1 INTRODUÇÃO O Tumor de Córtex Adrenal (TCA) é raro

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INTRODUÇÃO
O Tumor de Córtex Adrenal (TCA) é raro, acomete ambos os sexos, e atinge
mais a faixa etária abaixo de quatro anos ou acima de cinqüenta anos (YOUNG et
al., 1981). As características apresentadas pelos TCAs de crianças são semelhantes
em todos os países, diferenciando-se apenas na proporção de estádios ao
diagnóstico, no resultado do tratamento e na origem do tumor ligada ou não à
síndrome de Li-Fraumeni ou a outras alterações moleculares (SANDRINI; RIBEIRO;
DELACERDA, 1997, RIBEIRO; FIGUEIREDO, 2004, RODRIGUES-GALINDO et al.,
2005, MICHALKIEWICZ et al., 2004, FIGUEIREDO et al., 2005). No Paraná e em
São Paulo, a grande maioria dos TCAs de crianças têm uma origem muito parecida,
relacionada com a mutação TP53 R337H encontrada na linhagem germinativa
associada com perda do segundo alelo (RIBEIRO et al., 2001 e LATRONICO et al.,
2001). Os parâmetros histológicos e critérios de benignidade e malignidade dos
TCAs em crianças, e conseqüentemente os resultados de tratamentos, têm
diferenças importantes em relação aos mesmos parâmetros analisados em
pacientes adultos. Um dos parâmetros mais importantes na separação entre grupos
com melhor ou pior prognóstico em crianças é o tamanho do tumor (SANDRINI;
RIBEIRO; DELACERDA, 1997, MICHALKIEWICZ et al., 2004).
Do ponto de vista clínico, os sinais e sintomas do TCA são os mesmos em
crianças ou adultos. Em todas as faixas etárias o tumor pode ser assintomático (em
um número pequeno de casos), ou se apresentar como forma virilizante, forma
cushingóide ou forma mista. Este trabalho procurou, entre outros objetivos,
identificar possíveis associações entre as diferentes manifestações clínicas do tumor
de córtex adrenal e a presença ou ausência de linfócitos T citotóxicas.
O tratamento do TCA baseia-se principalmente na cirurgia. O diagnóstico
efetuado precocemente, juntamente com a ressecção total do tumor são
fundamentais para o sucesso terapêutico. A sobrevida global do TCA, segundo
dados do registro internacional (IPACTR) é de aproximadamente 55%, mas, em se
tratando de estádios avançados, esta é muito mais baixa (MICHALKIEWICZ et al.,
2004). A estatística atual dos resultados preliminares com o protocolo farmacológico
antitumoral para estádios III e IV (associação de mitotano, etoposide, cisplatina e
doxorrubicina), como já foi analisado preliminarmente em pacientes adultos
2
(BERRUTI et al., 1998), não mostra evidências de melhores resultados (estudo em
análise), e portanto, é importante que novas formas de tratamento sejam
pesquisadas. A maior quantidade de células do sistema imunológico no TCA de
melhor prognóstico, como já foi observado em vários outros tipos de tumores, é
evidência a favor da idéia para se desenvolver novas estratégias terapêuticas
relacionadas à imunoterapia.. As opções em maior uso vão desde a administração
de interleucina 2, interferon-alfa, e inibidores da liberação de radicais livres
(inibidores de receptores histamínicos 2), até o uso de células dendríticas autólogas
ativadas ex vivo. Um aspecto importante de outras pesquisas do mesmo grupo (em
andamento) é a informação sobre o comportamento do TCA de crianças em relação
ao sistema imunológico humoral e celular, o que irá complementar com dados da
presente pesquisa para se chegar a uma melhor definição do que realmente precisa
ser modificado. Neste sentido, nem sempre a deficiência de uma resposta
imunocelular é uma limitação apenas da defesa celular contra o TCA, poderá existir
também situações inerentes ao TCA, como seu potencial de expressão ou não de
apresentadores de antígenos CMH da classe I, antígenos especificamente de
tumores (MAGE, BAGE, GAGE) que irá definir se haverá ou não uma atuação de
linfócitos T citotóxicos (VAN DEN EYNDE; BOON, 1997). O foco desta pesquisa foi
identificar e quantificar células imunocompetentes CD8+ e CD25+ nas diversas
condições do TCA de crianças.
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1.1 - OBJETIVOS
1.1.1 Objetivo Geral
Verificar se há evidência do envolvimento da imunidade celular no
tumor de córtex adrenal de crianças.
1.1.2 Objetivos Específicos
1)
Verificar se existe associação entre a proporção de linfócitos CD8+
ou CD25+ com a apresentação clínica (presença ou ausência da
síndrome de Cushing) e evolução das crianças com tumor de córtex
adrenal.
2)
Verificar se o estádio, presença de recidiva, ou tamanho do tumor de
córtex adrenal em crianças está associado com a infiltração de
linfócitos T CD8+ ou CD25+.
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2
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
A glândula adrenal, também chamada como supra-renal, situa-se sobre o
pólo superior de cada rim, ocupando uma posição ântero-medial, ao nível da 11a
vértebra torácica. O parênquima cortical, parte mais importante da glândula, é
responsável por 90% do seu tamanho no adulto e surge na 5a semana de vida intrauterina, de origem embrionária do tecido mesodérmico. Já a medula adrenal surge
na 7a semana, tendo origem da crista neural, de onde se originam também os
gânglios simpáticos. O volume da medula pouco se altera da vida fetal para a adulta,
mas o córtex tem crescimento em várias fases, fato este importante para o
entendimento da gênese dos TCAs. O primeiro período de crescimento ocorre por
volta do nascimento, seguindo depois, um período de hipotrofia fisiológica e depois
voltando a crescer até a adolescência, atingindo seu tamanho máximo na fase de
adulto jovem, chegando a um peso aproximado de 4,5g (KEENE; HEWER1, e
SUCHESTON; CANNON2, citado por MESIANO; JAFFE, 1997). Além do ACTH,
outros hormônios como o hormônio do crescimento, prolactina, vasopressina,
ocitocina, insulina e IGF-II podem promover o crescimento do córtex adrenal
(DHOM, 1973, MESIANO; JAFFE, 1997 e SPENCER et al., 1999).
O tumor de córtex adrenal é uma doença rara, que acomete ambos os sexos,
e que atinge mais a faixa etária abaixo de quatro anos ou acima de cinqüenta anos
(YOUNG et al., 1981, MCWHIRTER; STILLER; LENNOX, 1989, RIBEIRO et al.,
1990, MOSSO et al., 1992 e MICHALKIEWICZ et al., 1997). No Paraná e em São
Paulo, a grande maioria dos TCAs de crianças têm uma origem comum, que é a
mutação R337H TP53 encontrada na linhagem germinativa associada com perda do
segundo alelo (RIBEIRO et al., 2001 e LATRONICO et al., 2001).
As características apresentadas pelos TCAs de crianças são semelhantes
em todos os países, diferenciando-se apenas na proporção de estádios ao
diagnóstico, no resultado do tratamento e na origem do tumor ligada ou não à
síndrome de Li-Fraumeni ou
1
a outras
alterações
moleculares
(RIBEIRO;
KEENE, M. F. L.; HEWER, E. E. Observations on the development of the human suprarenal gland. J
Anat, v.61, p.302-324, 1927.
2
SUCHESTON, M. E.; CANNON, M. S. Development of zonular patterns in the human adrenal gland.
J Morphol, v.126, p 477-491, 1968.
5
FIGUEIREDO, 2004).
Os primeiros levantamentos sobre grande número de casos de TCA no sul e
sudeste do Brasil foram registrados por MARIGO; MULLER; DAVIES, em São Paulo
(1968) e no Paraná, por RIBEIRO et al., (1990) e SANDRINI; RIBEIRO;
DELACERDA, (1997). Assim, enquanto a incidência mundial é em torno de 0,2 a
0,38/milhão de crianças até 15 anos de idade (STILLER, 1994; HISADA et al., 1998;
DESANDES et al., 2004), no Paraná é cerca de 3,5/milhão (PIANOVSKI et al.,
2005).
Entre janeiro de 1990 e dezembro de 2001, foram registrados no IPACTR
(Registro Internacional de Tumores Adrenocorticais Pediátricos) 259 pacientes,
sendo 79,5% deles procedentes de Paraná e São Paulo (MICHALKIEWICZ et al.,
2004). Muito embora alguns dos achados moleculares relacionados com a etiologia
do TCA no Paraná (RIBEIRO et al., 2001) e São Paulo (LATRÔNICO et al., 2001)
sejam quase exclusivos destas regiões, nota-se que a fisiopatologia, as
manifestações clínicas e as características microscópicas são semelhantes a de
outras grandes séries de TCA (revisões feitas por SANDRINI; RIBEIRO;
DELACERDA, 1997, MICHALKIEWICZ et al., 2004, RIBEIRO; FIGUEIREDO, 2004,
RODRIGUES-GALINDO et al., 2005).
2.1 CARACTERÍSTICAS DE BENIGNIDADE E MALIGNIDADE
Carcinoma é definido como neoplasia maligna das células de origem de
qualquer um dos tecidos epiteliais. Os carcinomas originários de epitélio glandular
são também chamados adenocarcinomas (COTRAN; KUMAR; ROBBINS, 1994).
Enquanto os adenomas são geralmente pequenos, encapsulados e esteróidesecretores, os carcinomas têm suas células caracteristicamente com numerosas
mitoses, citoplasma escasso, pleomorfismo, e com áreas de necrose e hemorragia
dentro do tumor. Permanecem controvérsias na definição de parâmetros macro e
microscópicos para adenoma e carcinoma de córtex adrenal (STEWART; JONES;
JOLLEYS, 1974, HOLCOMBE; PYSHER; KIRKLAND, 1984, WEATHERBY;
CARNEY, 1984), mas este tema não é objetivo do presente trabalho. Um dos
problemas relacionados com o significado de alguns parâmetros histológicos e
critérios de benignidade e malignidade dos TCAs em crianças é que muitos dos
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parâmetros e conclusões foram deduzidos de estudos de tumores de adultos. Esta
preocupação tem fundamento, uma vez que existem diferenças epidemiológicas,
clínicas e patológicas (microscopia e macroscopia) dos TCAs entre crianças e
adultos (FIGUEIREDO et al., 2000 e RODRIGUES-GALINDO et al., 2005). Um dos
parâmetros mais importantes em crianças é o tamanho do tumor (SANDRINI;
RIBEIRO; DELACERDA, 1997), utilizado para distinguir estádio I (<200g, com 10%
de risco de não sobreviver), de II (com quase 50% de probabilidade de ir a óbito em
5 anos) (MICHALKIEWICZ et al., 2004). Este risco de 10% para o estádio I poderia
ter sido mais baixo, se o critério tivesse limitado o peso em até 100g, o que
corresponderia a um volume de aproximadamente 200cm3 (SANDRINI; RIBEIRO;
DELACERDA, 1997).
A massa tumoral foi considerada importante anteriormente (HOUGH et al.,
1979), enquanto o limite de peso estudado por WEISS; MEDEIROS; VICKERY,
(1989), de mais de 250g, juntamente com outros parâmetros (invasão de cápsula,
mitoses
atípicas
e
maior
diâmetro
acima
de
10cm)
não
se
associou
significativamente com menor sobrevida. A falta de consenso em relação ao peso
e/ou tamanho parece estar também no tipo de tumor (diferença entre tumor
pediátrico e do adulto), e na falta de associação com tumor residual microscópico ou
macroscópico (estádio III ou IV, segundo critérios para tumor pediátrico)
(MICHALKIEWICZ et al., 2004).
Além da massa do TCA, HOUGH et al., (1979) defendiam ser importante, na
classificação de malignidade, a presença de bandas fibrosas largas atravessando o
TCA, crescimento difuso, invasão vascular, necrose e perda de peso corporal do
paciente (variáveis que até o presente não foram confirmadas como preditivas de
mau prognóstico em crianças).
Os critérios de classificação, como doença benigna ou maligna, segundo
GANDOUR; GRIZZLE (1986) (um pouco modificado de HOUGH et al., 1979) não
conseguiram diferenciar as crianças que sobreviveram das que foram a óbito por
progressão da doença (SANDRINI; RIBEIRO; DELACERDA, 1997). Estes autores
também concluíram que não havia boa concordância entre prognóstico e os critérios
adotados por VAN SLOOTEN et al., (1985), os quais defenderam sete parâmetros
ponderados entre 1, 6 e 9, onde o escore inferior a 8 classificaria o TCA como
benigno (atividade mitótica; necrose; hemorragia, fibrose e/ou calcificação; estrutura
7
do nucléolo; invasão da cápsula; hipercromasia nuclear; atipia nuclear).
WEISS; MEDEIROS; VICKERY, em 1989, propuseram que apenas uma de
12 variáveis estudadas, índice mitótico acima de 20, conseguia definir TCA como
sendo bastante maligno. Estes autores já não admitiam ser tão importante o que
havia sido anteriormente proposto pelo próprio WEISS em 1984, o qual defendeu
como pior prognóstico a presença de três ou mais de nove parâmetros classificados
como maligno: grau nuclear, acima de 5 mitoses por 50 campos de grande aumento,
mitoses atípicas, característica do citoplasma (as células claras compreendem 25%
ou menos do tumor), arquitetura difusa (se mais de 1/3 do tumor é composto por
camadas de células sem um padrão definido), necrose, invasão de estruturas
venosas, invasão de estruturas sinusoidais, e invasão da cápsula do tumor. E da
mesma forma, estes achados não foram satisfatórios na avaliação de 58 TCAs de
crianças feita por SANDRINI; RIBEIRO; DELACERDA, em 1997. Entretanto, na
avaliação de 107 pacientes (29 crianças e 78 adultos) de São Paulo (LUCON et al.,
2002), estratificados de acordo com os critérios de WEISS (1984), concluiu-se que
100% dos pacientes com escore de Weiss < ou igual a 3 sobreviveram, em contraste
com aqueles com escore > 3 que tiveram sobrevida mais baixa (61,65%). Em
relação ao peso do tumor, os tumores com escore de Weiss inferior ou igual a 3 e
maior que 3 tiveram pesos de 23,38 g ± 41,36 g e 376,3 g ± 538,76 g,
respectivamente. Em relação ao tamanho, os escores < ou igual a 3 e > 3 tinham
média de tamanho de 3,67 ± 2,2 cm e 9,64 ± 5,8 cm, respectivamente. Infelizmente,
este estudo não fez comparações entre tumores de crianças e de adultos, e ainda
não é possível estimar se estes parâmetros são válidos para prever o prognóstico de
TCAs de crianças. Mesmo assim, percebe-se algo interessante neste estudo: o
escore de Weiss (inferior ou igual a 3) se associou bem com peso e tamanho
encontrados por LUCON et al. (2002).
A tentativa de associação de dois ou mais parâmetros pode acrescentar
melhor precisão na definição como tumor maligno; o problema é identificar a seleção
de marcadores com maior especificidade. STOJADINOVIC et al. (2003) observaram
que a existência de necrose, mitose atípica, mais que 5 mitoses em 50 campos de
grande aumento, invasão sinusoidal, índice histológico superior a 5, e presença de
mais de dois marcadores moleculares desfavoráveis [Ki-67 (+), p21 (+), p27 (+),
mdm-2(-)] foram associados com metástases de carcinoma de córtex adrenal. Este
8
estudo foi concluído a partir de análises realizadas em 37 adenomas e 67
carcinomas de córtex adrenal. Obviamente os tumores pequenos podem não ter tido
o tempo necessário para acumular as características apontadas por WEISS (1984),
e por outro lado, o que realmente influenciaria na recidiva e no aparecimento de
metástases não seria o simples fato de ter ou não células do TCA saindo por via
linfática, hematogênica e/ou por falhas ou acidentes ocorridos durante a cirurgia
para outros locais. Invasão vascular ou de cápsula pelas células do TCA pode ser a
evidência de que estas células estão transpondo as barreiras do tumor, e neste
sentido, não existe nenhuma evidência que diferencie risco de recidiva a partir de
células de estádio I, II, III ou IV que crescem fora do TCA (todas são igualmente
malignas até que se prove o contrário). Entretanto, o conceito de que células
tumorais que crescem bem no seu local primário ou como metástases, parece
depender muito mais se elas são ou possuem características de células tronco
(TROSKO et al., 2004), não importando se elas são de estádio inicial ou avançado.
Neste conceito de células que crescem e proliferam em outros tecidos (como as
células tronco), existem características como a permanência nelas da atividade de
telomerase.
2.2 ESTADIAMENTO DO TCA
O estadiamento adotado neste trabalho (Tabela 1), leva em consideração o
tamanho igual ou menor que 100g ou volume igual ou abaixo de 200cm3 para
estádio I, e as condições de ressecabilidade cirúrgica, sem levar em consideração
qualquer dos critérios anátomo-patológicos de malignidade (SANDRINI; RIBEIRO;
DELACERDA, 1997).
Os resultados do IPACTR mostram uma chance de sobrevida livre de
eventos, em 5 anos, no momento do diagnóstico, de 90% para o estádio I (limite de
peso até 200g), valor que decresce para cerca de 50% para o estádio II
(MICHALKIEWICZ et al., 2004). As demais características dos outros estádios
(Tabela 1) permanecem como foram anteriormente descritas (SANDRINI; RIBEIRO;
DELACERDA, 1997). Acredita-se que quanto menor o limite de corte para estádio I,
maior será a sobrevida de cinco anos. Isto não foi observado em um estudo francês
com 253 tumores de adulto (ICARD et al., 2001), onde se notou apenas 66% de
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sobrevida para o estádio I (TCA<5cm) e 58% para o II (tumor >5cm). É interessante
notar neste estudo realizado na França, que o máximo que um tumor do estádio I
pode atingir é 125cm3 (aproximadamente 70g), o que significa que além do tamanho
ou peso do tumor, a faixa etária pode identificar um tumor de prognóstico melhor ou
pior. Assim, é possível que TCA em crianças de maior idade possa ter mais
semelhança com TCAs de adultos (RIBEIRO et al., 2000, FIGUEIREDO et al., 2000,
RIBEIRO; FIGUEIREDO, 2004).
TABELA 1 - ESTADIAMENTO DO TCA PARA CRIANÇAS
Estadiamento
3
Estádio I
Tumor completamente ressecado,volume tumoral < 200 cm ou menor de
100g, ausência de metástases e níveis hormonais normais após cirurgia.
3,
Tumor residual microscópico ou tumor > 200 cm “spillage” durante cirurgia ou
Estádio II
persistência de níveis hormonais anormais depois da cirurgia.
Estádio III
Tumor residual macroscópico ou irressecável.
Estádio IV
Metástase à distância
FONTE: SANDRINI, R.; RIBEIRO, R. C.; DELACERDA, L. Childhood adrenocortical tumors. J Clin
Endocrinol Metab, v. 82, p. 2027-2031, 1997.
2.3 PRODUÇÃO DE ESTERÓIDES PELO CÓRTEX ADRENAL E TCA
O córtex adrenal sintetiza, a partir do colesterol, vários hormônios como os
glicocorticóides, mineralocorticóides e os esteróides sexuais, que possuem a mesma
estrutura em comum do ciclopentanoperidrofenantreno. A secreção dos esteróides
adrenais
é
aproximadamente
igual
ao
que
é
recém-sintetizado,
pois
o
armazenamento destes hormônios é insignificante. O ritmo circadiano da secreção
de cortisol é dependente das flutuações de ACTH, que por sua vez está sob controle
10
hipotalâmico, em retro-alimentação negativa pelo cortisol. As secreções de
desoxicorticosterona, corticosterona, 18-hidroxi-corticosterona e de aldosterona,
acompanham também as flutuações do ACTH, porém em menores proporções que o
cortisol. Suas funções principais são: armazenamento de glicogênio e manutenção
da glicemia, atuação no metabolismo de proteínas e lipídeos, estimulação do apetite,
e propriedades antiinflamatórias. A aldosterona é controlada principalmente pelo
sistema renina-angiotensina e é bastante sensível às variações de potássio sérico.
Sua função principal é a regulação da retenção de sódio e potássio urinários através
do sistema renina angiotensina aldosterona, com o conseqüente controle da pressão
arterial (MOURA; FIGUEIREDO, 2004).
A produção elevada de esteróides pelo TCA não depende de ACTH (este
pode estar bloqueado se existir excesso de cortisol), pode não ter um ritmo
circadiano
preservado
e
nem
sempre
apresenta
elevação
dos
principais
representantes de cada classe [cortisol na classe dos glicocorticóides, aldosterona
na classe dos mineralocorticóides e dehidroepiandrosterona (com ou sem o radical
sulfato) ou testosterona na classe dos andrógenos] (MENDONÇA et al., 1995). Uma
das finalidades do presente trabalho é rever a questão do excesso de cortisol sérico
com manifestação de síndrome de Cushing como parâmetro que pode interferir no
total de linfócitos T citotóxicos no TCA, baseado no pressuposto de que foi
observado menor sobrevida quando havia síndrome de Cushing em crianças
(BERGADA et al., 1996, MICHALKIEWICZ et al., 2004). Enquanto predomina
excesso de andrógenos em crianças com TCA (MICHALKIEWICZ et al., 2004), nos
adultos observa-se mais freqüentemente síndrome de Cushing, seguida de síndrome
não-funcionante (ICARD et al., 2001, FAVIA; LUMACHI; D’AMICO, 2001). Talvez
esta maior proporção de síndrome de Cushing em adultos do que em crianças, seja
um dos motivos para o pior prognóstico do TCA em adultos, como verificado por
ICARD et al., (2001) para os 253 casos avaliados, com sobrevida de 66%, 58%, 24%
e 0% para os estádios I, II, III e IV, respectivamente.
2.4 CÉLULAS TRONCO, HEMATOPOIESE E IMUNIDADE
As células tronco ou células mãe são células pluripotentes capacitadas em
gerar duas linhagens principais: uma para as células linfóides e outra para as células
11
mielóides com a finalidade de reconstituir a hematopoiese a longo prazo e de forma
completa em animais. Uma de suas características principais é a auto-regeneração,
isto é, ao se dividirem dão origem a uma nova célula tronco. Embora exista no
sangue circulante, a maior parte das células tronco se encontra na medula óssea.
A Figura 1 mostra um esquema simplificado da diferenciação das células
tronco hematopoiéticas e da maturação das células T e B. As células tronco são
capazes de se dividirem assimetricamente, dando origem na mesma divisão a uma
nova célula tronco e a uma célula comprometida. Ao se dividirem, sob a ação dos
fatores de crescimento e das citocinas, as células tronco dão origem às células
precursoras, que se caracterizam pela perda do potencial de auto-regeneração e
pelo comprometimento com uma determinada via de diferenciação. Estas células
precursoras são encontradas na medula óssea e elas têm capacidade de originar
colônias contendo células de diferentes linhagens, que com o tempo, ao se dividirem
e se diferenciarem, tornam-se restritas a uma única linhagem. O comprometimento
da célula com uma linhagem ocorre segundo uma ordem específica. Assim, primeiro
ocorreria a separação entre linhagens mielóide e linfóide. A seguir ocorre a
separação entre a linhagem granulocítica e monocítica e depois a eritróidemegacariocítica. Na continuação do processo de divisão, quando já diferenciadas,
estas células saem para o sangue periférico circulante, para exercerem suas
funções especificas. Dentro de suas respectivas linhagens, os linfócitos T ativados,
as imunoglobulinas e anticorpos produzidos pelas células B, e os macrófagos,
derivados dos monócitos deixam a corrente sanguínea e penetram diretamente nos
diferentes tecidos (REGO, 2001).
12
FIGURA 1 – HEMATOPOIESE E ORIGEM CÉLULAS DO SISTEMA IMUNOLÓGICO
Ilustração demonstra a diferenciação de células responsáveis pela imunidade no sangue e nos
tecidos, a partir de seus progenitores linfóides e mielóides na medula óssea, a partir da célula
tronco. Reproduzido e modificado de www.acm.uiuc.edu ,com permissão.
2.5 EVIDÊNCIAS DE IMUNIDADE CELULAR CONTRA TUMORES
Os linfócitos T podem ser tipo T citotóxico (CD8+), que reagem contra
proteínas expressas na superfície das células, ou do tipo T auxiliar (T “helper”,
CD4+) com subtipos auxiliar 1 (que estimula linfócitos T citotóxicos) e auxiliar 2 (que
ativa anticorpos). Linfócitos T citotóxicos são apresentados a antígenos por
moléculas CMH da classe I. Os linfócitos B se transformam em plasmócitos que
liberam anticorpos que também participam no combate ao tumor (KIRKIN;
DZHANDZHUGAZYAN; ZEUTHEN, 1998, ZENG, 2001). Entretanto, o mecanismo
humoral não é um objetivo de pesquisa deste projeto, e portanto, não será revisado
aqui.
13
Além da biologia mais ou menos agressiva dos tumores, é importante
considerar a existência ou não de reação do sistema de defesa celular contra
possíveis antígenos presentes no tumor. Os tumores sólidos humanos são infiltrados
por linfócitos, principalmente T. Linfócitos T citotóxicos (CD8+) e linfócitos T
auxiliares (CD4+) foram identificados em tumores, juntamente com antígenos
associados com tumores, tais como mart-1, gp100 e tirosinase (VAN DEN EYNDE;
BOON, 1997).
Genes que codificam antígenos tumorais reconhecidos pelos
linfócitos T citotóxicos, como MAGE, BAGE E GAGE, muitas vezes têm sua
expressão aumentada (BOON; COULIE; VAN DER EYNDE, 1997, ROSENBERG,
1997, VAN DEN EYNDE; VAN DER BRUGGEN, 1997). Estes e outros antígenos
podem estimular os linfócitos CD8+ e CD4+ após a apresentação feita por moléculas
codificadas por genes CMH da classe I (expressas na superfície de algumas
células), resultando em produção de linfocinas pelos linfócitos auxiliares 1, ativação
de linfócitos citotóxicos CD8+ e, finalmente resultando na lesão e morte da célula
tumoral (KIRKIN et al., 1988, ZENG, 2001) (Figura 2). Toda proteína estranha ao
sistema imunológico, produzida a partir de transformações do tumor, poderá resultar
em recrutamento e acúmulo de linfócitos T citotóxicos (LTC) contra o tumor
(PISARRA et al., 1999) ou, se os antígenos estiverem livres em meio solúvel, poderá
haver reação com anticorpos secretados pelos plasmócitos. Na análise de 131
tumores colo-retais, foi encontrado, por meio de células marcadas para CD8+,
associação entre maior número de LTC nos tumores e melhor sobrevida (NAITO et
al., 1998). A associação entre a presença de linfócitos e outros fatores prognósticos
como tamanho do tumor, estádio ou tempo de sobrevida, também foi encontrada em
tumores de próstata (VESALAINEN et al., 1994), câncer gástrico (SETALA et al.,
1996, ISHIGAMI et al., 2002), carcinoma oral (REICHERT et al., 1998), melanoma
(PISARRA et al., 1999, LADÁNYI et al., 2004), câncer de pulmão (ECHCHAKIR et
al., 2000), câncer de ovário (ZHANG et al., 2003), carcinoma de endométrio
(KONDRATIEV et al., 2004), estudos anteriores em câncer colo-retal (ROPPONEN
et al., 1997) e outros. Entretanto, outros estudos não conseguiram demonstrar
associação entre maior infiltração de linfócitos T e melhor sobrevida, como no câncer
de esôfago (SHIBAKITA et al., 1999) e câncer renal (NAKANO et al., 2001).
A localização de linfócitos T dos casos estudados e citados acima tinha um
padrão mais ou menos semelhante: nos tumores colo-retais, os LTCs localizavam-se
14
em ilhas de células cancerosas dos tumores, associado a melhores índices de
sobrevida (NAITO et al., 1998); no câncer de endométrio havia maior predominância
de LTCs em células epiteliais do tumor (KONDRATIEV et al., 2004) e no câncer de
ovário, na porção intratumoral (ZHANG et al., 2003). Em todos estes casos, no
entanto, a interpretação dos dados das contagens de linfócitos deve ser cuidadosa,
sobretudo nas áreas de tumor onde há excesso de necrose.
A maioria dos estudos realizados sobre o papel antitumoral dos LTCs não
explorou o estado de ativação destes linfócitos, e, segundo alguns autores, pode
haver falhas na associação entre número expressivo de LTCs (não ativados) e
progressão do tumor. Esta avaliação tem sido feita a partir da identificação de
marcadores [receptor alfa de interleucina 2 (CD25) e OX40 (CD134)] de ativação de
linfócitos T em melanomas (LADÁNYI et al., 2004). Outros ativadores, como CD69
não foram eficientes em mostrar associação entre presença de linfócitos e evidência
de atividade anti-tumoral de LTCs (BERD et al., 1994, DIEDERICHSEN et al., 1999).
Assim, nestes estudos, em vez de se limitar a mostrar apenas o número de LTCs, os
autores optaram por mostrar a co-localização de marcadores de ativação na mesma
célula, por exemplo, CD4+ ou CD8+ com CD25 ou CD134 (LADÁNYI et al., 2004).
Verificou-se que estes marcadores estavam mais freqüentemente associados a
linfócitos T CD4+ do que a CD8+.
Acredita-se que linfócitos T positivos para alguns marcadores de ativação,
como CD134, representam um subtipo específico de células contra o tumor (VETTO
et al., 1997, RAMSTAD et al., 2000, KJAERGAARD et al., 2000, PETTY et al., 2002).
A infiltração de linfócitos freqüentemente acontece em tumores que progridem para
estádios avançados, mas é importante distinguir os casos onde realmente estas
células estão atuando como agentes anti-tumorais. Alguns mecanismos foram
propostos para explicar quando elas não estão sendo eficientes: falha na ativação
de linfócitos T devido à perda ou redução de atividade de antígenos associados a
tumores ou moléculas da classe I do CMH, falha na apresentação de antígenos, falta
de co-estimulação, ou participação de fatores imunossupressores produzidos por
células do tecido tumoral (WHITESIDE, 1999, MARINCOLA et al., 2000).
Os achados de alguns estudos só foram significativos quando se especificou
a localização dos linfócitos no tumor, quando os tumores foram estratificados por
15
faixa etária ou outras características (AALTOMAA et al., 1992, MÉNARD et al., 1997,
JOHNSON et al., 2000).
FIGURA 2 – ATIVAÇÃO DE LINFÓCITOS CONTRA CÉLULAS DO CÂNCER
Diagrama modificado da Universidade da Virgínia (www.people.virginia.edu/~rjh9u/imresp/html),
ilustrando as imunidades humoral e celular em alguns tumores. Vários antígenos associados a
tumores já foram identificados, tais como mart-1, gp100 e tirosinase (BOON et al., 1997;
ROSENBERG, 1997; VAN DEN EYNDE ; VAN DER BRUGGEN, 1997). As moléculas codificadas por
genes CMH das classes I e II desempenham um papel importante nas respostas imunes. Linfócitos T
antígeno-específicos não reconhecem antígenos na forma livre ou solúvel, mas, ao contrário,
reconhecem porções de antígenos protéicos não covalentemente ligados às moléculas CMH I e II. Os
ativadores reportados em alguns estudos (por exemplo, HLA-DR, CD69, CD25 e CD134) constituem
marcadores importantes no processo de identificação de linfócitos T ativados (CD4+ ou CD8+), porém
é possível a identificação de linfócitos T citotóxicos CD8+ em maior proporção em alguns tipos de
tumores com melhor prognóstico, sem a comprovação de indicadores de ativação.
16
3
MATERIAL E MÉTODOS
3.1 CASUÍSTICA
Este estudo caracteriza-se por ser retrospectivo e foi aprovado pelo Comitê
de Ética em Pesquisa (CEP) da Universidade Federal do Paraná e pelo CEP do
Hospital Pequeno Príncipe, para ser realizado no Centro de Genética Molecular e
Pesquisa do Câncer em Crianças (CEGEMPAC).
A casuística consiste de amostras de tumor de córtex adrenal de trinta e
quatro pacientes, oriundas de duas instituições: dezenove do Hospital Pequeno
Príncipe de Curitiba e quinze do Hospital do Câncer (A C Camargo, São Paulo).
Doze casos eram do sexo masculino e vinte e dois do sexo feminino, com idade no
diagnóstico variando de 5 dias a 15 anos, em acompanhamento por mais de seis
meses. As amostras dos TCAs de pacientes das duas instituições foram
conservados em blocos de parafina, nos casos precedentes de Curitiba, e em
microcortes, já fixados em lâminas, nos casos oriundos de São Paulo. Todas
estiveram arquivadas no CEGEMPAC (setor de citogenética), na vigência do estudo
e, ao final, foram devolvidas às instituições de origem.
O processo de seleção dos pacientes foi baseado na disponibilidade de
amostra do tumor em blocos de parafina e de dados clínicos. Com exceção de um
paciente, todos os demais 33 pacientes tinham os dados clínicos disponíveis.
O diagnóstico de tumor de córtex adrenal foi confirmado pela análise
histopatológica do tumor primário ou de amostras de metástases. Todas as lâminas
disponíveis foram previamente revisadas e classificadas de acordo com o
estadiamento
proposto
já
descrito
anteriormente
(SANDRINI;
RIBEIRO;
DELACERDA, 1997), considerando os registros nos prontuários dos pacientes, mas
não os dados histopatológicos. Entretanto, houve diferenças nos protocolos de
tratamento, sobretudo no que diz respeito à conduta cirúrgica para o estádio II (com
ou sem extração de todos os linfonodos), e seleção de quimioterápicos com ou sem
mitotano.
17
3.2 IMUNOHISTOQUÍMICA PARA CD8+ E CD25+
3.2.1 Preparo dos Cortes de TCA e de Tecido para Controle (amígdala)
Foi obtido material de amígdala humana para controle dos exames de
imunohistoquímica, conforme orientação do fabricante dos anticorpos utilizados
(Novocastra, Newcastle, Reino Unido). Cortes de 4µm de TCA e de amígdala foram
montados em lâminas, sendo utilizado uma lâmina para controle negativo e uma
para controle positivo em cada lote dos ensaios realizados. Inicialmente um corte de
cada amostra de TCA foi fixado em lâmina e corado com hematoxilina e eosina pelo
método convencional. Um patologista confirmou o diagnóstico de tumor de córtex
adrenal e a amostra passou a ser utilizada nos ensaios de imunohistoquímica.
3.2.2 Desparafinização do Tecido
Os cortes de cada tumor, nas lâminas, foram previamente preparados, com
duas amostras de tecido controle positivo e negativo (amígdala), e deixados em
estufa a 37oC durante a noite anterior ao ensaio.
O procedimento de desparafinização utilizado incluiu as seguintes etapas:
imersão em xilol por 10 minutos (duas vezes), seguidos de imersão em álcool
absoluto a 100% por 5 minutos (duas vezes), imersão em álcool a 90% por 2
minutos (duas vezes), imersão em álcool a 70% por 2 minutos (duas vezes) e
finalmente as lâminas com os cortes foram mantidas submersas em água destilada
por 5 minutos no mínimo.
3.2.3 Fase de Recuperação Antigênica
Utilizou-se o tampão citrato a 10mM em pH=6,0 (acetato de sódio
monobásico),
preparado
no
dia
anterior
ao
estudo.
Simultaneamente
à
o
desparafinização do tecido, este tampão foi aquecido e mantido a 100 C. As lâminas
foram retiradas da água destilada e imersas nesta solução tampão para provocar um
choque térmico, e conservadas a 100o C durante 8 minutos. Em seguida, as lâminas
foram mantidas por 15 minutos na mesma solução em temperatura ambiente.
18
3.2.4 Inibição da Peroxidase Endógena
Imediatamente após a recuperação antigênica iniciou-se o procedimento
para inibição da peroxidase endógena. Cem microlitros de uma solução de PBS com
água oxigenada a 0,3% foram pipetados cobrindo todo o tecido montado na lâmina
por 30 minutos. Em seguida as lâminas foram lavadas com solução de PBS por 5
minutos.
3.2.5 Incubação com os Anticorpos Primários
Inicialmente foi adicionado soro de cavalo (100µl) sobre cada lâmina e
incubado por 20 minutos. Cada um dos dois anticorpos primários de camundongo
(anti-CD8 e anti-CD25) foi utilizado na diluição recomendada pelo fabricante: 1/40
(anti-CD8), e 1/150 (anti-CD25).
Em cada lâmina do estudo foi aplicado o mesmo volume da solução, com o
anticorpo (100µl) cobrindo todo o corte, e incubado em uma câmara umedecida a
8oC, por toda a noite. Nas lâminas identificadas como “controle negativo”, em vez do
anticorpo primário, foi aplicado 100µl de solução PBS, sendo este o único
procedimento diferente efetuado nas lâminas controles e nas testadas.
3.2.6 Lavagens e Incubação com o Anticorpo Secundário e Complexo AvidinaHorseradish Peroxidase
No dia seguinte, pela manhã, as lâminas foram lavadas com PBS (três
lavagens de 5 minutos). O anticorpo secundário (Novocastra, Newcastle, Reino
Unido), uma imunoglobulina conjugada com biotina que reconhece a imunoglobulina
de camundongo primária, foi utilizado nas duas reações (CD8 e CD25). Este
conjugado foi preparado com 2 gotas da solução fornecida pelo fabricante para cada
5 ml de tampão. Cem microlitros da solução do conjugado foram aplicados sobre o
corte e incubado por 30 minutos em temperatura ambiente.
Após lavagem em tampão PBS, para retirar o anticorpo conjugado não ligado
ao antígeno específico (CD8 ou CD25), os cortes foram incubados por 30 minutos
em uma solução denominada “AB”: 5ml de tampão PBS com 2 gotas do reagente A
19
(solução de avidina) + 2 gotas do reagente B (enzima Horseradish peroxidase),
ambos os reagentes fornecido no kit.
3.2.7 Revelação com Solução de Tetrahidrocloreto de Diaminobenzidina (DAB)
Após lavagem com tampão PBS por 5 minutos (três vezes), foi preparada
uma solução tampão com DAB fornecida pelo fabricante do kit (solução de ácido
cítrico + H202= 1ml + 1 gota da solução DAB), e aplicado 100µl em cada lâmina, por
um período de 10 minutos. O DAB, na presença de enzima peroxidase, produz um
precipitado marrom insolúvel em álcool.
3.2.8 Contra-coloração com Hematoxilina
Após a revelação com DAB, as lâminas foram lavadas em água destilada por
5 minutos, e posteriormente imersas em solução de hematoxilina de Harris por mais
um minuto.
As lâminas foram novamente lavadas em água corrente fria por 2 minutos, e
depois imersas sucessivamente em solução de álcool a 100%, 90% e álcool a 70%,
e finalmente foram montadas as lamínulas sobre os cortes com meio de montagem.
3.3 CONTAGEM DOS LINFÓCITOS POSITIVOS PARA CD8 OU CD25
Em microscópio óptico, em campo de grande aumento (400 vezes), foram
contadas as células positivas para CD8 e CD25, em 10 campos, traduzindo o
resultado (soma de células em 10 campos), o equivalente a contagem de células por
milímetro quadrado do tumor. Esta contagem foi feita (em cada amostra) por um
patologista (Dr. Gilberto Sampaio) e pelo responsável por este projeto (Guilherme A.
Parise).
Foram evitadas contagens em áreas muito próximas à necrose. Os campos
escolhidos eram aleatórios, dentro de áreas com tumor em cada lâmina. Nos casos
onde contagens baixas foram obtidas, outros campos foram observados para
confirmar a pequena presença de linfócitos. Em nenhum caso, houve alteração do
número expresso em 10 campos, em função de uma revisão de outros campos.
20
Posteriormente, na análise dos resultados, arbitrariamente foi escolhido um
patamar que separasse os números extremos obtidos nas contagens preliminares.
Assim, passou-se a considerar contagem elevada de células marcadas, quando o
número obtido fosse maior ou igual a 60/mm2, no caso das células CD8+, e maior ou
igual a 4/mm2, no caso das células CD25+.
3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Todos os dados obtidos foram incluídos em uma planilha eletrônica
(Microsoft Excel) e posteriormente exportados para o software Statistica para que
fosse efetuada a análise estatística, seguindo a orientação do professor Luiz
Gonzaga Caleffe, da Faculdade Evangélica do Paraná.
As variáveis contínuas foram avaliadas quanto à sua distribuição e, para
aquelas com distribuição normal, foram calculados a média aritmética e o desvio
padrão.
Para comparação de grupos em relação a variáveis quantitativas foi
considerado o teste não-paramétrico de Mann-Whitney.
Para variáveis categóricas foram utilizados o teste exato de Fisher (bilateral)
e o teste Qui-quadrado de Pearson para avaliação das hipóteses de interesse.
Para a análise de associação entre duas variáveis contínuas foi calculado o
coeficiente de correlação de Pearson.
Na análise de sobrevida global foi considerada a curva de Kaplan-Meier.
Em todos os testes estatísticos valores de p< 0,05 indicaram significância
estatística
21
4
RESULTADOS
Neste estudo retrospectivo, foram analisadas por imunohistoquímica amostras
de córtex adrenal de 34 crianças, 12 (35%) do sexo masculino e 22 (65%) do sexo
feminino, obtidas de duas instituições: Hospital Pequeno Príncipe de Curitiba (n=19)
e Hospital do Câncer de São Paulo (n=15). A idade no diagnóstico variou de cinco
dias
até
15
anos,
com
mediana de 30 meses.
Os
pacientes
tiveram
acompanhamento de seis ou mais meses.
A Tabela 2 mostra todos os pacientes estudados e seus dados clínicos
relevantes a este estudo: sexo, idade, estádio da doença, forma de apresentação
clínica, evolução e contagens de linfócitos T CD8+ e CD25+. Vinte e sete pacientes
tinham idade ao diagnóstico inferior a 4 anos de idade (79,4% dos casos), cinco
entre 4 e 12 anos (14,8%) e dois pacientes apresentavam idade superior a 12 anos
(5,8%).
Treze pacientes (41%) estavam no estádio I, três (9%) no estádio II, cinco
(16%) no estádio III, e onze (34%) no estádio IV.
Dezessete (52%) pacientes apresentaram-se com síndrome virilizante, e
doze (36%) com a forma mista, (sinais virilizantes e de síndrome de Cushing).
Quatro (12%) pacientes, sem manifestações endócrinas, tiveram o diagnóstico
realizado pela presença de massa abdominal, ou como achado de exame.
Os tamanhos dos tumores, após ressecção cirúrgica, foram analisados em
função do volume (n= 30 pacientes) e/ou do peso (n=25 pacientes). A relação peso
com o volume do TCA é de 100g para 200cm3 (MICHALKIEWICZ et al., 2004),
porém houve algumas diferenças no presente estudo que impossibilitam agrupar
peso abaixo de 100g (n=13) com o grupo abaixo de 200cm3 (n=17). Para efeito de
estadiamento, o estádio I foi considerado com ambos os parâmetros. Assim, para
efeito de comparação com contagem de linfócitos, o tamanho do tumor foi baseado
no peso, ou seja, considerou-se estádio I apenas tumores ”J
Foram analisados os pesos de 25 tumores. Estes tiveram uma variação entre
1 e 2700g (Tabela 2). Treze pacientes apresentavam tumores com peso menor ou
igual a 100g ao diagnóstico e doze pacientes com peso maior que 100g. Nesta
pequena casuística todos os pacientes dos estádios I (n=13) e II (n=3) sobreviveram
e portanto não aparecem no gráfico de Kaplan-Meier (Figura 3). Dois pacientes não
22
tiveram classificação do estádio (dados de peso e tamanho foram perdidos dos
prontuários).
FIGURA 3 – SOBREVIDA DOS PACIENTES DOS ESTÁDIOS III E IV
Óbito
Vivo
1,0
0,9
Sobrevida Acumulada
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0
50
100
150
200
250
300
Estádio
Estadio 4IV
Estádio
Estadio 3III
Tempo de Sobrevida (meses)
A Figura 3 demonstra, neste gráfico, que a sobrevida dos pacientes dos estádios III e IV nesta
casuística foi semelhante aos resultados reportados no IPACTR/2004.
.
23
TABELA 2 - RESULTADO DA CONTAGEM DE LINFÓCITOS CD8+ E CD25+ INTRATUMORAL E DADOS CLÍNICOS
continua
Paciente Sexo
Idade
Estádio
Peso (g)
Evolução
CD 8+
2
(n/mm )*
CD25+
2
(n/mm )*
20
20
Bem
31
2
mista fragmentado
>400
Óbito
48
0
3
Forma clínica Volume (cm )
1
F
1a 6m
I
mista
2
F
7a 3m
IV
3
M
2a 8m
I
virilização
52,5
50
PS
43
2
4
F
2a 7m
I
virilização
43
20
Bem
22
6
5
F
2a 3m
I
mista
23
60
Bem
32
1
6
F
8m
I
virilização
179
100
Bem
37
0
7
F
6m
IV
virilização
122
50
Bem
0
0
8
F
3a
IV
massa
123
210
Óbito
0
0
9
F
15a
IV
mista
SD
SD
Óbito
0
0
10
M
2a 9m
IV
virilização
1232
620
Óbito
1
0
11
F
7m
I
mista
117
100
Bem
68
3
12
M
10m
III
Não funcionante
539
320
PS
12
1
13
M
4a 5m
I
virilização
24
15
Bem
111
12
14
M
1a 10m
II
virilização
280
170
PS
0
0
15
M
2a 9m
III
Não descrito
2244
1050
Óbito
10
0
16
F
5dias
I
Não funcionante
16
SD
Bem
117
8
17
M
3a 4m
III
virilização
841
370
Doença ativa
9
2
conclusão
24
Paciente Sexo
Idade Estádio
18
F
1a 1m
19
F
1a 3m
20
3
Forma clínica Volume (cm )
Peso (g)
Evolução
CD 8+
2
(n/mm )
CD25+
2
(n/mm )
I
virilização
1
1
Bem
160
43
Não funcionante
396
265
Bem
76
0
F
II
Não
1a 10m descrito
mista
8,5
SD
Óbito
7
4
21
F
1a 9m
I
virilização
96
58
Bem
64
0
22
F
4a 7m
IV
virilização
4968
1880
Doença ativa
9
2
23
M
4a 4m
IV
virilização
4323
1540
Bem
0
0
24
F
2a 10m
II
virilização
370
104
PS
12
3
25
F
10a
IV
virilização
3800
SD
Óbito
14
0
26
M
virilização
5231
2700
Óbito
8
0
27
F
IV
Não
2a 8m descrito
virilização
SD
SD
PS
22
5
28
F
1a 1m
I
virilização
150
41
Bem
25
0
29
F
1a 4m
IV
virilização
175
Óbito
54
1
30
M
3a 10m
IV
mista
1296
95
SD
Óbito
14
1
31
M
3a 4m
I
virilização
72
Bem
2
11
32
F
1a 2m
I
mista
Bem
66
13
33
F
11m
III
mista
125
SD
Bem
91
13
14a
SD
60
SD
34
M
3a 7m
III
mista
4840
SD
Bem
1
2
Bem= sem doença ativa; CIR= cirurgia; M=mitotano; QT= quimioterapia; PS=perda de seguimento. SD= sem descrição no prontuário.*n/mm =
2
soma de linfócitos marcados em 10 campos de grande aumento (400X, equivalente a 1mm de tumor).
1
25
4.1 CONTAGEM DE LINFÓCITOS CD8+ E CD25+
Enquanto células CD8+ são linfócitos T citotóxicos, as marcadas com CD25+
são expressas em linfócitos T, B e macrófagos. A Tabela 2 apresenta o número de
linfócitos CD8+ e CD25+ por 10 campos de grande aumento (1 mm2). A morfologia e
o padrão de coloração dos linfócitos marcados com CD8 e CD25 estão
apresentados nas Figuras 5 e 6. A intensidade e a localização da coloração para
CD8 e CD25 foram satisfatórias em todas as lâminas estudadas nas diluições dos
anticorpos primários (CD8, 1/40; e CD25, 1/150) seguindo protocolos sugeridos pelo
fabricante, indicando boa especificidade para estes anticorpos, sem coloração “não
específica” (ou seja, com artefatos no preparo provocando coloração muito baixa
em matriz extracelular).
O número de linfócitos CD8+ observados nos TCAs variou entre 0 e 168/mm2 e
houve correlação (r=0,71) com o número de células CD25+ que apresentou variação
entre 0 e 43 (Figura 4).
FIGURA 4 – CORRELAÇÃO ENTRE POPULAÇÃO DE LINFÓCITOS T CD8+ E
CD25+ EM TUMORES DE CÓRTEX ADRENAL (n=34)
CD8+ (N/mm2)
CD25+ (N/mm2)
26
FIGURA 5 - LINFÓCITOS T CITOTÓXICO CD8+ NO TCA
Fotomicrografia que apresenta, em coloração marrom, positividade para CD8 em linfócitos T
citotóxicos CD8+ (setas), junto a células de tumor de córtex adrenal (núcleos indicados por “NTCA”). Aumento de 1000 vezes.
27
FIGURA 6 - LINFÓCITOS T CITOTÓXICO CD25+ NO TCA
N-TCA
N-TCA
Fotomicrografia que apresenta célula em coloração marrom, (marcada positivamente para CD25),
que pode ser linfócito T citotóxico ativado (seta), próxima a células de tumor de córtex adrenal
(núcleos indicados por “N-TCA”). Aumento de 1000 vezes.
28
4.2 ASSOCIAÇÃO ENTRE LINFÓCITOS T CD8+ E CÉLULAS CD25+ COM O
PESO DO TUMOR
Foi investigada a relação entre o número de linfócitos T e vários parâmetros
encontrados nos TCAs e nos pacientes. Embora houvesse uma tendência à
existência de maior número de linfócitos em tumores com peso inferior a 100g, esta
tendência não foi confirmada pela análise estatística, como demonstrado na Tabela
3 (p=0,088).
TABELA 3 – ASSOCIAÇÃO ENTRE CONTAGEM DE CÉLULAS CD8+ E O PESO
DO TUMOR
CD8+ n/mm
2
Peso > 100g
n
6
1
7
< 60 células
11
12
23
Total
17
13
30
Peso
Teste Exato de Fisher bilateral
p=0,088
A tendência, que não obteve significância estatística na contagem de células
CD8+, foi confirmada, analisando os dados obtidos com a contagem de células
CD25+, observando-se uma associação entre maior número de células marcadas,
com os tumores com peso inferior a 100g (p= 0,026), não sendo registrado nenhum
caso de contagens elevadas de células CD25+, com peso do tumor superior a
100g(Tabela 4).
29
TABELA 4 - ASSOCIAÇÃO ENTRE CONTAGEM DE CÉLULAS CD25+ E O PESO
DO TUMOR
CD 25+ n/mm
2
Peso Peso > 100g
n
4
0
4
< 4 células
7
14
21
Total
11
14
25
! "#
Teste Exato de Fisher bilateral
p=0,026
Os TCAs com maior número de Linfócitos T CD8+ (contagem acima de 60
células/mm2), estavam todos em estádio inicial (estádio I), muito embora, outros
pacientes de estádio I possuíam também, contagem baixa de células CD8+. Ao
contrário, os TCAs em estádio IV, possuíam todos, contagem de linfócitos CD8+
abaixo de 60 células/mm2.
Na Tabela 5, está expresso a associação entre a contagem de células CD8+ e o
estadiamento do TCA. Não houve diferença estatisticamente significativa, quando
comparados todos os quatro estádios. Por isso, procurou-se mais uma vez a
comparação com os dados extremos do estadiamento, e também analisar a média e
mediana das contagens absolutas das células em cada um dos estádios. Os dados
indicam uma associação estatisticamente significativa entre maior contagem de
células e um menor estádio; e entre uma menor contagem de células associada com
o estádio mais avançado.
TABELA 5 - ASSOCIAÇÃO ENTRE NÚMERO DE CÉLULAS CD8+ E ESTÁDIOS I E
IV
Estadiamento
Número de Média da contagem
pacientes de células CD8/mm
2
Mediana
Estádio I
13
59,85
43
Estádio IV
11
13,45
8
Teste não paramétrico de Mann-Whitney
.
p=0,001
30
Da mesma forma, verifica-se na Tabela 6 que os tumores do estádio I
Estadiamento
Número de Média da contagem
pacientes de células CD25/mm
2
Mediana
Estádio I
13
7,77
3
Estádio IV
11
0,36
0
Teste não paramétrico de Mann-Whitney
.
p=0,005
possuíam uma contagem média mais elevada em relação aos TCAs do estádio IV,
que possuíam uma contagem média de células CD25+ mais baixa.
TABELA 6 - ASSOCIAÇÃO ENTRE NÚMERO DE CÉLULAS CD25+ E ESTÁDIOS I
E IV
A contagem de células representativa de um bom prognóstico, isto é, uma
contagem de células CD8+ •PP
, ou de células CD25+ •PP
2
2
, foi observada
no estádio I, uma situação oposta à demonstrada no estádio IV (Tabela 7).
TABELA 7- ASSOCIAÇÃO ENTRE CONTAGEM ELEVADAS DE CÉLULAS CD8+ E
CD25+ COM ESTÁDIOS I E IV
31
4.3 ASSOCIAÇÃO ENTRE LINFÓCITOS T CD8+ E CÉLULAS CD25+ COM
RECIDIVA
Em relação às recidivas, a Tabela 8 mostra que os pacientes com maior
contagem de Linfócitos T CD8+ (• 60 células/mm2) foram os que não recidivaram,
enquanto todos os TCAs que recidivaram apresentavam contagem baixa de
linfócitos CD8.
TABELA 8 – ASSOCIAÇÃO ENTRE CONTAGEM DE CÉLULAS CD8+ E RECIDIVA
CD8+ n/mm
2
Sem Recidiva
$%'.-/0 *0 12
Uma ou mais
n
recidiva
7
Estádio
I
7
8(100%)
14
0
Estádio
IV
10
0
10
7
Total
17
8
24
CD8 <60 e CD25 <4
5(31%)
Teste Exato de Fisher bilateral
Total
13
11(69%)
16
p=0,019
24
Marcadores
< 60 células
CD8 $&%')(*
$,+
Total
Teste Exato de Fisher
11
p=0,002
32
Esta mesma comparação é também apresentada na tabela 9, desta vez,
através da análise comparando a presença de uma ou mais recidiva associada com
a contagem absoluta de linfócitos T CD8+. Observa-se que a média da contagem de
células CD8+ é 56,8 e a mediana 64, para os tumores sem recidiva; e 14,3 e 8
respectivamente para os casos com uma ou mais recidiva.
TABELA 9– ASSOCIAÇÃO ENTRE NÚMERO ABSOLUTO DE CÉLULAS CD8+ E
RECIDIVA
Analisando a presença de células CD25+ (que podem ser linfócitos ativados)
e recidivas, (Tabela 10), todos os tumores com maior número de células CD25+ (• 4
células/mm2), não apresentaram recidiva. Entretanto, o grupo CD25+ <4
células/mm2 não ficou bem definido, talvez pelo número reduzido da amostragem.
TABELA 10 - ASSOCIAÇÃO ENTRE CONTAGEM DE CÉLULAS CD25+ E
RECIDIVA
Número de Média da contagem
Uma ou mais Mediana
Recidiva
2
2
CD25+ n/mm pacientes
Sem Recidiva
n
de células CD8/mm
recidivas
3
45Sem
687 97 :;
13
56,8
64
5
0
5
Uma ou mais
10
14,3
8
< 4 células
9
10
19
Total
14
Teste
não paramétrico de Mann-Whitney
Teste Exato de Fisher bilateral
10 p=0,018
24
p=0,053
33
Embora tenha sido notada uma tendência para tumores com maior número de
células CD25+ não recidivarem, esta associação não teve significância estatística,
considerando as contagens extremas (•RXPP
2
na Tabela 10), ou contagem
absoluta das células CD 25+(Tabela 11).
TABELA 11 - ASSOCIAÇÃO ENTRE NÚMERO ABSOLUTO DE CÉLULAS CD25+
E RECIDIVA
Recidiva
Número de
pacientes
Média da contagem Median
de células CD25/mm
2
a
Sem
13
7,15
1
Uma ou mais
10
0,80
0
Teste não paramétrico de Mann-Whitney
p=0,166
Não foi encontrado nenhuma relação estatisticamente significativa entre número
baixo ou aumentado de linfócitos CD8+ ou células CD25+ com sexo, idade de
diagnóstico, forma de apresentação clínica (entre tumores funcionantes com e sem
síndrome de Cushing), histopatologia, estádios II e III e sobrevida, muito embora,
34
conforme já citado anteriormente, tenha sido observado relação direta com o estádio
I e IV.
Para uma análise conjunta da associação entre a contagem de células CD8+ e
CD25+ com a presença ou não de recidivas, a Tabela 12 mostra a união destes
dados, onde se analisa a presença de pelo menos um indicador favorável (CD8+ •D
60/ mm2 ou de CD25+•PP2, com a presença ou ausência de recidivas.
TABELA 12- ASSOCIAÇÃO ENTRE NÚMERO DE CÉLULAS CD8+ E CD25+ E
RECIDIVA
Marcadores
CD8
<&=>)?@
<,A
CD8 <60 e CD25
<4
Número de
Média da contagem de
2
Mediana
8(100%)
0
8
5(36%)
9(64%)
16
13
10
23
pacientes
Total
Teste Exato de Fisher
células CD25/mm
0,029
35
5
DISCUSSÃO
Diversos trabalhos avaliaram a relação do sistema imunocelular com tamanho
(peso ou volume), recidiva, histopatologia, metástases e sobrevida, na tentativa de
esclarecer o papel de linfócitos T citotóxicos contra o tumor (Tabela 9). Os tumores
de córtex adrenal de crianças, analisados neste trabalho, também apresentaram
dados de um papel defensor de linfócitos T (e possivelmente outras células
imunocompetentes CD8+ e CD25+) contra o TCA. Foi encontrado que o peso
reduzido do tumor, estádio baixo e ausência de metástases estão diretamente
relacionados com maior contagem de linfócitos intratumorais. Apesar destes
parâmetros (baixo peso, estádio e ausência de metástases) estarem relacionados a
um melhor prognóstico do TCA (ou maior sobrevida), não foi possível obter um
número de pacientes suficientemente grande para encontrar uma relação direta
entre a maior presença de linfócitos T e menor número de óbitos. Entretanto,
considerando apenas os pacientes dos estádios I e IV, nota-se uma relação entre
número de células e óbito. A maior quantidade de linfócitos T citotóxicos foi o
parâmetro mais freqüentemente associado à maior sobrevida pela maioria dos
autores (Tabela 9).
Neste estudo foi mostrado que houve correlação entre resultados de linfócitos
CD8+ com células CD25+ (r=0,7), indicando existir uma proporcionalidade de
linfócitos ativados em relação aos não ativados no tumor. Entretanto, CD25 pode ser
encontrado em linfócitos T e B ativados e macrófagos (WEISS; CHANG, 1999).
Marcadores de ativação de linfócitos foram usados em outros estudos, CD25
e CD134 no melanoma (LADÁNYI et al., 2004), redução da cadeia zeta do CD3 nos
tumores gástricos (ISHIGAMI et al., 2002) e orais (REICHERT et al., 1998). O papel
central das células T na imunidade antitumoral está bem estabelecido. Entretanto, a
progressão tumoral, freqüente na presença de substancial infiltração linfocítária,
sugere que células T não são totalmente capazes de manter uma resposta
imunológica efetiva para controlar o crescimento tumoral. Evidências sugerem que
infiltrações de linfócitos T em neoplasias humanas são funcionalmente deficientes,
incompletamente ativadas ou anérgicas. As células imunocompetentes dentro dos
infiltrados linfóides tumorais podem não estar no estado ativado. As expressões de
dois marcadores de células T ativadas, receptor α(CD25) de interleucina 2 e OX 40
36
(CD134, um marcador apenas encontrado em linfócitos T ativados), foram estudadas
através da imunohistoquímica em amostras de melanoma cutâneo primário de 76
pacientes (LADÁNYI et al., 2004). Maiores graus de infiltração de linfócitos
intratumorais CD25+ e CD134+ se relacionaram com menores espessuras dos
melanomas. A freqüência de amostras com altos números de células peritumorais
CD25+ e CD134+ foi significativamente mais baixa em melanomas que
desenvolviam metástases à distância, comparada com tumores com metástases em
nódulos linfáticos (LADÁNYI et al., 2004). A alta densidade peritumoral esteve
associada com sobrevida mais longa (pela análise univariada), enquanto que, em
análise multivariada, a densidade de células CD134+ no espaço peritumoral e com
infiltração linfocítica tinha também impacto na sobrevida.
NAKANO et al. (2001) analisaram o significado biológico da infiltração
linfocitária tumoral em 221 pacientes com carcinoma de células renais, sem um
tratamento pré-operatório, e encontraram resultados diferentes do encontrado neste
estudo e por LADÁNYI et al., em 2004. A infiltração do tecido tumoral não só por
CD8+, mas também por células CD4+, estava associada com uma sobrevida mais
curta. Os autores atribuíram as reações das células imunes, maiores quanto mais
avançado ou quanto mais maligno for o tumor, provavelmente pela sua maior
antigenicidade. Estes autores também encontraram uma maior freqüência de Ki67
em linfócitos CD8+ (por meio de dupla coloração), um antígeno associado com
proliferação (presumivelmente células efetoras citotóxicas), e relacionaram este
resultado com uma longa sobrevida nos pacientes, e uma correlação entre CD8 e o
grau tumoral (atipia) ou malignidade do tumor, sugerindo um possível aumento na
quantidade de antígenos associados ao tumor que podem ser reconhecidos pelas
células T em casos de câncer mais diferenciados.
ZHANG et al. (2003) realizaram análise imunohistoquímica em 186 amostras
congeladas de carcinomas ovarianos em estádio avançado (III e IV) para verificar a
distribuição da infiltração de células T tumorais. A infiltração por células T CD3∈+
(detectados por anticorpos que reconhecem a cadeia ∈) dentro do tumor (células T
intratumorais) foi encontrada em 102 de 186 tumores (54,8%), e foi indetectável em
72 tumores (38,7%). Houve diferenças significativas na distribuição de pacientes
com sobrevida livre de doença e sobrevida global, de acordo com a presença ou
ausência de células T intratumorais. A sobrevida em 5 anos foi de 38% entre os
37
pacientes que possuíam células T e de 4,5% ente os pacientes que não continham
nenhuma célula T intratumoral. Diferenças também estatisticamente significativas na
taxa de sobrevida livre de doença e global, de acordo com a presença ou ausência
de células T intratumorais, foram observadas entre os 74 pacientes com uma
resposta clínica completa após ressecção total e quimioterapia (Cisplatina; Cisplatina
e Ciclofosfamida; ou Cisplatina e Paclitaxel). A sobrevida em 5 anos foi de 73,9%
nos pacientes que possuíam células T intratumorais, enquanto foi de 11,9% nos que
não as possuíam. A presença de células T intratumorais correlacionou-se
independentemente, com recaída tardia ou prolongamento da vida, em análises
multivariadas e estava associada com uma expressão aumentada de interferon γ e
interleucina 2 no tumor. A ausência de células T intratumorais estava associada com
níveis aumentados de fator de crescimento do endotélio dos vasos.
38
TABELA 9 – COMPORTAMENTO DO SISTEMA IMUNOLÓGICO CELULAR EM DIVERSAS FORMAS DE CÂNCER
T C A Melanoma
Marcador de
Linfócitos
Marcadores de
ativação
CD8+
1
CD25+ ,
CD134+
CD25+
1
CA esôfago CA endométrio
CA Rim
CA Ovário
CA
Gástrico
CD3∈
CD3∈,
Zeta CD3+
CD8+
CD8+
CD 8 +
Ki 67
Interferon γ,
Interleuc.2
Granzima B
Ki 67
Ki 67,
CD45
Ca Oral
Zeta CD3+
Número de
pacientes
Peso
34
76
131
70
90
221
186
185
138
Sim
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
Tamanho
NA
NA
NA
Sim
NA
NA
NA
Sim
NA
Estádio
Sim
NA
NA
NA
Não
Sim
NA
NA
Sim
Recidiva
Sim
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
NA
Histopatologia
Não
NA
NA
NA
NA
Sim
NA
NA
NA
Invasão
Vascular
Diferenciação
NA
NA
NA
NA
Sim
NA
NA
Sim
NA
NA
NA
NA
Sim
NA
Sim
NA
NA
NA
Metástase
Sim
Sim
NA
NA
NA
NA
NA
Sim
NA
Sobrevida Sim e não*
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Sim
Sim
Sim
LADANYI
et al.,
2004
NAITO
et al.,
1998
SCHUMACHER KONDRATIEV NAKANO ZHANG et ISHIGAMI
et al.,2001
et al., 2004 et al.,2001
al., 2003 et al.,2002
REICHERT et
al.,1998
Referência
1-
CD8+
Coloretal
CD8+
ESTE
ESTUDO,
2005
CD25 é um receptor de interleucina 2 (interleu 2).
NA= Dado não avaliado no estudo; SR=sem relação; TIL= Linfócito Intra Tumoral. Todos os casos citados como “sim” significa que foi encontrado
relação com melhor condição clínica, e “não”, sem relação;
* Não houve relação considerando todos os pacientes, mas houve, quando incluído apenas os pacientes de estádio I e IV.
39
Os glicocorticóides em elevadas concentrações desempenham um papel
inibitório sobre a imunidade humoral e celular. Assim, a existência de elevadas
concentrações de glicocorticóides (cortisol), na síndrome de Cushing, além de
reduzir a resposta imunológica, poderia estar relacionada com pior prognóstico
(BERGADA et al., 1996; MICHALKIEWICZ et al., 2004) devido a presença de
hipertensão arterial/crise hipertensiva ou outros efeitos metabólicos.
No
presente
estudo
não
foi
encontrada
diferença
estatisticamente
significativa entre o número de células (baixo ou aumentado) em relação aos casos
com presença (n=10) e ausência de síndrome de Cushing (n=18). Este resultado
pode supostamente ter ocorrido devido ao fato da concentração de corticóide não
estar suficientemente elevada nos pacientes com síndrome de Cushing para alterar
a imunidade celular, ou ainda por este mecanismo não ter um papel importante
neste sistema.
A expressão diminuída da cadeia zeta de CD3 em células T tem sido
identificada em vários tipos de câncer e pode estar relacionada com uma resposta
imunológica inefetiva. ISHIGAMI et al., (2002) estudaram 185 casos de câncer
gástrico, e verificaram que 121 tumores tinham uma expressão normal, enquanto 64
tumores tiveram uma diminuição da cadeia zeta de CD3. Estes autores concluíram
que um menor número de linfócitos intra tumoral estava correlacionado com doença
progressiva, sugerindo que a cadeia zeta de CD3 é um marcador prognóstico
importante em carcinoma gástrico.
Vários clones de linfócitos citotóxicos infiltrando carcinoma de grandes células
de pulmão humano foram isolados por ECHCHAKIR et al., (2000). Os clones foram
pesquisados para fenótipos com expressão de CD3, TCRαβ, CD8, CD4 e CD28.
Clones de linfócitos T citotóxicos estavam seletivamente aumentados no tumor,
quando comparados aos linfócitos sanguíneos periféricos autólogos.
Outros marcadores foram avaliados por imunohistoquímica (cadeias zeta e
Epson de CD3) em linfócitos de 138 amostras de carcinoma oral de células
escamosas (REICHERT et al., 1998). A expressão da cadeia zeta era inversamente
correlacionada com o estádio do tumor. A sobrevida era significantemente menor em
pacientes onde linfócitos T intratumorais CD3 zeta+ estavam ausentes ou
diminuídos. Assim, alterações na expressão de marcadores de células T em tumores
tem sido relatadas em vários outros estudos. Uma diminuição na expressão ou
40
ausência da cadeia zeta, é possível causa para o não funcionamento das células
imunes no sítio tumoral e na circulação periférica de pacientes com doenças
malignas (WHITESIDE; RABINOWICH, 1998).
A partir do conhecimento da relação entre o sistema imunológico e tecido
tumoral obtido por meios de vários marcadores, é possível propor um modelo
simplificado sobre como visualizamos esta integração.
Quando antígenos são apresentados por proteínas CMH (complexo maior de
histocompatibilidade) da classe I por células de TCA, identificados por macrófagos e
linfócitos T citotóxicos, os macrófagos fagocitam estes antígenos quebrando-os em
partes e liberam pequenas porções destes antígenos com 6 a 20 aminoácidos.
A Figura 7 resume o processo de identificação dos antígenos e ativação do
sistema de defesa contra células do TCA. Os pequenos antígenos são apresentados
na superfície do macrófago por proteínas CMH da classe I para linfócitos T
citotóxicos que são ativados, se infiltram no tumor e destroem as células do TCA que
apresentam os antígenos. Da mesma forma, os macrófagos apresentam os
antígenos às células T auxiliares. As células auxiliares, por sua vez, apresentam os
antígenos para os linfócitos B, que produzem anticorpos contra os antígenos de
TCA. O sistema imunológico não reage contra proteína CMH da classe II para
destruir células imunocompetentes (BERNSTEIN et al., 1995; ANTONY; RESTIFO,
2005). Na ilustração da Figura 7, aparecem outros dois mecanismos que podem
contribuir ou impedir a morte da célula do TCA. Um deles é o sistema de destruição
por células Natural Killer (NK), que são ativadas e atacam células de TCA, que
possuem antígenos ligados a anticorpos na sua superfície (CALIGIURI, et al., 1993 e
GLUCK, et al., 2004). O outro mecanismo, também ilustrado na Figura 7, envolve um
processo ativo do tumor contra linfócitos T citotóxicos desenvolvido pelas células
tumorais. O ligante de Fas (FasL) se liga ao Fas expresso em linfócitos T citotóxicos
induzindo a apoptose destas células. O mecanismo de defesa do tumor contra os
linfócitos T ocorre de duas maneiras, diminuindo a expressão de Fas ou aumentando
a expressão de FasL. Este mecanismo tem sido observado em melanoma (HAHNE
et al., 1996), câncer de colon (O’CONNELL et al., 1996), câncer de fígado (STRAND
et al., 1996 e YANO et al., 1996), câncer de pulmão (NIEHANS et al.,1997), câncer
de cérebro (SAAS et al., 1997), carcinoma de ovário (RABINOWICH et al., 1998) e
carcinoma de esôfago (SHIBAKITA et al., 1999). Outros motivos para uma atuação
41
inadequada do sistema imunológico podem ser inerentes ao tumor ou à célula do
sistema imunológico.
Estas falhas podem ser decorrentes da baixa expressão ou redução na
expressão de CMH da classe I (em células tumorais) ou CMH da classe II (células
apresentadoras de antígenos) (GARRIDO; RUIZ-CABELLO, 1991).
A necrose observada nos tumores são resultados de vários fatores que
variam de tumor para tumor, na intensidade e na qualidade dos fatores. Estes
fatores podem ser inerentes ao próprio tumor (ritmo de morte celular, vascularização,
etc), ou externos ao tumor, como o ataque do sistema imunológico. A presença de
células do sistema imunológico no tumor pode ser inespecífica (a partir de uma
simples reação inflamatória), ou pode significar um processo ativado a partir de
antígenos. A separação das duas populações de linfócitos pode ser feita a partir da
localização no tumor. Em geral, admite-se que as células mais distantes da área de
necrose podem estar mais relacionadas ao processo mediado pelos apresentadores
de antígenos. Assim, valorizou-se neste estudo a avaliação deste último mecanismo,
cujos resultados sugerem existir um importante sistema de defesa contra o tumor de
córtex adrenal de crianças.
.
42
43
Diante do que foi observado e interpretado para o TCA e outros tipos de
câncer, existe um papel importante do sistema imunológico contra o câncer que
poderia ser fortalecido com medidas que aumentassem a intensidade de resposta
contra o tumor. As opções que poderiam ser empregadas oferecem oportunidades
para estudos sobre várias modalidades de imunoterapia (KLEBANOFF et al., 2005):
1- Uso de agentes farmacológicos que ativem o sistema imunológico (por exemplo,
interferon, interleucina 2, etc);
2- Tratamento com antígenos do tumor, processo de vacinação (PARMIANI et al.,
2002; YU et al., 2002);
3- Transferência de linfócitos T autólogos ativados (DUMMER et al., 2002);
4- Transferência de células dendríticas (PILON-THOMAS; VERHAEGEN; MULE,
2004).
5- Transferência de células NK (ativadas ex vivo) para combate às metástases
(WHITESIDE; VUJANOVIC; HERBERMAN, 1998).
44
6
CONCLUSÕES
1)
O sistema imunocelular é um sistema de defesa importante contra o
TCA de crianças, entretanto, nos estádios III e IV os pacientes
poderiam se beneficiar com uma complementação terapêutica
através de agentes farmacológicos que garantam uma ativação de
linfócitos T citotóxicos, linfócitos B e células NK, contra os TCAs que
apresentem adequadamente seus antígenos.
2)
Não foi encontrada uma associação estatisticamente significativa
entre a proporção de linfócitos CD8+ ou células CD25+ e a
apresentação clínica ou a evolução das crianças com tumor de
córtex adrenal. Acredita-se que um dos principais motivos foi o
pequeno número de casos analisados.
3)
Existe uma associação estatisticamente significativa entre a
proporção de linfócitos CD8+ ou células CD25+ e o estádio, a
recidiva, e o tamanho do tumor de córtex adrenal em crianças.
45
7.
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55
ANEXOS
ANEXO 1
CARTA DE APROVAÇÃO DO PROJETO PELO COMITÊ DE
ÉTICA EM PESQUISA EM SERES HUMANOS DO
HOSPITAL DE CLÍNICAS DA UFPR........................................ 55
ANEXO 2
CARTA DE APROVAÇÃO DO PROJETO PELO COMITÊ DE
ÉTICA EM PESQUISA EM SERES HUMANOS DO
HOSPITAL PEQUENO PRÍNCIPE............................................ 56
ANEXO 3
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
DO PACIENTE COM TCA........................................................ 57
56
ANEXO 1 – CARTA DE APROVAÇÃO DO PROJETO PELO COMITÊ DE ÉTICA EM
PESQUISA EM SERES HUMANOS DO HOSPITAL DE CLÍNICAS DA UFPR
57
ANEXO 2 – CARTA DE APROVAÇÃO DO PROJETO PELO COMITÊ DE ÉTICA EM
PESQUISA EM SERES HUMANOS DO HOSPITAL PEQUENO PRÍNCIPE
58
ANEXO 3 – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO DO
PACIENTE COM TCA
59
Consentimento para responsáveis
Pesquisa da presença de Linfócitos T em amostras de tecido de parafina
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
RELAÇÃO ENTRE INFILTRAÇÃO DE LINFÓCITOS T COM ESTÁGIO,
TAMANHO, APRESENTAÇÃO CLÍNICA E SOBREVIDA DE TUMORES DE
CÓRTEX ADRENAL EM CRIANÇAS
Este exame visa avaliar a presença de células do sangue dentro do tumor de córtex
adrenal que seu(sua) filho(a) teve.
Este termo de consentimento visa dar informações sobre a pesquisa que será
discutida com você. Assim que entender este estudo, e concordar em participar
dele, será solicitado sua assinatura e você receberá uma cópia dele.
Antes de compreender sobre esta pesquisa, é importante você saber o seguinte:
- Fica inteiramente a seu critério decidir se você deseja participar ou não deste estudo.
- Caso você decida não mais participar deste estudo, ou venha mais tarde a
desistir de continuar neste estudo a criança da sua família que teve/tem o tumor de córtex adrenal não
perderá os benefícios do tratamento médico que recebe do Hospital Pequeno Príncipe.
Qual é o envolvimento deste estudo ?
Apenas utilizaremos material já retirado e excisado, e dados dos prontuários médicos. Não haverá necessidade de
fazer nenhum exame na sua criança.
Nós informaremos ao médico da sua criança sobre os resultados destes testes . Se você desejar ser informado(a)
sobre os resultados deste estudo nós concordaremos em informar e o seu médico irá discutir com você o significado
do teste.
Quais os riscos deste estudo ?
Praticamente não há riscos, visto que usaremos apenas o material que já foi retirados do tumor e os dados clínicos
que estão prontuário da sua criança.
Quais são os benefícios deste estudo ?
Nós não podemos prever se você receberá qualquer benefício por tomar parte deste estudo. Entretanto, a
informação obtida a partir deste estudo poderá nos propiciar um melhor entendimento sobre os tumores da córtex
adrenal em crianças.
Que outras opções existem ?
Você poderá escolher não participar deste estudo.
O que se sabe sobre informação nova ?
Você será informado sobre qualquer informação nova obtida durante o curso desta pesquisa que poderá causar
desistência da continuidade neste estudo. Você tem o direito de saber sobre os resultados deste estudo. Se desejar
saber mais sobre quando e como obter os resultados desta pesquisa você poderá contactar Dr. *XLOKHUPH
60
$XJXVWR3DULVH pelos telefones H Cavalcante de Figueiredo pelo telefone 41-30293204.
ou Dr. Bonald
O que dizer sobre confidencialidade ?
A sua amostra de tumor será codificada. O código e o resultado do teste serão mantidos num arquivo separado.
DECLARAÇÃO DE ENTENDIMENTO
1. Eu li o texto acima e aceito de livre e espontânea vontade que minha criança tome parte neste estudo.
2. Tive a oportunidade de conversar tanto quanto eu quis com o médico Dr. _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
_ _ _ __ _ , que está cuidando da criança da minha família que teve/tem o tumor de córtex adrenal, sobre as
razões deste estudo e sobre seus riscos.
3. Fui informado que dados clínicos meus não serão disponibilizados para qualquer pessoa fora destes hospitais
sem minha permissão.
4. Estou ciente de que quando eu precisar esclarecer mais dúvidas a respeito deste estudo ou sobre injúrias que
acontecerem por conta da coleta de sangue poderei telefonar para Dr. *XLOKHUPH$XJXVWR
ou Dr. Bonald C. Figueiredo
3DULVH pelos telefones H
através do fone 41-30293204 (CEGEMPAC de Curitiba) ou 41-3336-8010 (residência).
5. Sei que poderei obter mais informações sobre os meus direitos como participante deste estudo através do
escritório da Comissão de Ética do Hospital Pequeno Príncipe (41H
e do Hospital de
Clínicas da Universidade Federal do Paraná (41-3601800, 41-360-1839).
6. Receberei uma cópia deste termo de consentimento.
61
DECLARAÇÃO DO VOLUNTÁRIO
Eu li (ou alguém leu para mim) o conteúdo deste formulário de consentimento e fui incentivado a fazer perguntas.
Eu recebi respostas para todas as minhas perguntas. Eu aceito participar desta pesquisa.
Nome:___________________________________
________________________________________
Assinatura do voluntário
_____________________________
Local e data
___________
Hora
DECLARAÇÃO DO MÉDICO/PESQUISADOR OU DE PESSOA DESIGNADA PELO MÉDICO
RESPONSÁVEL
Eu, abaixo assinado, certifico que discuti o projeto de pesquisa com o voluntário adulto acima referido. Expliquei
todas as informações apresentadas neste termo de consentimento, incluindo sobre quaisquer riscos que podem
ocorrer. Ainda declaro que fui incentivado a fazer perguntas sobre este estudo.
Nome: ________________________________
______________________________________
Médico/pesquisador ou designado
___________________________
Local e data
______________
Hora
DECLARAÇÃO DA TESTEMUNHA
Eu acompanhei o processo de consentimento informado e certifico que a pesquisa, o tratamento, riscos, benefícios
e outras opções de tratamento foram apresentadas ao voluntário acima citado.
Nome: ________________________________
______________________________________
Testemunha
___________________________
Local e data
______________
Hora
Em caso de perguntas ou emergências com referência a este protocolo, por favor, contatar
diretamente: Serviço de Hematologia e Oncologia-Hospital Pequeno Príncipe-Rua
Desembargador. Mota,1070, CEP 80250-060-Água Verde-Curitiba-PRou CEGEMPAC, Rua
Agostinho Leão Júnior, 400, Alto da Glória, Curitiba, PR, 80.060-240.