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Daniella Inácio Barros 2
Riselane de Lucena Alcântara Bruno 3
Helber Véras Nunes 2
Maria Carmen Bhering 4
RESUMO
As sementes de mangaba apresentam rápida perda da viabilidade pelo fato de
suas sementes serem recalcitrantes e possuírem germinação relativamente lenta, tornandose necessário o desenvolvimento de testes que permitam a obtenção rápida e confiável de
informações sobre o potencial de germinação. Esta pesquisa foi executada com o objetivo
de desenvolver metodologia apropriada para o uso do teste de tetrazólio em sementes
de mangaba. Estudou-se inicialmente os seguintes métodos de pré-condicionamento:
semente imersa diretamente na solução de tetrazólio (testemunha); embebição em papel
toalha umedecido a 25°C por 16 e 24 horas; imersão direta em água a 40°C por 2 e 4
horas com e sem retirada do tegumento; corte longitudinal deixando o embrião exposto;
corte na extremidade superior lateral com e sem imersão em água a 25°C por 4 e 8 horas;
três cortes na semente, dois laterais e um na parte superior oposta ao eixo embrionário
para remoção do embrião com e sem imersão em água e perfuração em área superior.
Em todos os métodos testados as sementes foram colocadas em solução de 2,3,5 trifenil
cloreto de tetrazólio, para coloração, nas concentrações de 0,05; 0,075; e 0,1% por 30,
60, 90 e 120 minutos, em BOD a 40°C. O teste de tetrazólio pode ser utilizado para
avaliar com rapidez a viabilidade das sementes de mangaba; para a condução do teste, as
sementes devem ser seccionadas com três cortes no tegumento para a retirada do embrião
e imersas na solução de tetrazólio a 0,075%, por 60 a 90 minutos em BOD a 40°C, para o
desenvolvimento da coloração ideal.
Termos para indexação: Pré-condicionamento, concentração da solução,
período de coloração.
1
Parte da tese de doutorado do primeiro autor.
Professor Dr. Efetivo do IFMA-Campus Codó. [email protected]; [email protected]
Prof. Dr. Adjunto do Programa de Pós-Graduação em Agronomia, Depto. de Fitotecnia, CCA/UFPB, AreiaPB, Bolsista CNPq. [email protected]
4
Pesquisadora MSc. Depto. de Fitotecnia, UFV, Viçosa-MG, [email protected]
2
3
AGRONOMIA
TESTE DE TETRAZÓLIO EM SEMENTES DE MANGABA
(Hancornia speciosa Gomes)
Revista ACTA Tecnológica - Revista Científica - ISSN 1982-422X , Vol. 5, número 2, jul-dez. 2010
TETRAZOLIUM TEST FOR SEEDS MANGABA
(Hancornia speciosa Gomes)
ABSTRACT
Mangaba seeds present fast viability loss because the seeds are recalcitrant and
possess relatively slow germination. So, the development of tests which allow a fast and
trustworthy information attainment on germination potential becomes necessary. This
research was executed aiming to develop appropriate methodology for the tetrazolium
test use in mangaba seeds. The following pre-conditioning methods were initially studied:
immersed seed directly in the tetrazolium solution (witness); imbibition in humidified
paper towel at 25°C for 16 and 24 hours; direct immersion in water at 40°C for 2 and
4 hours with and without tegument withdrawal; longitudinal cut leaving the displayed
embryo; cut in the extremity lateral superior with and without immersion in water at 25°C
for 4 and 8 hours; three cuts in the seed, two laterals and one in the opposing superior part
to the embryonic axle for removal of the embryo with and without immersion in water
and perforation in superior area. In all of the tested methods, the seeds had been placed
in solution of 2,3,5 triphenyl chloride of tetrazolium, for coloration, in concentrations of
0,05; 0,075; and 0.1% for 30, 60, 90 and 120 minutes, in 40 BOD°C. The tetrazolium
test can be used to evaluate quickly mangaba seeds viability. The most efficient preconditioning method is the mangaba seeds embryo withdrawal through three cuts; then,
they are immersed in tetrazolium solution at 0,075% for 60 to 90 minutes in 40 BOD°C,
for the ideal coloration development.
Index terms: Pre-conditioning, solution concentration, coloration period.
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TESTE DE TETRAZÓLIO EM SEMENTES DE MANGABA (Hancornia speciosa Gomes)
INTRODUÇÃO
O Nordeste Brasileiro vem se destacando pelo grande número de empresas
de processamento de polpa de frutas, as quais tem encontrado extrema dificuldade
na obtenção de matéria-prima que garanta seu funcionamento o ano todo. Dentre as
mais variadas espécies vegetais que são utilizadas para extração de polpa, ressaltase a mangabeira (Hancornia speciosa Gomes), árvore frutífera, nativa do Brasil, da
família das Apocináceas (Nogueira et al., 2003). A mangabeira encontra-se vegetando
espontaneamente nas regiões Sudeste, Norte, Centro-Oeste e Nordeste, com abundância
nas áreas de tabuleiros costeiros e baixadas litorâneas da região Nordeste (Ferreira, 1980;
Gonzaga Neto et al., 1987).
Seu fruto é bastante apreciado por apresentar boa digestibilidade e alto valor
nutritivo, com teor de proteína (1,3 a 3,0%) superior ao da maioria das frutíferas (Pinheiro
et al., 2001). Sua propagação pode ser via assexuada, mediante o uso de parte vegetal e
sexuada, através da semente, sendo esta o meio mais comumente utilizado.
À semelhança de muitas fruteiras nativas, ainda são poucos os conhecimentos
capazes de contribuir para um maior desenvolvimento da cultura. Dentre os inúmeros
problemas existentes com esta espécie, pode-se destacar a rápida perda da viabilidade pelo
fato de suas sementes serem recalcitrantes, o que impõe que a semeadura seja realizada
logo após a remoção das sementes dos frutos (Villachica, 1996) e a ação inibitória da
polpa do fruto sobre a germinação das sementes (Tavares, 1960; Grigoletto, 1997).
O teste de germinação é completado somente após algumas semanas, de
maneira que, dependendo principalmente das condições em que forem armazenadas as
sementes, o resultado obtido ao final do teste pode já não mais representar a sua real
capacidade de germinação (Nascimento et al., 1997).
A análise de sementes é um instrumento essencial no controle da qualidade das
sementes produzidas e/ou da avaliação da tecnologia de produção empregada (Andrade
et al., 1996). A sua principal finalidade é determinar o valor de cada amostra para fins
de semeadura ou armazenamento. Porém, para a expressão da qualidade de um lote de
sementes é preciso pessoal técnico treinado, padronização de metodologia, procedimentos
uniformes e programa de trabalho voltado para a aferição e aperfeiçoamento das técnicas
empregadas (Figliolia et al., 1993).
Camargo (1997) ressalta a importância do desenvolvimento de testes rápidos
para avaliação da viabilidade das sementes, principalmente para aquelas que apresentam
baixa capacidade de armazenamento e germinação lenta, onde o teste de germinação
apresenta grandes limitações. Uma das alternativas seria o uso do teste de tetrazólio
onde vem sendo usado principalmente devido à rapidez na estimativa do potencial de
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Revista ACTA Tecnológica - Revista Científica - ISSN 1982-422X , Vol. 5, número 2, jul-dez. 2010
germinação das sementes (Botezelli, 1998).
Pela rapidez e precisão na determinação da viabilidade e do vigor, o teste de
tetrazólio tem sido usado por diversas espécies, tais como: soja - Glycine max (França Neto
et al., 1999), feijão - Phaseolus vulgaris (Bhering et al., 1999), milho - Zea mays (Dias
e Barros, 1999), abóbora - Cucurbita moschata e abobrinha - Cucurbita pepo (Barros,
2002), melancia - Citrullus lunatus (Bhering et al., 2005), amendoim - Arachis hypogaea
(Bittencourt e Vieira, 1999), café - Coffea arabica (Araújo et al., 1997 e Vieira et al.,
1998), algodão - Gossypium hirsutum (Vieira e Von Pinho, 1999), braquiária - Brachiaria
brizantha (Dias e Alves, 2001), jenipapo - Genipa americana (Nascimento e Carvalho,
1998), maracujá-doce - Passiflora alata (Malavasi et al., 2001), girassol - Helianthus
annus (Fontinélli e Bruno, 1997) e pupunha - Bactris gasipaes (Ferreira e Sader, 1987).
Conforme Rodrigues e Santos (1998), o teste de tetrazólio não é muito difundido
entre espécies perenes, como florestais e frutíferas, embora apresente excelentes condições
para ser utilizado rotineiramente, uma vez que muitas dessas espécies necessitam de
um longo período para germinarem. Em vista dessa situação, tem sido desenvolvidas
pesquisas com sementes de Jenipapo procurando abreviar o prazo requerido para a
obtenção dos resultados de viabilidade, a partir da padronização do teste de tetrazólio
(Nascimento e Carvalho, 1998).
Diante da inexistência de informações sobre a avaliação rápida da viabilidade
de sementes de mangaba, esta pesquisa foi executada com o objetivo de desenvolver
metodologia apropriada para o uso do teste de tetrazólio em sementes dessa espécie.
MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi conduzido no Laboratório de Análise de Sementes da Universidade
Federal da Paraíba em Areia-PB. Foram utilizados frutos de mangaba provenientes
da Estação Experimental de Mangabeira pertencente a Emepa - Empresa Estadual de
Pesquisa Agropecuária da Paraíba localizada em João Pessoa - PB. As sementes foram
retiradas de frutos maduros (Figura 1) selecionados logo após caírem ao solo, lavadas até
a completa retirada da polpa, espalhadas sobre papel toalha, secas à sombra por 24 horas
permanecendo em geladeira durante o período do ensaio.
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TESTE DE TETRAZÓLIO EM SEMENTES DE MANGABA (Hancornia speciosa Gomes)
Figura 1. Fruto de mangaba.
Para a avaliação da viabilidade das sementes, pelo teste de tetrazólio, foram
realizados testes preliminares visando determinar o método de pré-condicionamento,
concentração da solução de tetrazólio e o período de tempo necessário para se obter
coloração requerida para avaliação das sementes de mangaba.
As sementes foram submetidas aos seguintes métodos de pré-condicionamento:
semente imersa diretamente na solução de tetrazólio nas concentrações de 0,075; 0,5
e 0,1% (testemunha); embebição em papel toalha umedecido com quantidade de água
equivalente a 2,5 vezes o peso do papel seco em germinador a 25°C por 16 e 24 horas;
imersão direta em água a 40°C por 2 e 4 horas com e sem retirada do tegumento; corte
longitudinal paralelo aos cotilédones deixando o embrião exposto (Figura 2 A); corte na
extremidade superior lateral da semente com e sem imersão em água a 25°C por 4 e 8
horas (Figura 2 B); três cortes na semente, dois laterais e um na parte superior oposta ao
eixo embrionário para remoção do embrião com e sem imersão em água (Figura 2 C);
perfuração na área superior não crítica da semente (Figura 2 D). As sementes tiveram
seus embriões removidos manualmente com o auxílio de um estilete, de tal forma que
fossem evitados danos em suas estruturas. Em todos os pré-condicionamentos testados
as sementes foram colocadas em solução de 2,3,5 trifenil cloreto de tetrazólio, para
coloração, nas concentrações de 0,075; 0,5 e 0,1% durante 30, 60, 90 e 120 minutos, no
escuro em BOD a 40°C. Após cada período, os embriões foram lavados em água corrente
e mantidos submersos em água até o momento da avaliação.
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Revista ACTA Tecnológica - Revista Científica - ISSN 1982-422X , Vol. 5, número 2, jul-dez. 2010
Figura 2. Métodos de pré-condicionamento das sementes de mangaba para o
teste de tetrazólio: A - corte longitudinal paralelo aos cotilédones; B - corte na extremidade
superior lateral da semente; C - três cortes na semente, dois laterais e um na parte superior
oposta ao eixo embrionário; D - perfuração em área superior não crítica da semente.
Os embriões foram analisados individualmente, externa e internamente, após
o seccionamento longitudinal entre os cotilédones, observando-se a ocorrência de danos
nas faces interna e externa dos cotilédones e do eixo embrionário, verificando-se ainda a
profundidade de cada dano e a sua distância em relação a áreas vitais. Nas sementes de
mangaba, as áreas vitais incluem o eixo hipocótilo-radícula e a região de inserção entre
os cotilédones e o eixo.
A diferenciação de cores dos tecidos foi observada de acordo com os critérios
estabelecidos por Moore (1985), ou seja, vermelho brilhante ou rosa brilhante (tecido
vivo e vigoroso), vermelho carmim forte (tecido em deterioração) e branco leitoso ou
amarelado (tecido morto). A interpretação foi feita com auxílio de lupa de seis aumentos
(6x), com iluminação fluorescente.
Definida a metodologia mais adequada para o pré-condicionamento,
concentração da solução e coloração das sementes, esta foi aplicada, repetindo-a
diversas vezes para a caracterização correta das principais alterações e sua associação
com a viabilidade das sementes. A eficiência do teste de tetrazólio na determinação da
viabilidade das sementes de mangaba foi avaliada através da comparação dos resultados
de tetrazólio e germinação, para tanto de cada lote eram retiradas amostras de 200
sementes divididas em duas subamostras de 100, apresentando coerência com os valores
obtidos para plântulas normais e anormais e sementes mortas nos testes de germinação.
Dessa forma, as classes de viabilidade foram estabelecidas, sendo assim cada semente foi
classificada em viável e inviável conforme coloração dos tecidos do embrião, presença e
localização dos danos.
O teste de germinação foi conduzido utilizando-se quatro repetições de 25
sementes, que antes do início do teste foram tratadas com fungicida Benomil - 500
na concentração de 1,0g/kg de sementes, em seguida distribuídas em folhas de papel
“germitest”, umedecidas com água destilada numa quantidade equivalente a 2,5 vezes
o peso do substrato seco (Brasil, 1992), sendo os rolos confeccionados e mantidos em
germinador a 28oC por 30 dias.
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TESTE DE TETRAZÓLIO EM SEMENTES DE MANGABA (Hancornia speciosa Gomes)
Para o teste de tetrazólio foram utilizadas quatro repetições de 25 sementes,
colocadas em copo plástico de 50mL, adicionando-se a este a solução de tetrazólio em
quantidade suficiente para cobrí-las, em BOD a 40°C sob escuro.
Utilizou-se o delineamento experimental inteiramente casualizado com
quatro repetições. Calcularam-se os coeficientes de correlação simples de Pearson (r)
entre os testes de tetrazólio viabilidade e germinação. A significância dos valores de r foi
determinada pelo teste t, a 1 e 5% de probabilidade.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Dentre os métodos de pré-condicionamento testados em sementes de mangaba,
verificou-se que as sementes imersas diretamente na solução de tetrazólio (testemunha), as
embebidas em papel toalha umedecido por 16 e 24 horas e as perfuradas na área superior,
todas sem a retirada do tegumento, não coloriram. Esta ausência de coloração pode ser
decorrente da presença do tegumento, que dificultou a penetração da solução de tetrazólio
para o interior da semente. Resultados semelhantes foram obtidos por Zucarelli et al.
(1999) e Gonzalez et al. (1997), com sementes de sucará (Gledistchia amorphoides) e
quiabo (Hibiscus esculentus) respectivamente, submetidas ao teste de tetrazólio, as quais
apresentaram ausência de coloração, independentemente da concentração da solução e do
tempo de coloração. Os autores atribuíram esses resultados ao tegumento impermeável,
que impediu a penetração da solução de tetrazólio.
As sementes de mangaba que foram cortadas na extremidade superior lateral
com e sem imersão em água a 25°C por 4 e 8 horas, só coloriram no local onde foi
feito o corte. Esta situação ocorreu em trabalho realizado por Mendonça et al. (2001)
com sementes de louro-pardo (Cordia trichotoma), onde mesmo após o maior período
de exposição e maior concentração, apenas houve coloração dos tecidos no local do
ferimento.
Para as sementes imersas diretamente em água a 40°C por 2 e 4 horas, com
retirada do tegumento observou-se que estas desenvolveram coloração nos dois períodos
estudados. Ao contrário, em sementes com a presença do tegumento não houve coloração
do embrião devido à dificuldade de penetração da solução de tetrazólio para o interior da
semente. De acordo com Costa (1992), é importante ressaltar que a imersão direta das
sementes em água não deve ser feita por período de tempo excessivo, pois pode acarretar
redução na disponibilidade de O2 comprometendo dessa forma, a qualidade das sementes
e conseqüentemente, levando a obtenção de resultados incorretos.
Nas sementes seccionadas longitudinalmente com descarte de uma metade a
coloração ocorreu apenas superficialmente na parte externa do embrião, demorando cerca
de 7 horas, portanto, não se mostrando um método adequado de pré-condicionamento.
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Revista ACTA Tecnológica - Revista Científica - ISSN 1982-422X , Vol. 5, número 2, jul-dez. 2010
As sementes de mangaba com três cortes (dois laterais e um na parte superior
oposta ao eixo) com e sem imersão em água, verificou-se que estes facilitaram a retirada
do embrião sem causar dano e que ambos foram eficientes apresentando o mesmo
comportamento, coloração adequada e uniforme. Todavia, considerando que métodos
mais demorados implicam em maior tempo necessário para a condução do teste e
obtenção dos resultados, o método de pré-condicionamento mais indicado, por permitir
o desenvolvimento de coloração adequada, uniforme e com maior rapidez foi o que as
sementes sofreram três cortes sem imersão em água. De acordo com Delouche et al.
(1976), o pré-condicionamento feito de maneira adequada permite que, após a imersão
das sementes na solução de tetrazólio, ocorra o desenvolvimento da coloração ideal,
facilitando a interpretação do teste.
As concentrações da solução de tetrazólio usadas neste ensaio proporcionaram
variações de tonalidades nos embriões de mangaba. As de 0,5 e 0,075% desenvolveram
coloração semelhante, onde os tecidos viáveis coloriram-se mais uniformemente
obtendo coerência com as recomendações de Moore (1985). Todavia, é mais indicado
o uso rotineiro de solução a 0,075%, considerando que o sal de tetrazólio é um produto
caro e que a 0,5% requer maior consumo deste sal. Concordando, dessa forma, com os
resultados obtidos para algumas espécies como soja, algodão, amendoim, milho, feijão e
café os quais tem indicado o uso de solução a 0,075%, permitindo o desenvolvimento de
coloração ideal tanto nos tecidos vigorosos como nos não vigorosos (Barros, 2002).
O uso da solução de tetrazólio a 0,1% não se mostrou adequado, uma vez
que os tecidos vigorosos ao invés de róseo apresentaram-se vermelho um pouco
menos intenso que a tonalidade de vermelho observada nos tecidos com lesões, o que
dificultou a observação dos danos, devido a proximidade da intensidade da coloração
vermelho desenvolvido especialmente nas regiões vitais do embrião, comprometendo sua
interpretação. Bhering et al. (2005), obtiveram resultados semelhantes para o teste de
tetrazólio em sementes de melancia (Citrullus lunatus), onde a concentração da solução a
0,1% não se mostrou adequada e a de 0,075% permitiu uma avaliação mais segura devido
aos padrões de coloração mais uniformes.
Com relação ao período de coloração, verificou-se que a coloração mais
adequada foi obtida quando as sementes foram imersas em solução de tetrazólio a 0,075%
por 60 a 90 minutos a 40°C, no escuro.
Definida a metodologia de pré-condicionamento, concentração da solução
e coloração, estabeleceu-se classes de níveis de viabilidade, onde cada semente
de mangaba avaliada foi qualificada em uma das classes (Figura 3), com base nas
observações de intensidade de coloração, profundidade e localização dos danos. Para
auxiliar no estabelecimento destas classes, foram considerados também os resultados
da porcentagem de germinação das plântulas obtidas no teste de germinação (Figura 4)
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TESTE DE TETRAZÓLIO EM SEMENTES DE MANGABA (Hancornia speciosa Gomes)
conduzido paralelamente ao teste de tetrazólio.
Cada foto representa uma semente de mangaba que foi seccionada
longitudinalmente. A superfície externa da semente é ilustrada à esquerda e a interna à
direita.
Classe 1. Sementes viáveis: coloração uniforme rosa brilhante, apresentando
tecido com aspecto normal e firme.
Classe 2. Sementes viáveis: semelhante a anterior só que com pequenas
manchas superficiais avermelhadas na face interna dos cotilédones. Pequena lesão
superficial na face externa do eixo embrionário.
Classe 3. Sementes viáveis: apresentam coloração branco leitoso em menos de
50% dos cotilédones, identificando tecido em deterioração. Extremidade da radícula com
coloração vermelha intenso.
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Revista ACTA Tecnológica - Revista Científica - ISSN 1982-422X , Vol. 5, número 2, jul-dez. 2010
Classe 4. Sementes inviáveis: ambos os cotilédones com a metade superior
branco leitoso.
Classe 5. Sementes inviáveis: Eixo embrionário completamente vermelho
carmim intenso.
Classe 6. Sementes inviáveis: totalmente branca e vermelho intenso,
apresentando tecidos flácidos, caracterizando tecido morto.
mangaba.
26
Figura 3. Classes para a determinação da viabilidade de sementes de
TESTE DE TETRAZÓLIO EM SEMENTES DE MANGABA (Hancornia speciosa Gomes)
Figura 4. Plântulas de mangaba normais (A) e anormais (B).
O valor do coeficiente de correlação obtido entre os resultados dos testes
encontra-se na Figura 5. Verificou-se que houve correlação positiva e significativa (r=
0,77) entre o teste de germinação e tetrazólio viabilidade. Esses resultados concordam
com Pasha e Das (1982), quando consideraram o teste de tetrazólio seguro, confiável e
apropriado para determinar o potencial de germinação de lotes de sementes de soja.
100
Germinação (%)
80
60
ŷ= 8,501 + 0,8812**x
r = 0,77
40
20
0
40
60
80
100
Tetrazólio viabilidade (%)
Figura 5. Correlação entre os valores de germinação e tetrazólio viabilidade em sementes
de mangaba.
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CONCLUSÕES
- O teste de tetrazólio pode ser utilizado para avaliar com rapidez a viabilidade
das sementes de mangaba;
- Para a condução do teste, as sementes devem ser seccionadas com três cortes
no tegumento para a retirada do embrião e imersas na solução de tetrazólio a 0,075%, por
60 a 90 minutos em BOD a 40°C, para o desenvolvimento da coloração ideal.
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