Placa de Hemaglutinação

Rio de Janeiro, 16 de Novembro de 2011
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Disciplina: BMW130- Tópicos Básicos em Bacteriologia e Virologia
Aula Prática I
Profa Mônica Santos de Freitas
ENSAIO DE HEMAGLUTINAÇÃO
O ensaio de placa de hemaglutinação baseia-se na propriedade que determinados
tipos de vírus possuem de se ligar aos resíduos de ácido siálico na superfície da
hemácia. Quando os vírus ligam-se as hemácias, promovem a sua hemaglutinação
formando uma espécie de rede. Quando não se ligam, as hemácias precipitam.
Protocolo:
1. Colocar no fluxo lamelar placas de 96 poços de fundo em U, pipetas, ponteiras,
descarte, tampão PBS;
2. Ligar o UV e deixar esterilizando por 30 min;
3. Pipetar 50 uL de tampão PBS em cada poço da placa;
4. Adicionar 50 uL da amotra à cada posso por meio de diluição seriada;
5. Adicionar sangue diluído em albumina 0,3% (com hematócrito a 1%) em todos
os poços;
6. Incubar por 40 min e ver o resultado;
O controle positivo será conduzido pela utilização de lectina de soja. O controle
negativo será conduzido pela utilização de PBS.
ENSAIO DE NEURAMINIDASE
O ensaio de neuraminidase baseia-se na propriedade que esta enzima possui de
clivar ligações de ácidos siálicos. O método é fluorimétrico, onde o 2,-(4metilumbeliferil)-α-D-N-ácido N-acetilneuramínico (MUNANA) é o substrato da
reação. A neuraminidase cliva esse composto gerando dois produtos: o ácido nacetilneuramínico (NANA) e 4-metilumbeliferil (MU), sendo o último fluorescente.
Utiliza-se placa fosca de 96 poços de fundo plano.
Figura 1. Desenho esquemático do ensaio de neuraminidase.
Protocolo:
1 – Pipetar 5µL de tampão MES nos poços.
2 – Adicionar 5µL da amostra nos poços, e adicionar 10 µL nos poços onde só terão
MUNANA.
3 – Colocar a placa em ambiente umidecido a 37ºC por 30 min.
4 – Retira a placa da estufa e adiciona o MUNANA (15 µL), e leva novamente para a
estufa e deixa por 1h.
5 – Ler a placa no leitor de placas. Comprimento de onda: Ex: 365/Em:455