Dissertação _Edilene Gadelha de Oliveira

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
MICROPARTÍCULAS DE POLI (ÁCIDO LÁCTICO)/POLOXÂMERO OBTIDAS POR
SPRAY DRYING PARA LIBERAÇÃO MODIFICADA DE METOTREXATO
DISCENTE: EDILENE GADELHA DE OLIVEIRA
ORIENTADOR: Prof. Dr. ARNÓBIO ANTÔNIO DA SILVA JÚNIOR
NATAL
2013
EDILENE GADELHA DE OLIVEIRA
MICROPARTÍCULAS DE POLI (ÁCIDO LÁCTICO)/POLOXÂMERO OBTIDAS
POR SPRAY DRYING PARA LIBERAÇÃO MODIFICADA DE METOTREXATO
Dissertação apresentada ao Programa
de
Pós-Graduação
em
Ciências
Farmacêuticas da Universidade Federal
do
Rio
Grande
do
Norte,
como
requisito para obtenção do título de
Mestre do curso de Mestrado em
Ciências Farmacêuticas.
ORIENTADOR: Prof. Dr. ARNÓBIO ANTÔNIO DA SILVA JÚNIOR
NATAL
2013
"Tudo o que um sonho precisa para ser realizado é
alguém que acredite que ele possa ser realizado”.
(Roberto Shinyashiki)
Dedico este trabalho a Deus, pela força, coragem e paciência que me
concedeu nos momentos difíceis e por sempre me guiar em busca dos
meus objetivos.
Aos meus pais Edson e Helena, pelo carinho e apoio ao longo da minha
vida, pela dedicação aos filhos, pela mensagem de amor, humildade e
perseverança em minha formação pessoal.
Ao meu irmão Evérton, pelos gestos tímidos de carinho, pelas conversas
descontraídas e por me inspirar na busca pelo conhecimento.
Ao meu esposo Afonso, pela compreensão, dedicação e amor nesses
anos de convivência, pelas conquistas compartilhadas, tristezas divididas,
enfim obrigada por pensar na minha felicidade em cada projeto da nossa
vida.
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Professor Dr. Arnóbio Antônio da Silva Júnior pela
recepção calorosa no seu grupo de pesquisa, por me dar a oportunidade de crescer
como profissional, e por ensinar que conhecimento é para ser repassado para
aqueles que o buscam.
A todos os professores da Universidade Federal do Ceará, meu sincero
agradecimento pelos ensinamentos durante a graduação e pela iniciação científica
na carreira acadêmica.
A todos os professores do Programa de Pós-graduação em Ciências
Farmacêuticas da UFRN que auxiliam os discentes em suas pesquisas e fazem do
Mestrado uma oportunidade única de crescimento profissional.
Ao professor Dr. Anselmo Gomes de Oliveira do Programa de Pósgraduação em Ciências Farmacêuticas da UNESP – Araraquara/SP pela parceria e
contribuição para o desenvolvimento deste trabalho.
Aos professores Dr. Euzébio Guimarães, Dra. Rosangela Balaban e Dr.
Edson Ito pelas contribuições iniciais no aprimoramento deste trabalho.
Aos nossos colaboradores Prof. Dr. Márcio Assolim, do Departamento de
Física Teórica e Experimental, pelas análises de DRX, Prof. Dr. Edson Ito, do
Departamento de Engenharia de Materiais, pelas análises de MEV, Prof. Eryvaldo
Sócrates, do Laboratório de Sistemas Dispersos (LaSiD), pelos ensaios de CLAE.
À professora Dra. Dulce Araújo e ao doutorando Tiago Roberto, do Núcleo
de Processamento Primário e Reúso de Água produzida e Resíduos (NUPRAR),
pela parceria e ajuda nos experimentos de análise térmica.
À professora Dra. Paula Machado, do Departamento de Farmácia
(UFRN), e ao Dr. Kleber Silva, do Laboratório de Doenças Infecciosas e Câncer
(LADIC), Centro de Biociências-UFRN, pela atenção, carisma e disponibilidade na
realização dos estudos em cultura de células.
À doutoranda Camila Machado (Pós-graduação em Química-UFRN) e à
professora Dra. Tereza Neuma pela ajuda nos experimentos de determinação do
tamanho de partícula no Laboratório de Tecnologia em Tensoativos (LTT).
Às doutoras Ana Luiza, Ana Maria e Lília Basílio pela ajuda nas correções
da dissertação e pela experiência transmitida.
A todos os professores e alunos do Laboratório de Tecnologia e
Biotecnologia Farmacêutica (TecBioFar), em especial, Margarete Moreno pela
acolhida no laboratório e pela amizade, Edinara Targino pelas tristezas divididas e
alegrias multiplicadas, Polyanne Nunes pela força nos momentos difíceis e sua
bondade, Alice Rodrigues pela ajuda nos experimentos e pelos ensinamentos,
Letícia Streck pela sua sofisticação e comprometimento.
À mestranda Izadora de Souza, pela amizade, simpatia e disponibilidade
nos estudos em cultura de células.
Aos alunos de iniciação científica, em especial, Iaponira Roque, pelas
longas horas de experimentos, compreensão nos momentos mais estressantes e
companheirismo.
Às minhas amigas e mestrandas Bárbara Cabral e Samara Ferreira, pela
amizade, simplicidade e pelas angústias superadas.
Às
secretárias
do
Programa
de
Pós-graduação
em
Ciências
Farmacêuticas Aureliana e Fábia, pela paciência, disposição e comprometimento.
Às instituições de fomento CAPES e CNPq pelo apoio financeiro e
recursos que possibilitaram o desenvolvimento deste trabalho.
Aos meus queridos amigos de Natal-RN, que de alguma forma fizeram
parte da realização deste trabalho e àqueles que contribuíram direta ou
indiretamente para essa conquista.
RESUMO
Novos sistemas de liberação de fármacos vêm sendo utilizados para aumentar a
eficácia de quimioterápicos devido à possível resistência de células cancerígenas.
As micropartículas de poli (ácido láctico) (PLA) constituem uma alternativa para
diminuir a toxicidade e prolongar a liberação do metotrexato (MTX). Além disso, o
uso de blendas poliméricas PLA/poloxâmeros pode melhorar o perfil de liberação do
fármaco devido a mudanças nas interações das partículas com superfícies
biológicas. O objetivo do estudo foi desenvolver micropartículas biodegradáveis de
MTX produzidas por spray drying e avaliar as interações entre o PLA e os diferentes
tipos de Pluronic® (PLUF127 e PLUF68) para modular a liberação do fármaco. As
variáveis de composição incluíram razões fármaco:polímero (1:10; 1:4,5; 1:3) e
polímero:copolímero (25:75, 50:50, 75:25). A reprodutibilidade e a eficácia do
método de spray drying foram confirmadas pela alta eficiência de incorporação dos
sistemas (75,0-101,3%). As micropartículas de MTX/PLA apresentaram-se esféricas
com superfície aparentemente lisa. Este formato mostrou-se dependente da razão
polímero:copolímero nas partículas contendo blendas. A análise térmica e a difração
de raios-X sugerem que há dispersão do fármaco por toda a matriz, enquanto que a
miscibilidade entre os componentes foi dependente da razão polímero:copolímero.
Nenhuma ligação química entre o fármaco e o polímero foi identificada pela análise
de FTIR. As micropartículas de PLA contendo MTX apresentaram perfil de liberação
prolongada, a qual se ajustou ao modelo cinético de Korsmeyer-Peppas. O PLU
acelerou a taxa de liberação in vitro do fármaco devido a sua possível saída da
matriz polimérica. Por outro lado, estudos de liberação do fármaco realizados em
cultura de células demonstraram que o PLU modulou a taxa de MTX liberado a partir
de micropartículas constituídas por blendas. Este efeito foi confirmado pela
citotoxicidade dos sistemas estudados, de acordo com a quantidade de fármaco
liberado em função do tempo. Portanto, o uso de PLU foi capaz de melhorar o perfil
de liberação de micropartículas de PLA contendo MTX, podendo ser utilizado como
carreador para modular a liberação do fármaco com potencial aplicação in vivo.
Palavras-chave: Micropartículas. Poli (ácido láctico). Pluronic. Metotrexato. Spray
drying.
ABSTRACT
New drug delivery systems have been used to increase chemotherapy efficacy due
the possible drug resistance of cancer cells. Poly (lactic acid) (PLA) microparticles
are able to reduce toxicity and prolong methotrexate (MTX) release. In addition, the
use of PLA/poloxamer polymer blends can improve drug release due to changes in
the interaction of particles with biological surfaces. The aim of this study was
developing spray dried biodegradable MTX-loaded microparticles and evaluate PLA
interactions with different kinds of Pluronic® (PLUF127 and PLUF68) in order to
modulate drug release. The variables included different drug:polymer (1:10, 1:4.5,
1:3) and polymer:copolymer ratios (25:75, 50:50, 75:25). The precision and accuracy
of spray drying method was confirmed assessing drug loading into particles (75.0101.3%). The MTX/PLA microparticles showed spherical shape with an apparently
smooth surface, which was dependent on the PLU ratio used into blends particles.
XRD and thermal analysis demonstrated that the drug was homogeneously
dispersed into polymer matrix, whereas the miscibility among components was
dependent on the used polymer:copolymer ratio. No new drug- polymer bond was
identified by FTIR analysis. The in vitro performance of MTX-loaded PLA
microparticles demonstrated an extended-release profile fitted using KorsmeyerPeppas kinetic model. The PLU accelerated drug release rate possible due PLU
leached in the matrix. Nevertheless, drug release studies carried out in cell culture
demonstrated the ability of PLU modulating drug release from blend microparticles.
This effect was confirmed by cytotoxicity observed according to the amount of drug
released as a function of time. Thus, studied PLU was able to improve the
performance of spray dried MTX-loaded PLA microparticles, which can be
successfully used as carries for modulated drug delivery with potential in vivo
application.
Keywords: Microparticles. Poly (lactic acid). Pluronic. Methotrexate. Spray drying.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Representação esquemática de um sistema matricial (A) e sistema
reservatório (B), constituído de fármaco e polímero, em forma de microesferas e
microcápsulas, respectivamente. .............................................................................. 23
Figura 2 - Ilustração esquemática da formação de partículas sólidas, utilizando o
processo de secagem por atomização. ..................................................................... 25
Figura 3 - Ilustração esquemática de um mini-spray dryer durante o processo de
funcionamento. .......................................................................................................... 26
Figura 4 – Representação esquemática da síntese do poli (ácido láctico) a partir de
reações de condensação e/ou de polimerização por abertura de anel. .................... 29
Figura 5 - Representação esquemática da estrutura química do poli (ácido láctico).30
Figura 6 - Representação esquemática geral da fórmula estrutural do poloxâmero,
sendo (a) composição do bloco hidrofílico PEO e (b) composição do bloco
hidrofóbico PPO ........................................................................................................ 32
Figura 7 - Representação esquemática da estrutura química do metotrexato .......... 34
Figura 8 - Representação esquemática da estrutura química do ácido fólico ........... 34
Figura 9 – Espectros de absorbância UV-Vis de soluções contendo o MTX,
componentes da matriz (PLA, PLUF127, PLUF68), o fármaco e a matriz
(MTX/PLA/PLU), em ácido acético 0,1 mol/L. ........................................................... 53
Figura 10 - Curva analítica do metotrexato em ácido acético 0,1 mol/L por
espectrofotometria UV-Vis a 305 nm......................................................................... 54
Figura 11 - Curva analítica do MTX em tampão acetato de amônio:metanol 75:25 por
CLAE a 303 nm. ........................................................................................................ 58
Figura 12 - Fotomicrografias do metotrexato não atomizado (A) e atomizado (B), em
um aumento de 2500x. .............................................................................................. 61
Figura 13 - Fotomicrografias de micropartículas de PLA sem fármaco (A); 1:10
MTX/PLA (B), 1:4,5 MTX/PLA (C) e 1:3 MTX/PLA (D), em um aumento de 2500x. . 62
Figura 14 - Fotomicrografias das micropartículas de MTX/PLUF127 (A), de blendas
MTX/PLA-PLUF127, nas razões polímero:copolímero 25:75 (B); 50:50 (C); 75:25 (D),
em um aumento de 2500x. ........................................................................................ 63
Figura 15 - Fotomicrografias das micropartículas de MTX/PLUF68 (A), de blendas
MTX/PLA-PLUF68, nas razões polímero:copolímero 25:75 (B); 50:50 (C); 75:25 (D),
em um aumento de 2500x. ........................................................................................ 64
Figura 16 - Espectros de infravermelho do MTX (A) e do PLA (B), no intervalo de
4000 a 400 cm-1. ....................................................................................................... 66
Figura 17 - Espectros de infravermelho das micropartículas 1:10, 1:4,5 e 1:3
MTX/PLA, no intervalo de 4000 a 400 cm-1. .............................................................. 67
Figura 18 - Espectros de infravermelho de micropartículas de PLUF127 sem
fármaco, MTX/PLUF127, blendas PLA-PLUF127 e MTX/PLA-PLUF127, nas razões
polímero:copolímero 25:75; 50:50 e 75:25 no intervalo de 4000 a 400 cm-1. ............ 68
Figura 19 - Espectros de infravermelho de micropartículas de PLUF68 sem fármaco,
MTX/PLUF68,
blendas
PLA-PLUF68
e
MTX/PLA-PLUF68,
nas
razões
polímero:copolímero 25:75; 50:50 e 75:25 no intervalo de 4000 a 400 cm-1. ............ 69
Figura 20 - Difratogramas de raios-X para o metotrexato não atomizado e atomizado,
micropartículas de PLA sem fármaco e micropartículas de MTX/PLA (1:10, 1: 4,5 e
1:3) em 2θ no intervalo de 5 a 45°. ........................................................................... 70
Figura 21 - Difratogramas de raios-X para as micropartículas de PLUF127 sem
fármaco, MTX/PLUF127, blendas PLA-PLUF127 e MTX/PLA-PLUF127, nas razões
polímero:copolímero 25:75; 50:50 e 75:25, em 2θ no intervalo de 5º a 45º. ............. 72
Figura 22 - Difratogramas de raios-X para as micropartículas de PLUF68 sem
fármaco, MTX/PLUF68, blendas PLA-PLUF68 e MTX/PLA-PLUF68, nas razões
polímero:copolímero 25:75; 50:50 e 75:25, em 2θ no intervalo de 5º a 45º. ............. 73
Figura 23 - Curvas TG e DSC do metotrexato em atmosfera de N2 100 mL/min, com
razão de aquecimento de 10°C/min. ......................................................................... 74
Figura 24 - Curvas TG e DSC de micropartículas de poli (ácido láctico), em
atmosfera de N2 a 100 mL/min, com razão de aquecimento de 10°C/min. ............... 75
Figura 25 - Curvas TG e DSC de micropartículas de Pluronic F127, em atmosfera de
N2 a 100 mL/min, com razão de aquecimento de 10°C/min. ..................................... 75
Figura 26 - Curvas TG e DSC de micropartículas de Pluronic F68, em atmosfera de
N2 a 100 mL/min, com razão de aquecimento de 10°C/min. ..................................... 76
Figura 27 - Curvas DSC dos sistemas MTX/PLA, em atmosfera de N2 a 100 mL/min,
com razão de aquecimento de 10°C/min. ................................................................. 77
Figura 28 - Curvas TG dos sistemas MTX/PLA, em atmosfera de N2 a 100 mL/min,
com razão de aquecimento de 10°C/min. ................................................................. 78
Figura 29 - Curvas DSC das blendas poliméricas PLA-PLUF127 (A) e PLA-PLUF68
(B), em atmosfera de N2 a 100 mL/min, com razão de aquecimento de 10°C/min. .. 79
Figura 30 - Efeito da concentração de PLA na entalpia de fusão (J/g) do PLUF127
(●) e PLUF68 (○). ...................................................................................................... 80
Figura 31 - Curvas TG de blendas PLA-PLUF127 (A) e PLA-PLUF68 (B), nas
diferentes razões polímero-copolímero, em atmosfera de N2 a 100 mL/min, com
razão de aquecimento de 10°C/min. ......................................................................... 81
Figura 32 - Curvas DSC dos sistemas MTX/PLA-PLUF127 e MTX/PLA-PLUF68, na
razão 75:25, em atmosfera de N2 a 100 mL/min, com razão de aquecimento de
10°C/min. .................................................................................................................. 81
Figura 33 - Curvas DSC dos sistemas MTX/PLA-PLUF127 e MTX/PLA-PLUF68, em
atmosfera de N2 a 100 mL/min, com razão de aquecimento de 10°C/min. ............... 82
Figura 34 - Curva analítica do metotrexato em tampão fosfato pH 7,4 (0,05 mol/L)
por espectrofotometria UV-Vis em 305 nm. .............................................................. 83
Figura 35 - Perfil de liberação do MTX a partir de micropartículas de PLA, contendo
razões fármaco:polímero 1:10 (■), 1:4,5 (●) e 1:3 (▼). ............................................. 84
Figura 36 - Avaliação do efeito burst do MTX a partir de micropartículas de PLA
contendo razões de fármaco:polímero 1:10 (■), 1:4,5 (●) e 1:3 (▼). ........................ 85
Figura 37 - Perfis de liberação do fármaco a partir dos sistemas 1:4,5 MTX/PLA (A) e
1:3 MTX/PLA (B), após submetidos ao modelo cinético de Korsmeyer-Peppas
(Mt/M∞ = lnK + nlnt)................................................................................................... 87
Figura 38 - Viabilidade de células Vero E6 cultivadas com micropartículas de PLA
sem fármaco, metotrexato e sistemas MTX/PLA, em diferentes concentrações, por
24 e 48 horas (n = 4). ................................................................................................ 89
Figura 39 - Viabilidade de células Vero E6 cultivadas com blendas poliméricas PLAPLUF127 75:25, PLA-PLUF68 75:25, metotrexato, sistemas MTX/PLA-PLUF127 e
MTX/PLA-PLUF68 75:25, em diferentes concentrações, por 24 e 48 horas (n = 4). 90
Figura 40 - Viabilidade de células Vero E6 cultivadas com metotrexato e sistemas
1:3 MTX/PLA, MTX/PLA-PLUF127 e MTX/PLA-PLUF68 75:25, na concentração de 1
μg/mL, por 24 e 48 horas. ......................................................................................... 92
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Propriedades físico-químicas das formas estereoquímicas do PLA......... 31
Tabela 2 - Parâmetros utilizados durante o processo de secagem por atomização
para obtenção de micropartículas. ............................................................................ 47
Tabela 3 - Resultados do estudo de precisão inter-dia e intra-dia para a validação da
metodologia analítica do metotrexato em espectrofotometria UV. ............................ 55
Tabela 4 - Resultados do estudo de precisão inter-laboratorial para a validação de
metodologia analítica do metotrexato em espectrofotometria UV. ............................ 55
Tabela 5 - Dados de recuperação do método analítico para quantificação do
metotrexato contaminado com PLA. ......................................................................... 56
Tabela 6 - Avaliação da robustez do método em diferentes valores de pH. ............. 56
Tabela 7 - Avaliação da robustez do método em diferentes tempos de agitação. .... 57
Tabela 8 - Teor de fármaco incorporado e eficiência de encapsulação nos diferentes
sistemas microparticulados ± coeficiente de variação (CV%). .................................. 58
Tabela 9 - Tamanho de partícula e distribuição do tamanho de partícula dos
sistemas microparticulados. ...................................................................................... 60
Tabela 10 - Modelos matemáticos utilizados para descrever a cinética de liberação
do fármaco a partir de sistemas 1:4,5 e 1:3 MTX/PLA. ............................................. 86
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANOVA
Análise de variância
ANVISA
Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ASC
Área Sob a Curva
CLAE
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CV
Coeficiente de variação
DHFR
Diidrofolato redutase
DMSO
Dimetilsulfóxido
DNA
Ácido Desoxirribonucléico
DOcc
Densidade óptica do controle celular
DOmt
Densidade óptica do material testado
DP
Desvio Padrão
DPR
Desvio Padrão Relativo
DRX
Difração de raios-X
DSC
Calorimetria Diferencial Exploratória
EE
Eficiência de encapsulação
FDA
Food and Drug Administration
FTIR
Espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier
HCl
Ácido clorídrico
MEV
Microscopia eletrônica de varredura
MTX
Metotrexato
MTX/PLA
Metotrexato incorporado à matriz de poli (ácido láctico)
MTX/PLA-PLU Metotrexato incorporado à blenda de poli (ácido láctico) e Pluronic®
MTX/PLU
Metotrexato incorporado à matriz de Pluronic®
NaOH
Hidróxido de sódio
PEO
Poli (óxido de etileno)
PLA
Poli (ácido láctico)
PLA-PLU
Blenda de poli (ácido láctico) e Pluronic® sem fármaco
PLGA
Poli (ácido láctico-co-ácido glicólico)
PLUF127
Micropartículas de Pluronic® F127 sem fármaco
PLUF68
Micropartículas de Pluronic® F68 sem fármaco
PPO
Poli (óxido de propileno)
QTA
Quantidade de fármaco adicionado no sistema polimérico
QTD
Quantidade de fármaco determinado no sistema polimérico
SPAN
Índice de polidispersão
TF
Teor de fármaco incorporado ao sistema
TG
Termogravimetria
TTF
Teor teórico de fármaco incorporado
UV-Vis
Ultravioleta visível
LISTA DE SÍMBOLOS
μm
micrometro
pH
potencial hidrogeniônico
°C
grau Celsius
g
grama
cm3
centímetro cúbico
%
porcentagem
®
marca registrada
pKa
constante de dissociação
α
alfa
γ
gama
mg
miligrama
Q0
quantidade inicial de fármaco
Qt
quantidade de fármaco liberado em determinado tempo
t
tempo
K0
constante de velocidade de ordem zero
KP
constante de liberação de primeira ordem
ft
fração de fármaco liberado em determinado tempo
KH
constante de velocidade de dissolução de Higuchi
Mt
quantidade de fármaco liberado no tempo inicial
M∞
quantidade de fármaco liberado em determinado tempo
a
constante que incorpora características estruturais e geométricas da
forma farmacêutica
n
expoente de liberação
KKP
constante de velocidade de dissolução de Korsmeyer-Peppas
m
massa
Mw
massa molar ponderada
L
litro
nm
nanômetro
μg
micrograma
p
nível de significância
mm
milímetro
NL
normal litro
h
hora
mL
mililitro
min
minuto
kV
quilovolts
Cu
cobre
Ni
níquel
θ
cm
teta
-1
número de ondas
rpm
rotação por minuto
R2
coeficiente de correlação
mAU
área de pico
ln
logaritmo natural
Q
massa de fármaco transportada em um determinado tempo
C
concentração da substância que se difunde
X
distância do local onde o fármaco se acumulado até a superfície de
liberação
D
coeficiente de difusão
D90
frequência de tamanho de 90% das partículas
D50
frequência de tamanho de 50% das partículas
D10
frequência de tamanho de 10% das partículas
W
watts
J
Joule
Tonset
temperatura inicial
ΔH
variação de entalpia
Tg
temperatura de transição vítrea
Tm
temperatura de fusão
SUMÁRIO
1INTRODUÇÃO............................................................................................................ 21
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA................................................................................. 22
2.1 Sistemas de Liberação de Fármacos................................................................... 22
2.2 Micropartículas poliméricas................................................................................. 22
2.3 Métodos de microencapsulação.......................................................................... 23
2.3.1 Secagem por atomização..................................................................................... 24
2.3.2 Fundamento da técnica spray drying................................................................... 25
2.3.3 Parâmetros relevantes no processo...................................................................... 26
2.3.3.1 Atomização......................................................................................................... 26
2.3.3.2 Ar de secagem.................................................................................................. 27
2.3.3.3 Temperatura de entrada e saída...................................................................... 27
2.4 Poli (ácido láctico)................................................................................................. 28
2.4.1 Síntese do PLA..................................................................................................... 28
2.4.2 Degradação do PLA............................................................................................. 30
2.4.3 Características físico-químicas............................................................................. 30
2.5 Poloxâmeros.......................................................................................................... 31
2.6 Metotrexato............................................................................................................. 33
2.6.1 Características físico-químicas............................................................................ 33
2.6.2 Mecanismo de ação.............................................................................................. 34
2.6.3 Farmacocinética e Toxicidade............................................................................... 35
2.6.4 Uso clínico............................................................................................................. 36
2.6.5 Aplicação de Sistemas de liberação de Fármacos contendo Metotrexato............ 36
2.7 Modelos matemáticos utilizados na interpretação da cinética de liberação
do metotrexato..............................................................................................................38
2.7.1 Cinética de ordem zero......................................................................................... 38
2.7.2 Cinética de primeira ordem.................................................................................. 39
2.7.3 Modelo de Higuchi................................................................................................ 39
2.7.4 Modelo de Korsmeyer-Peppas.............................................................................. 40
3 OBJETIVOS............................................................................................................... 41
3.1 Objetivo geral......................................................................................................... 41
3.2 Objetivos específicos............................................................................................ 41
4 MATERIAIS E MÉTODOS.......................................................................................... 42
4.1 Materiais.................................................................................................................. 42
4.1.1 Matérias-primas.................................................................................................... 42
4.1.2 Reagentes e Solventes........................................................................................ 42
4.1.3 Equipamentos e Acessórios................................................................................. 43
4.2 Validação da metodologia analítica do metotrexato por espectrofotometria
UV-Vis............................................................................................................................ 44
4.2.1 Seleção do comprimento de onda......................................................................... 44
4.2.2 Seletividade........................................................................................................... 44
4.2.3 Linearidade........................................................................................................... 44
4.2.4 Precisão.................................................................................................................45
4.2.5 Exatidão................................................................................................................ 45
4.2.6 Robustez............................................................................................................... 45
4.3 Obtenção de micropartículas............................................................................... 46
4.4 Análise quantitativa do fármaco nas micropartículas por espectrofotometria
UV-Vis........................................................................................................................... 47
4.4.1 Micropartículas de MTX/PLA................................................................................ 47
4.4.2 Micropartículas de MTX/PLU e blendas MTX/PLA-PLU...................................... 48
4.5 Caracterização físico-química dos sistemas microparticulados...................... 49
4.5.1 Determinação do tamanho de partícula............................................................... 49
4.5.2 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)......................................................... 49
4.5.3 Espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR)................. 49
4.5.4 Difração de raios-X (DRX)..................................................................................... 50
4.5.5 Análise térmica...................................................................................................... 50
4.6 Estudo do perfil de liberação in vitro dos sistemas microparticulados........... 50
4.6.1 Avaliação da cinética de liberação das micropartículas de MTX/PLA.................. 51
4.7 Avaliação da citotoxicidade.................................................................................. 51
4.8 Análise estatística.................................................................................................. 52
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................. 53
5.1
Validação
do
método
e
quantificação
do
metotrexato
por
espectrofotometria UV-Vis.......................................................................................... 53
5.2 Eficiência de encapsulação dos sistemas microparticulados........................... 57
5.3 Determinação do tamanho de partícula............................................................... 60
5.4 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)....................................................... 61
5.5 Espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR)........... 65
5.6 Difração de raios-X (DRX)..................................................................................... 70
5.7 Análise térmica....................................................................................................... 73
5.8 Perfil de liberação dos sistemas microparticulados.......................................... 83
5.8.1 Perfil e cinética de liberação dos sistemas MTX/PLA........................................... 83
5.8.2 Perfil de liberação das blendas MTX/PLA-PLU..................................................... 87
5.9 Avaliação da citotoxicidade dos sistemas microparticulados.......................... 89
6 CONCLUSÕES........................................................................................................... 93
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................. 94
APÊNDICES...................................................................................................................107
21
1 INTRODUÇÃO
Nas últimas décadas, os sistemas de liberação de fármacos vêm sendo
desenvolvidos e otimizados para o tratamento do câncer, principalmente para o
aumento da eficiência terapêutica devido ao uso limitado dos quimioterápicos
(FORMARIZ et al., 2004, 2006; LIANG et al., 2004; COREM-SALKMON et al., 2011;
GONG et al., 2012). O uso de micropartículas poliméricas constitui uma estratégia
interessante para prolongar a velocidade de liberação e diminuir a toxicidade desses
fármacos, aumentando a eficácia no tratamento farmacológico (WISCHKE;
SCHWENDEMAN, 2008; YANG et al., 2009).
O metotrexato (MTX) é um fármaco utilizado em vários tipos de câncer,
atuando na inibição do metabolismo do ácido fólico. Além disso, tem sido usado no
tratamento de doenças autoimunes, como a artrite reumatoide e o lúpus eritematoso
sistêmico. No entanto, este possui uma rápida eliminação plasmática, o que limita
seu tempo de exposição ao câncer, necessitando de administrações frequentes e
altas doses (BANERJEE et al., 2002; CARRETERO et al., 2010; XINQIANG et al.,
2010; COREM-SALKMON et al., 2011).
O poli (ácido láctico) (PLA) vem sendo estudado em sistemas de liberação
de
fármacos
devido
às
suas
propriedades
de
biodegradabilidade
e
biocompatibilidade. Além disso, possui aprovação pelo FDA para uso humano
(GARLOTTA, 2001; MANSOUR et al., 2010; LUCKACHAN; PILLAI, 2011;
LASPRILLA et al., 2012). O uso de blendas poliméricas de PLA/poloxâmeros se
justifica pela possibilidade de incorporar elementos hidrofílicos a uma matriz
hidrofóbica de PLA, o que poderia melhorar as propriedades de solubilidade e
estabilidade do fármaco (BONACUCINA et al., 2011) e, consequentemente, modular
a sua liberação. Além disso, estudos sugerem que os poloxâmeros podem aumentar
a biocompatibilidade de matrizes de PLA (KISS; BERTÓTI; VARGHA-BUTLER,
2002).
O presente estudo foi delineado a partir da preparação e caracterização
de
micropartículas
de
poli
(ácido
láctico),
em
diferentes
proporções
fármaco:polímero, bem como o uso de blendas PLA/poloxâmeros com distintas
variáveis de composição polímero:copolímero, utilizando a técnica de secagem por
atomização, no intuito de modular a liberação do metotrexato.
22
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 Sistemas de Liberação de Fármacos
O uso de novos sistemas de liberação de fármacos para a otimização do
efeito farmacológico dos quimioterápicos já existentes vem sendo extensivamente
estudado (FORMARIZ et al., 2004, 2006; COREM-SALKMON et al., 2011). O maior
obstáculo para o sucesso do tratamento convencional desses fármacos é a
resistência farmacológica das células cancerígenas (GONG et al., 2012).
Uma das maiores vantagens dos sistemas de liberação controlada é a
escolha de uma cinética de liberação desejada, ou seja, é necessário manter uma
concentração ótima do fármaco, dentro da faixa terapêutica, nas células tumorais ou
no sangue, não atingindo subdoses, que tornem o tratamento ineficaz, ou
sobredoses que sejam tóxicas ao organismo (PEZZINI; SILVA; FERRAZ, 2007).
2.2 Micropartículas poliméricas
As micropartículas poliméricas são bastante estudadas devido à sua
estabilidade físico-química e microbiológica e à reprodutibilidade quanto ao método
de produção (SCHAFFAZICK et al., 2003; SILVA-JÚNIOR, 2005, 2008; SILVAJÚNIOR et al., 2009). São estruturas de tamanho entre 1 a 1000 µm (SILVA et al.,
2003; SILVA-JÚNIOR, 2005), podendo ser classificadas, quanto à estrutura física,
em microesferas e microcápsulas (Figura 1). As microesferas são sistemas
matriciais, onde o fármaco se encontra uniformemente dissolvido ou disperso numa
rede polimérica, enquanto que microcápsulas são sistemas reservatórios contendo o
fármaco no interior de um núcleo, envolvido por uma membrana polimérica (SILVA et
al., 2003; LOPES; LOBO; COSTA, 2005; PEZZINI; SILVA; FERRAZ, 2007).
23
Figura 1 - Representação esquemática de um sistema matricial (A) e sistema reservatório (B),
constituído de fármaco e polímero, em forma de microesferas e microcápsulas, respectivamente.
Fonte: Autoria própria.
A caracterização de micropartículas envolve a análise de um conjunto de
parâmetros com o objetivo de garantir que o processo de obtenção utilizado seja
adequado. Dentre eles, o tamanho e a forma, as interações fármaco:polímero, a
eficiência de encapsulação e o perfil de liberação do fármaco devem ser
considerados (PICOS, 2000).
2.3 Métodos de microencapsulação
A microencapsulação pode ser definida como um processo pelo qual uma
ou mais substâncias são envolvidas por um filme polimérico, no entanto pode
conduzir à obtenção de partículas que estão dispersas em uma matriz polimérica. A
escolha do método a ser usado depende de alguns fatores como o tipo de sistema a
ser obtido, a solubilidade do polímero e do fármaco, a permeabilidade e espessura
da parede, o tipo e a velocidade de liberação, o tamanho, a forma das partículas e a
viabilidade do processo (SILVA-JÚNIOR, 2005; SUAVE et al., 2006). A seleção de
uma técnica de produção de micropartículas não pode afetar a estabilidade e a
atividade biológica do fármaco. Além disso, a eficiência de encapsulação no sistema
polimérico deve ser a mais elevada possível, incluindo um perfil de liberação
adequado para o uso pretendido (BENITA, 2006).
A técnica de secagem por atomização tem sido bastante difundida e
aplicada na indústria farmacêutica (MASTERS, 1972; CHOW et al., 2007). O
fundamento da obtenção das partículas consiste na co-precipitação com evaporação
do solvente, na qual o material pode estar dissolvido, emulsionado ou disperso no
meio líquido a ser atomizado (NANDIYANTO; OKUYAMA, 2011).
24
2.3.1 Secagem por atomização
A técnica de secagem por atomização ou spray drying permite transformar
soluções ou suspensões em um produto sólido, através de uma rápida evaporação
do solvente, o que favorece a preparação de dispersões sólidas amorfas (PAUDEL
et al., 2013).
A primeira citação da aplicação do método de secagem ocorreu no ano de
1860, sendo que sua primeira patente foi registrada somente em 1872. Os
dispositivos primitivos do equipamento spray dryer ocasionavam problemas na
eficiência, desempenho e segurança do processo. A partir de 1920, a primeira
aplicação industrial deste método foi na produção de leite em pó, após a evolução
do processo produtivo. Atualmente ainda continua sendo uma das mais importantes
aplicações (ÇELIK; WENDEL, 2005; CAL; SOLLOHUB, 2010).
No campo farmacêutico, essa técnica tem sido bastante difundida para
secagem de substâncias ativas, excipientes, encapsulação de vitaminas e produtos
biofarmacêuticos (proteínas e peptídeos) que podem ser veiculados em formas
farmacêuticas de uso parenteral, nasal ou pulmonar, suspensões, pós e aerossois
(ÇELIK; WENDEL, 2005; VEHRING; FOSS; LECHUGA-BALLESTEROS, 2007).
Uma das vantagens desta técnica é a possibilidade de controle da
morfologia, do tamanho de partícula e propriedades de fluxo, através da seleção
adequada de parâmetros e manipulação de variáveis inerentes ao processo
(NANDIYANTO; OKUYAMA, 2011). Tal técnica se torna adequada para materiais
termossensíveis devido ao menor tempo de contato entre a amostra e o calor
fornecido ao sistema, através de uma rápida evaporação do solvente (ÇELIK;
WENDEL, 2005).
Atualmente esta técnica tem sido utilizada no processo de obtenção de
sistemas de liberação de fármacos (RATTES; OLIVEIRA, 2007; CAL; SOLLOHUB,
2010). Os polímeros biodegradáveis estão dentre os carreadores mais utilizados na
preparação de dispersões sólidas, que são produtos formados pela combinação
fármaco-carreador do estado fluido para o sólido. Portanto, vários estudos foram
realizados no tocante à obtenção de micropartículas de poli (ácido láctico) (PLA) e
poli (ácido láctico-co-ácido glicólico) (PLGA), utilizando o método de secagem por
atomização (GAVINI et al., 2004; SILVA-JÚNIOR 2005, 2008; SILVA-JÚNIOR et al.,
2009; OLIVEIRA et al., 2013; PALAZZO et al., 2013).
25
2.3.2 Fundamento da técnica spray drying
A técnica compreende três etapas fundamentais no seu processo de
funcionamento: a primeira etapa é a atomização do fluido por um dispositivo
adequado, em forma de gotículas. Em seguida, estas são submetidas à interação
com um gás de secagem a uma temperatura constante. Durante esta fase, o
solvente contido na dispersão de gotículas sofre evaporação, o que resulta na
formação de partículas sólidas. Na última fase, as partículas secas devem ser
separadas do gás de secagem e coletadas em um recipiente adequado (ÇELIK;
WENDEL, 2005; CAL; SOLLOHUB, 2010; NANDIYANTO; OKUYAMA, 2011). Um
esquema representativo deste processo está ilustrado na Figura 2.
Figura 2 - Ilustração esquemática da formação de partículas sólidas, utilizando o processo de
secagem por atomização.
Fonte: adaptado de NANDIYANTO; OKUYAMA, 2011.
A simplicidade e a flexibilidade do funcionamento do equipamento spray
dryer permite a obtenção de uma ampla variedade de produtos farmacêuticos. Na
Figura 3, é possível visualizar um esquema do mesmo durante o processo de
funcionamento.
26
Figura 3 - Ilustração esquemática de um mini-spray dryer durante o processo de funcionamento.
Fonte: adaptado de AGHBASHLO et al., 2012.
2.3.3 Parâmetros relevantes no processo
As propriedades físico-químicas das micropartículas dependem dos
parâmetros do processo de secagem por atomização e da composição da
formulação (RATTES; OLIVEIRA, 2007). Alguns dos parâmetros mais críticos do
processo incluem a temperatura de entrada e saída, as características do líquido de
aspersão (viscosidade, tensão superficial, volatilização do solvente e concentração
de sólidos) e o tipo de atomizador (PATEL, R.; PATEL, M.; SUTHAR, 2009).
2.3.3.1 Atomização
A atomização consiste no processo pelo qual um líquido se divide em
gotículas, sendo considerada a operação mais importante no processo de secagem
(ÇELIK; WENDEL, 2005). A bomba peristáltica é responsável pela alimentação do
aparelho com a amostra a ser atomizada. A dispersão é formada dentro de um gás
de secagem que favorece o aumento da área de superfície das gotículas, facilitando
a transferência de calor do gás aquecido para o fluido atomizado, resultando em
rápida evaporação do solvente (BETE®, 2005; CAL; SOLLOHUB, 2010).
O tamanho médio das gotas é diretamente proporcional ao fluxo de
alimentação e à viscosidade do líquido de alimentação (ÇELIK; WENDEL, 2005). O
aumento da viscosidade geralmente tende a aumentar a tensão superficial do
27
líquido, diminuindo a eficiência de atomização devido ao aumento do tamanho das
gotas e, consequentemente, do tamanho das partículas formadas (BETE®, 2005).
Este aumento da viscosidade depende do solvente e do soluto utilizados na
formulação. No caso de soluções orgânicas contendo baixas concentrações de
poliésteres alifáticos (como o PLA), não há influência no aumento da viscosidade do
líquido, diferentemente de hidrogeis, que formam uma solução altamente viscosa, e
por isso, este parâmetro deve ser monitorado (SILVA-JÚNIOR et al., 2009).
Outro parâmetro a ser considerado é a concentração da solução de
alimentação, pois quanto mais concentrada for a amostra, maior será o tamanho e a
porosidade das partículas devido ao aumento da quantidade de moléculas de
fármaco e/ou polímero por gota (BÜCHI, 2002; SILVA-JÚNIOR et al., 2009).
Por último, o tipo de atomizador é importante para o controle de
homogeneidade na distribuição do tamanho das gotas. Isso acontece devido à
diminuição ou aumento da energia de atomização, dependendo do tipo de aspersor.
Quanto maior for a energia de atomização, menor será o tamanho da gota (ÇELIK;
WENDEL, 2005).
2.3.3.2 Ar de secagem
O aspirador, também conhecido como exaustor, influencia na quantidade
de ar de secagem no equipamento. Geralmente o ar atmosférico passa por um
sistema de filtros, sendo em seguida, aquecido (CAL; SOLLOHUB, 2010). À medida
que a velocidade de aspiração é regulada, a quantidade de ar seco pode aumentar
ou diminuir, apresentando efeito significativo no rendimento do processo (BÜCHI,
2002; SILVA-JÚNIOR, 2005). O fluxo de ar de atomização é definido como a
quantidade de ar pressurizado necessário para atomizar de forma eficiente a
dispersão. Quanto maior o fluxo de ar, menor será o tamanho de partículas. Além
disso, a umidade do ar residual deve ser considerada na obtenção do produto final,
pois pode favorecer o processo de aglomeração de partículas (BETE®, 2005; SILVAJÚNIOR, 2005).
2.3.3.3 Temperatura de entrada e saída
28
A temperatura de entrada é entendida como a temperatura de
aquecimento na câmara de secagem. Quando a solução, emulsão ou dispersão é
atomizada dentro da câmara de secagem, uma temperatura mais alta favorece
termodinamicamente a evaporação do solvente. A temperatura de saída é definida
como a temperatura da corrente de ar antes que as partículas sólidas entrem no
ciclone. A temperatura do ar de secagem é ajustada para permitir melhor eficiência
térmica, sem que ocorra degradação da amostra (BÜCHI, 2002; SILVA-JÚNIOR,
2005; CAL; SOLLOHUB, 2010).
O parâmetro que afeta a temperatura de entrada e de saída é a
velocidade de alimentação da amostra a ser atomizada. Quanto maior a taxa de
transferência da amostra, mais energia é necessária para evaporar o solvente da
dispersão. Quando a velocidade de alimentação é superior à taxa de evaporação do
solvente na câmara de secagem, pode ocorrer a formação de partículas
aglomeradas e acúmulo de líquido nas paredes do cilindro (BÜCHI, 2002).
2.4 Poli (ácido láctico)
O PLA tem sido investigado em sistemas de liberação de fármacos devido
à sua biocompatibilidade e habilidade para ser absorvido e degradado in vivo
(MATSUMOTO et al., 2005; WISCHKE; SCHWENDEMAN, 2008; MANSOUR et al.,
2010; SAEIDLOU et al., 2012). Foi aprovado pelo FDA para uso na terapêutica
(LUCKACHAN; PILLAI, 2011).
As micro e nanopartículas de poli (ácido láctico) têm sido estudadas para
administração prolongada de uma ampla variedade de substâncias ativas, bem
como peptídeos e proteínas (MANSOUR et al., 2010). Existem diferentes tipos de
PLA no mercado que podem ser diferenciados quanto à massa molar, grau de
cristalinidade, viscosidade e proporção de isômeros (D,L) (BRAGAGNI et al., 2013).
2.4.1 Síntese do PLA
O PLA de baixa massa molar foi descoberto em 1932 por Carothers
(DuPont), no entanto, somente em 1954, a empresa conseguiu produzir o PLA de
alta massa molar, o qual foi patenteado em seguida. Em 1973, o poli (ácido láctico)
29
foi proposto como carreador de fármacos em matrizes biodegradáveis
degradáveis (LASPRILLA
(
et al., 2012).
Na síntese do PLA (Figura 4), a presença de um átomo de carbono
assimétrico no ácido láctico pode originar duas formas opticamente ativas, o L-PLA
L
e
o D-PLA e, uma racêmica, o D,L-PLA
D,L
(SAEIDLOU
SAEIDLOU et al., 2012).
2012) O polímero obtido
pela policondensação
condensação do ácido lático apresenta baixa massa molar. Nessa reação
ocorre formação de água como subproduto da polimerização e, para obter polímeros
de massa molar elevada é necessário que solventes orgânicos e agentes
promotores de esterificação sejam utilizados,
utilizados, adicionando custo
c
ao processo
(GARLOTTA, 2001).
). O método mais comum para a obtenção do PLA com alta
massa molar é a polimerização através
atrav da abertura de anel.. O intermediário ácido
láctico cíclico é formado durante a primeira etapa quando a água do produto de
condensação é removida por evaporação durante o processo.
processo Na segunda etapa, os
isômeros purificados L-láctico
láctico, D-láctico ou D,L-láctico (50:50) são convertidos ao
poliéster por meio de reações de condensação.
condensação. O grau de cristalinidade do produto
prod
final depende da razão de isômeros (-L)
(
e (-D) obtidos durante o processo
(NAMPOOTHIRI;
NAMPOOTHIRI; NAIR; JOHN, 2010).
Figura 4 – Representação esquemática da síntese
s
do poli (ácido láctico) a partir de reações de
condensação e/ou de polimerização por abertura de anel.
Fonte: adaptado de GARLOTTA,
GARLOTTA 2001.
30
2.4.2 Degradação do PLA
O PLA sofre degradação por hidrólise não enzimática dos grupos ésteres
(LASPRILLA et al., 2012), originando subprodutos não tóxicos, como o ácido láctico,
os quais são eliminados pelo metabolismo celular (VERNON; LETOURNEAU, 2010).
Sua degradação geralmente ocorre pela cisão da cadeia principal e cadeias laterais
da macromolécula por processos físicos, químicos e biológicos como ativação
térmica, hidrólise, atividade biológica, oxidação, fotólise ou radiólise. Esses
fenômenos dependem de fatores como massa molar, cristalinidade, pureza,
temperatura, pH e grupos terminais carboxil e hidroxil (NAMPOOTHIRI; NAIR;
JOHN, 2010).
2.4.3 Características físico-químicas
O PLA (Figura 5) pode existir como diferentes isômeros, sendo que estes
diferem quanto à taxa de degradação, propriedades físicas e mecânicas. O L-PLA e
D-PLA têm natureza semicristalina devido à alta regularidade da sua cadeia
polimérica, enquanto que o D,L-PLA possui estrutura amorfa (GARLOTTA, 2001;
LUCKACHAN; PILLAI, 2011). A cristalinidade é crucial para o controle da taxa de
degradação, resistência térmica e mecânica (SAEIDLOU et al., 2012). O L-PLA
possui excelente biocompatibilidade e propriedades mecânicas. No entanto, a sua
degradação a longo prazo pode causar reações inflamatórias no organismo. Por
outro lado, o D,L-PLA é mais rapidamente degradado no organismo em relação aos
outros isômeros (FUKUSHIMA; KIMURA, 2008). As propriedades físico-químicas
dos isômeros do PLA podem ser encontradas na Tabela 1.
Figura 5 - Representação esquemática da estrutura química do poli (ácido láctico).
Fonte: GARLOTTA, 2001.
31
Tabela 1 - Propriedades físico-químicas das formas estereoquímicas do PLA
Formas
estereoquímicas
do PLA
Temperatura de
transição vítrea
(ºC)
Temperatura de
fusão (ºC)
Densidade
3
(g/cm )
Solubilidade
Clorofórmio,
dioxano,
L-PLA
50-80
173-178
1,290
acetonitrila,
cloreto de
metileno
Etilacetato,
dimetilsulfóxido,
D-PLA
40-50
120-150
1,248
tetrahidrofurano,
etillactato
Solventes do LD,L-PLA
43-53
Amorfo
1,250
PLA e acetona
Fonte: adaptado de SÖDERGARD; STOLT, 2002; NAMPOOTHIRI; NAIR; JOHN, 2010.
O poli (ácido láctico) com quantidade de L-PLA maior que 90% tende a
ser cristalino, influenciando na temperatura de transição vítrea (Tg) e na temperatura
de fusão (Tf) do polímero. A entalpia de fusão estimada para o PLA 100% cristalino
(ΔHºf) é de 93 J/g. Para o PLA amorfo, a Tg é um dos principais parâmetros a ser
considerado devido à mobilidade da cadeia polimérica, enquanto que, para o PLA
semicristalino, a Tf é determinante nesse processo (LASPRILLA et al., 2012).
As propriedades da matriz polimérica, tais como o comprimento e a
flexibilidade da cadeia do polímero, intumescimento, interações entre o polímero e o
fármaco, tamanho e porosidade das partículas influenciam diretamente na taxa de
liberação do fármaco (MANSOUR et al., 2010). Por isso, é interessante realizar a
caracterização físico-química de micropartículas, anteriormente ao estudo de
dissolução in vitro, facilitando, assim, a elucidação dos mecanismos de liberação do
fármaco.
2.5 Poloxâmeros
Os poloxâmeros, também conhecidos como Pluronics®, são copolímeros
não-iônicos dispostos em blocos, que consistem de um grupo hidrofílico poli (óxido
de etileno) (PEO) e um outro hidrofóbico poli (óxido de propileno) (PPO),
organizados em tribloco PEO-PPO-PEO (Figura 6). Esses copolímeros com
diferentes números de unidades PEO e PPO são caracterizados por diferentes
equilíbrios hidrófilo-lipófilo (EHL) (BATRAKOVA; KABANOV, 2008).
32
Os principais tipos de poloxâmeros são o poloxâmero 188 (PEO80-PPO27PEO80) também conhecido como Pluronic® F68, e o poloxâmero 407 (PEO101-PPO56PEO101), mais conhecido como Pluronic® F127 (USP, 2007). Estes apresentam
praticamente a mesma fração de massa de PEO, 80 e 70%, respectivamente, mas o
comprimento da cadeia do bloco PPO é maior no PLUF127 que no PLUF68
(ALEXANDRIDIS; TSIANOU, 2011).
Figura 6 - Representação esquemática geral da fórmula estrutural do poloxâmero, sendo (a)
composição do bloco hidrofílico PEO e (b) composição do bloco hidrofóbico PPO
Fonte: PATEL, H.; PATEL, R.; PATEL, M., 2009.
Devido ao seu caráter anfifílico, os poloxâmeros apresentam propriedades
surfactantes, incluindo a habilidade de interagir com superfícies e membranas
biológicas, bem como auxiliar na solubilização de fármacos pouco solúveis em água,
o que permite seu uso em administração parenteral de agentes quimioterápicos
(BONACUCINA et al., 2011). Além disso, estudos revelam que os Pluronics® podem
inibir o efluxo de fármacos através da Glicoproteína-P, diminuindo a resistência de
células cancerígenas a fármacos antineoplásicos (GIFFORD et al., 1998;
BATRAKOVA; KABANOV, 2008; SHIBAYAMA; TAKEDA; YAMADA, 2009).
Os poloxâmeros são ainda utilizados em formulações como agentes
emulsificantes, solubilizantes e dispersantes, sendo frequentemente considerados
como excipientes funcionais porque constituem componentes essenciais e têm papel
fundamental na formulação (PATEL, H.; PATEL, R.; PATEL, M., 2009). Atuam como
surfactante não-iônico em uma concentração de 20 a 30% (ALEXANDRIDIS;
TSIANOU, 2011).
Os poloxâmeros apresentam termosensibilidade inversa, ou seja, em
concentrações acima de 20%, formam solução aquosa em baixas temperaturas, mas
gelificam em temperaturas mais altas (ESCOBAR-CHÀVEZ et al., 2006; PATEL, H.;
PATEL, R.; PATEL, M., 2009). Devido à biocompatibilidade, aprovação pelo FDA e
ao comportamento termogelificante, o uso de poloxâmeros vem sendo investigado
33
como formador de matriz in situ, pela formação de gel, para uso em sistemas de
liberação de fármacos (GUO et al., 2007; MOEBUS; SIEPMANN; BODMEIER, 2009;
BONACUCINA et al., 2011). Estes têm sido bastante utilizados na área médica,
farmacêutica e cosméticos, sendo que no campo farmacêutico, há maior interesse
em géis, microemulsões, nanopartículas e blendas de polímeros sólidos (GUO et al.,
2007).
2.6 Metotrexato
Alguns dos fatores que restringe o uso de fármacos quimioterápicos são o
aparecimento de resistência farmacológica e a toxicidade destes compostos. O
desenvolvimento de sistemas de liberação controlada vem sendo aprimorado no
sentido de diminuir os efeitos adversos de antineoplásicos (MANSOUR et al., 2010;
GONG et al., 2012; MEI et al., 2013). O uso do metotrexato foi iniciado
empiricamente em 1951 para tratamento da psoríase e artrite reumatoide, mas
somente em 1958 ocorreu a publicação dessa descoberta. Em 1972, o MTX foi
aprovado pelo FDA para tratamento de psoríase (CARRETERO et al., 2010). Este
fármaco apresenta alto índice de resistência e toxicidade, portanto vem sendo
investigado em micropartículas biodegradáveis (BANERJEE et al., 2002; SILVAJÚNIOR, 2005, 2008; PATEL, H.; PATEL, B.; PATEL, V., 2010).
2.6.1 Características físico-químicas
O metotrexato N-[4-[[(2,4-diamino-6-pteridinil)metil]metilamino]benzoil]-Lácido glutâmico (Figura 7), também conhecido como ametopterina, possui massa
molar de 454,44 g/mol (USP, 2007). O fármaco apresenta-se como um pó alaranjado
cristalino, praticamente insolúvel em água e solventes orgânicos (etanol, clorofórmio
e éter), solúvel em soluções diluídas de hidróxidos e carbonatos alcalinos. Sua
molécula apresenta dois grupos carboxil com constantes de dissociação (pKa),
aproximadamente de 3,4 (α-carboxil) e 4,7 (γ-carboxil), bem como grupos funcionais
nitrogenados, no qual o mais básico é o grupamento N-1 guanidínico no anel pterina
(pka 5,71) (RUBINO, 2001). Sua solubilidade em água é altamente influenciada pelo
pH. É pouco solúvel em pH ácido (BITTENCOURT; BRUNSTEIN, 2006), mas em
34
solução alcalina, é classificado como classe III no Sistema de Classificação
Biofarmacêutica (alta solubilidade e baixa permeabilidade), encontrando-se na forma
ionizada (LINDENBERG; KOPP; DRESSMAN, 2004).
Figura
7 - Representação esquemática da estrutura química do metotrexato
.
Fonte: OLIVEIRA et al., 2013.
2.6.2 Mecanismo de ação
O MTX é análogo do ácido fólico, este possui denominação de N-[4-[[(2amino-3,4-diidro-4-oxo-6-pteridinil)
metil]amino]benzoil]-L-glutâmico
(Figura
8),
também conhecido como ácido pteroilglutâmico ou vitamina B9 (FARMACOPEIA
BRASILEIRA, 2010), solúvel em água, é um dos mais importantes componentes do
sistema hematopoético, sendo a coenzima que controla a geração de ferro heme no
organismo (FLORES et al., 2005).
Figura 8 - Representação esquemática da estrutura química do ácido fólico
Fonte: RUBINO, 2001.
35
O fármaco atua como um antagonista do ácido fólico e tem alta afinidade
pela dihidrofolato redutase (DHFR), enzima necessária para a conversão do
diidrofolato em tetraidrofolato (forma ativa), importante para a formação de purinas e
timidinas. Isso promove a inibição da síntese do DNA e, consequentemente,
ocasiona morte celular (CHLÁDEK et al., 1998; RUBINO, 2001; WARREN;
GRIFFITHS, 2008; COREM-SALKMON et al., 2011; FDA, 2013). O metotrexato se
liga fortemente à enzima DHFR, de forma competitiva. No entanto, essa ligação é
reversível. Portanto, um grande número de moléculas do fármaco precisa estar no
sítio de ação para manter a inibição (CARRETERO et al., 2010).
2.6.3 Farmacocinética e Toxicidade
O MTX, quando administrado em doses pequenas por via oral, é
rapidamente absorvido, enquanto que, em altas doses, a absorção é incompleta por
causa da saturação do transporte. Uma vez absorvido, o fármaco é parcialmente
inativado no trato intestinal e no fígado, o que significa baixa biodisponibilidade.
Níveis séricos do fármaco são conseguidos 1 a 2 horas após administração oral e,
de 30 a 60 minutos, após injeção intramuscular (CARRETERO et al., 2010). Seus
principais metabólitos são 7-hidroxi-metotrexato e 4-amino-4-deoxi-N10-ácido
metilpteroico (RUBINO, 2001).
O tempo de meia-vida de eliminação é de, aproximadamente, 3 a 10
horas para pacientes com psoríase ou artrite reumatoide (HERNANDEZ-BALDIZON,
2012; FDA, 2013). O tempo de meia-vida da fase de absorção é de 10 minutos e da
fase de distribuição é de, aproximadamente, 2 horas (RUBINO, 2001). Devido a essa
característica, o MTX necessita ser administrado frequentemente para atingir o efeito
terapêutico esperado. A excreção do fármaco é 90% (renal) e 10% (gastrointestinal),
sendo eliminado praticamente inalterado pela urina por filtração e secreção ativa
(CARRETERO et al., 2010; HERNANDEZ-BALDIZON, 2012).
A toxicidade do MTX oral é dose-dependente, sendo que doses iniciais de
20 mg têm mostrado maior eficácia, no entanto maior incidência de tolerância. A rota
parenteral
apresenta-se
mais
efetiva
e
com
menos
reações
adversas
gastrointestinais (CARRETERO et al., 2010). O uso sistêmico do metotrexato
ocasiona potenciais efeitos adversos, tais como náusea, vômitos, fadiga, dispneia,
anemia, leucopenia, trombocitopenia e hepatotoxicidade. A ocorrência de efeitos
36
tóxicos é a causa mais frequente de descontinuação do tratamento farmacológico
(TIAN; CRONSTEIN, 2007; CARRETERO et al., 2010).
2.6.4 Uso clínico
O uso clínico do MTX inclui o tratamento de diversas neoplasias, como
carcinoma da bexiga, cervical, da mama, ovariana, da próstata, do pulmão, renal e
testicular (COREM-SALKMON et al., 2011). Utilizado também para o tratamento de
leucemia linfocítica aguda, artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico, psoríase
e doença de Crohn (BITTENCOURT; BRUNSTEIN, 2006; LIANG et al., 2009;
PATEL, H.; PATEL, B.; PATEL, V., 2010).
A artrite reumatoide é uma doença sistêmica autoimune caracterizada por
poliartrite simétrica, crônica e deformante que produz incapacidade articular a longo
prazo, se não for controlada. O medicamento de escolha para esta enfermidade é o
MTX e, tradicionalmente, sua dose inicial recomendada tem sido 7,5 a 10 mg, com
doses de ácido fólico de 5 a 10 mg ao dia (HERNANDEZ-BALDIZON, 2012). Apesar
de o mecanismo de ação do fármaco na artrite reumatoide ser pouco conhecido,
baixas doses de MTX parecem exercer efeito antiinflamatório por ação
patofisiológica (LIANG et al., 2009). Estudos revelam que há inibição da produção de
citocinas proinflamatórias, promovendo a liberação de adenosina ou ativando células
T de apoptose, suprimindo a proliferação de linfócitos e neutrófilos (TIAN;
CRONSTEIN, 2007; WARREN; GRIFFITHS, 2008; XINQIANG et al., 2010).
2.6.5 Aplicação de Sistemas de Liberação de Fármacos contendo Metotrexato
O uso de metotrexato é limitado devido a sua toxicidade dosedependente, à meia-vida curta na corrente sanguínea e à resistência em célulasalvo. Recentemente, estudos têm sido realizados sobre micro e nanopartículas
contendo MTX, no intuito de diminuir sua toxicidade e superar mecanismos de
resistência das células cancerígenas, melhorando a adesão do paciente ao
tratamento quimioterápico (COREM-SALKMON et al., 2011). Além disso, outros
sistemas estão sendo investigados como lipossomas, dendrímeros, hidrogeis,
micelas e filmes poliméricos no intuito de melhorar o direcionamento do fármaco
37
para tumores dentro de uma faixa terapêutica desejada (WOLINSKY; COLSON;
GRINSTAFF, 2012).
Estudos com micelas poliméricas para incorporação de metotrexato foram
realizados por Zhang e colaboradores (2005), que avaliaram as características
físico-químicas destes sistemas e a liberação do fármaco in vitro, demonstrando
ótimo potencial como carreador de fármacos anticâncer pouco solúveis em água.
Além disso, outros sistemas poliméricos, como os dendrímeros, também foram
estudados para avaliar a influência na liberação desse fármaco (DHANIKULA;
HILDGEN, 2007).
Patel e colaboradores (2010) desenvolveram micropartículas de PLGA
contendo metotrexato, obtidas pela técnica de evaporação por solvente, e realizaram
a caracterização físico-química desses sistemas, os quais podem ser utilizados para
liberação controlada de fármacos antitumorais devido à diminuição da toxicidade do
MTX. As micropartículas de α-lactalbumina para controle da liberação desse fármaco
foram estudadas por Vijayaragavan et al. (2011), obtidas pela técnica de
emulsificação em solução aquosa e estabilizadas por reticulações com glutaraldeído.
A α-lactalbumina foi utilizada como novo carreador de fármacos com grande
potencial de aplicação na administração do MTX.
Corem-Salkmon
et
al.
(2011)
desenvolveram
um
sistema
de
nanopartículas ligadas à maghemita superparamagnética para liberação de
metotrexato por convecção aprimorada, técnica para a liberação de fármacos
diretamente em tumores cerebrais, contendo albumina sérica humana como
revestimento para tratamento de gliomas. As nanopartículas de MTX apresentaram
eficientes volumes de distribuição e lento tempo de depuramento in vivo, o que
sugere a eficácia destas partículas no tratamento farmacológico.
O metotrexato também vem sendo estudado em sistemas coloidais como
os lipossomas, pois este possui dificuldade em atravessar o estrato córneo, o qual
constitui a primeira barreira para a liberação transepitelial de fármacos, no caso de
tratamento de psoríase. Isso foi avaliado por Srisuk e colaboradores (2012) através
da investigação de lipossomas deformáveis contendo MTX, preparados a partir de
fosfatidilcolina (FC) e ácido oleico, comparado àqueles convencionais (FC e
colesterol). Os lipossomas deformáveis mostraram-se sistemas promissores para o
aumento de permeabilidade do MTX no tratamento de psoríase.
38
Após revisão da literatura, não foram encontrados trabalhos sobre a
obtenção de micropartículas pela técnica de secagem por atomização, contendo
blendas poliméricas PLA-Pluronic®, no intuito de modular a liberação do metotrexato.
Portanto, o presente trabalho apresenta a estratégia do uso de micropartículas de
PLA e blendas PLA-PLU para a melhoria da eficácia terapêutica de quimioterápicos.
Devido à biocompatibilidade, biodegradabilidade dos materiais utilizados e à
diminuição de toxicidade do fármaco, a presente pesquisa pretende estabelecer
sistemas carreadores de fármacos biodegradáveis e estáveis com potencial para uso
in vivo.
2.7 Modelos matemáticos utilizados na interpretação da cinética de liberação
do metotrexato
Vários modelos cinéticos descrevem a dissolução do fármaco para
sistemas de liberação imediata e modificada. Estes representam o perfil de liberação
do fármaco, onde a quantidade de substância dissolvida é representada
graficamente em função do tempo. A interpretação dos valores obtidos no ensaio de
dissolução
é
facilitada
pelo
uso
de
equações
genéricas
que
traduzem
matematicamente a curva de dissolução em função de algum parâmetro relativo à
forma farmacêutica (COSTA; LOBO, 2001).
2.7.1 Cinética de ordem zero
A liberação de formas farmacêuticas que não se desagregam e que
liberam o fármaco lentamente pode ser expressa da seguinte maneira:
Q0 – Qt = K 0 t
(1)
onde, Q0 é a quantidade inicial de fármaco, Qt é a quantidade de fármaco liberado
em determinado tempo t e K0 a constante de proporcionalidade. Quando se divide a
equação acima por Q0 e simplificando, pode-se dizer que ft = K0t, sendo que ft = 1(Qt/Q0), onde ft representa a fração do fármaco liberado no tempo t e K0 é a
constante de velocidade de liberação de ordem zero (COSTA; LOBO, 2001). Esta
39
relação pode ser aplicada a formas farmacêuticas de liberação modificada como
comprimidos matriciais
que
contêm fármacos pouco
solúveis.
As formas
farmacêuticas que seguem este perfil liberam a mesma quantidade de fármaco por
unidade de tempo, portanto este é o modelo ideal para uso em liberação prolongada
(MANADAS; PINA; VEIGA, 2002).
2.7.2 Cinética de primeira ordem
A aplicação deste modelo aos estudos de dissolução foi proposta pela
primeira vez por Gibaldi e Feldman (1967 apud COSTA, 2002). Hixson e Crowell
adaptaram a equação de Noyes-Whitney [dC/dt = K(Cs – Ct)], onde C é a
concentração do soluto no tempo t, Cs é a solubilidade no equilíbrio na temperatura
experimental. De um modo simples, este modelo pode ser expresso pela seguinte
relação:
log Qt = log Q0 +
KP t
2,303
(2)
onde Qt é a quantidade de fármaco liberado em determinado tempo t, Q0 é a
quantidade inicial de fármaco e KP é a constante de liberação de primeira ordem. As
formas farmacêuticas que contêm fármacos hidrossolúveis em matrizes porosas,
que seguem este modelo, liberam o fármaco de forma proporcional à quantidade
remanescente, sendo que a quantidade de fármaco liberada por unidade de tempo
diminui (MULYE; TURCO, 1995 apud MANADAS; PINA; VEIGA, 2002).
2.7.3 Modelo de Higuchi
Higuchi desenvolveu diversos modelos para analisar a liberação do
fármaco a partir de formas farmacêuticas constituídas por matrizes homogêneas
esféricas e matrizes não homogêneas planas ou esféricas (MANADAS; PINA;
VEIGA, 2002). Genericamente, é possível resumir o modelo de Higuchi à seguinte
expressão:
1
ft = K H t 2
(3)
40
onde KH é a constante de velocidade de dissolução de Higuchi, que descreve a
liberação do fármaco como um processo de difusão baseado na lei de Fick (COSTA,
2002). Este modelo pode ser usado para descrever a dissolução de fármacos a partir
de diversas formas farmacêuticas de liberação modificada, tais como alguns
sistemas transdérmicos, e comprimidos matriciais com fármacos hidrossolúveis
(COSTA; LOBO, 2001).
2.7.4 Modelo de Korsmeyer-Peppas
O modelo semi-empírico de Korsmeyer-Peppas ou lei das Potências é
aplicado, permitindo a obtenção dos parâmetros a e n, com a finalidade de ampliar a
informação sobre o mecanismo de liberação do fármaco a partir dos sistemas
microparticulados (SIEPMAN; PEPPAS, 2012). Este modelo pode ser representado
pela seguinte equação:
Mt
= KKP tn
M∞
(4)
onde, KKP é uma constante que incorpora características estruturais e geométricas
da forma farmacêutica, n é o expoente de liberação, indicativo do mecanismo de
liberação do fármaco, e a função de t é Mt /M∞ (fração do fármaco liberado). Esta
expressão pode ser reescrita da seguinte forma: Mt/M∞ = lnKKP + nlnt.
Para sistemas esféricos, o modelo de Korsmeyer-Peppas apresenta duas
interpretações físico-químicas distintas. Quando n assume um valor inferior a 0,43
indica que a liberação do fármaco é controlada por difusão (mecanismo de
transporte Fickiano). Quando n é superior a 0,85, a liberação é controlada pelo
intumescimento (ou erosão) do polímero (transporte caso-II ou mecanismo de
transporte não-Fickiano). Valores de n entre 0,43 e 0,85 estão relacionados com a
sobreposição de ambos os fenômenos, denominado de transporte anômalo
(SIEPMANN; PEPPAS, 2012).
41
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
•
Desenvolver e caracterizar micropartículas de poli (ácido láctico) e
blendas poliméricas PLA/poloxâmeros, obtidas pela técnica de
secagem por atomização, no intuito de modular a liberação do
metotrexato.
3.2 Objetivos específicos
•
Validar e aplicar a metodologia analítica do metotrexato;
•
Preparar micropartículas de MTX/PLA, nas razões fármaco:polímero
(1:10, 1:4,5 e 1:3), MTX/PLUF127 e F68, blendas MTX/PLA-PLUF127
e
PLA-PLUF68,
na
proporção
fármaco:polímero
(1:3)
e
polímero:copolímero (25:75, 50:50, 75:25) pela técnica de spray drying;
•
Investigar os parâmetros de eficiência de encapsulação e teor de
fármaco incorporado aos sistemas microparticulados;
•
Determinar o tamanho de partícula dos sistemas microparticulados
pela técnica de espalhamento de luz dinâmico;
•
Avaliar o tamanho e a forma das partículas por microscopia eletrônica
de varredura (MEV);
•
Avaliar os sistemas obtidos por espectroscopia no infravermelho por
transformada de Fourier (FTIR), difração de raios-X (DRX) e análise
térmica;
•
Avaliar o perfil e cinética de liberação in vitro dos sistemas
microparticulados obtidos;
• Realizar estudos
in vitro em cultura de células, avaliando a
citotoxicidade dos sistemas microparticulados.
42
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Materiais
4.1.1 Matérias-primas
•
Metotrexato - DEG (Brasil);
•
D,L-PLA (viscosidade inerente 0,67 dL/g a 25°C; massa molar aproximada de
100.000 g/mol) - BIRMINGHAM POLYMERS Inc. (USA);
•
Pluronic® F68 (Mw = 8.400 g/mol) – SIGMA-ALDRICH;
•
Pluronic® F127 (Mw =12.600 g/mol) – SIGMA-ALDRICH;
4.1.2 Reagentes e Solventes
•
Acetato de amônio – QHEMIS (Brasil);
•
Acetona – VETEC (Brasil);
•
Ácido acético glacial – VETEC (Brasil);
•
Ácido clorídrico – LABSYNTH;
•
Água purificada (condutividade 0,1 µS/cm a 25°C);
•
Água ultrapura (MilliQ®);
•
Dimetilsulfóxido (DMSO) – VETEC (Brasil);
•
Fosfato de potássio monobásico – VETEC (Brasil);
•
Hidróxido de sódio – QHEMIS (Brasil);
•
Meio de cultura Leibowitz (L-15) – SIGMA-ALDRICH;
•
Metanol grau HPLC – HEXIS CIENTÍFICA;
•
3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólio brometo (MTT) – SIGMAALDRICH;
•
Soro fetal bovino (SFB) – INVITROGEN;
•
Antibiótico-antimicótico – SIGMA-ALDRICH;
•
Triptose – SIGMA-ALDRICH.
43
4.1.3 Equipamentos e Acessórios
•
Balança analítica – GEHAKA, modelo AG – 200;
•
pHmetro – GEHAKA, modelo PG – 1800;
•
Lavadora Ultra-sônica – UNIQUE, modelo USC – 1400;
•
Espectrofotômetro – UV-Vis BIOCRROM, modelo Libra S32;
•
Espectrofotômetro – UV-Vis EVOLUTION, modelo 60S;
•
Spray dryer – BÜCHI , modelo 191;
•
Cromatógrafo líquido de alta eficiência, dotado de detector de ultravioleta –
THERMO SCIENTIFIC, modelo Surveyor Plus LC/MS;
•
Difratômetro – RIGAKU, modelo Miniflex II;
•
Espectrofotômetro infravermelho – PERKIN ELMER, modelo Spectrum 65;
•
Centrífuga – EXCELSA II, modelo 206 BL;
•
Microscópico Eletrônico de Varredura – HITACHI, modelo TM 3000;
•
Banho termostático – SOLAB, modelo SL-150/22;
•
Analisador de partículas Light Scattering – Nanotrac, modelo NPA252;
•
Equipamento simultâneo TGA-DSC – TA INSTRUMENTS, modelo SDT Q600;
•
Espectrofotômetro de microplacas – BIOTEK, modelo Epoch.
44
4.2 Validação da metodologia analítica do metotrexato por espectrofotometria
UV-Vis
4.2.1 Seleção do comprimento de onda
Foi realizada a varredura do comprimento de onda da solução de
metotrexato em ácido acético 0,1 mol/L em uma concentração de 10 μg/mL,
utilizando uma cubeta de quartzo de 1 cm de caminho óptico, para obtenção do
espectro de absorção na região do ultravioleta (200 a 400 nm).
4.2.2 Seletividade
A seletividade foi analisada comparando os espectros de ultravioleta
obtidos da análise da solução do fármaco (MTX), da solução dos polímeros (PLA,
PLUF127, PLUF68) e da solução do fármaco contendo os componentes da matriz
para avaliar a especificidade do método em relação ao metotrexato.
4.2.3 Linearidade
A solução estoque do metotrexato foi preparada em solução de ácido
acético glacial 20% na concentração de 500 μg/mL. Diferentes alíquotas desta
solução foram transferidas para balões volumétricos e o volume aferido com ácido
acético 0,1 mol/L a fim de obter soluções com diferentes concentrações (1,25; 2,5;
5,0; 7,5; 10,0; 12,5; 15,0; 17,5; 20,0 μg/mL). A absorbância das soluções foi
determinada por espectrofotometria na região ultravioleta em comprimento de onda
de 305 nm. A equação da reta foi obtida através da regressão linear entre o valor de
absorbância e a concentração do fármaco em μg/mL. A linearidade foi avaliada a
partir do coeficiente de correlação obtido da curva analítica. Os dados foram ainda
submetidos à análise de variância (ANOVA).
45
4.2.4 Precisão
A precisão intra-dia, inter-dia e a reprodutibilidade foram avaliadas a partir
do coeficiente de variação obtido em cinco diferentes concentrações de MTX, sendo
que duas foram localizadas abaixo, uma intermediária e duas acima do meio da
curva analítica. A precisão intra-corrida foi realizada em um estreito intervalo de
tempo, a inter-corrida, com intervalo de dois dias e manipuladores distintos entre as
análises, e a reprodutibilidade em laboratórios diferentes. Cada ensaio foi realizado
em triplicata. Os resultados obtidos foram submetidos ao teste t-Student (nível de
significância: p < 0,05).
4.2.5 Exatidão
A exatidão foi avaliada pelo método da recuperação por placebo
contaminado. Foi preparada uma solução padrão do fármaco contaminada com PLA.
Desta solução, foram obtidas cinco concentrações da curva analítica. Os resultados
deste ensaio foram submetidos à ANOVA e aplicados na equação a seguir para
obter a % de recuperação do MTX.
Exatidão=
Concentração média experimental
x100
Concentração teórica
(5)
4.2.6 Robustez
A robustez do método foi verificada através da variação do tempo de
agitação da solução (5,0; 7,5 e 10,0 minutos) e do pH da solução estoque,
ajustando-se para pH 1,50 e pH 2,50, utilizando HCl (0,1 mol/L) e NaOH (0,1 mol/L),
respectivamente. Foram investigadas cinco concentrações da curva analítica, em
triplicata, e analisados os coeficientes de variação entre as médias obtidas. Além
disso, foi realizada análise de variância dos resultados encontrados (p < 0,05).
46
4.3 Obtenção de micropartículas
As micropartículas de PLA contendo metotrexato foram obtidas a partir de
soluções atomizadas em aparelho de spray dryer BÜCHI-191, usando aspersor de
diâmetro 0,7 mm, em diferentes proporções fármaco:polímero (1:10; 1:4,5; 1:3), com
o objetivo de se obter sistemas microparticulados com o máximo de fármaco
incorporado. Os componentes foram pesados e dissolvidos em uma mistura de ácido
acético glacial e acetona (1:4). Os lotes foram produzidos em triplicata para avaliar a
reprodutibilidade
do
método
de
produção.
Foram
também
preparadas
micropartículas de PLA sem fármaco.
Para a obtenção de micropartículas de MTX/PLUF127 e F68, sistemas
contendo
blendas
MTX/PLA-PLUF127
e
MTX/PLA-PLUF68,
na
razão
fármaco:polímero (1:3) e polímero:copolímero (25:75, 50:50 e 75:25), foi realizado o
procedimento
descrito
anteriormente.
No
entanto,
para
a
preparação
de
micropartículas sem fármaco, os componentes foram dissolvidos somente em
acetona. Após o processo de secagem por atomização, o material foi coletado e
armazenado sob vácuo à temperatura ambiente. A razão fármaco:polímero de 1:3,
para sistemas MTX/PLU e MTX/PLA-PLU, foi utilizada devido à possibilidade de
incorporar uma maior quantidade de fármaco na micropartícula.
A temperatura de entrada foi ajustada somente no processo de obtenção
de micropartículas de PLU e blendas PLA-PLU sem fármaco, pois foi observada
adesão de material no ciclone a 80°C durante o processo de secagem. Além disso, a
temperatura de saída (aproximadamente 60°C) excedeu a faixa de temperatura de
fusão dos materiais (42 - 51°C), dificultando a produção de partículas sólidas.
Portanto, para as blendas PLA-PLUF127 e PLA-PLUF68, houve uma diminuição da
temperatura de entrada para 60°C e 50°C, respectivamente. Os parâmetros
utilizados durante a produção dos diferentes sistemas podem ser observados na
Tabela 2.
47
Tabela 2 - Parâmetros utilizados durante o processo de secagem por atomização para obtenção de
micropartículas.
Fluxo do ar
Fluxo da
Eficiência
Temperatura de Temperatura
de
bomba de
do
Sistema
entrada (°C)
de saída (°C)
atomização
alimentação
exaustor
(NL/h)
(%)
(%)
MTX/PLA
80
63
500
5
90
PLA
MTX/PLU
80
63
500
5
90
80
63
500
5
90
MTX/PLA-PLUF127
80
63
500
5
90
PLA/PLUF127
60
48
500
5
90
PLUF127
60
48
500
5
90
MTX/PLA-PLUF68
80
63
500
5
90
PLA/PLUF68
50
43
500
5
90
PLUF68
50
43
500
5
90
O processo produtivo e as análises físico-químicas foram realizadas sob
condições assépticas adequadas, garantindo a biossegurança do operador por meio
do uso de máscaras e luvas. Em relação ao descarte do material, o fármaco e as
micropartículas contendo metotrexato, após serem analisados pelas técnicas
analíticas, foram descartados em hipoclorito de sódio, utilizando recipiente adequado
para
seu
armazenamento,
sendo
posteriormente
recolhido
por
empresa
especializada para o descarte final dos resíduos.
4.4 Análise quantitativa do fármaco nas micropartículas por espectrofotometria
UV-Vis
4.4.1 Micropartículas de MTX/PLA
A
quantidade
de
micropartículas
de
PLA
contendo
metotrexato
equivalente a 2,5 mg de fármaco foi dissolvida em solução de ácido acético 20%
para obter uma solução estoque na concentração de 250 μg/mL. Alíquotas desta
solução foram transferidas para balões volumétricos de 10 mL e o volume foi aferido
com solução de ácido acético 0,1 mol/L, a fim de obter soluções na concentração de
10 μg/mL, as quais foram analisadas em triplicata, por espectrofotometria UV-Vis, no
comprimento de onda de 305 nm, de acordo com a metodologia validada citada
anteriormente.
48
4.4.2 Micropartículas de MTX/PLU e blendas MTX/PLA-PLU
Uma quantidade de micropartículas, equivalente a 2,5 mg de fármaco, foi
dissolvida em solução de ácido acético glacial. Em seguida, adicionou-se água
purificada e, após filtração, foi obtida uma solução estoque na concentração de 250
μg/mL. Alíquotas desta solução foram transferidas para balões volumétricos de 10
mL e o volume foi aferido com solução tampão acetato de amônio (pH 6,0; 0,05
mol/L) e metanol na razão 75:25 a fim de obter soluções na concentração de 8
μg/mL, as quais foram analisadas em triplicata através de Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE), de acordo com a metodologia previamente validada pelo
grupo de pesquisa, utilizando os seguintes parâmetros cromatográficos: detecção
UV (λ = 303 nm), fluxo (1 mL/min), coluna de fase reversa (Thermo Hypersil C18,
250 x 4,6 mm, 5 μm), fase móvel (tampão acetato de amônio:metanol 75:25) e
volume de injeção (25 μL). As amostras foram previamente filtradas em membrana
de nylon, com diâmetro do poro de 0,22 μm, antes de serem injetadas no
equipamento. Uma curva padrão para o doseamento do fármaco foi construída a
partir de soluções entre 2,0 a 12,0 μg/mL, em tampão acetato de amônio:metanol
75:25. A eficiência de encapsulação e o teor de fármaco incorporado foram
calculados de acordo com as equações a seguir.
EE % =
QTD
x 100
QTA
(6)
sendo, EE, a eficiência de encapsulação; QTD, a quantidade de fármaco
determinado no sistema polimérico e QTA, a quantidade de fármaco teoricamente
adicionada ao sistema polimérico.
TF % =
TTF x EE
100
(7)
sendo, TF, o teor de fármaco incorporado ao sistema; TTF, o teor teórico de fármaco
incorporado e EE, a eficiência de encapsulação.
49
4.5 Caracterização físico-química dos sistemas microparticulados
4.5.1 Determinação do tamanho de partícula
O diâmetro médio e a distribuição de tamanho de partícula foram
determinados pela técnica de espalhamento de luz dinâmico (Dynamic Light
Scattering) em um Nanotrac NPA252, utilizando o Programa Flex 10.4.3. As
micropartículas foram dispersas em uma mistura dos solventes hexano e acetato de
etila. O diâmetro médio baseado no volume foi utilizado como parâmetro para a
distribuição do tamanho de partícula. Os diâmetros correspondentes a 10%, 50% e
90% da distribuição de partículas foram determinados a partir da média de três
medidas de cada amostra. O índice de polidispersão (SPAN) da análise
granulométrica foi calculado a partir da equação abaixo (SANSONE et al., 2011).
SPAN =
D90-D10
D50
(8)
onde, D90 é a frequência de tamanho de 90% das partículas (μm); D50 é a frequência
de tamanho de 50% das partículas (μm); D10 é a frequência de tamanho de 10% das
partículas (μm).
4.5.2 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
As amostras de metotrexato não atomizado e atomizado, micropartículas
de PLA sem fármaco, sistemas MTX/PLA, MTX/PLU e blendas MTX/PLA-PLUF127,
MTX/PLA-PLUF68 foram analisadas em um microscópio eletrônico de varredura
(HITACHI, TM 3000). As amostras foram colocadas em uma fita adesiva de dupla
face impregnada com carbono sob um disco de alumínio, utilizando uma voltagem
de elétrons de 15 kV.
4.5.3 Espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR)
As análises foram realizadas para o MTX não atomizado, micropartículas
de PLA e PLU sem fármaco, sistemas MTX/PLA, MTX/PLU, blendas PLA-PLU sem
50
fármaco e sistemas MTX/PLA-PLU, através de espectroscopia na região do
infravermelho no intervalo de 4000-400 cm-1, em um equipamento da marca PERKIN
ELMER e modelo SPECTRUM 65, a fim de verificar a presença de grupos funcionais
e possíveis interações entre os componentes das micropartículas. Aproximadamente
1,00 mg de amostra foi misturada a 200 mg de brometo de potássio, com o auxílio
de gral e pistilo. Em seguida, a mistura foi submetida à prensa hidráulica para
obtenção das pastilhas, que foram armazenadas em dessecador antes da análise
(SILVA-JÚNIOR, 2005, 2008; SILVA-JÚNIOR et al., 2009).
4.5.4 Difração de raios-X (DRX)
As análises foram realizadas para amostras contendo metotrexato não
atomizado e atomizado, micropartículas de PLA e PLU sem fármaco, sistemas
MTX/PLA, MTX/PLU, blendas PLA-PLU sem fármaco e sistemas MTX/PLA-PLU. O
equipamento utilizado foi o difratômetro da marca RIGAKU e modelo MINIFLEX II,
tipo D Tex Ultra, com intervalo de leitura de 5º a 45º, em ângulo 2θ, utilizando
radiação Cu-Kα (λ =1,54 nm) e filtro de Ni (SILVA-JÚNIOR et al., 2009).
4.5.5 Análise térmica
As amostras foram analisadas por Calorimetria Diferencial Exploratória
(DSC) e Termogravimetria (TG) em um equipamento simultâneo TGA-DSC, TA
Instruments, modelo SDT Q600. As curvas de TG-DSC foram obtidas na faixa de
temperatura de 25ºC a 500°C, sob atmosfera de nitrogênio (N2) em um fluxo de 100
mL/min, com razão de aquecimento de 10°C/min, utilizando cadinho de platina
aberto, contendo de 6 - 12 mg de amostra.
4.6 Estudo do perfil de liberação in vitro dos sistemas microparticulados
O ensaio de liberação in vitro foi realizado em banho termostatizado a
37,0°C ± 0,2°C, utilizando meio tampão fosfato pH 7,4 (KH2PO4 0,05 mol/L).
Quantidades conhecidas de metotrexato nas micropartículas foram suspensas em 4
mL do meio de dissolução, em tubos de ensaio, que foram centrifugados a 3500 rpm
51
durante 10 minutos, nos quais o sobrenadante foi removido, filtrado em membrana
de acetato de celulose, com diâmetro de poro de 0,45 μm, e analisado em
comprimento de onda de 305 nm, em tempos previamente determinados, na região
do ultravioleta por espectrofotometria. O tampão foi adicionado aos tubos para a
reposição do meio de liberação. Todas as análises foram realizadas em sextuplicata.
Uma curva padrão utilizada para o doseamento do fármaco foi construída a partir de
soluções entre 1,25 a 20,00 μg/mL em tampão fosfato (0,05 mol/L; pH 7,4). A leitura
das amostras foi realizada em 305 nm por espectrofotometria UV-Vis (n = 4).
4.6.1 Avaliação da cinética de liberação das micropartículas de MTX/PLA
Os resultados da cinética de liberação foram obtidos a partir da regressão
linear dos perfis de dissolução, os quais foram submetidos a modelos matemáticos
de ordem zero, primeira ordem, Higuchi e Korsmeyer-Peppas. Os modelos cinéticos
aplicados apresentaram um coeficiente de correlação (R2) e uma constante de
velocidade de liberação (K), que foram avaliados para cada sistema estudado
(COSTA; LOBO, 2001; COSTA, 2002; MANADAS, PINA; VEIGA, 2002; SIEPMANN;
PEPPAS, 2012). Os gráficos obtidos para cada modelo matemático utilizado estão
presentes nos Apêndices A e B.
4.7 Avaliação da citotoxicidade
O método colorimétrico utilizado na determinação da viabilidade celular
realizado com o 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólio brometo (MTT),
fundamenta-se na capacidade que a piruvato-desidrogenase (enzima mitocondrial
presente em células vivas), possui de clivar os anéis tetrazólicos do MTT (amarelo e
solúvel em água), formando cristais de formazan. Estes são armazenados no
citoplasma celular e solubilizados após adição de dimetilsulfóxido (DMSO),
fornecendo um produto de coloração azul escura (MOSMAN, 1983; ZHANG et al.,
2003). A intensidade da cor é lida em espectrofotômetro, cuja absorbância obtida é
diretamente proporcional à viabilidade celular.
52
As células Vero E6 (ATCC® CRL-1586) foram cultivadas em meio
Leibowitz (L-15), suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB), 10% de triptose
e 1% de antibiótico-antimicótico (estreptomicina e anfotericina B). Uma suspensão
contendo aproximadamente 2,0 x 105 células/mL foi distribuída em uma placa de 96
poços e incubada por 24 horas em estufa a 37°C. Em seguida, as diferentes
concentrações do metotrexato e quantidades equivalentes do mesmo nos sistemas
microparticulados foram diluídas no meio L-15 com 2% SFB. Foram ainda testadas
micropartículas de PLA, blendas PLA-PLU sem fármaco. A placa foi incubada por 24
e 48 horas a 37°C. Após esse período, o meio foi removido e adicionado 50 μL de
MTT (5 mg/mL), seguido por incubação de 4 horas. Posteriormente, o meio foi
substituído por 100 μL de DMSO e a placa foi agitada por 10 minutos. A leitura foi
realizada em espectrofotômetro de microplacas (BIOTEK, modelo Epoch) a 540 nm.
Foram realizados dois experimentos independentes em duplicata (n = 4). A
viabilidade celular foi calculada a partir da absorbância da monocamada tratada com
a amostra, comparando-a ao controle celular, utilizando a equação a seguir.
V (%) =
DOmt
x 100
DOcc
(9)
Onde, V(%) é a viabilidade celular em porcentagem; DOmt é a Densidade Óptica do
material testado e DOcc é a Densidade Óptica do controle celular.
4.8 Análise estatística
Os resultados obtidos nos experimentos foram submetidos à análise de
variância (ANOVA) e/ou ao teste t-Student, com nível de significância (p < 0,05). A
análise estatística foi realizada, utilizando o software Sigma Start versão 2.0 e, na
construção dos gráficos, o OriginPro versão 8.0.
53
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1
Validação do método
espectrofotometria UV-Vis
e
quantificação
do
metotrexato
por
Para análise quantitativa do fármaco pelo método espectrofotométrico na
região ultravioleta, deve-se investigar o espectro de absorção do mesmo e escolher
o comprimento de onda a ser utilizado. Não devem ser observadas interferências de
impurezas, excipientes ou de solventes (CARDOSO et al., 2006). A Figura 9
apresenta os espectros de varredura do comprimento de onda do fármaco e da
matriz obtidos nas condições de análise.
Figura 9 – Espectros de absorbância UV-Vis de soluções contendo o MTX, componentes da matriz
(PLA, PLUF127, PLUF68), o fármaco e a matriz (MTX/PLA/PLU), em ácido acético 0,1 mol/L.
Legenda: MTX (preto), PLA (vermelho), MTX + PLA + PLUF127 (azul) e MTX + PLA + PLUF68 (rosa).
O metotrexato apresentou o pico de absorção em 305 nm, sendo
considerado adequado para a análise quantitativa do fármaco, pois nesse
comprimento de onda não há interferência da presença do solvente e dos
componentes da matriz. Portanto, o método pode ser considerado seletivo, ou seja,
possui a capacidade de quantificar o fármaco em presença de outras substâncias
como impurezas e produtos de degradação (ICH, 1996; ANVISA, 2003).
A linearidade consiste na capacidade do método de apresentar resultados
que sejam diretamente proporcionais à concentração do analito em amostras, em
uma dada faixa de concentração. Isso pode ser observado a partir do coeficiente de
54
correlação (R2), com critério mínimo de aceitação de 0,99 (ICH, 1996; ANVISA,
2003). A Figura 10 apresenta a curva padrão construída a partir dos valores da
absorbância em função da concentração do fármaco em μg/mL.
Figura 10 - Curva analítica do metotrexato em ácido acético 0,1 mol/L por espectrofotometria UV-Vis
a 305 nm.
A partir da regressão linear dos dados foi obtida a equação da reta y =
0,0505x - 0,0057. Verificou-se que a faixa de concentração de 1,25 a 20,0 μg/mL
mostrou linearidade adequada para a quantificação do fármaco. O coeficiente de
correlação encontrado (R2=0,9999) está de acordo com os parâmetros preconizados
pela ANVISA. Estes resultados foram submetidos à ANOVA, não apresentando
diferença estatística na linearidade (p = 0,999).
A precisão é um importante parâmetro analítico que avalia a proximidade
dos resultados obtidos de uma série de medidas de amostragens múltiplas de uma
mesma amostra (ICH, 1996; ANVISA, 2003). Os resultados do ensaio de precisão
intra-dia, inter-dia e inter-laboratorial estão apresentados nas Tabelas 3 e 4.
55
Tabela 3 - Resultados do estudo de precisão inter-dia e intra-dia para a validação da metodologia
analítica do metotrexato em espectrofotometria UV.
5,0
Intra-dia
Concentração analítica
(µg/mL±DP)
5,07 ± 0,08
CV
(%)
1,58
Inter-dia
Concentração analítica
(µg/mL±DP)
5,27 ± 0,13
CV
(%)
2,50
7,5
7,62 ± 0,24
3,12
7,53 ± 0,31
4,08
0,701
10,0
10,18 ± 0,28
2,76
10,18 ± 0,30
2,95
1,000
12,5
12,69 ± 0,30
2,40
12,60 ± 0,30
2,41
0,747
15,0
15,31 ± 0,34
2,20
15,10 ± 0,50
3,34
0,580
Concentração
teórica (µg/mL)
Valor p
teste t
0,083
Legenda: DP = desvio Padrão; CV = coeficiente de variação.
Tabela 4 - Resultados do estudo de precisão inter-laboratorial para a validação de metodologia
analítica do metotrexato em espectrofotometria UV.
Laboratório A
Laboratório B
Concentração
Valor p
Concentração analítica
teste t
teórica (µg/mL) Concentração analítica
CV(%)
CV(%)
(µg/mL±DP)
(µg/mL±DP)
5,0
5,07 ± 0,08
4,95 ± 0,19
1,58
3,84
0,375
7,5
7,62 ± 0,24
3,12
7,75 ± 0,32
4,10
0,614
10,0
10,18 ± 0,28
2,76
10,00 ± 0,22
2,25
0,455
12,5
12,69 ± 0,30
2,40
12,84 ± 0,05
0,39
0,443
15,0
15,31 ± 0,34
2,20
15,33 ± 0,28
1,85
0,961
Legenda: DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação.
A precisão intra-dia, inter-dia e inter-laboratorial foi avaliada pelo
coeficiente de variação (CV) de diferentes concentrações do fármaco. Os resultados
apresentaram um CV menor que 4,2%, indicando que o método se mostrou preciso
para a quantificação do fármaco de acordo com o preconizado pela ANVISA. Foi
observado que não houve diferença estatística significativa tanto nas precisões intra
e inter-dia, como na precisão inter-laboratorial (p > 0,05).
A exatidão representa o grau de concordância entre os resultados
encontrados e o valor aceito como referência (ICH, 1996; ANVISA, 2003). A Tabela
5 mostra os resultados de recuperação obtidos de soluções contaminadas com PLA.
56
Tabela 5 - Dados de recuperação do método analítico para quantificação do metotrexato contaminado
com PLA.
Concentração teórica (µg/mL)
Concentração analítica (µg/mL)
(±DP)
Recuperação (%) (±DP)
5,0
4,63 ± 0,12
92,69 ± 0,46
7,5
6,86 ± 0,03
91,54 ± 1,47
10,0
9,13 ± 0,15
91,29 ± 1,02
12,5
11,31 ± 0,06
90,51 ± 0,09
15,0
13,79 ± 0,10
91,93 ± 0,15
Legenda: DP = desvio padrão.
O método analítico proposto pode ser considerado exato, pois os
resultados obtidos nas diferentes concentrações apresentaram percentual de
recuperação mínima de 90,51 e máxima de 92,69%, de acordo com as normas
estabelecidas pela ANVISA, entre 80 e 120%. Os dados obtidos na exatidão
também
foram
submetidos
à
análise
de
variância
(ANOVA),
verificando
estatisticamente o grau de proximidade com o valor real (p > 0,05).
A robustez de um método analítico mede a sensibilidade que este
apresenta quando submetido a pequenas variações. Um método é considerado
robusto após revelar-se insensível a variações de parâmetros analíticos durante a
análise (ANVISA, 2003). As Tabelas 6 e 7 apresentam os resultados obtidos da
análise de robustez.
Tabela 6 - Avaliação da robustez do método em diferentes valores de pH.
CV(%)
5,0
pH 1,5
Concentração
analítica
(µg/mL±DP)
6,08 ± 0,13
CV(%)
2,09
pH 2,0
Concentração
analítica
(µg/mL±DP)
5,07 ± 0,08
7,5
9,02 ± 0,00
0,00
10,0
11,90 ± 0,16
12,5
15,0
Concentração
teórica (µg/mL)
CV(%)
1,58
pH 2,5
Concentração
analítica
(µg/mL±DP)
5,40 ± 0,03
7,62 ± 0,24
3,12
8,04 ± 0,04
0,51
1,34
10,18 ± 0,28
2,76
10,58 ± 0,09
0,84
14,76 ± 0,06
0,43
12,69 ± 0,30
2,40
13,08 ± 0,09
0,66
17,54 ± 0,04
0,23
15,31 ± 0,34
2,20
15,56 ± 0,04
0,26
Legenda: DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação.
0,56
57
Tabela 7 - Avaliação da robustez do método em diferentes tempos de agitação.
5,0 min
Concentração
teórica (µg/mL)
5,0
Concentração
analítica
(µg/mL±DP)
5,07 ± 0,08
7,5
7,5 min
1,58
Concentração
analítica
(µg/mL±DP)
5,18 ± 0,19
7,62 ± 0,24
3,12
10,0
10,18 ± 0,28
12,5
15,0
10 min
3,64
Concentração
analítica
(µg/mL±DP)
5,82 ± 0,05
7,79 ± 0,03
0,39
8,73 ± 0,03
0,39
2,76
10,24 ± 0,12
1,18
11,55 ± 0,12
1,00
12,69 ± 0,30
2,40
12,81 ± 0,11
0,85
14,59 ± 0,07
0,49
15,31 ± 0,34
2,20
15,15 ± 0,01
0,08
17,51 ± 0,08
0,47
CV(%)
CV(%)
CV(%)
0,86
Legenda: DP = desvio padrão; CV = coeficiente de variação.
De acordo com os resultados de robustez para variação de pH e tempo de
agitação observados nas Tabelas 6 e 7, todas as concentrações analisadas
apresentaram coeficientes de variação inferiores a 5,0%. Em relação ao tratamento
estatístico aplicado (ANOVA), foi observado que não houve diferença estatística
significativa (p > 0,05) entre as concentrações estudadas, em relação à variação do
pH de 1,5 a 2,5 e ao tempo de agitação de 5,0 a 10 minutos.
Considerando os pKas, em torno de 3,4 (α-carboxil) e 4,7 (y-carboxil) das
carboxilas do fármaco (RUBINO, 2001), praticamente não houve ionização do
mesmo na faixa de pH 1,5 a 2,5, e, portanto, não ocorreu interferência na
intensidade de absorção no comprimento de onda utilizado. O grau de agitação das
moléculas do fármaco também não influenciou significativamente na taxa de
ionização do mesmo. Diante disso, o método é considerado robusto para pequenas
variações de pH e diferentes tempos de agitação.
5.2 Eficiência de encapsulação dos sistemas microparticulados
O teor de fármaco incorporado nas micropartículas de MTX/PLA foi
determinado por espectrofotometria UV-Vis, utilizando a equação da reta citada
anteriormente para a curva analítica do MTX em ácido acético 0,1 mol/L, enquanto
que, nas micropartículas de MTX/PLUF127 e PLUF68, blendas MTX/PLA-PLUF127
e MTX/PLA-PLUF68, o doseamento do fármaco foi determinado por CLAE, que é um
método mais sensível que a espectrofotometria para amostras mais complexas.
58
A Figura 11 mostra a curva analítica do MTX em tampão acetato de
amônio:metanol (75:25), cuja equação da reta é y = 607,315x – 37,255 e o
coeficiente de correlação (R2 = 0,9997).
Figura 11 - Curva analítica do MTX em tampão acetato de amônio:metanol 75:25 por CLAE a 303 nm.
Os resultados do teor de metotrexato incorporado às micropartículas e da
eficiência de encapsulação podem ser encontrados na Tabela 8.
Tabela 8 - Teor de fármaco incorporado e eficiência de encapsulação nos diferentes sistemas
microparticulados ± coeficiente de variação (CV%).
Sistema
Razão
fármaco:polímero
Teor de MTX
incorporado (%) ± DP
Eficiência de
encapsulação (%) ± CV
MTX/PLA
1:10
8,6 ± 1,4
95,6 ± 1,4
MTX/PLA
1:4,5
18,2 ± 5,6
101,3 ± 5,6
MTX/PLA
1:3
26,6 ± 1,7
98,6 ± 1,7
MTX/PLUF127
1:3
22,5 ± 4,4
83,5 ± 4,4
MTX/PLA-PLUF127 25:75
1:3
21,6 ± 2,5
79,9 ± 2,5
MTX/PLA-PLUF127 50:50
1:3
22,2 ± 2,0
82,3 ± 2,0
MTX/PLA-PLUF127 75:25
1:3
22,0 ± 1,2
81,4 ± 1,2
MTX/PLUF68
1:3
21,9 ± 2,5
75,0 ± 2,5
MTX/PLA-PLUF68 25:75
1:3
21,2 ± 2,8
78,7 ± 2,8
MTX/PLA-PLUF68 50:50
1:3
22,6 ± 2,0
83,8 ± 2,0
MTX/PLA-PLUF68 75:25
1:3
21,8 ± 2,2
80,9 ± 2,2
59
De acordo com os resultados observados na Tabela 8, pode-se concluir
que os valores de eficiência de encapsulação (95,6 a 101,3%) mostraram-se
semelhantes para as micropartículas de MTX/PLA (p > 0,05), com um coeficiente de
variação menor que 6,0%. Logo, pode-se afirmar que o método de produção das
micropartículas foi considerado reprodutível e adequado para a obtenção destes
sistemas. Quanto ao teor de fármaco presente em cada sistema, os valores obtidos
foram satisfatórios, considerando que o método de secagem por aspersão
geralmente fornece micropartículas com alta eficiência de encapsulação (FU et al.,
2002; GAVINI et al., 2005; SILVA-JÚNIOR et al., 2008).
Os resultados das eficiências de encapsulação das micropartículas de
MTX/PLU e blendas MTX/PLA-PLUF127 e MTX/PLA-PLUF68 (75,0 a 83,8%) não
apresentaram diferença estatística significativa entre si (p > 0,05). Portanto, não
existe influência do tipo e da concentração de Pluronic® no teor de fármaco
incorporado pela blenda polimérica.
De acordo com a Tabela 8, pode-se observar também que a maior
quantidade de fármaco foi encapsulada em micropartículas contendo poli (ácido
láctico), confirmado pelos valores de eficiência de encapsulação que são, em geral,
superiores aos dos sistemas contendo Pluronic®. Durante a evaporação do solvente,
ocorre o fenômeno de difusão das partículas através de um fluxo de capilaridade,
que leva ao arranjo das partículas dentro da matriz polimérica (NANDIYANTO;
OKUYAMA, 2011; OLIVEIRA, et al., 2013). Existem fatores que influenciam nesse
processo como o tamanho molecular, a temperatura e viscosidade do solvente.
Moléculas pequenas, como o PLU, em relação ao PLA de alto peso molecular,
possuem um maior coeficiente de difusão, o que facilita o movimento das partículas
através dos canais e o aprisionamento do fármaco em regiões próximas à superfície.
Quanto maior a massa molar, menor será a difusão da partícula no meio. Por isso,
macromoléculas, como o PLA, possuem uma limitada mobilidade na blenda. Além
disso, o aglomerado de partículas maiores permite um maior aprisionamento da
molécula do fármaco no interior da matriz (NANDIYANTO; OKUYAMA, 2011).
60
5.3 Determinação do tamanho de partícula
A liberação do fármaco pode ser controlada pelo tamanho de partícula,
pelo mecanismo de degradação do polímero e pela variação de parâmetros
importantes no processo produtivo (BERKLAND; KIM; PACK, 2003). A Tabela 9
apresenta os resultados do tamanho de partícula e distribuição granulométrica dos
sistemas obtidos.
Tabela 9 - Tamanho de partícula e distribuição do tamanho de partícula dos sistemas
microparticulados.
Sistema
D10 (μm)
D50 (μm)
D90 (μm)
1:10 MTX/PLA
1,74
5,63
6,31
Diâmetro médio ±
DP (μm)
3,45 ± 2,00
1:4,5 MTX/PLA
2,52
5,79
6,34
5,11 ± 0,20
0,66 ± 0,14
1:3 MTX/PLA
0,019
5,79
6,34
4,16 ± 0,28
1,09 ± 0,01
MTX/PLUF127
3,77
4,22
6,34
4,92 ± 1,88
3,20 ± 5,32
MTX/PLA-PLUF127 25:75
2,50
5,56
6,31
4,84 ± 1,28
0,72 ± 0,55
MTX/PLA-PLUF127 50:50
0,11
2,42
6,22
3,30 ± 1,22
5,88 ± 4,17
MTX/PLA-PLUF127 75:25
3,74
4,12
4,50
4,00 ± 3,46
0,76 ± 1,09
MTX/PLUF68
3,55
5,84
6,35
5,37 ± 0,20
0,48 ± 0,19
MTX/PLA-PLUF68 25:75
2,02
5,85
6,36
5,05 ± 1,03
0,75 ± 0,54
MTX/PLA-PLUF68 50:50
0,93
3,12
6,01
3,28 ± 1,27
2,15 ± 1,26
MTX/PLA-PLUF68 75:25
0,0014
4,54
6,30
3,33 ± 1,15
1,85 ± 1,32
SPAN ± DP
0,83 ± 0,55
As micropartículas apresentaram tamanho uniforme (p > 0,05), com
aproximadamente 90% das partículas com diâmetro menor que 6,5 μm. Os
tamanhos médios dos sistemas microparticulados encontraram-se no intervalo de 3
a 5 μm, geralmente com valores baixos de SPAN, indicando proximidade dos
valores em torno da média, ou seja, baixa polidispersão. Esse resultado corroborou
com o tamanho de partícula observado nas fotomicrografias (aproximadamente 3
μm), podendo ser visualizado na próxima seção. A técnica de secagem por
atomização apresenta como vantagem a obtenção de micropartículas esféricas e
com tamanho uniforme, importante para a liberação do fármaco a partir de matrizes
poliméricas (ISKANDAR; GRADON; OKUYAMA, 2003; SILVA-JÚNIOR et al., 2008;
2009).
61
5.4 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
A microscopia eletrônica de varredura foi utilizada para avaliar a
morfologia das partículas, que influencia diretamente na taxa de liberação do
fármaco (VAY; FRIEß; SCHELER, 2012), a qual depende de fatores como o
tamanho, a forma, a mobilidade das cadeias poliméricas e as interações com o
polímero (LYU et al., 2005). A Figura 12 apresenta as fotomicrografias do fármaco
não atomizado e atomizado, em um aumento de 2500x.
Figura 12 - Fotomicrografias do metotrexato não atomizado (A) e atomizado (B), em um aumento de
2500x.
A partir da análise das fotomicrografias acima, foi possível verificar que o
fármaco não atomizado apresentou-se com um formato octaédrico (Figura 12-A) e,
após o processo de secagem por atomização, passou para a forma esférica (Figura
12-B). Isso porque a técnica de spray drying fornece partículas esféricas,
dependendo da natureza do material e das condições operacionais de secagem
como a temperatura de entrada, a razão de fluxo de ar ou de alimentação (PATEL,
R.P; PATEL, M.P; SUTHAR, 2009; LI et al., 2010; NANDIYANTO; OKUYAMA,
2011). Os resultados obtidos por MEV para micropartículas de poli (ácido láctico)
sem fármaco e micropartículas de MTX/PLA em um aumento de 2500x, podem ser
observados na Figura 13.
62
Figura 13 - Fotomicrografias de micropartículas de PLA sem fármaco (A); 1:10 MTX/PLA (B), 1:4,5
MTX/PLA (C) e 1:3 MTX/PLA (D), em um aumento de 2500x.
De acordo com a Figura 13, pode-se observar que as micropartículas de
PLA sem fármaco apresentaram uma morfologia toroidal devido a uma deformação
inicial da gotícula durante a secagem no spray dryer (ISKANDAR; GRADON;
OKUYAMA, 2003). A morfologia da partícula é definida durante o estado borrachoso,
quando a temperatura do processo está acima da temperatura de transição vítrea do
material (VAY; FRIEß; SCHELER, 2012), influenciando, no aumento da mobilidade
das cadeias poliméricas e, consequentemente, nas propriedades mecânicas do
mesmo (ROOS, 2002). Durante o processo de secagem, a solidificação da partícula
inicia quando a temperatura da superfície altamente viscosa está abaixo da Tg. Essa
camada ainda é frágil e, com a pressão de vapor do solvente, pode deformar-se, ou
mesmo, sofrer ruptura (BHANDARI; HOWES, 1999; VAY; FRIEß; SCHELER, 2012).
Comparando as fotomicrografias das micropartículas de MTX/PLA,
percebe-se que a presença de metotrexato favoreceu a esfericidade das partículas.
Isso porque o aumento de fármaco na matriz resulta em aumento da Tg e do módulo
elástico, diminuindo a mobilidade das cadeias poliméricas e a flexibilidade do
material (BLASI et al., 2005; VAY; FRIEß; SCHELER, 2012). Quando a Tg do
63
material é mais alta, aproxima-se da temperatura do processo, tornando mais rápido
o processo de solidificação da partícula, diminuindo a deformação da superfície da
partícula, que se torna mais esférica.
O controle da morfologia da partícula depende da concentração e do
tamanho dos componentes no líquido de atomização. Quando a fração dos
componentes é diferente, partículas únicas podem ser produzidas (NANDIYANTO;
OKUYAMA, 2011). Nas Figuras 14 e 15 podem ser observadas as fotomicrografias
das micropartículas de MTX/PLUF127 e F68, de blendas MTX/PLA-PLUF127 e
MTX/PLA-PLUF68, em diferentes razões polímero:copolímero em um aumento de
2500x.
Figura 14 - Fotomicrografias das micropartículas de MTX/PLUF127 (A), de blendas MTX/PLAPLUF127, nas razões polímero:copolímero 25:75 (B); 50:50 (C); 75:25 (D), em um aumento de
2500x.
64
Figura 15 - Fotomicrografias das micropartículas de MTX/PLUF68 (A), de blendas MTX/PLA-PLUF68,
nas razões polímero:copolímero 25:75 (B); 50:50 (C); 75:25 (D), em um aumento de 2500x.
.
Após análise das fotomicrografias das Figuras 14 e 15, pode-se observar
que, nas micropartículas de MTX/PLUF127 e F68, a presença do Pluronic® conferiu
às partículas uma forma toroidal. Isso acontece porque o poloxâmero pode atuar
como um plastificante, o que aumenta a flexibilidade da partícula, por aumentar a
mobilidade das cadeias poliméricas, favorecendo a sua deformação (PARK;
COHEN; LANGER, 1992; GHEBREMESKEL; VEMAVARAPU; LODAYA, 2007).
Por outro lado, com a diminuição do Pluronic®, e aumento de PLA na
blenda, as partículas foram se tornando mais esféricas e uniformes (baixa
polidispersão). Logo, a concentração máxima de poloxâmero a ser utilizado na
blenda é de 25%, no intuito de se obter micropartículas com esse formato. A adição
de uma pequena quantidade de surfactante pode diminuir a tensão superficial, o que
pode resultar em menores tamanhos de gota e, consequentemente, em menor
tamanho de partícula (PATEL, R.; PATEL, M.; SUTHAR, 2009; NANDIYANTO;
OKUYAMA, 2011; GAIGNAUX et al., 2012). É importante considerar que a seleção e
a razão dos componentes da blenda afetam as propriedades físicas e térmicas dos
65
materiais finais, e que a morfologia destas partículas depende da miscibilidade
destes componentes (LIM et al., 2013).
Moebus
e
colaboradores
(2009)
estudaram
hidrogeis
de
alginato:poloxâmero para liberação controlada de fármacos em superfícies mucosas.
A razão da blenda polimérica foi avaliada como parâmetro importante para controle
das propriedades das micropartículas. Os autores concluíram que esta proporção
afetou o tamanho e a forma das partículas. Quando estas possuíam uma alta
quantidade de poloxâmero 407, apresentavam-se frágeis e com forma distorcida,
sendo que, com o aumento de alginato na blenda, as micropartículas se tornavam
mais esféricas e de pequeno tamanho.
5.5 Espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR)
A espectroscopia de absorção na região do infravermelho é uma técnica
bastante difundida para a identificação e elucidação de compostos orgânicos,
baseada nas vibrações dos átomos de uma molécula (LOPES; FASCIO, 2004). Além
disso, pode fornecer informações importantes sobre a compatibilidade fármacoexcipiente ou possíveis reações entre as espécies químicas envolvidas durante ou
após qualquer processo físico e vem sendo utilizada na caracterização físicoquímica de sistemas de liberação de fármacos (SILVA-JÚNIOR et al., 2008).
Essa técnica foi realizada no intuito de verificar as possíveis interações
entre o fármaco e os componentes da matriz nos diferentes sistemas estudados. Os
espectros de cada amostra foram interpretados com o auxílio da literatura
“Identificação espectrométrica de compostos orgânicos” (SILVERSTEIN; WEBSTER;
KIEMLE, 2005). A Figura 16 apresenta os espectros de infravermelho dos
componentes isolados: o metotrexato e o poli (ácido láctico).
66
-1
Figura 16 - Espectros de infravermelho do MTX (A) e do PLA (B), no intervalo de 4000 a 400 cm .
Na Figura 16-A, no espectro de absorção do MTX, pode-se verificar a
presença de grupos funcionais característicos como a amina primária alifática, a
ligação C-N da amina secundária aromática e a ligação N-H da amida, cujas bandas
de absorção ocorrem em 3391,0 cm-1, 1333,0 cm-1, 1603,0 cm-1, respectivamente.
Em relação aos estiramentos das ligações do ácido carboxílico, as bandas ocorrem
em 1646,0 cm-1(C=O), 1208,0 (C-O) e 2962,5 (O-H). Em relação ao anel aromático,
as bandas características são identificadas próximas a 1500 cm-1 e 1550 cm-1.
No espectro de absorção do PLA na região do infravermelho (Figura 16B), as vibrações de deformação axial do éster ocorrem nas bandas 1756,0 cm-1
(C=O); 1087,0 cm-1; 1188,0 cm-1 e 1274,0 cm-1 (C-O). A banda característica do
grupo álcool, observada para a ligação O-H, corresponde a 3494,0 cm-1 e o
estiramento axial da ligação C-H ocorre na banda de absorção referente a 2998,0
cm-1. Na Figura 17, pode-se observar os espectros de infravermelho dos sistemas
MTX/PLA, nas razões fármaco:polímero (1:10, 1:4,5 e 1:3).
67
Figura 17 - Espectros de infravermelho das micropartículas 1:10, 1:4,5 e 1:3 MTX/PLA, no intervalo
-1
de 4000 a 400 cm .
Pode-se verificar na Figura acima que as bandas de absorção dos grupos
funcionais do metotrexato e poli (ácido láctico) foram identificadas nas diferentes
micropartículas, e não sofreram deslocamento relevante em relação ao comprimento
de onda, indicando ausência de interações químicas entre o fármaco e o polímero.
Além disso, ambos possuem lipofilicidade similar, o que sugere distribuição
homogênea do fármaco na matriz polimérica. Portanto, as condições operacionais
durante o processo de secagem por atomização não influenciaram na estabilidade
dos componentes isolados (SILVA-JÚNIOR et al., 2008; 2009).
A espectroscopia na região do infravermelho é uma técnica que tem sido
utilizada para avaliar interações entre uma mistura de componentes dispersos na
matriz. Esta informação pode ser aplicada no estudo de miscibilidade em blendas
poliméricas devido a possíveis mudanças na oscilação do dipolo das moléculas. Isso
pode manifestar-se como alterações na frequência e largura das bandas dos
espectros (NAIR et al., 2001).
Na Figura 18, estão presentes os espectros de infravermelho das
micropartículas de PLUF127 sem fármaco, MTX/PLUF127 e blendas PLA-PLUF127
e MTX/PLA-PLUF127, nas razões polímero:copolímero 25:75; 50:50; 75:25. Em
micropartículas de PLUF127 sem fármaco, as bandas características desse
poloxâmero, para os grupos C-O (éter), O-H (álcool) e C-H (carbono sp2) ocorrem
em 1103,5; 3435,0 e 2875,5 cm-1, respectivamente.
68
Figura 18 - Espectros de infravermelho de micropartículas de PLUF127 sem fármaco,
MTX/PLUF127, blendas PLA-PLUF127 e MTX/PLA-PLUF127, nas razões polímero:copolímero
-1
25:75; 50:50 e 75:25 no intervalo de 4000 a 400 cm .
Na Figura acima, nos sistemas MTX/PLA-PLUF127 e em blendas PLAPLUF127, foi observada a manutenção das bandas correspondentes aos
componentes isolados. Portanto, não foi possível observar interações químicas entre
o PLA e o PLUF127. No sistema MTX/PLUF127, a banda correspondente à ligação
O-H do Pluronic® apresentou um deslocamento para menor frequência (3429 cm-1),
em relação às micropartículas contendo somente PLUF127 (3435 cm-1), sugerindo
formação de ligação de hidrogênio com o grupo –NH2, correspondente à amina
primária do MTX (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2007). Estas interações
químicas podem alterar as propriedades físico-químicas do fármaco na matriz
polimérica (CHEN et al., 2012).
Na Figura 19, estão presentes os espectros de infravermelho das
micropartículas de PLUF68 sem fármaco, MTX/PLUF68, blendas PLA-PLUF68 e
MTX/PLA-PLUF68, nas razões polímero:copolímero 25:75; 50:50; 75:25. Em
micropartículas de PLUF68 sem fármaco, as bandas características do Pluronic®
F68 para os grupos C-O (éter), O-H (álcool) e C-H (carbono sp2) ocorrem em 1108,0;
3435,0 e 2879,0 cm-1, respectivamente.
69
Figura 19 - Espectros de infravermelho de micropartículas de PLUF68 sem fármaco, MTX/PLUF68,
blendas PLA-PLUF68 e MTX/PLA-PLUF68, nas razões polímero:copolímero 25:75; 50:50 e 75:25 no
-1
intervalo de 4000 a 400 cm .
Na Figura acima, pode-se observar que as bandas de vibração das
ligações envolvidas nas principais funções orgânicas dos componentes da matriz
e/ou blenda polimérica também foram identificadas. Além disso, não foi possível
observar interações químicas entre o PLA e o PLUF68. Por outro lado, o
deslocamento da banda, correspondente ao grupo –OH, no sistema MTX/PLUF68
(3413 cm-1), apresentou-se ainda mais pronunciado, quando comparado àquela das
micropartículas contendo somente Pluronic® F68 (3435 cm-1). Logo, sugere-se que
há interações mais fortes entre o fármaco e PLUF68 do que com o PLUF127.
70
5.6 Difração de raios-X (DRX)
Na caracterização físico-química de um fármaco é de extrema importância
a análise de sua cristalinidade dentro de uma matriz polimérica, principalmente
quando a substância é capaz de sofrer polimorfismo (OLIVEIRA et al., 2013). As
principais diferenças nas propriedades farmacêuticas dos polimorfos incluem a
solubilidade e a taxa de dissolução que afeta a biodisponibilidade (YADAV et al.,
2008; DONG; BOYD, 2011). Na Figura 20, estão representados os difratogramas do
metotrexato não atomizado e atomizado, micropartículas de PLA sem fármaco e
sistemas MTX/PLA, nas razões fármaco:polímero (1:10, 1:4,5 e 1:3).
Figura 20 - Difratogramas de raios-X para o metotrexato não atomizado e atomizado, micropartículas
de PLA sem fármaco e micropartículas de MTX/PLA (1:10, 1: 4,5 e 1:3) em 2θ no intervalo de 5 a 45°.
De acordo com o difratograma acima, no metotrexato não atomizado, há
presença de dois picos característicos, na região compreendida entre 5 e 10°, sendo
que o de maior intensidade se localiza em 9,3°, estando de acordo com o descrito na
literatura para a forma trihidratada do fármaco (CHADHA et al., 2009; OLIVEIRA et
al., 2013).
71
Após secagem por atomização, o fármaco apresentou-se como um
material amorfo, com ausência dos picos característicos de cristalinidade,
apresentando dois halos de amorfização compreendidos entre 10-15° e 20-30°. Isso
acontece porque a técnica spray drying ocasiona uma rápida evaporação do
solvente, dificultando a organização das moléculas em uma fase cristalina (SILVAJÚNIOR et al., 2005, 2008; PATEL, R.; PATEL, M.; SUTHAR, 2009).
O difratograma de raios-X para micropartículas de PLA sem fármaco
também apresentou um padrão amorfo, com halo de amorfização de maior
intensidade em torno de 15°, mas sem pico de difração, o que caracteriza ausência
de estrutura cristalina. Isso porque também foram obtidas pelo processo de secagem
por atomização, levando a um material de natureza amorfa.
A Figura 20 também apresenta os difratogramas obtidos para as
micropartículas de MTX/PLA, nas razões fármaco:polímero 1:10, 1:4,5 e 1:3. Todos
os sistemas apresentaram-se no estado amorfo, com idênticos halos de amorfização
em torno de 15°, sendo que os picos de cristalinidade observados no metotrexato
não atomizado desapareceram nos sistemas descritos, portanto pode-se concluir
que o fármaco está disperso molecularmente no interior da matriz (ZHANG; JIN;
ZHUO, 2005; CHANDAK; VERMA, 2008; JINGOU et al., 2011), com pouca ou
nenhuma
presença de fármaco
cristalino
na
superfície
da
micropartícula
(VIJAYARAGAVAN et al., 2011). Sabe-se que a distribuição do fármaco na matriz é
parâmetro importante a ser considerado em estudos de liberação in vitro e
biodisponibilidade (SILVA-JÚNIOR et al., 2009).
Nas Figuras 21 e 22, estão presentes os difratogramas de raios-X para as
micropartículas de PLUF127 e F68 sem fármaco, MTX/PLUF127 e F68, blendas
PLA-PLUF127
e
MTX/PLA-PLUF127,
PLA-PLUF68
respectivamente, em diferentes razões polímero:copolímero.
e
MTX/PLA-PLUF68,
72
Figura 21 - Difratogramas de raios-X para as micropartículas de PLUF127 sem fármaco,
MTX/PLUF127, blendas PLA-PLUF127 e MTX/PLA-PLUF127, nas razões polímero:copolímero 25:75;
50:50 e 75:25, em 2θ no intervalo de 5º a 45º.
Pode-se observar na Figura acima que existem dois picos característicos
de cristalinidade na estrutura do PLUF127, sendo que sua intensidade vai
diminuindo à medida que se diminui a quantidade de Pluronic® na blenda. Por outro
lado, o halo de amorfização característico do poli (ácido láctico) vai se tornando cada
vez mais proeminente em torno de 15°, com o aumento de PLA. Isso pode ser
confirmado também através da análise dos difratogramas das micropartículas de
MTX/PLA-PLUF127. Além disso, nenhum pico característico do MTX foi observado
nos diferentes sistemas, portanto, o fármaco encontra-se totalmente disperso na
matriz polimérica.
Em relação às micropartículas contendo PLUF68 (Figura 22), o mesmo
resultado foi observado quanto à diminuição dos picos característicos do poloxâmero
e ao aumento do halo de amorfização do PLA. Além disso, não há indícios de
cristalinidade do MTX e, portanto, este se apresenta disperso uniformemente na
matriz (CHANDAK; VERMA, 2008; JINGOU et al., 2011).
73
Figura 22 - Difratogramas de raios-X para as micropartículas de PLUF68 sem fármaco,
MTX/PLUF68, blendas PLA-PLUF68 e MTX/PLA-PLUF68, nas razões polímero:copolímero 25:75;
50:50 e 75:25, em 2θ no intervalo de 5º a 45º.
5.7 Análise térmica
O termo análise térmica refere-se a um grupo de técnicas nas quais as
propriedades físico-químicas de uma substância são medidas em função do tempo
ou da temperatura enquanto a amostra é submetida a uma programação controlada
de temperatura (RODRIGUES et al., 2005). A termogravimetria (TG) e calorimetria
diferencial exploratória (DSC) são técnicas aplicadas na caracterização, avaliação de
pureza,
compatibilidade
dos
excipientes
da
formulação,
identificação
de
polimorfismo, estabilidade e decomposição térmica de fármacos e medicamentos
(OLIVEIRA; YOSHIDA; GOMES, 2011).
O comportamento térmico de micropartículas biodegradáveis pode ser
determinado através do estudo de interações físico-químicas entre o fármaco e o
polímero (SILVA-JÚNIOR et al., 2008; 2009). Inicialmente foi avaliado o
comportamento térmico do metotrexato não atomizado, das micropartículas de PLA,
PLUF127 e PLUF68 sem fármaco e, posteriormente, dos sistemas contendo MTX e
PLA.
74
Figura 23 - Curvas TG e DSC do metotrexato em atmosfera de N2 100 mL/min, com razão de
aquecimento de 10°C/min.
A curva de DSC do metotrexato (Figura 23) apresenta um primeiro evento
endotérmico com temperatura inicial (Tonset) em 80,2°C e variação de entalpia em
torno de 100,4 J/g, devido provavelmente à desidratação. A perda de massa inicial
(9,76%) observada na curva TG corresponde a 2,5 moléculas de água. No entanto,
na análise de DRX, o MTX foi caracterizado como um trihidrato. Essa pequena
diferença pode ter ocorrido devido ao aumento da solvatação, em resposta a
mudanças ambientais durante a estocagem (VIPPAGUNTA; BRITTAIN; GRANT,
2001). Diante disso, a presença de 3 moléculas de água foi considerada no ajuste
da pesagem do fármaco na produção das micropartículas.
Após
a
desidratação,
é
possível
observar
mais
dois
eventos
endotérmicos, o primeiro é referente ao ponto de fusão da forma cristalina do
fármaco, com Tonset em 237,0°C (ΔH = 9,2 J/g), seguido de um rápido início do
processo de decomposição, e o segundo evento ocorre em 264,7°C (ΔH = 9,2 J/g).
A perda de massa de 46,01% observada na curva TG confirma o início da
decomposição, após a fusão do MTX. O comportamento térmico deste fármaco está
de acordo com a literatura, a qual menciona a decomposição do MTX, em uma
temperatura acima de 200°C, com perda de massa devido à carbonização
(OLIVEIRA et al., 2013).
75
Figura 24 - Curvas TG e DSC de micropartículas de poli (ácido láctico), em atmosfera de N2 a 100
mL/min, com razão de aquecimento de 10°C/min.
A curva de DSC do PLA (Figura 24) apresenta um deslocamento da linha
de base, correspondente à relaxação das cadeias poliméricas e à transição vítrea do
polímero, com Tonset em 54,2°C. Este resultado confirma a análise de DRX, na qual o
poli (ácido láctico) está na forma amorfa (SÖDERGARD; STOLT, 2002;
NAMPOOTHIRI; NAIR; JOHN, 2010). Em seguida, pode-se observar um evento
endotérmico que inicia na temperatura de 260,0°C (ΔH = 740,1 J/g), caracterizando
a decomposição do polímero. Esse processo também pode ser confirmado a partir
da curva TG, na qual é possível observar uma única etapa de perda de massa
(99,97%).
Figura 25 - Curvas TG e DSC de micropartículas de Pluronic F127, em atmosfera de N2 a 100
mL/min, com razão de aquecimento de 10°C/min.
76
A curva DSC do Pluronic® F127 (Figura 25) apresenta dois eventos
endotérmicos. O primeiro é referente ao ponto de fusão do PLUF127 com Tonset em
51,1°C (ΔH = 116,0 J/g), seguido por um segundo evento característico do início da
decomposição do copolímero, com Tonset em 344,8°C (ΔH = 471,6 J/g). A perda de
massa de 97,86% pode ser observada na curva TG referente a este processo. O
PLUF127 possui natureza cristalina, sendo confirmado pela análise de DRX.
Figura 26 - Curvas TG e DSC de micropartículas de Pluronic F68, em atmosfera de N2 a 100 mL/min,
com razão de aquecimento de 10°C/min.
A curva DSC do Pluronic® F68 (Figura 26) apresenta dois eventos
endotérmicos. O primeiro é referente ao ponto de fusão do PLUF68 com Tonset em
48,8°C (ΔH = 108,4 J/g), seguido por um segundo evento característico do início da
decomposição do copolímero, com Tonset em 349,3°C (ΔH = 353,1 J/g). A perda de
massa de 96,67% pode ser observada na curva TG referente a este processo. A
partir da análise térmica do material, pode-se observar que o PLUF68 também
possui natureza cristalina.
Os estudos de DSC foram realizados no intuito de investigar o estado
físico do fármaco na matriz polimérica porque este aspecto poderia influenciar na
liberação in vitro e in vivo do fármaco a partir dos sistemas (MEI et al., 2009). Além
disso, é possível avaliar interações fármaco-polímero dentro das micropartículas
(OLIVEIRA et al., 2013).
77
Figura 27 - Curvas DSC dos sistemas MTX/PLA, em atmosfera de N2 a 100 mL/min, com razão de
aquecimento de 10°C/min.
Nas curvas DSC dos sistemas MTX/PLA (Figura 27), pode-se perceber o
desaparecimento do pico de fusão do MTX, indicando ausência de fármaco cristalino
no interior da micropartícula, na qual a fase amorfa do MTX se encontra dispersa
(SILVA-JÚNIOR et al., 2008; 2009; CHEN et al., 2013). No entanto, não foi possível
observar ligações químicas entre o MTX e o PLA, confirmando o resultado da
análise de infravermelho.
Comparando os sistemas MTX/PLA, pode-se concluir que o aumento de
fármaco na matriz proporcionou um aumento da Tg. Isso pode ser explicado pelo
arranjo dos componentes na matriz polimérica durante o processo de secagem.
Moléculas pequenas, como o metotrexato, possuem um alto coeficiente de difusão
em relação a macromoléculas como o PLA, facilitando seu movimento através dos
canais formados na matriz, e sua localização próxima à superfície (NANDIYANTO et
al., 2011; OLIVEIRA et al., 2013). Uma grande quantidade de moléculas de fármaco
localizadas na superfície da micropartícula dificulta a mobilidade das cadeias
poliméricas e, por isso, aumenta a Tg. Esse resultado corrobora com as informações
obtidas a partir das fotomicrografias dos sistemas MTX/PLA sobre o aumento da
esfericidade das partículas com o aumento da Tg.
78
Em relação à degradação dos sistemas, foi possível observar que a
temperatura de decomposição (328,5 a 320,7°C) está acima daquela observada
para o fármaco isolado (264,7°C). Portanto, a estrutura da micropartícula aumentou
a estabilidade do fármaco. À medida que aumenta a concentração de metotrexato
na matriz, ocorre uma diminuição da estabilidade térmica da micropartícula. A
decomposição térmica dos sistemas MTX/PLA pode ser confirmada pela curva TG
(Figura 28), com variação de perda de massa de 66,32 a 56,92%.
Figura 28 - Curvas TG dos sistemas MTX/PLA, em atmosfera de N2 a 100 mL/min, com razão de
aquecimento de 10°C/min.
Os estudos de DSC foram realizados também no intuito de observar a
miscibilidade das blendas poliméricas (ROUZES et al., 2003; BRAGAGNI et al.,
2013). Há evidências de miscibilidade quando ocorre diminuição do ponto de fusão,
da temperatura de transição vítrea e/ou da cristalinidade (PILLIN; MONTRELAY;
GROHENS, 2006; LIM et al., 2013). Diante disso, foi analisado o comportamento
térmico das blendas poliméricas PLA-PLU sem fármaco, nas diferentes razões
polímero-copolímero.
79
Figura 29 - Curvas DSC das blendas poliméricas PLA-PLUF127 (A) e PLA-PLUF68 (B), em atmosfera
de N2 a 100 mL/min, com razão de aquecimento de 10°C/min.
Analisando as curvas DSC das blendas poliméricas em relação à razão
polímero-copolímero (Figura 29), percebe-se que a Tg do PLA não pode ser
visualizada devido ao pico de fusão do Pluronic® que ocorre a uma temperatura mais
baixa que a da respectiva transição vítrea. Além disso, a diminuição da concentração
de PLUF127 e aumento de PLA na blenda favoreceu uma menor temperatura de
fusão. Por outro lado, houve uma menor diminuição da Tm nas blendas contendo
PLUF68. Quando dois polímeros são compatíveis na fase amorfa, ocorre diminuição
da Tm, como resultado de uma pertubação na organização da fase cristalina (PARK;
COHEN; LANGER, 1992).
A miscibilidade de blendas contendo dois tipos de Pluronic® pode ser
melhor avaliada a partir de um gráfico que mostra o efeito da concentração de PLA
na entalpia de fusão do poloxâmero (Figura 30). Pode-se observar que o ΔH de
fusão diminuiu com o aumento de PLA e, consequentemente, menor fração de PLU
na blenda. A diminuição do ΔH de fusão foi mais pronunciada no PLUF127 que no
PLUF68, em função do aumento de PLA na blenda. Portanto, a porcentagem de
cristalinidade do PLUF127 presente na blenda foi menor que a do PLUF68,
principalmente na razão polímero-copolímero 25:75. Pode-se afirmar que o PLA, na
proporção de 25% na blenda, apresentou-se mais miscível com as cadeias de
80
PLUF127 do que com aquelas contendo PLUF68. No entanto, não se pode concluir
que existe imiscibilidade em blendas com uma maior concentração de PLA, pois não
foi possível identificar a Tg do PLA e a Tm do PLU, separadamente. Quando há dois
picos separados de fusão ou duas temperaturas de transição vítrea dos
componentes isolados, é indicativo de imiscibilidade dos polímeros (PILLIN;
MONTRELAY; GROHENS, 2006; LIM et al., 2013; PATRÍCIO; BÁRTOLO, 2013).
Figura 30 - Efeito da concentração de PLA na entalpia de fusão (J/g) do PLUF127 (●) e PLUF68 (○).
Na Figura 31, percebe-se que a diminuição do PLUF127 na blenda,
aumenta a estabilidade térmica do PLA. Nas blendas PLA-PLUF68, ocorre o inverso.
Em geral, as blendas contendo PLUF127 possuem maior estabilidade que àquelas
contendo PLUF68 devido à maior temperatura de degradação térmica. Além disso, a
decomposição da blenda ocorreu em dois estágios, sendo o primeiro caracterizado
pela degradação do PLA, compreendendo uma faixa de temperatura próxima a do
polímero isolado (260°C), enquanto que o segundo é referente à degradação do
Pluronic F127 e F68, com Tonset em 344,8 e 349,3°C, respectivamente.
Nas curvas TG das blendas PLA-PLUF127, o aumento de PLA na blenda
corresponde à perda de massa da 1ª decomposição (30,94 - 73,79%) e a diminuição
de PLU à 2ª decomposição (64,79 - 23,48%). Isso também ocorreu para as blendas
PLA-PLUF68, considerando a perda de massa correspondente à 1ª e 2ª
decomposição: 28,27 - 68,67% e 66,42 - 22,22%, respectivamente.
81
Figura 31 - Curvas TG de blendas PLA-PLUF127 (A) e PLA-PLUF68 (B), nas diferentes razões
polímero-copolímero, em atmosfera de N2 a 100 mL/min, com razão de aquecimento de 10°C/min.
Somente os sistemas MTX/PLA-PLUF127 e MTX/PLA-PLUF68, na razão
75:25, foram analisados quanto à miscibilidade da blenda após adição do fármaco,
pois estes apresentaram melhores características tecnológicas (como a forma
esférica e o tamanho uniforme) que os demais sistemas contendo Pluronic®.
Figura 32 - Curvas DSC dos sistemas MTX/PLA-PLUF127 e MTX/PLA-PLUF68, na razão 75:25, em
atmosfera de N2 a 100 mL/min, com razão de aquecimento de 10°C/min.
O pico de fusão do metotrexato (237,0ºC) não pode ser visualizado na
curva DSC dos sistemas MTX/PLA-PLU (Figura 32), o que sugere dispersão do
fármaco na blenda, no entanto não foi possível observar interações químicas entre o
82
MTX e o PLU. Além disso, a presença do MTX favoreceu uma maior temperatura de
fusão no sistema MTX/PLA-PLUF127 (46,1ºC), em relação à da blenda PLAPLUF127 75:25 (42,3ºC), enquanto que houve uma diminuição da Tm no sistema
MTX/PLA-PLUF68 (45,6ºC), comparado à blenda contendo PLUF68 (46,3ºC).
Portanto, após adição de fármaco, as blendas PLA-PLUF68 se tornaram mais
miscíveis que aquelas contendo PLUF127.
O Pluronic® pode atuar como um plastificante, diminuindo a Tg do PLA, e
influenciando também na diminuição do ponto de fusão do fármaco. Como o PLU se
funde a uma temperatura menor, há uma evidente diminuição da Tm do MTX e da Tg
do PLA, o que sugere uma maior miscibilidade do PLU nas cadeias poliméricas do
PLA, aumentando a sua mobilidade e, consequentemente, a flexibilidade da
partícula (GHEBREMESKEL; VEMAVARAPU; LODAYA, 2007; LIM et al., 2013).
Esse efeito aumentou com o aumento da proporção de Pluronic® na blenda como
discutido anteriormente. Esse resultado corroborou com a informação obtida na
fotomicrografias sobre o aumento da deformação das partículas com o aumento da
concentração de PLU.
Quanto à degradação destes sistemas, as micropartículas de MTX/PLAPLUF68, em geral possuem maior estabilidade que as blendas contendo PLUF127
devido à maior temperatura de degradação. Na Figura 33, a perda de massa pode
ser visualizada a partir de curvas TG dos sistemas MTX/PLA-PLUF127 (10,95;
49,82; 14,43%) e MTX/PLA-PLUF68 75:25 (13,26; 46,24; 13,12%), na 1ª, 2ª e 3ª
decomposição, respectivamente.
Figura 33 - Curvas DSC dos sistemas MTX/PLA-PLUF127 e MTX/PLA-PLUF68, em atmosfera de N2 a
100 mL/min, com razão de aquecimento de 10°C/min.
83
5.8 Perfil de liberação dos sistemas microparticulados
Os perfis de liberação do fármaco dependem de propriedades inerentes
ao polímero, ao fármaco e ao sistema-carreador. Fatores relacionados ao polímero
incluem a massa molar e cristalinidade, enquanto que os parâmetros dependentes
do fármaco são a solubilidade, a massa molar e a possibilidade de interações
fármaco-polímero. As características do tipo de carreador (microesfera ou
microcápsula), a incorporação e o estado físico do fármaco (dissolvido ou disperso)
na matriz polimérica, o tamanho de partícula e a porosidade influenciam também
nesse processo (JEONG; LEE; CHO, 2003). A curva padrão obtida para o
doseamento do metotrexato no estudo de liberação in vitro está representada na
Figura 34. A equação da reta e o coeficiente de correlação foram, respectivamente,
y= 0,0502x – 0,0052 e R2 = 0,9998.
Figura 34 - Curva analítica do metotrexato em tampão fosfato pH 7,4 (0,05 mol/L) por
espectrofotometria UV-Vis em 305 nm.
5.8.1 Perfil e cinética de liberação dos sistemas MTX/PLA
As micropartículas de PLA vêm sendo bastante estudadas para a
liberação prolongada de fármacos (MATSUMOTO et al., 2005; LASPRILLA et al.,
2012; BRAGAGNI et al., 2013). A Figura 35 apresenta os perfis de liberação de
micropartículas MTX/PLA (1:10, 1:4,5 e 1:3), em meio de dissolução tampão fosfato
pH 7,4 (0,05 mol/L).
84
Figura 35 - Perfil de liberação do MTX a partir de micropartículas de PLA, contendo razões
fármaco:polímero 1:10 (■), 1:4,5 (●) e 1:3 (▼).
Na Figura 35, pode-se observar que as micropartículas de 1:10 MTX/PLA
apresentaram uma liberação mais lenta do fármaco em relação aos outros sistemas.
A diminuição da razão fármaco:polímero na matriz favoreceu o decréscimo na
velocidade de liberação do metotrexato. Isso pode ser explicado porque o aumento
da concentração de PLA no interior da micropartícula determina uma menor
velocidade de difusão do fármaco através dos poros formados (EHTEZAZI;
WASHINGTON, 2000).
Os mecanismos descritos para controlar a liberação do fármaco, a partir
de sistemas que contém polímeros biodegradáveis, são a difusão através da matriz
polimérica, ou de poros existentes, e a liberação da substância ativa por erosão do
polímero (JEONG; LEE; CHO, 2003; LOPES; LOBO; COSTA, 2005; FREDENBERG
et al., 2011). Freitas e Marchetti (2005) estudaram microesferas de PLA contendo
nimesulida para uso em sistemas de liberação sustentada e observaram que o
fármaco havia sido liberado, principalmente por difusão através de microporos. Além
disso, concluíram que, à medida que havia diminuição no tamanho dos poros, o
tempo de liberação da nimesulida também diminuía.
Devido à lenta difusão do fármaco em micropartículas de 1:10 MTX/PLA,
pode-se considerar que a taxa de erosão do polímero atua como outro mecanismo
que condiciona o perfil de liberação do MTX (MANADAS, PINA; VEIGA, 2002). O
alto tempo de degradação do D,L-PLA (>12 meses), relatado na literatura (VAN DE
85
VELDE; KIEKENS, 2002; LASPRILLA et al., 2012), é indicativo dessa liberação lenta
do fármaco.
As micropartículas de 1:3 MTX/PLA apresentaram um perfil de liberação
mais rápido que o de 1:4,5 MTX/PLA e o 1:10 MTX/PLA. Uma grande área
superficial no interior da micropartícula, induzida por uma alta porosidade, pode
aumentar a entrada do meio de dissolução dentro das partículas e acelerar a difusão
do fármaco através dos poros (EHTEZAZI; WASHINGTON, 2000; WISCHKE;
SCHWENDEMAN, 2008). Na Figura 36, estão presentes os perfis de liberação do
fármaco até 12 horas para avaliação do efeito burst nos diferentes sistemas
MTX/PLA.
Figura 36 - Avaliação do efeito burst do MTX a partir de micropartículas de PLA contendo razões de
fármaco:polímero 1:10 (■), 1:4,5 (●) e 1:3 (▼).
Analisando os perfis de liberação durante o intervalo de tempo de 12
horas, micropartículas de 1:10 MTX/PLA apresentaram uma liberação bastante lenta
do fármaco, nos primeiros 30 minutos, enquanto no sistema 1:4,5 MTX/PLA foi
observada uma porcentagem de liberação inicial do fármaco maior que 20%. A
hidrofobicidade do PLA ocasiona uma diminuição na penetração de água, então a
difusão do fármaco através da região amorfa no meio de liberação é diminuída
(JEONG; LEE; CHO, 2003).
Em micropartículas de 1:3 MTX/PLA, houve uma alta porcentagem de
liberação do fármaco (acima de 40%), apresentando um alto efeito burst. Isso
ocorreu porque um grande número de moléculas do MTX distribuíram-se na
superfície da micropartícula como resultado de uma alta taxa de difusão do mesmo
86
durante o processo de secagem. Portanto, após o contato com o meio de
dissolução, seria esperado uma rápida liberação inicial do fármaco (PARAJÓ et al.,
2010; PALAZZO et al., 2013).
A cinética de liberação do fármaco é influenciada por diversos fatores
como a forma polimórfica, a cristalinidade, o tamanho de partícula, a solubilidade e a
quantidade incorporada na forma farmacêutica (COSTA; LOBO, 2001). A liberação
do fármaco a partir de sistemas de liberação modificada tem sido descrita por vários
modelos matemáticos, considerando f t uma função de t (tempo) relacionada com a
quantidade de fármaco liberado a partir de um sistema terapêutico (COSTA, 2002).
Estudos de perfil e cinética de dissolução são importantes por conta da correlação in
vitro e in vivo da resposta do fármaco pela comparação dos resultados do perfil de
liberação e farmacocinética (MANADAS; PINA; VEIGA, 2002).
Para micropartículas de 1:10 MTX/PLA, não foi possível avaliar a cinética
de liberação, pois foi liberado aproximadamente 10% da quantidade inicial de
fármaco existente na micropartícula. A cinética de liberação (Tabela 10) dos demais
sistemas MTX/PLA foi avaliada a partir dos resultados obtidos do perfil de
dissolução, os quais foram submetidos a modelos matemáticos específicos (ordem
zero, primeira ordem, Higuchi e Korsmeyer-Peppas). Os valores de coeficiente de
correlação (R2) indicam o modelo cinético que melhor se ajusta ao perfil de
dissolução do sistema avaliado (SERRA; STORPIRTIS, 2007).
Tabela 10 - Modelos matemáticos utilizados para descrever a cinética de liberação do fármaco a partir
de sistemas 1:4,5 e 1:3 MTX/PLA.
Modelo matemático
Ordem zero
Primeira ordem
Parâmetro
1:4,5 MTX/PLA
1:3 MTX/PLA
K0
0,0006±0,00
0,0010±0,00
2
0,2211±0,02
0,4623±0,03
KP
0,0022±0,00
0,0026±0,00
2
0,1075±0,01
0,1397±0,01
KH
1,5353±0,11
1,9869±1,00
2
0,3555±0,03
0,5989±0,10
KKP
0,3196±0,09
0,4960±0,03
n
0,6370±0,17
0,0987±0,01
0,9007±0,03
0,9626±0,00
R
R
Higuchi
R
Korsmeyer-Peppas
R
Legenda: Parâmetro ± DP (desvio padrão).
2
87
De acordo com a Tabela 10, pode ser observado que o modelo de
Korsmeyer-Peppas apresentou maior coeficiente de correlação (R2) para os
sistemas MTX/PLA, sendo que o valor do expoente de liberação n entre 0,43 e 0,85
(1:4,5 MTX/PLA) indica transporte anômalo, característico de formas farmacêuticas
poliméricas que pode envolver mais de um tipo de liberação como a difusão e
erosão. No caso de sistemas de liberação com valores de n menores que 0,43 (1:3
MTX/PLA), referem-se à combinação de processos de difusão através da matriz
polimérica e difusão parcial através de poros preenchidos com o meio de dissolução
no interior da matriz (COSTA; LOBO, 2001; SIEPMANN; GÖPFERICH, 2001;
SIEPMANN; PEPPAS, 2012). Na Figura 37, podem ser observados os gráficos dos
perfis de liberação, após serem submetidos ao modelo de Korsmeyer-Peppas.
Figura 37 - Perfis de liberação do fármaco a partir dos sistemas 1:4,5 MTX/PLA (A) e 1:3 MTX/PLA
(B), após submetidos ao modelo cinético de Korsmeyer-Peppas (Mt/M∞ = lnKKP + nlnt).
5.8.2 Perfil de liberação das blendas MTX/PLA-PLU
Os sistemas MTX/PLA-PLUF127 e F68, na razão 75:25, apresentaram
forma esférica, de acordo com a análise de MEV, e por isso, foram avaliados quanto
ao perfil de liberação do fármaco, comparados ao sistema 1:3 MTX/PLA. Blendas
poliméricas PLA-PLU exibem melhores propriedades mecânicas que os polímeros
isolados, afetando a morfologia das partículas e a taxa de liberação do fármaco
(PARK; COHEN; LANGER, 1992; PATTARINO; GIOVANNELLI; BELLOMI, 2007;
BAJPAI et al., 2008; BONACUCINA et al., 2011).
88
O metotrexato foi liberado totalmente em apenas 30 minutos de ensaio a
partir dos sistemas MTX/PLA-PLUF127 e MTX/PLA-PLUF68 75:25. Portanto, a
velocidade de liberação do fármaco foi mais rápida, em relação ao perfil de liberação
prolongada do sistema 1:3 MTX/PLA, o qual foi discutido anteriormente. Além disso,
o tipo de Pluronic® não interferiu no perfil de liberação do fármaco (p > 0,05). Isso
pode ser justificado pela semelhante fração de massa de grupos PEO na molécula
do PLUF127 (70%) e do PLUF68 (80%) (ALEXANDRIDIS; TSIANOU, 2011).
A velocidade de liberação do fármaco foi aumentada, principalmente
devido ao excesso de meio de dissolução, o que promoveu a dissolução e a saída
do Pluronic® da matriz, agindo como agente formador de poros (LOH et al., 2011).
As interações entre o poloxâmero e a água, na interface entre a região hidrofílica
(PEO) e o solvente, facilitaram a saída de moléculas de PLU do interior da
micropartícula, deixando-a porosa (PARK; COHEN; LANGER, 1992; LOH et al.,
2011). Além disso, os poloxâmeros atuam como agente solubilizante e surfactante,
aumentando a solubilidade do fármaco no meio (LEE et al., 2004; MOEBUS;
SIEPMANN; BODMEIER, 2009), alterando substancialmente sua cinética de
liberação (SANTANDER-ORTEGA et al., 2006; WISCHKE; SCHWENDEMAN,
2008).
O mecanismo predominante de liberação do fármaco a partir de
micropartículas contendo PLU é a difusão, não sendo influenciada pela degradação
do PLA (XIONG et al., 2007), que geralmente é lenta. Xiong e colaboradores (2005)
estudaram copolímeros em bloco graftizados PLA-PLUF127-PLA no intuito de
avaliar a cinética de liberação do fármaco em função da degradação de segmentos
hidrofóbicos do PLA. Os autores observaram que houve predomínio do mecanismo
de difusão em detrimento à taxa de degradação relativamente lenta do poli (ácido
láctico).
A difusão é o processo pelo qual o fármaco é transportado de um local
para outro situado no interior da matriz e resulta de movimentos moleculares
aleatórios, que ocorrem em pequenas distâncias (MANADAS, PINA; VEIGA, 2002).
A expressão matemática evidenciada por Aldolf Fick, que traduz a velocidade de
transferência da substância a difundir em um meio isotrópico, é representada a
seguir:
89
dQ
dC
= −D
dt
dX
(10)
na qual dQ/dt representa a velocidade de difusão, sendo Q, a massa de fármaco
transportada em um tempo, t; C, a concentração da substância que se difunde; X, a
distância do local onde o fármaco se encontra acumulado até a superfície de
liberação e D, o coeficiente de difusão. O fármaco incorporado à matriz polimérica se
dissolve após entrada da água no sistema, em seguida o fármaco se difunde para
fora do polímero (MANADAS, PINA; VEIGA, 2002).
5.9 Avaliação da citotoxicidade dos sistemas microparticulados
A citotoxicidade dos sistemas microparticulados foi avaliada em função do
tempo de incubação de diferentes concentrações de fármaco livre e quantidade
equivalente do mesmo nas micropartículas. Estudos relatam que esse parâmetro
influencia
diretamente
na
interação
do
fármaco
com
as
células
e,
consequentemente, na viabilidade celular (KANG et al., 2008; SANTOS et al., 2010).
Foram avaliados os sistemas 1:3 MTX/PLA, MTX/PLA-PLUF127 e MTX/PLAPLUF68 75:25, no intuito de correlacionar o ensaio de viabilidade celular com o
estudo de liberação in vitro.
Figura 38 - Viabilidade de células Vero E6 cultivadas com micropartículas de PLA sem fármaco,
metotrexato e sistemas MTX/PLA, em diferentes concentrações, por 24 e 48 horas (n = 4).
Legenda: *p < 0,05, comparado a micropartículas de PLA sem fármaco.
Na Figura 38, observou-se que as micropartículas de PLA sem fármaco
mostraram viabilidade celular acima de 80%, nas concentrações estudadas, em 24 e
90
48 horas de incubação. É importante ressaltar que estas não apresentaram efeito
sobre a proliferação de células Vero E6. Isso pode ser confirmado também pela
literatura que fornece informações sobre a biocompatibilidade do PLA (GARLOTTA,
2001; MANSOUR et al., 2010; LUCKACHAN; PILLAI, 2011; LASPRILLA et al.,
2012).
Por outro lado, o aumento da concentração do fármaco livre e dentro da
micropartícula levou a uma diminuição da viabilidade celular. O efeito citotóxico do
metotrexato, em relação às micropartículas de PLA sem fármaco (p < 0,05), ocorreu
devido à inibição da atividade da enzima dihidrofolato redutase, interferindo no
processo de divisão mitótica das células (RUBINO, 2001; WARREN; GRIFFITHS,
2008; FDA, 2013). Além disso, o MTX apresentou maior citotoxicidade em relação
ao sistema 1:3 MTX/PLA até 24 horas. Após esse período, houve uma diminuição do
número de células viáveis, indicativo de uma liberação prolongada do MTX no meio.
Esse resultado corroborou com o ensaio de liberação in vitro, no qual a taxa do
fármaco liberado foi de 70% nas primeiras 24 horas, atingindo 80% até 48 horas de
estudo.
Figura 38 - Viabilidade de células Vero E6 cultivadas com blendas poliméricas PLA-PLUF127 75:25,
PLA-PLUF68 75:25, metotrexato, sistemas MTX/PLA-PLUF127 e MTX/PLA-PLUF68 75:25, em
diferentes concentrações, por 24 e 48 horas (n = 4).
91
Na Figura 39, observou-se que as blendas PLA-PLU apresentaram
viabilidade celular acima de 80% durante o período de 24 a 48 horas. No entanto, foi
possível observar uma tendência ao aumento de biocompatibilidade (> 95% do
número de células viáveis), em relação ao PLA, nas primeiras 24 horas. A
modificação da superfície da matriz hidrofóbica do PLA a partir de grupos hidrofílicos
de poli (óxido de etileno) aumenta a biocompatibilidade do sistema (KISS; BERTÓTI;
VARGHA-BUTLER, 2002).
Os sistemas MTX/PLA-PLUF127 e F68 apresentaram uma liberação
prolongada do fármaco, o que pode ser visualizado pela diminuição do número de
células viáveis, após 24 horas, em relação ao fármaco livre, diferentemente do
estudo de liberação in vitro, no qual o fármaco foi liberado completamente em
apenas 30 minutos. A discordância dos resultados pode ter ocorrido devido às
diferenças físico-químicas no microambiente em que se encontravam as
micropartículas em cada tipo de estudo.
Em experimentos em cultura de células, a presença de um complexo de
proteínas e antibióticos pode influenciar o pH e, consequentemente, a ionização do
fármaco, mas a relação entre a massa de micropartículas e o volume de meio de
dissolução é mais determinante na velocidade de fármaco liberado. Portanto, o
menor volume de meio, comparado ao ensaio de liberação in vitro, foi responsável
pelo intumescimento do PLU, o qual se manteve na matriz, retardando a liberação
do fármaco. Isso pode ter ocorrido devido ao comportamento termogelificante do
Pluronic® à temperatura de 37°C (ESCOBAR-CHÀVEZ et al., 2006; PATEL, H.;
PATEL, R.; PATEL, M., 2009), diminuindo a taxa de difusão do fármaco para o meio.
O uso de poloxâmeros vem sendo investigado como formador de matriz in situ,
através da formação de gel, para uso em sistemas de liberação de fármacos (GUO
et al., 2007; MOEBUS; SIEPMANN; BODMEIER, 2009; BONACUCINA et al., 2011).
O efeito da liberação lenta do fármaco sobre o número de células viáveis
em função do tempo foi mais pronunciado com o aumento da concentração de
metotrexato no meio, por isso a viabilidade celular pode ser melhor avaliada na
concentração máxima de 1 μg/mL.
92
Figura 40 - Viabilidade de células Vero E6 cultivadas com metotrexato e sistemas 1:3 MTX/PLA,
MTX/PLA-PLUF127 e MTX/PLA-PLUF68 75:25, na concentração de 1 μg/mL, por 24 e 48 horas.
Legenda: *p < 0,05, comparado ao metotrexato.
Na Figura acima, observou-se que a porcentagem de células viáveis dos
sistemas
microparticulados
apresentaram
diferença
estatística
(p
<
0,05),
comparado ao metotrexato. Portanto até 24 horas, uma quantidade insuficiente de
fármaco foi liberada, não atingindo a ação citotóxica. Após esse período, as
micropartículas liberaram uma porcentagem de fármaco equivalente à dose do MTX
testado, o que tornou semelhante o número de células viáveis das amostras.
Comparando os sistemas contendo Pluronic® F127 e F68, não foi possível observar
diferenças significativas na taxa de liberação do fármaco, corroborando com o
resultado do ensaio in vitro.
93
6 CONCLUSÕES
As micropartículas de PLA contendo diferentes concentrações fármacopolímero (1:10; 1:4,5; 1:3) e blendas poliméricas PLA-PLU, com distintas variáveis
polímero-copolímero (25:75; 50:50; 75:25), foram obtidas com sucesso por spray
drying devido à alta eficiência de encapsulação dos sistemas, utilizando metodologia
analítica validada para o doseamento do metotrexato.
Quanto à distribuição do tamanho das partículas, os diferentes sistemas
microparticulados apresentaram-se uniformes e com baixa polidispersão, em um
intervalo de 3 a 5 μm. Em relação à morfologia, a presença do fármaco na matriz de
PLA e a razão polímero:copolímero 75:25, em blendas PLA-PLU, foram
determinantes para a obtenção de partículas mais esféricas, parâmetro importante
na velocidade de liberação do fármaco.
Os resultados do DRX e da análise térmica mostraram que o metotrexato
encontra-se disperso na matriz amorfa de PLA e nas blendas PLA-PLU, sendo
confirmado principalmente pela ausência de picos cristalinos do fármaco e do seu
ponto de fusão, enquanto que o tipo e a concentração de Pluronic® influenciaram a
miscibilidade das blendas obtidas. A análise térmica mostrou maior miscibilidade em
blendas contendo Pluronic® F127. Além disso, não foi possível observar ligações
químicas entre o MTX e o PLA pela análise de FTIR. Por outro lado, a presença de
fármaco favoreceu interações MTX-PLU.
No estudo de liberação in vitro do fármaco, as micropartículas de PLA
contendo metotrexato apresentaram um perfil de liberação prolongada, com cinética
envolvendo mecanismos de difusão e erosão, enquanto foi possível modular a
velocidade de liberação do mesmo a partir de blendas poliméricas contendo PLU.
Além disso, no ensaio de viabilidade celular, foi possível observar a liberação lenta
do fármaco no meio, a partir de sistemas contendo PLA e blendas PLA-PLU. Diante
disso, estes sistemas são promissores carreadores de fármacos biodegradáveis e
biocompatíveis para modificar a velocidade de liberação do MTX com potencial para
a aplicação em estudos in vivo.
94
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107
APÊNDICES
APÊNDICE A – Perfil de liberação do sistema de 1:4,5 MTX/PLA após submetido a
modelos matemáticos de ordem zero (A), primeira ordem (B) e Higuchi (C).
108
APÊNDICE B – Perfil de liberação do sistema de 1:3 MTX/PLA após submetido a
modelos matemáticos de ordem zero (A), primeira ordem (B) e Higuchi (C).