiro e a
sua entrada pode envolver diferentes tipos de receptores. Uma delas, claudin-I,
tem como função em estágios mais avançados da entrada na célula como ligação
nos hepatócitos polarizados (Evans et.al.,2007). O vírus entra na célula por
endocitose mediada por clatrina e pressume-se que ocorra fusão de peptídeos do
envelope viral a membrana do endossoma, mediado por baixo pH (Tscherne
et.al., 2006). As proteína do envelope do VHC possuem peptídeos de fusão
internos que, em baixo pH, são expostos mediante arranjo e trimerização da
proteína (Modis et.al, 2004). Alguns trabalhos sugerem que a entrada de todos os
vírus da família Flaviviridae, incluindo o VHC é realizado através de proteínas de
fusão classe II. Entretanto, os mecanismos envolvendo a ativação do VHC em pH
baixo, os passos da fusão e a identificação dos peptídeos de fusão não estão
bem caracterizados (Maradpour et.al.,2007). O VHC codifica uma poliproteína
simples após a liberação do RNA viral no interior da célula, este se destinará a
três funções: primeiramente tradução nas proteínas estruturais e não-estruturais,
replicação sob a ação de uma RNA polimerase-RNA dependente (NS-5B) e
finalizando com o empacotamento na partícula final do vírus (Rice et.al., 2005).
O processo de tradução das proteínas é realizado por enzimas da célula e
do próprio vírus, dando origem às proteínas estruturais e não estruturais. Após a
síntese e maturação, essas proteínas não estruturais e o RNA formam complexos
de replicação associados à membrana que catalisam a transcrição de fitas
negativas de RNA intermediárias, a partir das quais moléculas progênies de fitas
positivas são geradas. O RNA genômico e proteínas do capsídeo se unem
formando o nucleocapsídeo, que é transportado em vesículas citoplásmicas,
passando pelo complexo de Golgi, unem-se em associação com as demais
partículas e sofrem exocitose e liberação das células, figura 3 (Lindenbach
et.al.,2005).
Figura 3: Ciclo do VHC. a) Internalização e ligação do vírus; b) Liberação no citoplasma
e descapsidação; c) Tradução mediada-IRES e processamento da poliproteína; d)
Replicação do RNA; e) empacotamento e montagem; f) maturação do virion e liberação.
Fonte: Moradpour et.al., 2007.
1.4 - Diversidade Genética
A análise filogenética da seqüência completa ou parcial do VHC de
isolados de várias regiões do mundo, levou a identificação de 6 genótipos,
enumerados de 1 a 6, com um grande número de subgrupos dentro destes
grupos, chamados ‘’subclados’’ ou ‘’subtipos’’ identificados por letras minúsculas
(1a, 1b, 1c, 2a, 2b, 2c, 3a, 3b, 4a, 5a e 6a) (Robertson et.al., 1998). Os genótipos
diferem entre si de 31% a 34% na seqüência de nucleotídeo e aproximadamente
30% em suas seqüências de aminoácidos, enquanto os subtipos diferem de 20%
a 23% em suas seqüências de nucleotídeos, sendo que essa diferença varia de
acordo com a região do genoma (figura 4) (Simmonds, 1998; Pawlotsky, 2004).
Figura 4: Árvore filogenética da seqüência nucleotídica da região NS5 do HCV,
Fonte: SIMMONDS et al., 1998.
A variabilidade genética do VHC existe em diferentes níveis. Há evidências
de que o vírus VHC sofre processo adaptativo demonstrado através da evolução
da região hipervariável da glicoproteína do envelope E2 para prevenir o
reconhecimento dos anticorpos induzidos pela infecção. Outra teoria mostra que a
maioria das mudanças nas seqüências entre as espécies não afetam o fenótipo,
explicando grande parte da diversidade genética observada em populações
geográficas e epidemiologicamente diferentes do VHC (Simmonds, 2004;
Simmonds et.al., 2005).
Existe uma divergência de 5-8% entre variantes de cepas dos genótipos
1a, 1b e 3a em infecções não correlacionadas. Essa diversidade também pode
ser observada dentro de uma infecção no mesmo indivíduo, denominada de
“quasiespécies” e podem diferir em torno de 10% dentro de uma mesma
população. Esta variabilidade genética do VHC é atribuída, a baixa fidelidade da
enzima RNA polimerase RNA dependente, que não possui atividade corretiva,
permitindo a geração de variantes virais (Martell et.al., 1992; Simmonds, 2004).
Outros fatores que também podem interferir são a tentativa de escape da
vigilância do sistema imunológica do hospedeiro e a alta taxa de replicação
(Zeuzem et. al., 1996).
Esta diversidade genotípica tem implicações em múltiplos aspectos da
doença: na epidemiologia devido às diferenças na distribuição geográfica e
prováveis vias de contagio; na patogênese, pois as cepas de diferentes graus de
virulência, podendo ocorrer co-infecção por diferentes genótipos; no diagnostico
devido à necessidade de seleção de seqüências de nucleotídeos de regiões
extremamente conservadas para garantir a sensibilidade e especificidade dos
testes sorológicos e moleculares; no tratamento, pois diferentes genótipos
apresentam respostas diferentes às drogas utilizadas na terapia; e na profilaxia,
pois antepõem dificuldades na produção de vacinas (Charman, 1995).
1.4.1 – Distribuição Geográfica dos Genótipos do VHC
Os seis principais genótipos do VHC, cada compreendendo múltiplos
subtipos, foram identificados em diferentes áreas geográficas do mundo. Os
genótipos 1, 2 e 3 são responsáveis por 90% das infecções encontradas na
America do Norte e Sul, Europa, Rússia, China, Japão, Austrália e Nova Zelândia.
O genótipo 4 e predominante no Oriente Médio, Egito e África Central, enquanto o
genótipo 5 e quase exclusivo do Sul da África, enquanto que o genótipo 6 é
encontrado no Sudeste da Ásia (Figura 5) (Simmonds et. al., 2005).
Figura 5: Distribuição dos genótipos do VHC no mundo. Fonte: Zein, 2000, modificado.
1.4.2 - Epidemiologia do VHC no Brasil
A dimensão da situação epidemiológica da hepatite C crônica no Brasil
ainda é desconhecida. Segundo dados do Ministério da Saúde (M.S.), de 1994 a
2007 foram diagnosticados 52.489 casos. Dados M.S. baseados em doadores de
sangue, a prevalência de anti-VHC nas diversas regiões foi de 0,62% no Norte;
0,55% no Nordeste; 0,43% no Sudeste; 0,28% no Centro Oeste e 0,46% no Sul
(Ministério da Saúde, 2006). Campiotto e Colaboradores determinaram a
freqüência dos genótipos do VHC nas diferentes regiões do país: o genótipo 1 foi
o mais freqüente (64,9%), seguido do genótipo 3 (30,2%). Enquanto que os
genótipos 2, 4 e 5 foram encontrados com menor freqüência: 4,6%, 0,2% e 0,1%,
respectivamente (Campiotto et.al., 2005). De acordo com a Sociedade Brasileira
de Hepatologia, na distribuição dos subtipos do VHC no Brasil, prevalecem os
genótipos 1b, 1a e 3a.
Figura 6: Distribuição dos genótipos do VHC em diferentes regiões do Brasil. Fonte:
Campiotto et.al., 2005, modificado.
No Brasil, o genótipo 1b ocorre com maior freqüência na população de
doadores de sangue, sendo também encontrados em outros grupos os subtipos
1a, 2a, 2b e 3a (Gonçales et.al., 2000; Gruner et.al., 2000). Recentemente, foram
detectados os genótipos 4 e 5 (Levi et.al., 2002; Campiotto et.al., 2005).
1.4.2 - Epidemiologia do VHC em Rondônia
O Estado de Rondônia (RO), localizado na região Norte do País dentro
Amazônia
Ocidental,
apresenta
características
de
uma
região
de
alta
endemicidade para hepatites virais. Existem poucos relatos da distribuição dos
genótipos do VHC na população da Amazônia brasileira, o genótipo 1 tem uma
predominância 66,7%, seguido do genótipo 3 com 25% e genótipo 2 com 8,3%
(Paraná et.al., 2007). O estudo de Campiotto e colaboradores (2005) para o VHC
em indivíduos da região Norte, abrangendo os Estados do Acre e Amazonas
descreveu a presença de 64,3% para o genótipo 1, 7,1% para genótipo 2 e 28,6%
para o genótipo 3. Echevarría e colaboradores (2003) descreveram que o padrão
de transmissão da infecção do VHC demonstra que a infecção prevalece na
população urbana da bacia Amazônica (Bolívia, Brasil, Colômbia, Peru e
Venezuela) sendo incomum entre a população de ameríndios, sugerindo que a
infecção chegou à região Amazônica através da colonização pela população
branca.
Existem poucos relatos para prevalência do VHC no Estado de RO,
segundo o Sistema de Informação Nacional de Agravo de Notificação (SINAN), o
Estado teve um índice de detecção 9,7% no período de 1999 a 2005 (Governo de
Rondônia, 2005). Estes dados mostram que entre os estados da região Norte,
Rondônia é o segundo em maior número de casos notificados (Ministério da
Saúde, 2005). Um estudo realizado no Município de Monte Negro – RO com 267
voluntários encontrou uma prevalência de 0,83% para o VHC (Khouri et.al., 2005).
Em estudo de prevalência realizado com a população ribeirinha no rio Madeira, a
prevalência da hepatite C alcançou 7% (Katsuragawa, 2006). Dados do ano 2007
mostram que o Estado de Rondônia teve uma taxa de detecção de 5,17% (SVS,
2009).
1.4.3 – Formas de Transmissão do VHC
Atualmente, sabe-se que o VHC é transmissível por diversos meios.
Contudo,
a
grande
maioria
das
infecções
ocorre
por
via
parenteral,
fundamentalmente por exposição a transfusões de sangue e hemoderivados, uso
de drogas intravenosas, realizações de tatuagens, exposição percutâneas e
nosocomiais (Hwang et.al., 2006; Paraná et.al., 2007). A transmissão sexual do
VHC é relatada, porém com menor eficiência do que outras infecções transmitidas
por vírus tais como vírus da hepatite B e vírus da imunodeficiência (Ghosn et.al.,
2005). O risco estimado para a transmissão sexual é de 0 a 0,6% ao ano para os
parceiros que possuem relação monogâmica por longo tempo e de 1% ao ano
para aqueles com múltiplos parceiros (Terrault, 2002).
A transmissão vertical pode ocorrer tanto de forma intra-uterina como por
via perinatal. Alguns autores tem relatado que o risco de infecção é maior no caso
de uma criança nascida por parto vaginal que em cesarianas (Norkeweicz et.al.,
2007; Jain et.al., 2007). Contudo, nem todos os estudos demonstram esta ligação
entre o parto vaginal e a transmissão perinatal do VHC. Níveis virêmicos
elevados, acima de um milhão de cópias por mililitro, aumentam o risco de
transmissão vertical (Gonçales et.al., 2000).
Existem, ainda, outros fatores considerados de risco para a infecção pelo
VHC, como utilização de agulhas de acupuntura, tatuagens, colocação de
piercing, encarceramento e serviço militar tem sido avaliados em estudos de
caso-controle de infecção aguda (Alter et.al., 1999; Alter, 2002). Situações
cotidianas e habituais já foram relatadas, como a partilha de lâmina de barbear,
descrita na Índia (Thakral et.al., 2006), submissão ao procedimento de
endoscopia (CDC, 2008), além da transmissão intrafamiliar do vírus. Outra forma
de transmissão corresponde à prática de transplante de órgãos e tecidos. Pelo
menos 10% dos pacientes adquirem o vírus não referem à exposição a nenhum
fator risco conhecido. Estes casos são denominados esporádicos (Plancoulaine
et.al., 2008).
1.5 - Manifestações clínicas
O VHC causa hepatite aguda e crônica, sendo que cerca de 85% dos
casos evolui para infecção se torna crônica, podendo apresentar cirrose hepática,
após 20 a 30 anos em quase 10-20% dos casos. A infecção pelo VHC causa,
ainda por mecanismos indeterminados, carcinoma hepatocelular em 4% dos
pacientes com cirrose, anualmente (Ikeda et al., 1993).
A infecção aguda pelo VHC se apresenta de forma assintomática na
maioria dos casos, porém pode manifestar através dos seguintes sintomas: malestar, cefaléia, febre baixa, anorexia, astenia, fadiga, artralgia, náuseas, vômitos,
desconforto no hipocôndrio direito e aversão a alguns alimentos e cigarro. A
icterícia é encontrada entre 18 a 26% dos casos de hepatite aguda e iniciam-se
quando a febre desaparece, podendo ser precedida por colúria e hipocolia fecal.
Pode também haver hepatomegalia ou hepatoesplenomegalia. Na forma aguda,
os sintomas vão desaparecendo paulatinamente. O período de incubação varia de
15 a 150 dias e o período de transmissibilidade inicia-se uma semana antes dos
sintomas e mantém-se enquanto o paciente apresentar RNA-VHC circulante. As
complicações observadas são cronificação da infecção, cirrose hepática e suas
conseqüências (ascite, hemorragias digestivas, peritonite bacteriana espontânea,
encefalopatia hepática) e carcinoma hepatocelular (Kumar et.al., 2002; Ministério
da Saúde, 2006).
1.6 - Tratamento
Desde a identificação do VHC, grandes avanços têm sido obtidos no
desenvolvimento de terapias antivirais (Feld e Hoofnagle, 2005). O Interferon-alfa
(IFN-α), um importante mediador da resposta imune antiviral inata, foi escolhido
para o tratamento da hepatite crônica pelo VHC. Durante os anos 80 foi utilizado
em monoterapia, no entanto, apenas 6-12% dos pacientes tratados por doze
meses apresentaram resposta virológica sustentada ao tratamento (Di Bisceglie e
Hoofnagle, 2002). A resposta sustentada é definida como VHC-RNA negativo por
no mínimo seis meses após a suspensão da terapia (Marcellin et.al., 1997).
Em 1988, foram publicados os primeiros resultados que mostravam uma
melhora significativa da taxa de resposta sustentada quando se associava ao IFNα um análogo de nucleosídio de grande ação antiviral, a ribavirina. Este esquema
terapêutico apresentou 40% de resposta virológica sustentada, atingindo 50%
entre os doentes que tinham recidivado sob monoterapia (Davis et.al., 1998). A
ribavirina é um análago nuclesídico de guanosina, que interfere na replicação
viral. É administrada por via oral e seu uso tem aumentado a taxa de resposta
sustentada ao tratamento, principalmente pela redução da porcentagem de
recaídas virológicas após a suspensão da terapia (Davis, 1999). Outros estudos
relacionados
com
efeito
da
Ribavirina
evidenciam
sua
característica
imunomoduladora, modificando a resposta antiflamatória para padrão Th1
(elevação de IL-2 e IFN), reduzindo a extensão da lesão dos hepatócitos
(Bergamini et.al., 2002); modificação dos nucleotídeos intracelulares e atividade
mutagênica (Feld e Hoofnagle, 2005).
Recentemente
foi
desenvolvido
o
Interferon
Peguilato
(IFN-PEG),
composto por uma molécula de polietilenoglicol associado ao IFN-α. Esta
composição resultou em uma molécula ativa com meia vida longa, melhores
características farmacocinéticas e melhores taxas de resposta sustentada (Glue
et.al., 2000; Zeuzem et.al., 2000; Lindsay et.al., 2001). A terapia imune
combinada com IFN-PEG associado a Ribavirina alcançou taxas de resposta de
54%-56%, sendo que a maior desvantagem desta terapia é seu elevado custo
(Fried et.al., 2002; Strader, 2002; Hadziyannis et.al., 2004).
A resposta a terapia com IFN esta relacionada a características do
hospedeiro, tais como idade, sexo, duração da infecção, depósito de ferro e
fibrose hepática, bem como a características do vírus, tais como genótipo,
quasiespécies, carga viral e mutações em determinadas regiões do genoma viral
(Ferenci, 2004). Em geral, pacientes infectados com VHC genótipos 2 e 3
respondem melhor a terapia com IFN do que pacientes infectados com o genótipo
1, mas o fundamento virológico que justifique essa diferença na resposta ao IFN
entre os diferentes genótipos permanece desconhecido (Murphy et.al., 2002).
No Brasil, o protocolo de tratamento para o VHC, segue a Portaria 34, do
Ministério da Saúde, de 28 de Setembro de 2007 publicado em 09/10/2007,
preconiza que para os genótipos 2 e 3 o tratamento deve ser realizado com
interferon convencional mais ribavirina por 24 semanas e para o genótipo 1 o
tratamento deve ser realizado com peg-interferon mais ribavirina por 48 semanas
(Ministério da Saúde, 2007).
1.7 - Diagnóstico Laboratorial
Durante muito tempo a infecção pelo VHC foi diagnóstica por exclusão
baseada na ausência de marcadores de infecção aguda do vírus da hepatite A
(VHA) e hepatite B (VHB). A identificação do VHC, por métodos moleculares,
permitiu o desenvolvimento de métodos de diagnóstico imunoenzimáticos (Choo
et al., 1989). Estes métodos possibilitaram a implementação de rotinas
sorológicas em bancos de sangue na década de 90, que produziu uma mudança
das características epidemiológicas da infecção pelo VHC, passando de ser uma
hepatite pós-transfusional para, para ter uma associação mais precisa com outros
mecanismos parenterais como uso de drogas injetáveis e outras formas menos
comuns, onde exista exposição de membranas e mucosas ao vírus. Podemos
classificar os métodos correntes de diagnóstico do VHC em ensaios sorológicos e
de detecção do RNA do VHC.
1.7.1 - Ensaios Sorológicos
O teste imunoenzimático (EIA), sobretudo o ELISA, é utilizado na triagem
de anticorpos anti-VHC (Urdea et.al., 1997). No Brasil este teste tornou-se
obrigatório a partir de 1993, em candidatos a doação de sangue (Ministério da
Saúde, 1993). Os primeiros kits que surgiram no mercado em 1990 foram
denominados de 1ª geração, iniciou-se com a clonagem do genoma do VHC e
expressão do antígeno recombinante c100-3 (derivado da região NS4 do vírus)
em levedura, que detectavam apenas anticorpos para este antígeno (Van Der
Poel et.al., 1990).
Os ensaios de 2ª geração agregaram o antígeno c22-3 da região “C”
(capsídeo ou core) e o antígeno c33c derivado da região não NS3, neste teste
sorológico 13% dos resultados são dados como indeterminados (Zein et al.,
1997). Ainda assim, nem todos os pacientes em imunossupressão após
transplante ou imunocomprometidos pela infecção pelo HIV podem apresentar
infecção pelo VHC sem anticorpos detectáveis (Erensoy, 2001). No entanto, nas
populações de alto risco, a eficácia dos testes da 3ª geração é muito boa,
detectando anticorpos contra quatro proteínas recombinantes do VHC, diferindo
dos ensaios da 2ª geração pela substituição da proteína NS5 no lugar do antígeno
5-1-1 (Schiff, 1999), e a substituição de alguns antígenos recombinantes por
peptídeos sintéticos, observando uma maior especificidade e sensibilidade, em
relação aos demais testes sorológicos. Apesar deste avanço, resultados
indeterminados não foram eliminados (Colin et al., 2001).
As vantagens do teste de ELISA incluem facilidade de automação e de uso,
custo acessível, baixa variabilidade e alta sensibilidade na triagem de doadores
de sangue e órgãos. As principais desvantagens são a abundância de falsopositivos em populações de baixo risco e baixa sensibilidade verificada em
amostras de pacientes após transplante hepático e outras situações de
imunossupressão (Schiff et.al., 1999). A reatividade falsa pode ocorrer devido à
ligação não específica das imunoglobulinas do soro ou plasma a contaminantes
presentes nas preparações de antígeno do VHC, partes de fusão ou regiões não
especificas dos antígenos recombinantes ou aos reagentes de revestimento ou de
bloqueio.
Resultados
falso-negativos
também podem ocorrer
quando
o
diagnóstico é realizado no período de janela imunológica ou em casos de
imunodeficiência (Gretch, 1997).
Alguns testes sorológicos suplementares já foram usados baseados na
técnica de immunoblot (IB) e permitiam a confirmação da reatividade dos
anticorpos contra as proteínas individuais do VHC, empregando as mesmas
proteínas presentes no ELISA. Este ensaio sofreu aprimoramento tecnológico que
resultou na produção de kits de 1ª, 2 ª e 3 ª geração (Schiff et.al., 1999). A
interpretação deste ensaio depende do tipo e versão e dos critérios do fabricante.
Os resultados são reportados como positivos, quando duas ou mais bandas estão
presentes, indeterminado, quando há apenas uma banda e negativo, na ausência
de bandas. Um teste positivo confirma a reatividade especifica dos anticorpos
anti-VHC. Um teste indeterminado ou negativo pode ocorrer no período préconversão, em recém-nascidos de mãe positiva, em pacientes transplantados que
apresentam respostas de anticorpos insuficientes, ou ainda numa reação cruzada.
Um teste anti-VHC positivo com confirmação pelo IB não é um marcador
verdadeiro de infecção ativa, uma vez que pacientes restabelecidos podem
permanecer anti-VHC positivos por longos períodos (Erensoy, 2001).
1.7.2 - Diagnósticos Moleculares
Devido às limitações dos testes sorológicos, para confirmar o estado do
portador de VHC é feito o diagnóstico molecular para detecção direta do RNA viral
considerada uma ferramenta essencial. Suas vantagens incluem a possibilidade
do diagnóstico precoce na infecção viral na fase aguda, diagnóstico da infecção
em pacientes incapazes de montar uma resposta sorológica e confirmação da
infecção ativa em situações específicas. Os testes de detecção do RNA do HCV
são classificados em qualitativos e quantitativos (Germer et al., 2001).
1.7.2.1 - Detecção Qualitativa do RNA
Os testes qualitativos utilizados para detecção do RNA do VHC são: a) RTPCR (Transcrição Reversa – Reação em Cadeia da Polimerase), TMA
(Transcription Mediated Amplification) e o NAT (nucleic acid tests), sendo que a
RT-PCR é considerada como gold standard no diagnóstico da infecção e na
avaliação da resposta antiviral (Schiff et.al.,1999).
A técnica de PCR é realizada através do isolamento do RNA da amostra,
seguido de transcrição reversa para gerar o cDNA que será utilizado na
amplificação especifíca da seqüência de ácido nucléico. A utilização desta técnica
de RT-PCR para a detecção da presença de RNA do VHC em soro de pacientes
suspeitos iniciou-se na década de 90, sendo considerada como diagnóstico útil
durante a terapia antiviral, porque o desaparecimento do RNA-VHC durante o
tratamento é um forte preditor de resposta sustentada (NIH, 1997). Esta
metodologia apresenta boa sensibilidade e especificidade, permitindo a detecção
do vírus antes dos ensaios sorológicos tornarem-se a diferenciação dos casos de
infecção ativa e diagnóstico em pacientes incapazes de formação de uma
resposta imune efetiva (Garson et al.,1990; Zaaijer et al.,1993).
O teste de TMA para o RNA do VHC, baseado, também, na amplificação
de alvo molecular, tem se mostrado mais sensível que o teste de RT-PCR
apresentando grande aplicação como teste de confirmação de resposta
sustentada ao tratamento (Zarraci et al., 2000). O NAT foi introduzido nos centros
de transfusão sanguínea para diminuir o período de janela, reduzindo a
transmissão viral. O European Committee for Proprietary Medicinal Products
(CPMP) exige que após 1° de julho de 1999 todos os derivados de plasma,
distribuídos na União Européia, sejam testados negativos para VHC pelo NAT
(Erensoy, 2001).
1.7.2.2 - Detecção Quantitativa do RNA
Os testes quantitativos têm capacidade de determinar o número de
partículas virais presentes no soro de pacientes infectados (carga viral), que
resulta de particular importância no prognóstico e na terapêutica. Duas técnicas
são utilizadas na quantificação do RNA do VHC em amostras clínicas. A primeira
é baseada na técnica de PCR e detecta baixas quantidades de vírus. A segunda
técnica é baseada na tecnologia de bDNA (branched DNA).
A técnica de bDNA detecta diretamente as moléculas de ácido nucléico
pela amplificação do sinal luminoso (Urdea et.al.,1997). A concentração do RNA
do VHC é calculada a partir de uma curva de padrões externos criada com quatro
transcritos de RNA, que são usadas como padrões e incluídos na reação. Os
resultados são expressos em RNA do VHC Meq/mL(Erensoy, 2001).
Ambos os testes têm limites inferiores de detecção semelhante, ainda que
o bDNA obtenha uma faixa de resolução mais ampla no que concerne aos limites
superiores de detecção, evitando a necessidade, na maioria das vezes, de retestes com diluição de amostras de maior carga viral.
1.7.2.3 - Quantificação do VHC por PCR em Tempo-Real
Apesar da metodologia de RT-PCR competitiva para quantificação de o
VHC ser empregada há longa data em muitos laboratórios de diagnóstico
apresentando bons resultados, sua baixa sensibilidade analítica e limitada faixa
de resolução de 3 log impõe algumas limitações. Isto tem impulsionado a busca
de metodologias alternativas que possam suprir estas deficiências. A PCR em
tempo real é uma metodologia capaz de permitir a detecção do produto de PCR à
medida que vai sendo formado, e não somente ao final da reação de PCR
(Zeuzem et al., 1996).
Dessa forma, acrescentou-se ao extremamente sensível método de PCR,
maior praticidade, menor tempo para obtenção do resultado e diminuição da
possibilidade de reação cruzada (Heid et al., 1996; Gibson et al. 1996). O
equipamento de PCR em tempo real possui uma fonte de emissão de luz, que
pode ser uma lâmpada halógena ou um feixe de laser. A frente da fonte de luz
estão colocados os filtros de excitação, que selecionam o comprimento de onda
específico para a excitação de cada fluorófo presente na reação. A luz é então
direcionada para a placa de amostras através de um conjunto de espelhos
dicróicos. Os corantes presentes na amostra são excitados e emitem
fluorescência, que direciona os espelhos para o filtro de emissão. Esse filtro
seleciona a luz emitida nos comprimentos de onda específicos de cada corante
presente na reação. A luz selecionada é direcionada para a câmera CCD, que
converte o sinal luminoso em sinal eletrônico, que é utilizado pelo software
gerenciador do equipamento para o traçado gráfico da reação (Higuchi
et.al.,1992).
Na PCR em tempo real, a quantidade de produto formado durante o curso
da reação de amplificação é feita por monitoramento da fluorescência dos
corantes ou sondas introduzidos na reação, que é proporcional à quantidade de
produto formado, enquanto o número de ciclos necessário para obter uma
quantidade determinada de moléculas de DNA é registrado. Assumindo uma
determinada eficiência na amplificação, que normalmente é próxima a duplicação
do número moléculas por ciclo de amplificação, é possível calcular o número de
moléculas de DNA da seqüência amplificada presentes inicialmente na amostra.
Com a utilização de químicas de detecção altamente eficientes, instrumentos
sensíveis e ensaios otimizados, o número de moléculas de DNA alvo na amostra
pode ser determinado com acurácia e sensibilidade sem precedentes, suficientes
para detecção de uma única molécula (Kubista et.al.,2006).
Esse sistema é composto por corantes fluorescentes que se ligam ao
produto formado e reportam sua presença a partir da emissão de fluorescência.
Durante os ciclos iniciais o sinal fluorescente é fraco e não pode ser distinguido da
fluorescência de fundo (“background”). À medida que o produto de PCR se
acumula, o sinal fluorescente é percebido, aumentando exponencialmente
durante os primeiros ciclos da reação. Em seguida, o nível de sinal é saturado.
Essa saturação ocorre em função do consumo de alguns componentes críticos
para a reação; ou seja, iniciadores, sistema de detecção ou dNTP. Outro
componente limitante é o número de moléculas de polimerase, cujo decréscimo
faz com que a amplificação exponencial seja convertida em amplificação linear
(Kubista et.al.,2006; Watzinger et.al.,2006).
No experimento de PCR em tempo real todas as curvas formadas são
saturadas no mesmo nível de fluorescência. Portanto, a quantificação em ponto
final não é demonstrativa quanto à quantidade inicial de moléculas-alvo presente
na amostra e permite apenas resultados qualitativos. Por outro lado, as curvas da
PCR em tempo real são monitoradas durante a fase exponencial da reação, que
reflete a diferença na quantidade inicial de moléculas de DNA (Watzinger
et.al.,2006).
Essa diferença é quantificada pela comparação do número de ciclos de
amplificação necessários para que a curva de uma determinada amostra atinja
um determinado nível de sinal fluorescente (“threshold”). O número de ciclos
necessários para atingir o “threshold” é chamado Ct (“Cycle threshold”), que é o
dado utilizado para a quantificação da amostra. É esperado que as curvas de
amplificação sejam paralelas durante a fase exponencial da reação, de modo que
o ajuste de “thresohold” não seja crítico para a quantificação (figura 7) (Kubista
et.al.,2006).
Figura 7: Resultado do PCR em tempo real em gráfico de amplificação contendo a linha
que é o nível de detecção ou o ponto a partir do qual a fluorescência atinge um nível
maior do que o do background e o Ct de amplificação. Dorak., 2006 (modificado).
O PCR em tempo real utiliza exclusivamente fluorescência como método
de detecção, dependendo da química utilizada, diferentes tipos de sondas
fluorogênicas podem ser descritas. As sondas de hidrólise são comumente
conhecidas como sondas TaqMan® (Applied Biosystems, Foster, CA, USA) ou
sondas 5` nuclease. Essas sondas são duplamente marcadas, contendo um
fluoróforo “reporter”, como FAM ou VIC, convalentemente ligado a extremidade 5`;
e um fluoróforo “quencher”, como TAMRA, convalentemente ligado a extremidade
3`. Quando a molécula “reporter” é estimulada por uma fonte de luz a emitir
fluorescência, essa região é transferida para o “quencher”, que suprime a emissão
de fluorescência pelo “repórter”. Esse princípio físico é conhecido como
transferência de energia da ressonante da fluorescência – FRET (Selvin, 1995).
Durante a reação, quando a Taq DNA polimerase estende os iniciadores, a sonda
hibridizada é clivada devido a atividade 5` exonuclease da enzima e as moléculas
“reporter” e “quencher” são separadas. Isso extingue o FRET e faz com que a
fluorescência do “reporter” deixe de ser captada pelo “quencher” e passe a ser
detectada pelo sistema ótico do equipamento (figura 8).
Figura 8:.Em a: Sonda com presença na extremidade 5` “reporter”, na extremidade 3’
“quencher” e atividade inicial da Taq polimerase. Em b: Atividade Exonuclease 5' da DNA
Polimerase (Mocellin et al. ,2003 – modificada).
As vantagens da utilização de sondas TaqMan® são a facilidade para o
desenho das sondas e as poucas restrições quanto a seleção das sequênciasalvo. A utilização de sondas no sistema de PCR em tempo real confere maior
especificidade, tendo possibilidade de combinar duas ou mais sondas em uma
única reação de PCR. Entretanto, é necessário que os produtos de PCR gerados
sejam pequenos entre 80 a 130 para obter eficiência máxima no processo de
amplificação (Kubista, 2004).
O sistema SYBR Green I se liga inespecificamente a fitas duplas de DNA
geradas durante a amplificação. Trata-se de uma assimétrica cianina que, livre
em solução não emite fluorescência, mas, ligada a moléculas de DNA emite um
forte sinal luminoso (Nigren et.al., 1998). A toxicidade do brometo tem levado a
uma maior popularidade da SYBR Green (Bengtsson et al., 2003; Zipper et al.,
2004).
As vantagens do SYBR Green I incluem fácil manuseio e baixo custo. A
principal desvantagem esta relacionada à ligação com produtos não-específicos.
Isso ocorre porque durante os ciclos consecutivos de PCR, a quantidade de DNA
de fita dupla se eleva de maneira exponencial, aumentando assim a quantidade
de SYBR Green ligado e sua fluorescência. Entretanto, quando ocorre
amplificação inespecífica ou amplificação de dímeros de primers, estes também
são detectados, interferindo com a quantificação final dos produtos específicos da
reação. Para avaliar a presença de produtos inespecíficos formados durante a
reação, utiliza-se a curva de dissociação. A curva de dissociação distingue
diferentes seqüências a partir da porcentagem do conteúdo GC, sendo que
quanto mais elevado for este valor, maior será a temperatura de melting da
seqüência (Zipper et al., 2004).
A PCR em tempo real permite seu uso como ferramenta diagnóstica para
detecção da infecção e quantificação de seu agente etiológico. O ensaio de
quantificação absoluta baseia-se na análise da curva-padrão (Applied Biosystems,
2005). A curva-padrão relaciona-se às concentrações de DNA padrão. É por meio
destes dados, ou seja, quantidades conhecidas de DNA, que o software efetua a
quantificação de DNA alvo nas amostras em teste (Applied Biosystems, 2005). A
curva-padrão também fornece o coeficiente angular da reta (slope), composta
pelos pontos da curva. Este dado será importante para o cálculo da eficiência da
amplificação (ε), uma alta eficiência está associada a uma inclinação de,
aproximadamente, 3,32 para cada diluição de 10 do alvo (Too, 2003; Applied
Biosystems, 2005). Slope de -3,3 relaciona-se a uma eficiência de 100%
indicando que o número de moléculas amplificadas dobra a cada ciclo da PCR
(Kubista et al., 2006).
As características da PCR em tempo real possibilitam a eliminação da
etapa
laboriosa
pós-amplificação
(preparo
do
gel
para
eletroforese),
convencionalmente necessária para visualização do produto amplificado. Desta
forma, pode-se observar que as vantagens da PCR em tempo real em relação à
PCR convencional são inúmeras e incluem rapidez na obtenção dos resultados,
reprodutibilidade e capacidade quantitativa (Sundsfjord et al., 2004; Yang and
Rothman, 2004).
Esta técnica é altamente sensível, já está sendo desenvolvida para o
acompanhamento de inúmeras doenças, tais como AIDS, hepatite C, dengue,
toxoplasmose e as leishmanioses (Francino et al., 2006; Kompalic-Cristo et al.,
2007; Manna et al., 2008). Sendo considerada uma técnica inovadora porque é
capaz de promover a quantificação acurada do imput de DNA e o monitoramento,
em tempo real, do produto amplificado (Solano-Gallego et al., 2007). O sistema de
quantificação possui aplicações variadas, incluindo identificação de alelos em
DNA genômico, análise de seqüências virais, bacterianas ou de protozoários a
partir de várias fontes, análise de patógenos em alimentos, análise de produtos
transgênicos, além da aplicação em diagnóstico (Novais et.al., 2004).
Atualmente, existem conjuntos diagnósticos disponíveis para a detecção e
quantificação de DNA e RNA em amostras clínicas, especialmente desenvolvidas
para o acompanhamento de pacientes com AIDS e hepatite C (Raoult et.al.,
2004). Diante do exposto, para alguns autores, a PCR tida como “padrão-ouro”
anteriormente será substituída pela técnica de referência quantitativa PCR em
tempo-real (Mary et al., 2004). A sensibilidade deste método de PCR em tempo
real permite a resolução de uma ampla faixa de cargas virais sem a necessidade
de diluição das amostras, ele vem se mostrando como a alternativa buscada para
a detecção e quantificação do RNA do VHC (Kleiber et al., 2000; Komurian-Pradel
et al., 2001).
1.7.3 – Identificação do Genótipos do VHC
A região 5` NCR é a região de escolha para detecção qualitativa e
quantitativa do RNA do VHC por ser uma região altamente conservada. Por esta
razão é a mais utilizada para ensaios de genotipagem do VHC na maioria dos
laboratórios clínicos. Entretanto, devido a sua alta conservação a região 5`NCR
não é adequada para discriminar o genótipo 6 do genótipo 1 e os subtipos para os
genótipos 1, 2, 3, 4 e 6. A única possível exceção é o genótipo 5, o qual não tem
relatos de outros subtipos a não ser o 5a (Chinchai et.al., 2003).
Dessa forma é fundamental a escolha de uma região que apresente um
polimorfismo maior dentro do genoma e que permita diferenciar os diferentes
genótipos e seus subtipos de forma mais acurada. As regiões mais estudadas
com essa finalidade são as regiões do core, envelope E1 e a região NS5B (Bukh
et.al.,1995). O padrão-ouro para genotipagem do VHC é a RT-PCR, seguida do
seqüenciamento dos nucleotídeos de regiões como NS5B, Core e E1 e
comparação das seqüencias obtidas com seqüencias consenso provenientes de
banco de dados como o GenBank ou
“los Alamos Hepatitis C” (Simmonds
et.al.,1994).
Muitos laboratórios utilizam o seqüenciamento para determinação dos
genótipos do VHC principalmente em estudos epidemiológicos moleculares
(Simmonds et.al.,1994). Para este tipo de pesquisa esta técnica possui uma
sensibilidade média que pode variar dependendo dos “primers” utilizados e de
região do genoma utilizada para analise dos dados (Laperche et.al.,2005). A
principal desvantagem relacionada com essa técnica é a exigência de uma mãode-obra qualificada, equipamentos de alto custo, além da necessidade de utilizar
diferentes protocolos para uma melhor padronização (Weck, 2005).
Existem vários trabalhos que desenvolveram ensaios de RT-PCR usando
“primers” específicos relacionados com a região do core e da NS5B do VHC para
diferentes subtipos, diferenciados pelo tamanho dos fragmentos referente
associado a cada subtipo e visualizados através da técnica de eletroforese.
Alguns trabalhos apresentaram problemas, tanto na diferenciação dos genótipos
quanto em amostras que possuem infecções mistas (Ohno et.al.,1997). Este
método apresenta vantagens, pois através da RT-PCR convencional, com
utilização de controles positivos e negativos é possível genotipar as amostras
analisadas diferenciando-as através do peso molecular descrito para cada
genótipo.
Os ensaios com polimorfismo de tamanho de fragmento de restrição
(RFLP) possibilitam utilizar diferentes enzimas de restrição para diferentes
genótipos que contem sítios específicos. Os sítios específicos desses produtos da
RT-PCR são submetidos a digestão por diferentes enzimas de restrição. A
determinação do genótipo se dá pelo perfil dos tamanhos dos fragmentos
visualizados após eletroforese.
Estes ensaios estão descritos na região 5` NCR, core e a região NS5B
(Nakao et.al.,1991; Pohjanpelto et.al.,1996). A PCR-RFLP da região 5`NCR
identifica bem os principais genótipos do VHC, entretanto, estudos comparativos
desta região com outros métodos baseados na região 5`NCR mostrou
discrepância para tipo e subtipos (Anderson et.al.,2003). Por outro lado, o método
baseado na região do core não conseguiu distinguir com acurácia outros
genótipos alem do 1 e 6 sendo preciso utilizá-lo em conjunto com outro método de
genotipagem (Chinchai et.al.,2003). Este método foi um dos primeiros utilizado
para genotipagem do VHC baseados nas seqüências e foi utilizado em vários
estudos, incluindo um dos maiores estudos epidemiológicos realizados para
verificar a distribuição geográfica dos genótipos no mundo (Davidson et.al.,1995).
Atualmente, a PCR em tempo real tem sido utilizada como método de
genotipagem do VHC, embora ainda existam poucos trabalhos publicados. Pela
plataforma TaqMan, Moghaddam (2006), descreveu a determinação dos
genótipos 1, 2 e 3a, com resultados que demonstraram uma correlação de 100%
quando comparado ao seqüenciamento da região 5`NCR e LiPA (Moghaddam
et.al.,2006). Estudos utilizando a plataforma TaqMan podem ser uma alternativa
para genotipagem de baixo custo, dependendo da quantidade de sondas
utilizadas (Lindh et.al.,2005). A genotipagem do VHC pode ser feita através de
análise de “melting curve” utilizando o fluoróforo SYBR Green I, a diferença entre
os genótipos é feita através de diferentes Tm (temperatura de “melting”).
A
principal desvantagem desse método é que os genótipos apresentam Tm muito
próximas
dificultando
assim uma
discriminação
mais
acurada
(Fujigaki
et.al.,2004). Existem inúmeros métodos comerciais disponíveis para genotipagem
do VHC, a maioria deles focados na região 5`NCR que possui alto grau de
conservação entre os isolados dos diferentes genótipos (Murphy et.al., 2007).
Entretanto, esses métodos possuem uma deficiência em diagnosticar
subtipos ou mesmo genótipos. Um dos métodos comerciais mais utilizados em
laboratórios clínicos é a hibridização reversa utilizando “primers” biotinilados para
amplificar a região 5` NCR do VHC, através da RT-PCR. O produto marcado com
biotina então é hibridizado numa membrana de nitrocelulose que já esta
impregnada com sondas específicas para cada genótipo. Adiciona-se a reação a
estreptavidina marcada com fosfatase alcalina, que converte o substrato
NBT/BCIP em um precipitado colorido. A determinação do genótipo se dá através
de um perfil específico para cada um (Stuyver et.al.,1993).
Este método é
chamado de Versant VHC Genotype Assay (LiPA). Atualmente esta em curso
uma nova versão do LiPA que utiliza a região do core e 5`NCR que poderá
discriminar melhor tanto os genótipos como os subtipos (Ross et.al.,2000).
Uma das vantagens do LiPA é que o produto da RT-PCR para detecção
qualitativa e quantitativa do VHC poderá ser utilizado diretamente pelo LiPA,
embora isso acrescente um curso extra ao teste. A desvantagem do LiPA é a
presença de bandas não específicas dificulta a correta interpretação (Payne
et.al.,2001).
Existem kits no mercado que fornecem reagentes de seqüenciamento com
reações realizadas em um único tubo com fluorescência bidirecional (CLIP
seqüenciamento), além do instrumento e softwares para análises. Este software
analisa dados em tempo real, alinha e compara as seqüências obtidas com
seqüências referências da biblioteca do software para tipo, subtipo e isolados
próximos. Este método pode ser utilizado através de “amplicons” gerados por kits
comerciais após uma purificação por coluna. Estudos demonstram bons
resultados comparados com outros testes comerciais, como por exemplo, o LiPA.
Estes resultados são esperados pelo fato de que os dois testes focam a região 5`
NCR (Germer et.al.,2006).
O teste de Invader VHC ASR é baseado na utilização de uma enzima que
cliva as estruturas secundárias que são formadas quando o DNA é desnaturado e
rapidamente renaturado. É um teste somente de detecção e a RT-PCR deve ser
realizado a priori com primers biotinilados ou não.
A região 5` NCR é utilizada neste teste pode ser usada em conjunto com
produtos amplificados de kits comerciais para detecção qualitativa ou quantitativa.
Após a RT-PCR, cada amostra é diluída, desnaturada e distribuída em 8 poços
com a enzima cleavase I e sondas Invader que diferenciam os genótipos 1 e 6. A
placa é incubada por 30 minutos a 63°C, após realiza-se a leitura da placa
utilizando uma leitora. O software analisa os dados e determina os genótipos
(Weck, 2005). A limitação deste teste é que apenas o genótipo é identificados
sem subtipagem.
O Abbot ASR é uma reação em “one step” por PCR em tempo real que
utiliza sondas específicas para a determinação dos genótipos. Os “primers” e
sondas são baseados na região 5`NCR com exceção dos genótipos 1a e 1b que
utilizam “primers” e sondas focadas na região NS5B (Weck, 2005).
O teste TRUGENE NS5B sequencing assay esta em desenvolvimento pela
Visible Genetics/BayerDiagnostics. Este teste incorpora seqüências da região
NS5B que são filogeneticamente mais informativas e como padrão ouro podem
discriminar também os subtipos de modo preciso (Othman et.al.,2004). O teste
utilizando DNA enzima imunoensaio (DEIA) GEN-ETI-K DNA é disponível através
da Sorin Biomédica. Neste ensaio, sondas marcadas para genótipo específico da
região do core que são ligados em poços de placas em microdiluições. Os
produtos da RT-PCR são hibridizados e detectados com anticorpos monoclonais
específicos contra a fita dupla de DNA (Viazov et.al., 1994; Vatteroni et.al., 1997).
Vários grupos de pesquisas desenvolveram ensaios de sorotipagem para
detectar
anticorpos
genótipos
específicos
que
reaja
com
epítopos
imunodominantes na região NS4 ou da região do core. Estes anticorpos podem
diferenciar os genótipos, mas não os subtipos de cada genótipo. Estes testes não
são amplamente utilizados, pois no geral não possuem a acurácia dos métodos
moleculares (Sandres et.al., 2001). Dois ensaios comerciais estão disponíveis no
mercado. Serotyping 1-6 assay (Murex Diagnóstica) é um teste competitivo de
enzima imunoensaio (EIA) que utiliza peptídeos sintéticos derivados da região
NS4 e do core para detectar anticorpos específicos dos genótipos 1 a 6 (Dixit
et.al.,1995).
O teste RIBA serotyping SI assay (Chiron) é um imunoblot recombinante
com peptídeos sorotipo-específicos da região do NS4 e do core imobilizados
numa tira (Pawlotsky et.al.,1997). O teste RIBA detecta somente anticorpos dos
genótipos 1 a 3, enquanto que o teste de Murex EIA teoricamente detecta
genótipos de 1 a 6.
1.8 - Justificativa
Os testes sorológicos referentes à infecção pelo VHC no estado de
Rondônia são coletados e analisados pelo Laboratório Central do Estado – Lacen
RO como também por laboratórios particulares. Enquanto que os testes
moleculares são coletados
e enviados para laboratórios
de referência
credenciados juntos ao Ministério da Saúde, causando uma demora maior na
liberação dos resultados, podendo ocorrer extravio de amostras durante o trajeto,
custo elevado de envio das amostras, além disso, existem os fatores emocionais
e psicológicos relacionados ao paciente.
Os testes moleculares possuem alto grau de sensibilidade e especificidade,
são considerados imprescindíveis para confirmar a infecção persistente e
resultam fundamentalmente no acompanhamento do tratamento, verificando o
sucesso terapêutico. A PCR em tempo real engloba todas as características
positivas dos testes moleculares além de permitir uma maior sensibilidade em
amostras com baixas cargas virais. Como podemos observar os testes de biologia
molecular representam um avanço no controle e tratamento da infecção pelo
VHC, pois permitem não somente a confirmação diagnóstica como também a
orientação terapêutica a ser instituída.
Portanto este estudo tem a finalidade de contribuir para a implementação
de uma técnica que permita a identificação viral, tanto qualitativa como
quantitativa em uma única reação juntamente com a genotipagem do vírus, útil
não só para estudos epidemiológicos como aplicável a prática clínica, na
determinação da necessidade de tratamento e no acompanhamento do paciente.
Estes testes moleculares não são realizados em nenhum laboratório
público ou e privado no estado de Rondônia, sendo que as amostras que são
coletadas são enviadas para laboratórios de outras regiões tais como, CentroOeste e Sudeste do País. A padronização destes testes moleculares visa um
diagnóstico de rotina que possam atender a demanda de Rondônia e Estados
vizinhos com padrão de qualidade, para isso será implantado controles de
qualidade no laboratório, garantindo resultados confiáveis. Isso possibilita menor
tempo de liberação dos resultados dos testes e um custo mais acessível,
seguindo as normas exigidas pela CGLAB – Coordenação Geral de Laboratórios
de Saúde Pública do Brasil para maior controle de qualidade.
2. OBJETIVOS
2.1 - Objetivo Geral
Padronizar e validar um método para identificação, quantificação e
genotipagem do vírus da hepatite C em amostras de soro de pacientes atendidos
no ambulatório de hepatites virais do Centro de Pesquisa em Medicina Tropical de
RO – CEPEM.
2.2 - Objetivos Específicos
•
Padronizar um diagnóstico rápido qualitativo e quantitativo da infecção pelo
VHC, utilizando metodologia de RT-PCR em tempo real.
•
Produzir um transcrito de RNA para quantificação do VHC através da
geração de uma curva externa.
•
Avaliar o teste de padronização quanto à sensibilidade, especificidade e
reprodutibilidade comparando com um teste já comercializado de utilização
rotineira.
•
Identificar os genótipos 1, 2 e 3 do VHC pela técnica de PCR em tempo
real.
•
Comparar os resultados de genotipagem por PCR em tempo real com o
seqüenciamento para verificar a acurácia do método.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 - Local do Estudo
O Ambulatório de Hepatites Virais do Centro de Pesquisa em Medicina
Tropical de Rondônia (CEPEM), esta localizado na BR 364, Km 3,5 na cidade de
Porto Velho, sendo considerado o centro de referência no Estado para o
diagnóstico e tratamento das hepatites virais. Foi criado no ano de 1993, com
objetivo de atender pacientes com suspeita clinica de hepatites virais com
característica aguda ou crônica. Atualmente existem aproximadamente 1500
pacientes cadastrados como portadores de hepatite C atendidos no ambulatório.
As amostras de soro dos pacientes são armazenadas em tubo de criopreservação
a -70°C para posteriores estudos sorológicos ou moleculares.
3.2 - População Estudada
Foram incluídos neste estudo pacientes portadores do VHC com marcador
sorológico positivo para o vírus. O critério de inclusão: todos anti-VHC positivo
utilizado neste estudo abrangia pessoas de ambos os sexos, com idade entre 1860 anos atendidos no Ambulatório de Hepatites Virais do CEPEM na cidade de
Porto Velho – RO durante o período compreendido entre os meses de Janeiro de
2007 a Outubro de 2009. Os critérios de exclusão: pacientes abaixo ou acima da
faixa etária discriminada, indígenas, grávidas e portadores de outras patologias
crônicas associadas.
3.3 - Fluxograma da Metodologia
Segue abaixo o quadro mostrando o fluxograma de todas as etapas do
estudo (Quadro 1).
Quadro 1: Fluxograma das etapas desenvolvidas no estudo.
Amostras Biológicas
Extração do RNA viral
Produção do cDNA
PCR Convencional Qualitativo
PCR em Tempo Real
Clonagem
Quantitativo
Qualitativo
Purificação do
Amplicon
Seqüenciamento
Genotipagem
Ligação em Vetor de
Clonagem
Transformação em
TOP10F
Extração do DNA
Plasmidial
Kit
Comercial
cDNA do
Transcrito
Digestão
Enzimática
Linearização
do Plasmídeo
Quantificação
do Transcrito
Produção do
Transcrito
Purificação do
Plasmídeo
3.4 - Amostras Biológicas
Foram analisadas 100 amostras de soro de pacientes com hepatite C
crônica, com confirmação clínica e laboratorial. Os pacientes foram submetidos a
um questionário, explicando o objetivo do trabalho e sua relevância, sendo que
todos assinaram o termo de consentimento livre esclarecido (TCLE) (Anexo I).
Um volume de 10ml de sangue venoso foi coletado do paciente em tubos
do tipo “Vacutainer” sem anticoagulantes. Estas amostras foram incubadas por 2
horas (h) a 37ºC, para retração de coágulo. Após este período as amostras foram
centrifugadas por 10 minutos (min) a 4.000 rotações por minuto (rpm). Em
seguida os soros foram distribuídos em duas alíquotas de 1,5 ml cada e
armazenados em freezer -70ºC. Uma alíquota foi armazenada na soroteca e a
outra para execução dos ensaios moleculares.
3.5 - Extração do RNA Viral
A obtenção do RNA viral foi realizada através do kit QIAamp® viral RNA Kit
(QUIAGEN®, USA) conforme instruções do fabricante. Em cada tubo estéril tipo
ependorf de 1,5 mL foram adicionados 280 µL de soro e 560 µL do tampão AVL
(“Viral Lysis Buffer”). Os tubos foram vigorosamente homogeneizado por 15 s
(segundos), incubado a temperatura ambiente por 10 min para completa lise da
partícula viral e a seguir, centrifugado por 1min a 12.000 rpm. Após centrifugação
foi adicionado 560 µL de etanol absoluto, homogeneizado e centrifugados por 1
min a 12.000 rpm. Após centrifugação 630 µL da solução foram colocados em
colunas com membrana de sílica-gel, acoplados a bases coletoras e
centrifugadas por 1 min a 12.000 rpm.
Após este período, as bases de acoplamento da coluna foram descartadas
e substituídas por novas. Novamente foram transferidos 630 µL da solução dos
tubos para as colunas, centrifugadas por 1 min a 12.000 rpm, e substituídas às
bases. Foi adicionados 500 µL de tampão AW1 (“Washer Buffer 1”), centrifugados
por 1 min a 12.000 rpm e substituídas as bases.
Outro tampão, o AW2 (“Washer Buffer 2”) foi adicionado na coluna, em um
volume de 500 µL, centrifugado por 3 min a 12.000 rpm para lavagem das
colunas. Após a centrifugação, as bases foram descartadas, as colunas
acopladas a tubos estéreis de 1,5 mL e adicionados 60 µL de tampão AVE
(“Elution Buffer”) no centro das colunas para eluição do RNA. As colunas
acopladas aos tubos foram centrifugadas por 1 min a 12.000 rpm. Por fim as
colunas foram descartadas, e os tubos, contendo o RNA viral, foram quantificados
por espectrofotômetro para medir a concentração e pureza do RNA da amostra
extraída (NanoDrop 1000 – Thermo Scientific). Após esta etapa as amostras
foram armazenadas em freezer a -70ºC.
3.6 - Reação de Transcrição Reversa - RT
A produção do DNA complementar (cDNA) ocorreu através da reação de
transcrição reversa (RT) logo após a extração do RNA viral. Na primeira etapa
deste processo o RNA viral extraído foi submetido a 70°C por 10 min e a 4°C por
igual período, utilizando-se para cada amostra, 1 µL de iniciadores aleatórios
[500µg/ml] (Random Primers - Promega). Na segunda etapa, ao produto da
primeira foram acrescentados para cada amostra o volume de 4 µL de solução
tampão 5X (First Strand Buffer 5X Invitrogen), 2 µL de Dithiothreitol 0,1 M (Ultra
PureTM Dithiothreitol Invitrogen), 3 µL de Desoxinucleotídeos (100 mM dNTP
Invitrogen) e 0,5 µL de inibidor de RNase [40U/µL] (RNaseOUTTM Recombinant
Ribonuclease Inhibitor Invitrogen), e incubados a 42°C por 2 min em
termociclador. Ao final desta etapa, adicionou-se 0,5 µL de transcriptase reversa
[200U/µL] (SuperScriptTM II Reverse Transcriptase Invitrogen) submetido a
incubação, por 50 min a 42°C. O processo de síntese de cDNA gerou um produto
final de aproximadamente 20 µL de cada amostra. O material foi mantido em
congelador a -20ºC até a PCR. Todas as incubações da síntese de cDNA foram
feitas em termociclador ABI Prism 7500 Veriti (Applied Biosystems).
3.7 - Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real – PCR em Tempo
Real
3.7.1 - Primers
Utilizou-se a PCR em tempo real inicialmente como qualitativa para
detecção do genoma VHC, com seqüências de “primers” e sondas selecionados
na literatura e analisados por bioinformática, através de alinhamentos múltiplos
das seqüências disponíveis no banco de dados do Blast – “National Center for
Biotechonolgy”
do
NCBI
“National
Center
Bank
Bioinformatic”
(http:
//www.ncbi.nlm.nih.gov) para a seqüência dos “primers” que amplificam um
fragmento de 190pb e sondas genótipo específico referente à região 5` NCR
(Tabela 1) (Lindh et.al., 2005).
Tabela 1: Mostra a seqüência dos “primers” e sondas utilizados para detecção e
genotipagem do VHC.
Primer
Seqüência
TM
VHC F
VHC R
Sonda Gt1
5`CTGCGGAACCGGTGAGTACA 3`
5` TGCACGGTCTACGAGACCTCC 3`
FAM 5`ACCCGGTCGTCCTGGCAATTCC 3` TAMRA
60°C
68.9°C
Sonda Gt2
VIC 5`AAGGACCCAGTCTTYCCGGYAATTC 3` TAMRA
68.7°C
Sonda Gt3
NED 5`ACCCGGTCACCCCAGCGATTCC 3` TAMRA
70.7°C
Sonda Gt4
FAM 5`CCCGGTCATCCCGGCGATTC 3` TAMRA
69.4°C
3.7.2 - Curva de Eficiência
A curva de eficiência foi determinada de acordo com Too (2003), por meio
da fórmula:
e = (10 1/slope) -1.
3.7.3 - Especificidade da Reação
A avaliação da especificidade do PCR em tempo real foi utilizada a
equação s = (1+ e) DCt, onde “e” significa a eficiência da amplificação e o “DCt” a
diferença dos valores dos Cts da amostra (Too, 2003).
3.7.4 - Avaliação da Reprodutibilidade
Para analise da reprodutibilidade do sistema foram utilizados controles
diluídos seriadamente e processados em duplicata juntamente com as amostras
de VHC com genótipo e carga viral desconhecida, sendo o mesmo experimento,
repetido três vezes.
3.7.5 - Determinação da Sensibilidade Analítica do Método
A determinação da sensibilidade em relação à quantificação das amostras
foram utilizados controles positivos. Sendo que um controle RNA do VHC foi
produzido “in house” comparado com o controle transcrito de RNA do VHC cedido
pelo Laboratório de Virologia da fundação Biomèrieux, referente à região de
5`NCR com fragmento de 90pb.
O outro controle utilizado foi o Kit Comercial com painel de quantificação do
RNA OptiQuant VHC (Acrometrix, USA). Uma amostra do painel com
determinação de 5.000,000 UI/mL foi diluída em plasma humano negativo para
VHC em 5.000,000 UI/mL, 500.000 UI/mL, 50.000 UI/mL, 5.000 UI/mL, 2.500
UI/mL, 1.250 UI/mL e 500 UI/mL. O cDNA dessas amostras foram utilizados na
quantificação por PCR em tempo real.
3.7.6 - PCR em Tempo Real Qualitativa – Sistema SYBR GReen
A reação foi realizada em um volume total de 20 µL, sendo que as
amostras analisadas foram processadas em duplicatas. O mix da reação era
composto de 10 µL do SYBR Green Master Mix (AppliedBiosystems, CA, USA),
0,5 µL do “primer” VHC F e VHC R em uma concentração de 300nM, conforme
seqüência mencionada na tabela 1,5 µL de cDNA e um volume de água ultra pura
para completar o volume final da reação.
Todas as amostras foram produzidas em duplicata. A reação foi
processada utilizando a plataforma tecnológica ABI PRISM 7500 SDS (Applied
Biosystems, Foster CA, USA), em 40 ciclos com ciclagens 50°C por 2 min, 95°C
por 10 min, 45 ciclos de 95°C por 15 s, 60°C por 1 min e um único ciclo de 95°C
por 15 s, 60°C por 1 min para analise da dissociação. A velocidade de incremento
da rampa de temperatura foi ajustada para simular o termociclador de 9600.
3.7.7 - PCR em Tempo Real Qualitativa – Sistema TaqMan
A reação foi realizada em um volume total de 20 µL, sendo 10 µL do kit
TaqMan PCR Master Mix (Applied Biosystems), com 300nM de cada “primer”
VHC F e VHC R e 50nM das sondas referentes ao genótipo 1, 2 e 3, conforme
seqüência mencionada na tabela 1, 5 µL de cDNA e um volume de água ultra
pura para completar o volume final da reação. A reação foi processada utilizando
a plataforma tecnológica ABI PRISM 7500 SDS (Applied Biosystems, Foster CA,
USA), com ciclagens 50°C por 2 min, 95°C por 10 min, 45 ciclos de 95°C por 15 s,
60°C por 1 min. A velocidade de incremento da rampa de temperatura foi ajustada
para simular o termociclador de 9600.
3.7.8 - PCR em Tempo Real Quantitativa
Na PCR em Tempo Real quantitativa foram utilizados os sistemas SYBR
Green e TaqMan, sendo realizada baseada em uma curva padrão externa que
consiste em alíquotas de concentrações conhecidas do alvo molecular objeto do
estudo. A amplificação e detecção da curva padrão são realizadas paralelamente
com as amostras que se quer quantificar. Para a construção desta curva utilizouse a técnica clonagem a partir da inserção da região 5’ NCR do VHC em um vetor
de clonagem juntamente com controles positivos comerciais.
3.8 - Reação em Cadeia da Polimerase – PCR Convencional
Para a produção da curva padrão utilizou inicialmente a PCR convencional
qualitativa, para amplificação do fragmento de 190pb referente à região 5` NCR,
mesmo “primer” utilizado na PCR em Tempo Real. Um plasmídeo com inserto de
190pb foi clonado, sendo transcrito para uma molécula de RNA. O cDNA do
transcrito quantificado foi submetido a PCR em tempo real em duplicata
juntamente com as amostras desconhecidas e os controles positivos em triplicata.
Para a PCR convencional selecionou-se 02 amostras com carga viral
conhecida. Aproximadamente 50ng do cDNA foram usados numa reação com
volume final de 50µL, sendo 5 µL do Tampão 10x concentrado da enzima
(200mM Tris-HCL [pH 8,4], 500mM KCL), 2mM de Cloreto de Magnésio (MgCl2)
50mM, 0,1mM dNTPs e 0,3 µM de cada “primer” (Tabela 1) e 1,5U de DNA
polimerase (Platinum® Taq DNA polymerase, Invitrogen). As amplificações foram
realizadas no termociclador ABI Prism 7500 Veriti (Applied Biosystems) com uma
temperatura de desnaturação inicial de 94oC por 5 min, seguida de 40 ciclos de
94oC por 1 min, 53oC por 1 min, 72 oC por 2 min e uma extensão final de 10 min a
72oC.
O resultado das amplificações foi detectado por eletroforese em gel de
agarose a 1,9%, corado com brometo de etídeo 1µg/mL, visualizados em luz
ultravioleta e digitalizados pelo UVP Vision Works (UVP, Inglaterra).
3.8.1 - Purificação dos Fragmentos Utilizando “QIAquick Gel Extraction Kit”
(Qiagen-USA)
As
bandas
correspondentes
aos
fragmentos
amplificados
foram
seccionadas do gel de agarose, colocadas em tubo tipo eppendorf, adicionandose 300 µL de “QG Solubilization buffer”, incubou-se a temperatura de 50°C por 5
min para solubilização da agarose, em seguida adicionou-se 150 µL de álcool
isopropilico e incuba-se a temperatura ambiente por 5 min. Adicionou-se todo o
volume na coluna fornecida no kit, centrifugou-se por 1 min a 8000 rpm,
descartou-se o sobrenadante e lavou-se a coluna com 750 µL de “Buffer PE
Wash” , centrifugou-se novamente por 8000 rpm por 1 min novamente, descartou-
se o sobrenadante, identificou-se outro tubo eppendorf e lavou-se a coluna com
40 µL de “Buffer EB Elution buffer”.
3.8.2 - Preparação de Bactérias Competentes
O preparo de células competentes seguiu a metodologia descrita por
Messing (1979). Bactérias E. coli TOP 10’F, estocadas a –70oC em meio LB/
DMSO 10% (Dimetilsulfóxido) foram semeadas em placas contendo LB/ágar a
1,5%, e incubadas a 37oC por 18 h. Uma colônia foi inoculada em 5 mL de meio
LB para crescimento durante 18 a 20 h a 37oC em agitação constante (250
rpm/min) e então 0,5 mL desta cultura foram inoculados em 50 mL de meio LB. As
culturas foram coletadas em fase exponencial de crescimento determinada
quando a absorbância a 600 nm (nanômetro) estava entre 0,35 e 0,45. As
bactérias foram sedimentadas por centrifugação a 4.000 rpm, por 10 min a 4oC, e
logo suspensas em 0,5 volumes de uma solução de CaCl2 50mM. Após 2 h de
incubação em gelo, as bactérias foram centrifugadas e o precipitado suspenso em
0,8 vol. de tampão FSB (Acetato de potássio 10 mM pH 7,5; MnCl2. 4H2O 45 mM;
CaCl2.2H2O 10 mM; KCl 100 mM; Glicerol 10%). Para armazenamento foi
adicionado DMSO a 10% e a preparação distribuída em alíquotas de 200 µL,
congelada em nitrogênio líquido e posteriormente estocadas a –70oC.
3.8.3 - Clonagem dos Amplicons Purificados
Para a clonagem do fragmento de 190pb purificado do produto
amplificados foi ligado ao vetor pTZ57R/T (Fermentas, Life Sciences) (Figura 9)
pela ligação T-A.
Figura 9: Mostra o vetor pTZ57R/T utilizado para produção da curva padrão.
Para a ligação T-A, aproximadamente 100 ng (4 µL) do produto purificado
da PCR foi usado numa reação de 6 µL que continha 1 µL do tampão 10X e 1 µL
do vetor pTZ57R/T. A solução final foi misturada e incubada por 30 min a
temperatura ambiente. Após incubação, adicionou-se 2 µL da reação a 200 µL de
células competentes (E. coli TOP 10’F) e incubou-se no gelo por 15 min e logo
após por 42°C por 60 s, retornou-se ao gelo por mais 15 min e em seguida
adicionou-se 150 µL de meio de cultura SOC (Gibco) à solução, que foi submetida
à agitação constante de 215 rpm, durante 30 min a 37°C. Após agitação, 150 µL
da reação foram aplicados em uma placa contendo meio sólido LB/Agar, 100
µg/mL de ampicilina, IPTG/X-Gal e incubada a 37°C por 16 h. As colônias brancas
nas placas LB/Agar, foram processadas para o isolamento do DNA plasmidial,
pois é esperado que estas contenham o inserto.
3.8.4 - Extração do DNA Plasmidial (Miniprep)
As colônias resultantes da transformação foram selecionadas com base na
mudança de coloração. As colônias brancas foram escolhidas ao acaso nas
placas LB/Agar/ IPTG/X-gal, e processadas para isolamento de DNA plasmidial.
As colônias foram cultivadas em 2 mL de meio LB/ampicilina a 37oC por 18 h, em
agitação constante (280 rpm/min) e os plasmídeos foram extraídos usando o
procedimento de mini-preparação descrito em Sambrock et al., (1989).
3.8.5 - Análise do DNA Plasmidial Através de Enzimas de Restrição
Para analisar se os plasmídeos extraídos pela metodologia de “miniprep”
possuíam o inserto, foram utilizadas as enzimas de restrição Bam HI e Eco RI
(Invitrogen® - USA). Para isso foram utilizados 3 µL do produto de miniprep, 1µL
de tampão 10X “react” 3, 0,8µL de Bam HI e 0,6 de Eco RI, água ultra pura 10µL,
o mix foi incubada a 37°C por 2 h.
O gel de agarose a 2,0%, acrescido de brometo de etídio 1µg/mL (Sigma
Chemical Company, St. Louis, USA), foi usado para confirmação e visualização
da ligação do inserto ao vetor de clonagem. Os produtos de digestão foram então
comparados a marcador de 50 pb (Invitrogen®-USA), visualizados em
transluminador UV.
3.8.6 Linearização do Plasmídeo
Após a confirmação do processo de clonagem através da digestão
enzimática, foi realizada a linearização do plasmídeos extraídos com a enzima de
restrição Eco RI (Invitrogen® - USA). Para isso foram utilizados 3 µL do produto
de miniprep, 1µL de tampão 10X “react” 3 , 0,5 µL de Eco RI e água ultra pura, a
mistura foi incubada a 37°C por 2 h.
O gel de agarose a 2,0%, acrescido de brometo de etídio 1µg/mL (Sigma
Chemical Company, St. Louis,USA), foi usado para confirmação e visualização do
processo de linearização do vetor de clonagem. Os produtos de digestão foram
então comparados a marcador de 50 pb (Invitrogen®-USA), visualizados em
transluminador UV.
3.8.7 - Purificação do Plasmídeo Linearizado
A purificação do fragmento linearização após corte com enzimas de
restrição foi realizada com uso de kit “QIAquick Gel Extraction Kit” (QIAGENUSA), conforme instrução do fabricante, descrito no item 3.8.1.
3.8.8 - Produção do Transcrito do VHC
Para a produção do transcrito de RNA do VHC os plasmídeos foram
quantificados por espectrofotometria seguida da digestão enzimática com a
enzima de restrição Eco RI (Invitrogen® - USA), conforme metodologia descrita
no item 3.8.6. Os produtos de digestão foram então comparados a marcador de
peso molecular (Invitrogen®-USA), visualizados em transluminador UV.
Após a confirmação da digestão enzimática, o produto restante da reação
de digestão (45 µL) foi utilizado para o processo de extração pelo método Fenolclorofórmio. No produto da digestão do plasmídeo foi adicionado 1 volume de
Fenol:clorofórmio:álcool isoamílico na proporção 25:24:1, agitou-se a mistura em
vortex e centrifugou-se por 2 min a 12000 rpm. A fase aquosa transparente
superior foi transferida para um novo tubo de 1,5 mL e adicionou-se 1 volume de
clorofórmio:álcool isoamílico na proporção 24:1 agitou-se a mistura em vortex e
centrifugou-se por 2 min a 12000 rpm. Novamente, a fase aquosa transparente
superior foi transferida para um novo tubo de 1,5 mL para adição de 0,1 volume
de Acetato de Sódio 3M pH 5,2 (Promega) e 2,5 volume de etanol absoluto,
incubando-a por 5 min a 4°C. Logo após esta etapa centrifugou-se por 10 min a
14 000 rpm. O sobrenadante foi descartado e adicionando-se o mesmo volume de
etanol a 70%, centrifugou-se por 10 min a 14 000 rpm. Descartou-se o
sobrenadante e o excesso de etanol foi retirado em um concentrador (Eppendorf,
Alemanha) por 5 min. O pellet foi ressuspenso em 10 µL de água nuclease free
(Promega). Após esta etapa ocorreu a transcrição do DNA plasmidial extraído
utilizando o kit RiboMaxTM em larga escala para produção do RNA em sistema
T7 (“RiboMaxTM Large Scale RNA production system T7”, Promega), conforme
instrução do fabricante utilizando controles positivos.
Para reação foi utilizado um mix com os seguintes componentes: 8 µL
Tampão T7 5x da transcrição, 6 µL rNTPs (25mM ATP, CTP, GTP e UTP), 12 µg
do DNA plasmidial extraído, 4 µL Mix da Enzima T7 e a água livre de nuclease foi
adicionada para completar o volume de 40 µL da reação. As amostras foram
incubadas a 37°C por 4 h. Logo após, adicionou-se 2 U de RNase free DNase/µg
de DNA e incubados a 37°C por 1 h. Em seguida ocorreu a purificação do
transcrito de RNA, com adição de 1 volume de fenol (pH 4.5):clorofórmio: álcool
isoamílico (24:25:1), agitou-se a mistura em vortex e centrifugou-se por 2 min a
12000 rpm. A fase aquosa transparente superior foi transferida para um novo tubo
de 1,5 mL e adicionou-se 1 volume de clorofórmio:álcool isoamílico na proporção
24:1 agitou-se a mistura em vortex e centrifugou-se por 2 min a 12000 rpm.
Novamente, a fase aquosa transparente superior foi transferida para um novo
tubo de 1,5 mL para adição de 1/10 volume de acetato de sódio 3M pH 5,2
(Promega) e álcool isopropanol, incubando-a por 5 min a 4°C. Logo após esta
etapa centrifugou-se por 10 min a 14 000 rpm. O sobrenadante foi descartado e
adicionado o mesmo volume de etanol a 70%, centrifugando-o por 10 min a
14.000 rpm. Descartou-se o sobrenadante e o excesso de etanol foi retirado em
um concentrador (Eppendorf, Alemanha) por 5 min. O pellet foi ressuspenso em
20 µL de água nuclease free (Promega) e armazenados a -70°C.
3.8.9 - Quantificação do Transcrito
O transcrito de RNA foi quantificado por espectrofotômetro para medir a
concentração e pureza do RNA (NanoDrop 1000 – Thermo Scientific). A
quantificação absoluta foi utilizada para determinação do número exato de
moléculas de RNA transcrito para determinação da carga viral. Após a
quantificação foi determinado o numero de cópias/µL do transcrito de RNA
baseado na formula abaixo. As
amostras
quantificadas
foram diluídas
seriadamente e submetidas à reação de transcrição reversa (RT), conforme
metodologia descrita 3.6.
Número de cópias do transcrito = (X g/µL RNA/ [tamanho do transcrito em pb x
340]) x 6,022 x 1023
3.9 - Genotipagem do VHC
Para genotipagem das amostras do VHC foram utilizados as seguintes
técnicas: seqüenciamento e a PCR em tempo real utilizando sondas especificas
para os genótipos 1, 2 e 3 descrita na tabela 1.
3.9.1 - Seqüenciamento das Amostras de VHC
Das 100 amostras analisadas 40 amostras foram escolhidas de forma
aleatórias para realização do seqüenciamento no Laboratório de Metabolismo
Macromolecular Firmino Torres de Castro da Universidade Federal do Rio de
Janeiro, gentilmente cedido pelo Prof. Dr. Edson Rondinelli, Dra. Rosane Silva e
Dr. Túran P. Ürményí, utilizando o seqüenciador MegaBACE (GE Healthcare Life
Sciences), sem prévia clonagem e “primers” que amplificam fragmento da região
NS5b do vírus.
3.9.2 - Reação de PCR para Seqüenciamento das Amostras de VHC
Inicialmente foi realizada uma PCR para detecção do VHC nas amostras
de cDNA selecionadas. Para reação foram utilizados “primers” que amplificam um
fragmento de 260pb da NS5b do vírus VHC, sendo 5 µL do Tampão 10x
concentrado da enzima (200mM Tris-HCL [pH 8,4], 500mM KCL), 2mM de Cloreto
de Magnésio (MgCl2) 50mM, 2,5mM dNTPs e 30pmol/µL de cada “primer”, e 5U
de DNA polimerase (Taq DNA polymerase, Invitrogen), 10 µL de cDNA e água
ultra pura para completar o volume final de 50 µL. As amplificações foram
realizadas no termociclador 9700 (Eppendorf), seguida de 25 ciclos com
temperaturas 94oC por 15 seg, 53oC por 15 seg, 72oC por 15 seg, após esta
ciclagem foi realizada uma extensão final de 10 min a 72oC.
O resultado das amplificações foi detectado por eletroforese em gel de
agarose a 1,5%, corado com brometo de etídeo 1µg/mL, visualizados em luz
ultravioleta e digitalizados pelo UVP Vision Works (UVP, Inglaterra).
3.9.3 - Reação de Nested PCR para Seqüenciamento das Amostras de VHC
Os “amplicons” positivos na primeira PCR foram submetidos à Nested PCR
com “primers” que amplificam um fragmento de 215pb da NS5b do vírus VHC.
Para esta reação foram utilizados 5 µL do Tampão 10x concentrado da enzima
(200mM Tris-HCL [pH 8,4], 500mM KCL), 2mM de Cloreto de Magnésio (MgCl2)
50mM, 2,5mM dNTPs e 30pmol/µL de cada “primer”, e 5U de DNA polimerase
(Taq DNA polymerase, Invitrogen), 5 µL do “amplicon” e água ultra pura para
completar o volume final de 50 µL. As amplificações foram realizadas no
termociclador 9700 (Eppendorf), seguida de 25 ciclos com temperaturas 94oC por
15 seg, 53oC por 15 seg, 72oC por 15 seg, após esta ciclagem foi realizada uma
extensão final de 10 min a 72 oC.
O resultado das amplificações foi detectado por eletroforese em gel de
agarose a 1,5%, corado com brometo de etídeo 1µg/mL, visualizados em luz
ultravioleta e digitalizados pelo UVP Vision Works (UVP, Inglaterra).
3.9.4
-
Purificação
do
Produto
da Reação
de
Nested
PCR
para
Seqüenciamento das Amostras de VHC
Após a confirmação da amplificação das amostras por Nested PCR, foi
realizada a purificação do “amplicon” pelo kit microcon (Montáge® life science
kits) conforme instrução do fabricante. Em um tubo de 1,5 mL foi acoplada a
coluna com o filtro (kit), onde foram adicionados 200 µL de água destilada e todo
o “amplicon” para centrifugação por 20 min a 4400 rpm.
Após este período
identificou-se um novo tubo de 1,5 mL transferindo a coluna com o filtro e
adicionou-se 30 µL de água destilada dentro da coluna centrifugando por 20 min a
4400 rpm. Descartou-se a coluna e armazenou-se - 20°C.
3.9.5 - Reação de Seqüenciamento
As amostras foram submetidas à detecção no seqüenciador automático
MegaBACE (GE Healthcare Life Sciences) utilizando protocolo e programação
padrão de corrida com parâmetros padronizados pelo laboratório.
4. RESULTADOS
4.1 - Analise dos “primers”
Os “primers” selecionados VHC F e VHC R mostraram-se específicos para
o vírus da hepatite C quando analisado através do programa Blast, conforme
figura 10 e 11. A eficiência dos “primers” foi demonstrada quando as amostras
analisadas foram amplificadas utilizando as técnicas PCR em tempo real e na
PCR convencional.
Figura 10: Alinhamento realizado no BLAST com “primer” VHC F, mostrando uma
máxima identidade entre as cepas utilizadas no alinhamento.
Figura 11: Alinhamento realizado no BLAST com “primer” VHC R, mostrando uma
máxima identidade entre as cepas utilizadas no alinhamento.
4.2 - PCR em Tempo Real Qualitativa
Inicialmente foi realizada a padronização da reação de transcrição reversa
(RT) das amostras de VHC. Para esta etapa foram utilizadas 05 amostras,
selecionadas de forma aleatória e em uma reação em duas etapas.
Os resultados referentes à padronização do processo de RT foram
observados na PCR em tempo real de acordo com ciclo de amplificação (Ct). Os
05 cDNAs tiveram resultados similares em ambos sistemas, estes resultados são
demonstrados na tabela 2.
Tabela 2: Ct de amplificação do resultado obtido na reação de PCR em tempo real,
utilizando os sistemas TaqMan e SYBR Green, referente a padronização da RT.
Amostras
PCR em Tempo Real
Sistema TaqMan
Sistema SYBR Green
1236
Ct = 22,40
Ct = 22,70
1802
Ct = 23,88
Ct = 23,11
755
Ct = 31,92
Ct = 30,86
3018
Ct = 32,97
Ct = 32,14
2418
Ct = 32,98
Ct = 31,85
4.2.1 - PCR em Tempo Real Qualitativa
Pelo sistema SYBR Green os “primers” VHC F e VHC R foram testados em
varias concentrações finais que variava entre 300nM a 600nM, juntamente com
uma amostra controle positivo para VHC. Verificou-se que o comportamento da
reação em relação ao gradiente de concentração não diferenciava em relação ao
Ct de amplificação, conforme figura 12.
Figura 12: PCR em tempo real utilizando o sistema SYBR com a variação de
concentração do “primer”. Amplificação no Ct 24,1= 300nM, Ct 24,7 = 400nM, Ct 25,4 =
500nM e Ct 25,8 = 600nM.
A segunda analise refere-se aos cDNAs de 05 amostras de VHC, testadas
em duplicatas, utilizando a concentração final do “primer” em 500nM e 600nM, já
que diferença foi mínima entre os Cts dessas concentrações. A partir dessa
analise ficou determinada concentração de 500nM para o “primer”. A tabela 3
demonstra a média dos valores dos Cts nas duas concentrações avaliadas.
Tabela 3: Valores dos Cts de amplificação das amostras testadas para as concentrações
finais dos primers” 500nM e 600nM.
Amostras
Sistema SYBR Green
1236
“Primer” VHC F e VHC R
(500nM)
Ct = 22,40
“Primer” VHC F e VHC R
(600nM)
Ct = 22,12
1802
Ct = 23,88
Ct = 23,43
755
Ct = 31,92
Ct = 31,90
3018
Ct = 32,97
Ct = 32,76
2418
Ct = 32,98
Ct = 32,24
As 100 amostras de VHC utilizados neste estudo amplificaram com “primer”
na concentração de 500nM, testadas em duplicatas, conforme figura 13a.e 13b.
Figura 13a: Amostras de VHC amplificadas com “primers” na concentração final de
500nM utilizando o sistema SYBR Green.
Figura 13b: Dissociação das amostras de VHC amplificadas com “primers” na
concentração final de 500nM utilizando o sistema SYBR Green
4.3 - Produção do Plasmídeo para Construção da Curva Padrão
4.3.1 - Padronização da Reação de PCR Convencional
O controle positivo VHC foi utilizado para realização de um gradiente de
temperatura de anelamento dos “primers” com concentração final de 500nM, as
temperaturas testadas foram 55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°C, 60°C e 61°C, todas
as amostras amplificaram, produzindo um “amplicon” correspondente ao tamanho
190pb, conforme demonstrada na figura 14.
M
1
2
3
4
5
6
7
190pb
250pb
Figura 14 – Perfil eletroforético do gel de agarose a 2.0%, mostrando o gradiente de
temperatura dos “primers” VHC F e VHC R para amplificação do fragmento da região
5`NCR correspondentes a 190pb. Coluna M- peso molecular 50 pb, Coluna 1: T-55°C;
Coluna 2: T-56°C; Coluna 3: T-57°C; Coluna 4: T-58°C; Coluna 5: 59°C; Coluna 6:
60°C e Coluna 7: 61°C.
A temperatura de anelamento escolhida para amplificação das amostras foi
60°C. Cinco amostras amplificaram juntamente com o controle positivo, conforme
figura 15.
M
250pb
1
2
3
4
5
6
7
190pb
Figura 15 – Perfil eletroforético do gel de agarose a 2.0%, mostrando os “amplicons” da
RT-PCR com uso de “primers” VHC F e VHC R para amplificação do fragmento da região
5`NCR correspondentes a 190pb. Coluna M- peso molecular 50 pb, Coluna 1 a 5:
Amostras de VHC; Coluna 6: Controle Positivo de VHC; Coluna 7: Controle branco.
4.3.1 - Digestão do DNA Plasmidial
Na confirmação da clonagem 07 clones foram obtidos pelo processo de
digestão enzimática, conforme figura 16.
pTZ 2886 pb
250pb
190 pb
Figura 16: Perfil eletroforético do gel de agarose 2.0%, acrescido de brometo de etídio
0.1%. Digestão enzimática com Bam HI e Eco RI, dos produtos de clonagem em vetor
pTZ e fragmento do VHC. Coluna M: peso molecular de 50 pb; Colunas 1-7: pTZ ligado
ao “amplicon” do VHC.
4.3.1.1 - Digestão do Plasmideo Controle
No processo de re-transformação no plasmídeo controle positivo foi obtidos
04 clones, conforme figura 17.
M
1
2
3
4
5
pBluescript II SK 3.0 Kb
200pb
90 pb
Figura 17: Perfil eletroforético do gel de agarose 2.0%, acrescido de brometo de etídio
0.1%. Digestão enzimática com Bam HI e EcoRI, do plasmideo controle re-transformado
contendo fragmento do VHC. Coluna M: peso molecular de 50 pb; Colunas 1,2,4 e 5:
plasmídeo controle ligado ao “amplicon” do VHC.
4.3.2 - Linearização do Plasmídeo
Foram produzidos 04 clones linearizados com Eco RI para produção do
transcrito de VHC, conforme figura 18.
M
1
2
3
4
3055 pb
Figura 18: Em M: Marcado de peso molecular de 100pb. Linha 1 a 4: plasmídeo pTZ
Linearizado com a enzima de restrição EcoRI.
O plasmideo controle linearizado produziu 04 clones para ser utilizado
como controle na produção do transcrito de RNA de VHC, conforme figura 19.
M
1
2
3
4
3090pb Vetor + Inserto
Figura 19: Em M: Marcado de peso molecular de 100pb. Linha 1 a 4: plasmídeo controle
Linearizado com a enzima de restrição Eco RI.
4.4 Transcrito de RNA
Foram transcritos os 4 plasmídeos linearizados selecionados, sendo 02
plasmídeos clonados no vetor pTZ e 2 plasmídeos controles positivos, conforme
figura 20.
1
2
3
4
5
6
Figura 20: Transcrito do RNA de VHC. Linha 1 e 6: Controle positivo de RNA Linha 2 a 5:
RNA do HCV de amostras de pacientes.
4.4.1 Quantificação e Diluição do Transcrito
Os transcritos de RNA de VHC quantificados por espectofotometria com
699,0 ng/µL e 1,121,2 ng/µL foram caracterizados como transcrito RO (TRO) e
transcrito controle positivo (TCont+), respectivamente, obtendo o resultado em
copias/µL. A diluição seriada do transcrito quantificado é demonstrada na tabela
4.
Tabela 4: Diluição seriada dos transcritos de VHC quantificados TRO e TCont+
Transcritos de RNA de VHC
Quantificação TRO do VHC
Quantificação TCont+
Método “in house”
do VHC
6000000000000
20000000000
600000000000
2000000000
60000000000
200000000
6000000000
20000000
600000000
2000000
60000000
200000
6000000
20000
600000
2000
60000
20
6000
600
4.5 - Construção da Curva Padrão - PCR em Tempo Real Quantitativa
Os cDNAs do transcrito diluído seriadamente foram amplificados por PCR
em tempo real, sendo realizadas ao todo cinco reações para avaliação da curva
padrão, utilizando uma curva de sete pontos (sete diluições) para o transcrito
TRO, uma curva de seis pontos (seis diluições) e uma curva de seis pontos (seis
diluições) para o kit comercial. Foi observado entre essas reações uma variação
de um a dois Cts de diferenças de cada transcrito analisado, conforme tabela 5.
Tabela 5: Avaliação da reprodutibilidade da curva padrão para os Transcritos.
Curva Padrão
Kit Comercial
5000000
500000
50000
2500
1250
500
Curva Padrão
Tcont+
2000
20000
200000
2000000
20000000
Curva Padrão
TRO
600
6000
60000
600000
6000000
60000000
600000000
Ct
Curva 1
25,36
28,58
32,44
35,56
36,38
38,53
Ct
Curva 1
37,99
33,72
30,94
27,61
23,01
Ct
Curva 1
38,45
34,78
31,74
27,57
24,81
22,17
21,91
Ct
Curva 2
25,12
28,84
32,41
35,63
36,42
38,5
Ct
Curva 2
36,12
32,64
29,78
27,23
22,56
Ct
Curva 2
37,62
34,92
31,03
27,06
24,02
22,84
20,14
Ct
Curva 3
25,68
28,6
32,46
35,62
35,96
38,32
Ct
Curva 3
37,43
32,83
29,86
27,99
22,37
Ct
Curva 3
36,58
34,21
31,95
27,91
24,63
23,45
20,73
Ct
Curva 4
26,92
28,57
32,43
34,52
35,94
38,41
Ct
Curva 4
37,12
33,23
31,2
26,32
23,12
Ct
Curva 4
37,93
33,93
30,93
28,04
23,84
23,02
21,62
Ct
Curva 5
25,42
28,59
32,61
34,91
36,12
38,01
Ct
Curva 5
36,86
33,09
30,56
26,02
22,38
Ct
Curva 5
38,86
35,04
31,22
26,83
25,09
21,92
22,33
Média Ct
25,7
28,63
32,47
35,24
36,16
38,35
DP
0,71
0,11
0,08
0,51
0,23
0,21
CV
3%
0%
0%
1%
1%
1%
Média Ct
37,10
28,63
32,47
27,03
22,68
DP
0,69
0,41
0,63
0,84
0,35
CV
2%
1%
2%
3%
2%
Média Ct
37,88
28,63
32,47
27,48
24,47
22,68
21,34
DP
0,87
0,48
0,45
0,53
0,53
0,63
0,89
CV
2%
2%
1%
2%
2%
3%
4%
Ct= threshold cycle, DP=Desvio Padrão e CV= Coeficiente de Variação
A reprodutibilidade dos testes foi observada através do coeficiente de
variação (CV) produzido por cada diluição analisada, enquanto que a
especificidade dos testes pela não obtenção de sinal em nenhum dos controles
negativos adicionados em cada corrida.
Não houve diferença significativa entre as médias do coeficiente de
variação (CV) de cada transcrito com p = 0,107, este resultado baseia-se nos
dados obtidos na tabela 5 e através da analise da variância, “ANOVA”, com α <
0,05. Outra analise de variância refere aos resultados obtidos da média do CV de
umas das concentrações analisadas com intervalo de confiança de 95%,
conforme tabela 6 (Anexo II).
Tabela 6: Média do Coeficiente de Variação
Amostras
Kit Comercial
TRO
Tcont+
Média do CV
1%
2%
2%
CV = Coeficiente de Variação
Desvio do CV
0,01
0,01
0,01
A curva linear de regressão foi usada para correlacionar o número de
cópias/µL ou UI/µL x Ct, resultando no percentual do coeficiente de determinação
(R2) de cada uma das concentrações dos transcritos analisados, dados mostrados
nas figuras 21, 22 e 23.
45
40
35
30
Ct Média
25
Log. (Ct Média)
Ct 20
15
10
5
0
100
1
10000
1000000 100000000 1E+10
1E+12
y = -1,2683Ln(x) + 45,65
Cópias/uL
2
R = 0,9692
Figura 21: Regressão linear da curva padrão para o transcrito TRO: correlacionando
número de cópias/µL x ct.
Curva Padrão
40
Ct
35
30
25
20
15
10
5
0
1
10
100
1000
10000
100000
1000000
10000000 100000000
Carga Viral
curva padrao
y = -1,4204Ln(x) + 47,767
Log. (curva padrao)
2
R = 0,9815
Figura 22: Regressão linear da curva padrão para o transcrito controle positivo:
correlacionando número de cópias/µL x ct.
45
40
35
Ct
30
25
Ct Média
20
Log. (Ct Média)
15
10
y = -1,5127Ln(x) + 48,613
R2 = 0,9949
5
0
1
10
100
1000
10000
100000 1000000 1E+07
carga viral UI/ml
Figura 23: Regressão linear da curva padrão para o kit de quantificação comercial:
correlacionando a carga viral x ct
Para avaliação da sensibilidade e reprodutibilidade dos testes foram
utilizados cDNAs de amostras de VHC testadas em duplicata para quantificação
juntamente com o cDNA diluído de cada um dos transcritos analisados, controle
negativo e um controle branco. Através do Ct obtido em cada reação, o número
de cópias foi calculado pelo software da plataforma ABI 7500 interpolando o Ct de
cada reação na relação linear observada entre os Ct da curva padrão dos
transcritos TRO, TCont+ e o kit comercial. Os resultados foram concordantes,
conforme mostra a tabela 7 e figura 24.
Tabela 7: Quantificação das amostras com o Transcrito TRO, TCont+ e o kit comercial.
Amostras de VHC
2540
2583
9264
2553
6469
1236
1802
2523
2709
1278
CONT+
CONT+
Kit Comercial UI/mL
51.201,00
75.626,00
129.187,00
85.182,00
44.564,00
28.429,00
70.788,00
18.621,00
44.121,00
2.728,39
23.703,00
1.505,05
TCont+ Copias/uL
57.099,00
86.502,00
152.998,00
98.188,00
49.251,00
30.514,00
80.621,00
19.455,00
48.563,00
3.928,43
25.055,00
2.084,68
TRO Copias/uL
40.009,00
63.707,00
120.656,00
73.421,00
33.903,00
19.833,00
58.877,00
11.974,00
33.373,00
4.572,12
15.904,00
2.248,73
Figura 24: Amostras amplificadas juntamente com os controles de quantificação.
Utilizando o teste da analise da variância com as amostras quantificadas
pelos transcritos TRO, TCont+ e o kit comercial, conforme dados mostrados na
tabela 7,
com α < 0,05 não houve diferença significativa entre as cargas virais
determinadas pelos transcritos analisados com p = 0,90, este resultado baseia-se
nos dados obtidos na tabela 10, possibilitando uma avaliação de concordância
dos testes analisados (Anexo III).
4.7 Especificidade do Teste
Para a avaliação da especificidade da reação os transcritos TRO, TCont+ e
o kit comercial foram testados com 03 amostras de plasma controle negativo
(Acrometrix), 02 amostras negativas para VHC e 01 amostra com carga viral
indetectavel pelos testes realizados. Todas as reações foram negativas para os
transcritos analisados.
4.8 - Genotipagem do VHC
4.8.1 – Genotipagem por PCR em Tempo Real
O “primer” VHC F e VHC R foi testado na concentração final de 500nM,
juntamente com variações de concentração feitas com as sondas Gt1, Gt2 e Gt3
genótipos específicos. Cada sonda foi testada separadamente utilizando
concentrações finais que variavam entre 100nM a 500nM. O resultado da
amplificação em relação a concentração variou dependendo do genótipo.
Observou-se que na sonda Gt1 a concentração final de 100nM não difere da
sonda a 200nM dentro do ciclo de amplificação, conforme figura 25.
Figura 25: PCR em tempo real utilizando o sistema TaqMan com a variação de
concentração da Sonda GT1 . Amplificação no Ct 23,78 = 100nM, Ct 23,81 = 200nM, Ct
24,86 = 300nM, Ct 26,01 = 400nM e Ct 29,86 = 500nM.
Em relação à sonda Gt2 a amostra controle para o genótipo 2 do VHC
apresentou uma boa amplificação exponencial, quando testada na concentração
final de 300nM. A sonda Gt3 apresentou melhores resultados quando utilizada em
uma concentração final de 400nM para detecção do genótipo 3.
Posteriormente analisou-se o sistema TaqMan com amostras de cDNAs
em duplicatas utilizando mesma concentração final do “primer” a 500nM com cada
sonda especifica. A sonda a 100nM para o genótipo 1, 300nM para o genótipo 2 e
400nM para genótipo 3. A tabela 8 mostra os valores dos Cts e a genótipo das
amostras analisadas.
Tabela 8: Valores dos Cts para as concentrações de “primers” e sonda analisadas e a
genotipagem das amostras:
Sistema TaqMan
Amostras
500nM/100nM Gt1 = 100nM; GT2 = 300nM e Gt3 = 400Nm
1236
Ct = 22,40
Genótipo 1
1802
Ct = 23,88
Genótipo 1
755
Ct = 31,92
Genótipo 1
3018
Ct = 32,97
Genótipo 3
2418
Ct = 32,98
Genótipo 3
2467
Ct = 29,27
Genótipo 2
Os cDNAs das 100 amostras analisadas para detecção do genótipo do
VHC foram caracterizados em 78% das amostras como genótipo 1, pois
amplificaram utilizando a sonda Gt1 na concentração final de 100nM, figura 26a.
Para o genótipo 2 foi detectado um percentual de 10%, figura 26b. O genótipo 3
foi detectado em 12% das amostras com sonda Gt3 400nM, conforme figura 26c.
Figura 26a: Amostras de VHC amplificadas utilizando o sistema TaqMan com sondas
marcadas com fluorófo que caracterizam o genótipo 1.
Figura 26b: Amostras de VHC amplificadas utilizando o sistema TaqMan com sondas
marcadas com fluorófo que caracterizam o genótipo 2.
Figura 26c: Amostras de VHC amplificadas utilizando o sistema TaqMan com sondas
marcadas com fluorófo que caracterizam o genótipo 3.
4.8.2 – Genotipagem por Seqüenciamento
Todas as 40 amostras submetidas ao seqüenciamento foram genotipadas,
apresentando resultados concordantes com PCR em tempo real referentes a
detecção dos genótipos 1, 2 e 3. Sendo que, 35 foram caracterizadas como
genótipo 1, 02 como genótipo 2 e 03 como genótipo 3.
5. DISCUSSÃO
A infecção causada pelo vírus da hepatite C (VHC) é considerada de
grande importância, sendo que nos últimos anos uma serie de progressos tem
sido realizado no estudo deste vírus. Mesmo com toda a evolução metodológica a
infecção pelo VHC representa um grande desafio mundial no que diz respeito à
saúde pública. Nas últimas décadas, o diagnóstico e a monitorização laboratorial
da infecção pelo vírus teve grandes avanços, como a criação dos testes
sorológicos baseados na pesquisa de anticorpos dirigidos contra antígenos do
vírus estruturais e não-estruturais, no plasma ou soro do paciente infectado. Estes
métodos não são totalmente conclusivos para a confirmação da infecção, pois
detectam anticorpo em mais de 97% das pessoas infectadas, sua especificidade é
excelente, no entanto possui limitações. Resultados falsamente positivos tendem
a ocorrer em doentes com baixo risco de infecção, tais como doadores voluntários
de sangue e trabalhadores de saúde. Os testes falsamente negativos apesar de
raros
são
mais
comuns
em
doentes
severamente
imunossuprimidos
(transplantados ou co-infectados pelo VIH em fase adiantada da doença) ou em
indivíduos que estejam no período de janela sorológica (Carithers et.al., 2000).
A implantação dos testes sorológicos na década de 90 foi responsável pela
queda dos casos de transmissão transfusional do VHC, no entanto ainda persiste
um risco residual a ser eliminado. Testes moleculares são candidatos a este
propósito por anteciparem o diagnóstico e também por serem utilizados como
ferramenta de auxilio no planejamento terapêutico. Estas situações justificam a
pesquisa do RNA viral do VHC através de métodos qualitativos e quantitativos
(carga viral) (Duarte, 2006). Testes quantitativos têm a vantagem de confirmarem
a presença de RNA do vírus e ao mesmo tempo determinarem à quantidade de
vírus em circulação, enquanto que os testes qualitativos são mais sensíveis para
a detecção do vírus; estes dois tornaram-se "padrão ouro" para diagnóstico e
avaliação da resposta terapêutica relacionado à hepatite C.
Para confirmação diagnóstica aconselha-se a determinação qualitativa do
RNA-VHC, de preferência pelo método da PCR. As determinações quantitativas,
por outro lado, mostram-se muito interessantes antes do início do tratamento,
juntamente com a determinação do genótipo, para definição da duração do
tratamento e monitorização da resposta terapêutica ou para acompanhamento de
casos não tratados.
A tecnologia de PCR em tempo real tem um potencial de aplicação como
um teste sensível o suficiente para o diagnóstico e confirmação da eliminação do
vírus nos casos de tratamento bem sucedido e também como teste quantitativo
capaz de monitorar a queda na carga viral de pacientes durante o tratamento
(Duarte, 2006). Vários testes moleculares principalmente utilizando a PCR em
tempo real, visando à detecção, quantificação e genotipagem do VHC em
amostras de soro, têm sido desenvolvidos com fins comerciais. Estes testes
possuem características de ótima sensibilidade na determinação do genótipo,
porém apresentam limitações na determinação dos subtipos e precisam de
profissionais altamente qualificados para sua realização, elevando muito o custo
(Nakatai, 2008).
Na busca do desenvolvimento de testes sensíveis, específicos, de alto
rendimento e menor custo, várias tecnologias têm sido utilizadas para criação de
ensaios para detecção qualitativa, quantitativa e genotípica do VHC. O objetivo do
trabalho vai de encontro à realidade, tornando-o ainda mais relevante e de
interesse tecnológico para a nossa região, principalmente porque visa à
padronização de uma técnica molecular para desenvolvimento de produtos com
fins de diagnóstico molecular, diminuindo os gastos associados à importação de
kits comerciais.
O presente trabalho iniciou com a padronização do método de extração do
RNA viral que possibilitasse detectar a presença do ácido nucléico do VHC, nas
amostras de pacientes que apresentassem tanto baixa quanto alta carga viral.
Então, optou-se em aumentar o volume de soro de 140 µL conforme indicada nas
instruções do fabricante para 280 µL com o objetivo de aumentar a sensibilidade
do teste, diminuindo as limitações de detecção nas amostras com menor número
de partículas virais. Duarte (2006) observou que a padronização de um teste para
detecção do RNA do VHC que utilize um maior volume de soro para extração é
considerada favorável principalmente na detecção de ácido nucléico empregada
na triagem de bancos de sangue, que prevê a formação de mini-pools
plasmáticos como também em pacientes que apresentem baixa carga viral.
No curso da infecção pelo VHC, diferentes condições dos marcadores
diagnósticos podem ocorrer em virtude das flutuações destes, utilizados como
anticorpos contra diferentes peptídeos virais. Estudos demonstram que na fase de
pós-soroconversão os níveis de RNA tornam-se indetectáveis em alguns
momentos, mesmo quando usados testes de alta sensibilidade (Hyland et.al.,
2003). Esta variação reflete o efeito da resposta imune sobre o vírus e passa a
ser motivo de preocupação principalmente para os serviços que adotam a triagem
de doadores através do uso de detecção do RNA viral nas amostras (Fang et.al.,
2003). O método de extração padronizado neste trabalho permitiu aumentar
qualidade do RNA viral extraído, o qual é crucial para a obtenção de bons
resultados utilizando a PCR em tempo real. Além disso, os resultados alcançados
demonstram que esta técnica pode ser útil em casos de investigação diagnóstica
em pacientes que apresentem baixa ou alta carga viral.
No processo de confecção do cDNA foi padronizado um protocolo
utilizando a enzima Superscript II para as amostras submetidas a transcrição
reversa, devido ao fato desta apresentar uma boa estabilidade térmica diminuindo
formações de estruturas secundárias. O “random primer” utilizado como iniciador
da reação, mostrou-se sensível quando submetidos à PCR em tempo real e
convencional. Alguns estudos afirmam que a utilização do “random primers”
favorece a origem de múltiplos segmentos diferentes de cDNA derivados do RNA
original e com isto a transcrição pode perder a sensibilidade (Lekanne
et.al.,2002). Outros estudos relacionados com a transcrição reversa apresentaram
resultados inconsistentes quando utilizaram o “random primer” juntamente com a
enzima M-MLV-RT (Moloney murine leukemia vírus-RT) na mesma reação,
provavelmente estes resultados estejam relacionados com a temperatura de
anelamento da transcrição reversa influenciando a formação de estruturas
secundárias na molécula de RNA (Stahlberg et.al.,2004). Apesar de que, o tipo de
“primer” utilizado na transcrição reversa também pode influenciar a eficiência da
reação (Bustin et.al.,2005). Estudos mostram que a utilização de “primer”
especifico melhora a sensibilidade do teste na PCR em tempo real (Lekanne
et.al., 2002), neste estudo não foi observada uma diminuição na sensibilidade
analítica do cDNA quando utilizado na amplificação por PCR em tempo real tanto
para o sistema TaqMan quanto para o SYBR Green, apresentando uma eficiência
de 100% em todas as amostras analisadas (Tabela 2). Estes resultados são
compatíveis com estudos relacionados à detecção do VHC utilizando os sistemas
TaqMan e SYBR Green (Bustin, 2000; Ji-Hong Yang et.al., 2002; Desombere
et.al., 2005).
A PCR em tempo real utilizada neste trabalho de forma qualitativa,
quantitativa e genotípica foi desenvolvida através da escolha de uma seqüência
nucleotídica do VHC baseado na região 5`NCR, que apresenta alto grau de
conservação, permitindo a melhora da sensibilidade na reação. Estudos
demonstram uma boa correlação da região 5` NCR quando comparados com a
região NSB, relacionada a genotipagem do vírus (Murphy et.al., 2007).
Testes qualitativos obtidos através da PCR em tempo real para o VHC
demonstram que “primers” desenhados com um número menor de nucleotídeos
obtêm eficiência máxima no processo de amplificação. Além disso, a temperatura
necessária para a atividade 5` exonuclease da Taq DNA polimerase 60°C
considerada ótima para a processividade da enzima (Kubista, 2004; Sueli
et.al.,2008). Os resultados obtidos neste trabalho condizem com relatados da
literatura, onde um conjunto de “primers” foi avaliado de acordo com regras
preestabelecidas como Tm de 60°C. Sendo que, foi possível detectar a presença
do VHC nas amostras analisadas qualitativamente, tanto na PCR convencional
através da produção de fragmento de 190pb, como na PCR em tempo real onde o
resultado foi visualizado pela Ct de amplificação.
Para obtenção destes resultados, inicialmente foi realizado um gradiente de
concentração dos “primers” por PCR em tempo real utilizando a plataforma de
temperatura padrão do aparelho. A primeira analise refere-se à melhor
concentração inicial que variava entre 2µM, 5µM e 10µM associada a
concentração final que variava de 300nM a 600nM. Verificou-se que o melhor
resultado foi obtido com a concentração inicial de 10µM e concentração final à
500nM onde o ciclo de amplificação ficou com uma característica mais
exponencial, apresentando uma boa eficiência para os testes realizados com o
sistema TaqMan e SYBR Green (Tabela 2). A seguinte etapa visava a melhor
concentração inicial de sonda para detecção do genótipo, com variação entre 2µM
e 5µM e concentrações finais entre 100nM a 500nM. Ficou determinado após
aplicação pelo sistema TaqMan uma concentração inicial a 5µM e concentração
final a 100nM, 300nM e 400nM para as sondas genótipo 1, 2 e 3 respectivamente.
As seqüências da sonda foram marcadas com fluorófos para determinar o
genótipo específico amplificado em reações separadas. Estudos demonstram que
“primers” e sondas numa mesma concentração de 200nM apresentam melhor
eficiência na reação (Sueli et.al., 2008). Enquanto que outros ensaios
demonstram que uma boa eficiência PCR em tempo real qualitativa e quantitativa
é obtida com “primers” na concentração final 400nM e sonda na concentração
200nM (Duarte, 2004). Esses resultados dependem da região do genoma do vírus
analisada e da reação a ser padronizada.
Para verificar a eficiência de cada sonda dos diferentes genótipos foram
realizados testes em duplicata. A sonda Gt1 para o genótipo 1 apresentou uma
melhor eficiência de detecção, do que as sondas Gt2 e Gt3 para o genótipo 2 e 3,
respectivamente. Testes que utilizam sondas para identificar diferentes genótipos
demonstraram maior eficiência para os genótipos 1 e 3, em reações onde as
sondas são colocadas no mesmo tubo (Sueli et.al., 2008). Existem poucos
trabalhos utilizando PCR em tempo real para genotipagem do VHC. Pela
plataforma TaqMan, Moghaddam (2006) descreve a determinação dos genótipos
1, 2 e 3a em 37 pacientes da Noruega. Houve uma correlação de 100% com
seqüenciamento da região 5`NCR. Outro estudo mostra 158 amostras que foram
analisadas por seqüenciamento para os genótipos 1, 2, 3 e 4 através de painéis,
mostrando uma correlação de 99% para o genótipo 1, 94% para o genótipo 2,
91% para o genótipo 3 e 100% para o genótipo 4 (Rolfe et.al., 2005). Do mesmo
modo, outros autores mostram que a genotipagem através da PCR em tempo real
pela plataforma TaqMan foi capaz de identificar 524 amostras de um total de 614
amostras e pode ser uma alternativa de baixo custo (Lindh et.al., 2005). Técnicas
alternativas foram desenvolvidas para genotipagem do VHC, utilizando sondas
FRET que identifica e analisa o vírus através da “melting curve” (Bullock
et.al.,2002).
Um estudo recente utilizando o método de genotipagem por PCR em
tempo real baseado na região NS5B, caracterizou o predomínio do genótipo 1 em
97,93% das amostras analisadas, demonstrando que a sensibilidade do método
pode estar relacionada com os desenhos das sondas (Sueli, 2008). Os resultados
obtidos com a genotipagem por PCR em tempo real são concordantes com dados
descritos na literatura em relação à prevalência do genótipo 1, principalmente
quando comparamos a região escolhida para detecção.
Apesar da alta
conservação da região 5`NCR, diferentes estudos mostram que a diferenciação
para o tipo do genótipo é acurada principalmente quando estes resultados são
comparados com a região NS5B (Cantaloube et.al.,2006; Sueli, 2008).
Em relação à caracterização do subtipo viral do VHC, nenhum método
baseado na região 5’ NCR pode ser utilizado com segurança para definição do
subtipo. Estudos demonstram que a falha na região 5’ NCR para subtipagem
principalmente entre os subtipos 1a e 1b, se deve ao fato que o fragmento
analisado difere somente em 1 nucleotídeo na posição 99 (Chen et.al.,2002).
Outro estudo demonstra que o nucleotídeo G na posição 243 da região 5’ NCR
era considerado representativo do genótipo 1b, porem foi encontrado em
populações do genótipo 1a (Corbet et.al.,2003; Cantaloube et.al.,2006). Contudo,
o que atualmente tem relevância clínica é a determinação do genótipo envolvido
na infecção e não a determinação do subtipo.
Neste estudo a genotipagem do VHC foi determinada com sondas
marcadas com fluorófo diferentes referentes à detecção do genótipo 1, 2 e 3. O
genótipo 1 foi detectado em 78% das amostras, o genótipo 2 em 10% e o
genótipo 3 em 12% das amostras analisadas em reações separadas.
Observamos em determinadas amplificações para a sonda especifica para o
genótipo 2, a não formação de curva exponencial, precisando muitas vezes
produzir um novo cDNA para amplificá-lo novamente, para porém obter um
resultado
positivo.
Estudos
mais
aprofundados
serão
necessários
para
confirmação destes resultados por PCR em tempo real.
Alguns fatores podem influenciar a eficiência da PCR em tempo real, como
por exemplo, a quantidade de RNA utilizada na reação de transcrição reversa
(Stahlberg et.al., 2004). Para um volume final de 20 µL da RT, foi padronizado um
volume de 8 µL de RNA extraído, apesar que outros autores citam a utilização de
um volume maior, entretanto nossos resultados foram eficientes quando
comparados com volumes menores de RNA. As médias das concentrações
verificadas neste estudo não apresentaram diferenças entre os genótipos.
Estudos para genotipagem por PCR em tempo real demonstram que o RNA é
extraído a partir de 1.000 µL de plasma e eluído em 80 µL, ou seja, 12,5 vezes
mais concentrado (Cook et.al., 2006). No nosso caso, partimos de 280 µL de soro
e eluímos em 60 µL, isto é, 3,3 vezes mais concentrado, não alterando a detecção
do VHC nas amostras analisadas. Neste caso o volume de soro utilizado foi
menor em relação ao outro estudo pelo fato que muitas vezes não há volume
suficiente de soro para tirarmos 1000 µL para extração do RNA.
Outros autores demonstraram que a eficiência da amplificação tem a ver
com o grau de pureza do ácido nucléico extraído e a condição de estocagem da
amostra (Tange et.al.,2005; Schuurman et.al., 2007). Assim, utilizamos uma
membrana de sílica (kit de extração) que confere uma alta eficiência ao processo
de extração, possibilitando um rendimento e pureza superior aos obtidos com as
técnicas convencionais, minimizando as variações de rendimento ou pureza
decorrentes do processo manual, com isso diminuindo o custo da reação. Apesar
de que, trabalhos recentes utilizam um sistema automatizado que reduz os riscos
de contaminação cruzada entre as amostras, além de permitir o processamento
simultâneo de um número maior de amostras (Loens, et.al.,2007; Stevens et.al.,
2007). Este sistema mesmo apresentando mais vantagens, ainda possui um
elevado custo de reagentes e necessita de equipamentos específicos. No nosso
estudo conseguimos um alto grau de pureza no ácido do nucléico das amostras
extraídas, obtendo positividade na reação de PCR em tempo real.
Para quantificação das amostras de VHC por PCR em tempo real foi
produzida a curva padrão, a partir do transcrito TRO, obtido através do processo
de clonagem e transcrição “in house”, juntamente com o TCont+, gerado do
plasmídeo re-transformado. Ambos foram correlacionados com kit comercial
(Acrometrix) para quantificação do VHC utilizado em laboratórios de pesquisa e
rotina. Os resultados referentes à quantificação das amostras mostraram não ter
diferença significativa quando avaliada a especificidade e reprodutibilidade
comparados a curva padrão dos métodos de quantificação utilizados neste
estudo. A utilização de uma curva padrão composta por diluição seriada
possibilita a obtenção de resultados quantitativos para uma ampla faixa de
valores, desde uma carga viral baixa até uma carga viral elevada. Resultados
recentes descritos na literatura comparando métodos de quantificação do RNA do
VHC demonstraram que a concordância apresentada entre os testes quantitativos
comercializados atualmente não permite que os mesmos sejam utilizados de
maneira intercambiável, apesar de terem resultados expressos segundo a
padronização internacional (IU/ml), motivo que levou a conclusão que cada centro
definisse a metodologia que seria utilizada rotineiramente e, a partir disso,
avaliasse as variações na carga viral dos pacientes em tratamento somente com
dita metodologia (Sarrazin et al., 2006; Caliendo et al. 2006).
O método de quantificação do RNA do VHC desenvolvido neste trabalho
implicou na geração de controles (transcritos) com a mesma característica da
amostra, ou seja, um controle de RNA extraído seguido de transcrição reversa,
sendo sua eficiência comparada com RNA do kit comercial para VHC
(Acrometrix), permitindo assim superar o grau de limitação dos transcritos. Alguns
estudos realizados para desenvolvimento de métodos de quantificação do VHC,
utilizam apenas plasmídeos e fazem a correlação com um kit comercial de
quantificação (Roche ou Acrometrix). Os resultados obtidos nesses estudos foram
excelentes, porém apresentaram limitações (Cook et.al., 2004; Duarte, 2006). O
fator limitante radica no fato do controle (plasmídeo) não ter a mesma
característica da amostra, necessitando de um calibrador para ser utilizado com
função de curva padrão, aumentando assim o custo da reação.
Os resultados quantitativos nas amostras analisadas obtidos com o
transcrito produzido “in house” no nosso estudo, demonstraram semelhança ao
teste comercializado para quantificação (Acrometrix). Estes dados baseiam-se na
média do coeficiente de variação (Tabela 6) obtida a partir do Ct produzido na
curva padrão, sendo que para o kit comercial (Acrometrix) a média foi de 1% e 2%
para TRO e TCont+, demonstrando que não houve diferença significativa entre as
médias do coeficiente de variação (CV) de cada transcrito com p = 0,107 (Tabela
5) com intervalo de confiança de 95%. Estes resultados são semelhantes aos
obtidos em trabalhos anteriores de quantificação do VHC, onde as médias dos CV
variavam de 0,42% a 2,5% (Cook et.al., 2004; Castelain et.al., 2004; Barbeu et.al.,
2004; Duarte, 2006). Em outros estudos para quantificação do RNA do VHC
através da produção de transcrito “in house” a média do CV obtido em dez
experimentos independentes foi 0,7% a 3,7% (Komurian-Pradel et.al., 2001). Os
nossos resultados indicam uma boa reprodutibilidade considerada adequada para
a quantificação das amostras.
A faixa de determinação das diferentes cargas virais nas amostras deste
estudo foi considerada ampla, isto tem significância relevante em relação a outros
testes quantitativos para VHC, pois a variação da concentração abrange uma
ampla faixa de detecção e quantificação (Komurian-Pradel et.al., 2001; Sabato
et.al., 2007).
Na comparação dos três testes encontrou-se um coeficiente de correlação
semelhantes com r2 = 0,96 para TRO, TCont+ com r2 = 0,98 e o kit comercial
(Acrometrix) r2 = 0,99, obtidos da curva linear de regressão que foi usada para
correlacionar o número de cópias/µL ou UI/ µL x Ct. Resultados demonstrados em
outros estudos apresentam uma boa concordância correlacionados com os
nossos. Em estudo feito com RUO-MPLC (Roche), Abbott ASR-Q (Qiagen) e
ASR-HP (Roche) para quantificação do VHC, baseados na regressão linear, os
coeficientes de correlação foram r2 = 0,83; 0,92 e 0,78, respectivamente (Sabato
et.al., 2007). Outros estudos demonstram que coeficientes de correlação
considerados aceitáveis variam entre r2 = 1 a 0,85 (Komurian-Pradel et.al., 2001;
Duarte, 2006; Caliendo et.al., 2006; Sabato et.al., 2007).
O método utilizado neste estudo para os processos de detecção,
quantificação e genotipagem apresentou um custo final de aproximadamente R$
300,00. Se levarmos em consideração que um seguimento ideal de um paciente
com hepatite C crônica, implica na necessidade de exames moleculares nas
semanas 4, 12, 24 e 48, sendo que para os pacientes portadores do genótipo 1
seria acrescentada semana 72, este custo seria praticamente cinco vezes menor
do que os valores praticados tanto nos laboratórios particulares quanto o valor
pago pelo Sistema Único de Saúde (SUS). Além do custo, o fator mais importante
é a redução no tempo de execução e liberação do resultado dos testes realizados,
que seria em 24 horas, que traria um benefício considerável no auxílio
diagnóstico, fornecendo informações importantes sobre a doença e a resposta
virológica dos pacientes em tratamento.
Atualmente os resultados dos exames moleculares para VHC demoram
entre 20 a 90 dias, pelo fato de não serem realizados dentro do Estado de
Rondônia. Portanto, a implantação da metodologia desenvolvida neste estudo
ajudaria não só para agilizar o diagnóstico da infecção, mas também no
acompanhamento dos pacientes durante o tempo de tratamento.
6. CONCLUSÃO
•
A metodologia molecular descrita neste manuscrito de tese é de
importância e impacto imediato na saúde pública, sobretudo para os
pacientes crônicos infectados pelo vírus da hepatite C.
•
Este estudo englobou características positivas quando comparadas a
outras técnicas e dados na literatura, permitindo a detecção, quantificação
e genotipagem do VHC.
•
A aplicabilidade imediata do estudo realizado vem de encontro com a atual
situação
socioeconômica
e
demográfica
do
Estado.
Tendo
em
consideração que a prevalência do VHC descrita na região norte é de
0,62%, a implantação desses testes sensíveis e específicos atenderia a
demanda de Rondônia e Acre, maiores em casos positivos na região Norte
do país.
•
O teste padronizado reúne características moleculares essenciais, com
custo mais acessível e liberação do resultado em um menor tempo,
favorecendo a confirmação diagnóstica como também a orientação
terapêutica a ser instituída.
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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