UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC: CNPq, CNPq/AF, UFPA, UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PARD, PIAD, PIBIT, PADRC E FAPESPA RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO Período: 08/2014 a 07/2015 ( ) PARCIAL (X) FINAL IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO Título do Projeto de Pesquisa: Estudo da Correlação de Marcadores Imunológicos, Genéticos e de Estresse Oxidativo com a apresentação Clínica da Hepatite B Crônica. Nome do Orientador: Rosimar Neris Martins Feitosa Titulação do Orientador: Doutor Instituto/Núcleo: Instituto de Ciências Biológicas Laboratório: Laboratório de Virologia Título do Plano de Trabalho: Avaliação de marcadores imunológicos e genéticos (IFN-gama e TGF-beta) em pacientes com infecção crônica pelo Vírus da hepatite B. Nome do Bolsista: Michel dos Santos Costa Tipo de Bolsa: (x) PIBIC/ FAPESPA 1. INTRODUÇÃO O Vírus da hepatite B (VHB) pertence à família Hepadnaviridae, do gênero Orthohepadnavirus, no qual se encontram outros membros que compartilham características estruturais e funcionais (Ganem & Schneider, 2001; Mason et al., 2005). A hepatite B continua sendo um grande problema de saúde pública, haja vista a existência de evidência sorológica de infecção passada em cerca de dois bilhões de indivíduos no mundo, sendo que destes, 350 milhões permanecem cronicamente infectados (WHO, 2007). O VHB é classificado em genótipos, os quais diferem entre si através de mudanças, de no mínimo 8%, nas sequências nucleotídicas (Locarnini, 2004; Schaefer, 2007). Reconhece-se oito genótipos diferentes, denominados de A a H, além de numerosos subgenótipos (Schaefer, 2007). O genótipo A é dividido em cinco subgenótipos, A1(Aa), A2(Ae), A3, A4 e A5, assim como os genótipos B, C e D. Os subgenótipos do F são F1 a F4, e ainda não foram descritas subclassificações para os genótipos E, G e H (Schaefer, 2007). O VHB é transmitido mediante a exposição percutânea e das membranas mucosas ao sangue e fluidos corpóreos contaminados, entre eles o soro, sêmen e saliva. A presença do HBeAg no soro se correlaciona com altas cargas virais, facilitando a transmissibilidade do vírus. Reconhece-se como vias de transmissão a percutânea/parenteral, a sexual, a vertical e a horizontal (Alter, 2013). Durante a fase crônica, o VHB poderá ser responsável por quadros de hipoplasia medular, e na doença hepática terminal, em razão da própria hipertensão portal com hiperesplenismo, ocorre a pancitopenia (Ferraz, 2010). Nas fases iniciais da infecção pelo VHB, há prejuízo da ação da imunidade inata do hospedeiro. Este fato pode ser explicado pela dificuldade do reconhecimento das proteínas virais pelo sistema imunológico, pelo processo de tradução do pgRNA se realizar no interior do nucleocapsídeo e pela não expressão de genes regulatórios pela célula hospedeira quando infectada pelo VHB (Wieland et al., 2004). Portanto, estes fatores funcionam como escapes do sistema imune que é altamente sensível à produção de mRNA virais (Hui & Lau, 2005). Mesmo assim, reconhece-se a participação da imunidade natural com a produção de interferon (INF) tipo 1, α / β, pelas células infectadas e a ativação de células natural killers (NK) e células T natural killers (NKT) pelo INF-γ. O INF-α / β direciona o alvo da resposta para os produtos de replicação viral, enquanto que as células NK são ativadas pelo reconhecimento de moléculas indutoras de stress celular ou modulação do MHC classe I nas células infectadas (Bertoletti & Gerhing, 2006). Yuen et al. (2007), pesquisando as diferentes respostas de LTh durante a hepatite crônica, onde HBeAg é positivo em indivíduos asiáticos, observaram que os infectados com o genótipo B possuíam maior secreção de INF-γ e maior chance de soroconversão. Na fase crônica, demonstra-se o importante papel do fator de transformação do crescimento celular beta 1 (TGF-β1) na indução da fibrogênese hepática. Esta citocina está envolvida na síntese e deposição dos componentes da matrix extracelular, como a fibronectina, o colágeno tipo I, III e IV, a elastina, a osteonectina, os bioglicanos, por meio das células estreladas ativadas. Tem sido demonstrado que os níveis de RNAm para TGF-β1 e procolágeno I estão altamente relacionados com o grau de fibrose encontrada nas biópsias hepáticas de modelos animais portadores de hepatite crônica (Kanzler et al., 1999). Em todas as fases da resposta imune, seja inata ou adaptativa, o papel das citocinas é fundamental. Sua secreção surge em resposta a antígenos variados estimulando o desenvolvimento da imunidade e da inflamação. Entre as suas funções, destaca-se o estímulo para a diferenciação e crescimento de linfócitos, ativação de diferentes células efetoras para eliminação de antígenos e estimulação do crescimento das células hematopoiéticas (Abbas & Lichtmann, 2007). No contexto da infecção pelo VHB, INF-γ e TGF-β1 exercem também um papel de destaque. 2. JUSTIFICATIVA Tem sido sugerido que um aumento da apoptose de células T durante a infecção pelo VHB é a causa de prejuízo na regulação da resposta imunitária celular, ajudando a manter a infecção. Assim, o interesse em descobrir os prováveis mecanismos pelos quais o VHB se perpetua no fígado, e para determinar as condições que predispõem para a progressão da doença, faz a investigação da expressão de genes de citocinas em tecido hepático de grande interesse. São necessários estudos detalhados avaliando indicadores virais e do hospedeiro para o risco de resistência e a identificação de fatores do hospedeiro que prevêem para o risco de progressão da fibrose deve ser uma prioridade. Assim como estudos de determinantes genéticos de risco do hospedeiro para a evolução para quadros de carcinoma hepatocelular também são necessários. 3. OBJETIVOS: 3.1 Objetivo geral: Avaliar a expressão dos genes de IFN-gama e TGF-beta em pacientes cronicamente infectados pelo Vírus da hepatite B, buscando identificar possíveis marcadores imunogenéticos associados à infecção por este agente. 3.2 Objetivos específicos: Correlacionar a quantificação da expressão dos genes de IFN-gama e TGFbeta com a apresentação clínica da infecção crônica pelo VHB e demais causas; Comparar a expressão dos genes de IFN-gama e TGF-beta no tecido hepático de portadores de hepatite crônica pelo VHB com outras hepatites crônicas de causas viral e ainda as não virais; Buscar associação entre a quantificação da expressão dos genes de IFNgama e TGF-beta, com os níveis séricos das alaninas aminotransferases (ALT/AST) e Gamma-glutamyl transferase (GGT). 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Aspectos éticos A pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa via Plataforma Brasil, conforme os preceitos da Declaração de Helsinque e do Código de Nuremberg e respeitadas as Normas de Pesquisa Envolvendo Seres Humanos (Res. CNS 196/96 e complementares), do Conselho Nacional de Saúde. Os pacientes selecionados para a pesquisa e que aceitaram participar foram informados sobre os objetivos da pesquisa e assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE). 4.2 4.2.1 População Investigada e Coleta das Amostras Caracterização das amostras e População do estudo Trata-se de um estudo do tipo transversal e analítico, realizado no Laboratório de Análises Clínicas do Hospital Universitário João Barros Barreto, onde foram selecionados casos consecutivos de pacientes portadores crônicos do VHB e com outras doenças hepáticas crônicas, incluindo a doença hepática não-alcoólica (DHGNA), hepatite autoimune, cirrose biliar primária, entre outras. Posteriormente devido à retirada pelo Ministério da Saúde da obrigatoriedade de realização da biópsia pelos portadores crônicos do VHB para início do tratamento, o que ocasionou dificuldades para a obtenção de amostras deste grupo, optou-se por coletar também amostras de pacientes portadores crônicos do VHC na tentativa de aumentar o tamanho amostral. Todos os pacientes selecionados foram avaliados clinicamente e submetidos à investigação complementar que constou de exames hematológicos, bioquímicos, sorológicos, virológicos, ultrassonográficos e endoscópicos, além da biópsia hepática, sendo estes dados transcritos dos prontuários para o protocolo de pesquisa específico. Sendo estimada a coleta de amostra de 50 pacientes, os quais foram divididos nos grupos a seguir: a) Grupo 1 – portadores de hepatite B crônica, caracterizados por alterações clínicas e dos testes hepáticos, HBsAg positivo, HBeAg positivo ou negativo; b) Grupo 2 - Portadores de hepatite C crônica, caracterizados por sorologia anti-VHC positiva e detecção de RNA-viral; c) Grupo 3 – portadores de doença hepática crônica não viral, incluindo a doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA), a hepatite autoimune, a cirrose biliar primária, entre outras, caracterizados por alterações clínicas e dos testes hepáticos. d) Grupo 4 – indivíduos submetidos à colecistectomia biliar convencional, sem alterações hepáticas necro-inflamatórias, que servirão como controles normais. 4.2.2 Critérios de inclusão e exclusão Os pacientes investigados foram incluídos, atendendo a faixa etária igual ou acima de 18 anos, de ambos os gêneros, com sorologia positiva para o anti-VHC e detecção de RNA viral; portadores de HBsAg por mais de 6 meses, que possuíam ou não persistência de alaninoaminotransferase elevada e que não estavam fazendo terapia antiviral. Sendo excluídos da pesquisa indivíduos que não atendiam os requisitos estipulados acima e aqueles pacientes co-infectados pelo VHD e/ou HIV e pacientes que utilizaram ou estavam em uso de terapia antiviral específica contra VHB. 4.3 Procedimentos laboratoriais A análise da expressão dos genes estudados foi realizada no Laboratório de Virologia do Instituto de Ciências Biológicas da UFPA. 4.3.1 Extração de DNA Para a conservação do RNA, foram acrescentados 1.200 UL de RNAlater® Tissue Collection ao fragmento de tecido hepático, de acordo com o protocolo do fabricante (Applied Biosystems, USA). A extração de RNA foi realizada usando-se o kit Norgen Biotek Corporation e, seguiu a seguintes etapas de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. 4.3.2 Transcrição Reversa (cDNA) Após a extração, o RNA obtido foi quantificado através de leitura em espectrofotômetro Qubit® 2.0 Fluorometer, utilizando-se o Qubit™ RNA Assay Kits de acordo com o protocolo do fabricante. Para cada amostra foi feito o ajuste da concentração e mantido a -80 ºC até o momento da transcrição. As amostras de RNA foram transcritas em DNA complementar, utilizando-se o kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription kits (sem inibidor), de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante (Applied Biosystems, USA). 4.3.3 Quantificação da expressão dos genes IFN-gama e TGF-beta por PCR em Tempo Real As reações para quantificação da expressão dos genes foram realizadas em placas de 96 poços, utilizando os reagentes TaqManTM (Applied Biosystems, USA) e o equipamento Step One Plus (Applied Biosystems, USA). As sondas referentes aos genes-alvo e ao controle endógeno que foram utilizadas no experimento são: para o IFN-gama: Hs00989291_m1 e para o TGF-beta: Hs00171257_m1. A quantificação relativa dos genes alvos e o cálculo do intervalo de confiança foram realizados utilizando o método CT Comparativo (ΔΔCT), método utilizado para quantificação relativa da comparação do limiar da fase exponencial (threshold), sem recurso a curvas padrão. 4.3.4 Quantificação do DNA do VHB e RNA do VHC Os valores de Quantificação do DNA do VHB e RNA do VHC foram realizados de modo qualitativo e quantitativo pelo Laboratório Central do Estado (LACEN-PA) e obtidos a partir do prontuário dos pacientes. 4.3.5 Procedimentos histopatológicos Espécimes de biópsia hepática foram obtidas de pacientes com indicação médica para investigação de alterações de parênquima hepático, dentro do protocolo de atendimento clínico. As biópsias hepáticas foram realizadas por profissional médico do referidos hospital, com agulha de Trucut e dirigidas pela ultrasonografia. Cada amostra de biópsia hepática foi separada em duas partes, uma delas foi enviada para estudo genético no Laboratório de Virologia/ICB/UFPA e a outra examinada no Departamento de Anatomia Patológica da UFPA, obedecendo às rotinas do serviço, submetida às colorações de hematoxilina-eosina (HE), cromotrope azul de anilina (CAB), reticulina de Gomori e orceína de Shikata. O diagnóstico histopatológico obedeceu a classificação da Sociedade Brasileira de Hepatologia (Gayotto, 2000) e a francesa de METAVIR (Bedossa & Poynard, 1996), pontuando a atividade do infiltrado inflamatório portal e peri-portal de 0 a 3 e as alterações estruturais de 0 a 4. Ressalta-se que todos os resultados dos exames feitos fora do Laboratório de Virologia da UFPA foram obtidos do prontuário do paciente. 4.3.6 Análise Estatística Para a análise estatística foram utilizados os programas EPIINFO 6.04 b e Biostat 5.0 (Ayres et al., 2007). Os níveis de expressão dos genes foram comparados, em relação às variáveis utilizadas no estudo, através do Teste t de Student e Anova. Foi utilizada a Análise de Regressão Linear, a fim de avaliar a associações independentes, entre cargas virais, graus de fibrose hepática e expressões gênicas. Estabeleceu-se em 5 % o nível de significância (valor de p < 0,05). 4.3.7 Riscos e benefícios Os possíveis riscos para o sujeito da pesquisa incluíram dor local e sangramentos. Todos os pacientes permaneceram em observação por quatro horas após a realização da biópsia, sendo utilizados todos os meios para evitar estes riscos, uma vez que este procedimento foi realizado por profissional especializado e experiente. Foram utilizados materiais descartáveis em todo o procedimento. Há ainda o risco de divulgação indevida ou perda de informações constantes no prontuário do sujeito da pesquisa, o que foi minimizado pelo compromisso ético do pesquisador durante a manipulação dos prontuários, uma vez que o mesmo possuía experiência em trabalhar com análise deste material. Para o pesquisador houve o risco de não obtenção de todas as informações necessárias a partir do prontuário dos pacientes, dificultando assim a análise final dos resultados obtidos. O grande benefício desta pesquisa para todos os que participaram será possibilitar um melhor entendimento sobre a influência da resposta imunológica do hospedeiro (pessoa infectada) através de suas citocinas e genes no tipo de evolução da doença crônica do fígado pelos vírus das hepatites B e C. Há ainda a tentativa de responder por que alguns que se infectam podem eliminar espontaneamente o vírus, enquanto outros se tornam crônicos, podendo evoluir para cirrose ou tumor de fígado. 6. RESULTADOS Foram obtidas 21 amostras, sendo estes pertencentes aos grupos de portadores do VHB (n=4), do VHC (n=4), hepatites não virais (HNV) (n=5) e grupo controle (CT) (n=8). Todos os grupos de pacientes, assim como para o grupo controle, tiveram seus níveis séricos de ALT, AST, GGT e AFP avaliados, além do grau de fibrose e de atividade inflamatória no tecido hepático quando este fosse identificado. As medianas dos níveis de ALT em cada grupo foram: pacientes portadores do VHB 25 UI/L, em portadores do VHC foi de 64 UI/L, em portadores de hepatite não viral foi de 49 UI/L e no grupo controle foi de 27 UI/L. Para AST os valores obtidos foram 30 UI/L, 39 UI/L, 6 UI/L e 24 UI/L, respectivamente. Para GGT foram encontrados valores medianos de 20,5 UI/L em pacientes portadores do VHB, de 42 UI/L em portadores do VHC, 9 UI/L em portadores de hepatite não viral e 29 UI/L no grupo controle. Em relação ao nível de fibrose, foram observados entre os portadores de hepatite B 3 (75%) pacientes apresentando grau F1 e 1 (25%) o grau F0. Entre os portadores de hepatite C 3 (75%) casos de pacientes apresentando grau F1 e 1 (25%) caso de grau F3. Entre os indivíduos portadores de hepatite não viral, 2 (40%) casos apresentavam graus de fibrose F1, enquanto somente 1 (20%) apresentou nível de fibrose F4. No grupo controle todos apresentaram o grau F0. Quanto ao grau de resposta inflamatória verificou que 75% dos portadores de hepatites B apresentavam o grau A1, enquanto que, para o VHC foi observado 50% e entre os indivíduos com infecção não viral 60%. Entre os pertencentes ao grupo controle 100% apresentavam grau A0 (Tabela 1). O processo de inflamação esteve ausente em 8,33% dos indivíduos com escore de fibrose hepática F0 e em 57,14% do F1, em todos os demais escores foi observada inflamação leve (A1) e moderada (A2), sendo que em F1 esteve a maior frequência dos níveis de inflamação A1 (50,00%) (Tabela 2). Tabela 1 – Dados clínicos, bioquímicos e histopatológicos segundo escores de METAVIR da população do estudo. VHB VHC HNV CT (n=4) (n=4) (n=5) (n=8) 2/2 3/1 4/1 5/3 25 64 49 27 30 39 6 24 20,5 42 9 29 F0 (%) 1 (25) - - 8 (100,0) F1 (%) 3 (75) 3 (75) 2 (20) - F2 (%) - - - - F3 (%) - 1 (25) - - F4 (%) - - 1 (20) - A0 (%) 1 (25) - - 8 (100,0) A1 (%) 3 (75) 2 (50) 4 (60) - 2 (50) - - Gênero (F/M) ALT (UI/L) Mediana AST (UI/L) Mediana GGT (UI/L) Mediana Estadiamento da fibrosea Grau de inflamaçãob A2 (%) - F: Feminino; M: Masculino. ALT: alanina aminotransferase (normal: 14 a 55 UI/L); AST: aspartato aminotransferase (normal: 14 a 32 UI/L); GGT: gamaglutamiltransferase (normal: < 50 UI/L); AFP: alfafetoproteína (normal: < 15 nm/mL); a Escores de Fibrose F0: ausência de fibrose; F1: portal sem septos; F2: portal com alguns septos; F3: muitos septos sem cirrose; F4: cirrose; b Atividade Inflamatória A0: ausente; A1: mínima; A2: moderada. Tabela 2 – Frequência dos níveis de atividade inflamatória nos escores de fibrose hepática dos pacientes com hepatite viral e não viral. Escores de fibrose hepáticaa Atividade inflamatóriab F0 F1 F2 F3 F4 A0 0 8,33% 0 0 0 A1 8,33% 50,00% 0 8,33% A2 0 0 0 8,33% 8,33% 0 a Escores de Fibrose F0: ausência de fibrose; F1: portal sem septos;F2: portal com alguns septos; F3: muitos septos sem cirrose; F4: cirrose; bAtividade Inflamatória A0: ausente; A1: mínima; A2: moderada. No presente estudo não houve diferenças estatisticamente significativas entre a expressão de INF-γ e TGF-β entre os pacientes portadores de hepatite não viral (HNV), VHB e VHC (Figura 1). Figura 1- Gráfico em dot-plot apresentando a média dos valores de expressão de INF-y e TGF-B entre pacientes portadores do VHB, VHC e Hepatite Não Viral (HNV). Nos pacientes portadores de hepatite crônica não foram encontradas diferenças significativas entre INF-γ e TGF-β e os graus de fibrose (Figura 2-A) e inflamação (Figura 2-B); dosagens normais ou elevadas de ALT, AST e GGT (Figura 3). Figura 2 - Gráfico em dot-plot apresentando a média da expressão de INF-y e TGF-B de acordo com o grau de fibrose (A) e inflamação (B) entre os portadores de hepatite crônica. Figura 3 - Gráfico em dot-plot apresentando a média da expressão de IFN-y e TGF-B de acordo com dosagens normais ou elevadas de ALT, AST e GGT entre pacientes portadores de hepatite crônica. As análises de correlação linear entre a expressão de INF-γ, TGF-β e as dosagens de ALT, AST e GGT nos pacientes portadores de hepatite crônica não foram significativas (Figura 4). Figura 4 - Correlação linear entre as expressões de INF-y e TGF-B e as dosagens de ALT, AST e GGT. 7. DISCUSSÃO Os mecanismos moleculares envolvidos na progressão da lesão hepática crônica até à cirrose, e em última análise, para o carcinoma hepatocelular, decorrente das infecções pelo VHB e pelo VHC, continuam a serem discutidos. A persistência da infecção por esses vírus e consequente inflamação crônica do fígado é caracterizada por uma deficiência da resposta imunitária mediada por linfócitos T citotóxicos ativados (Bertoletti & Ferrari, 2003), que têm papel essencial na destruição do VHB e de células infectadas com o VHC, através de diversas vias, incluindo a produção e síntese de citocinas com ação antiviral, perforina, granzima B entre outros. Existem outros estímulos que podem causar lesão hepática, como a ingestão de álcool, a colestase, a esteatose, o abuso de drogas e a autoimunidade, assim a variabilidade genética viral está sempre interagindo com os fatores ambientais, fazendo com que os danos no fígado tenham um gradiente de severidade (Voruganti et al., 2010). A avaliação histopatológica do tecido hepático através da biópsia é considerada a forma mais especifica de avaliar os danos resultantes da infecção crônica pelos vírus das hepatites B e C, bem como de outras doenças crônicas, possibilitando a graduação da atividade necroinflamatória, o estadiamento da fibrose e a detecção de eventuais doenças associadas (Bedossa et al., 1994). Sabe-se que a hepatite viral é a causa principal ou secundária da elevação das enzimas ALT e AST (Clark et al., 2003; Pendino et al., 2005; Chen et al., 2007) e que a atividade das transaminases é um indicador de lesão hepática tanto nas formas agudas como nas crônicas (Rehermann & Nascimbeni, 2005). A GGT é uma enzima microssomal que pode ser isolada a partir do hepatócitos e do epitélio da vesícula biliar, e seu aumento pode ocorrer em várias doenças do fígado, da vesícula biliar, do pâncreas, na síndrome metabólica e no diabetes mellitus tipo 2 (Aygün et al., 2010) No presente estudo foi observado que apesar das variações nos níveis séricos das enzimas hepáticas ALT e AST as maiores medianas foram verificadas em pacientes com VHC, seguidos de VHB e HNV respectivamente, sendo que para GGT foi observado a seguinte ordem VHC, seguido pelo VHB e por fim HNV. Os resultados do presente estudo corroboram com outros achados da literatura mostrando que dentre as hepatites não virais a esteatose hepática tem sido fortemente associada à atividade da ALT (Clark et al., 2003; Pendino et al., 2005; Chen et al., 2007), assim como na hepatite autoimune estudos mostram um nível de ALT persistentemente baixo associado à melhora do prognóstico (Miyake et al., 2005), além de uma associação entre a elevação persistente da ALT com a baixa sobrevida desses pacientes (Miyake et al., 2006). Semelhante aos nossos resultados Alter et al., (1997) mostraram que pacientes assintomáticos com níveis detectáveis de RNA do VHC têm elevações de ALT, o mesmo observado naqueles indivíduos positivos para anticorpos contra o VHC. Importante enfatizar que todos os pacientes com VHB deste estudo eram HBeAg soro convertidos e tiveram as menores medianas nos valores de ALT, esses achados corroboram os de Yuen et al., (2006) que observaram, na soro conversão de pacientes HBeAg positivo, uma redução dos níveis da atividade da ALT, sugerindo que na hepatite B a ALT é útil não só para determinar a presença da doença do fígado e a necessidade de tratamento, mas também para medir o curso da história natural da infecção e predizer a soroconversão do antígeno HBeAg. Em todos os grupos estudados a mediana da ALT foi superior à média da AST, perfil típico da infecção e doença hepática crônica em fases iniciais e intermediárias (Kim et al., 2008), o que corresponde ao estadiamento da maioria dos pacientes deste estudo. Quando analisada a associação das enzimas hepáticas nos pacientes com fígado normal ou com fibrose ou cirrose, independente da doença hepática, foi observado maior valor de ALT em fibrose enquanto resultado indicativo de que a extensão da fibrose pode ter influência na medida dessa enzima, concordando com outros relatos na literatura em que os valores séricos da ALT são mais altos do que os da AST nas fases iniciais das hepatites, sugerindo que em pacientes com hepatite crônica, os valores da AST superiores aos da ALT indicam liberação adicional de AST das mitocôndrias nos hepatócitos, em consequência de dano hepatocelular mais grave ou prolongado (Clermont & Chalmers, 1967; Zechini, et al., 2004). Semelhante aos resultados do presente estudo, Granot et al., (2001) correlacionaram a atividade da ALT ao escore de fibrose. Uma associação de altas concentrações de ALT e AST com os maiores níveis de atividade inflamatória hepática observada neste estudo sugere que os valores elevados das transaminases pode se correlacionar com parâmetros histológicos de gravidade da doença, corroborando os resultados de Zechini, et al., (2004). Diferente dos resultados do presente estudo, Roshan & Guzman (2014) concluíram que a ALT não é um indicador confiável na associação da inflamação hepática ou fibrose em pacientes com VHC visto que há uma variação significativa nos níveis da ALT no curso da infecção. No presente estudo, verificou-se uma possível associação positiva entre o grau de fibrose e os níveis de atividade inflamatória com os valores elevados de GGT, porém a avaliação por doença hepática não foi possível em virtude do tamanho amostral dos pacientes com VHB. Em estudo recente foi proposto que em pacientes com hepatite viral crônica, a GGT pode ser utilizada para prever avançada lesão histológica hepática, especialmente em pacientes com hepatite B (Eminler et al., 2014). Algumas pesquisas consideraram a GGT um dos marcadores indiretos para fibrose hepática, tendo sido incluída no FIBROINDEX desenvolvido por ImbertBismut et al., (2001) e validado por Poynard et al., (2002). A elevação de GGT é atribuída à presença de lesões em ductos biliares nos portadores de VHC (Giannini et al., 2001) Mossong et al., (2011) correlacionaram positivamente a AST e a GGT com a pontuação METAVIR, seguida por contagem de plaquetas e alfa2macroglobulina, em pacientes com VHC. Apesar da correlação negativa entre níveis séricos de INF-γ com atividade inflamatória e com cirrose encontrada nesta pesquisa, isso não quer dizer que citocina não se mantenha ativada por células Th1 antígeno-específicas quanto maior for o dano hepático. Tanto que em modelo animal, demonstrou-se que o INF-γ assume um importante papel na patogênese da infecção pelo VHB, ao serem induzidos por estimulação de LTh1 HBsAg-específicos, que, por sua vez, ativam células citotóxicas efetoras (Ohta et al., 2000). Neste sentido, Tang et al. (2006) estudaram 43 pacientes portadores crônicos de VHB e 19 controles, encontrando concentrações maiores de INF-γ no grupo com cirrose hepática ativa e houve correlação positiva com os níveis de transaminases, o que não ocorreu em nossa pesquisa devido ao baixo número amostral. A injúria tecidual estimularia as células estreladas na produção de citocinas com função reparadora do dano, como a TGF-β1, que ao mesmo tempo que antagoniza os efeitos inflamatórios tenta reparar a lesão tecidual por meio da síntese de colágeno. Até certo ponto, este efeito e benéfico, porém a estimulação crônica levaria a substituição de grande parte do tecido hepático normal por tecido fibrótico, desarranjando a arquitetura hepática com impacto na circulação portal e na função do órgão. Admite-se também, que em pacientes portadores crônicos do VHB, há predomínio da resposta do Th2 em relação a Th1, resultando no aumento da produção de citocinas anti-inflamatórias (Vierling, 2007). A citocina TGF-β1 tem um efeito imunossupressão, resultando em um aumento da replicação do VHB, acarretando maior grau de fibrose hepática. Ela ativa as células estreladas com posterior estimulação de proteínas da matrix extracelular, como o colágeno e a fibronectina, induzindo a fibrose (Visvanathan & Lewin, 2006; Malhi & Gores, 2008). Portanto, os pacientes cronicamente infectados pelo VHB possuem estimulação continua de fatores que levam a síntese de TGF-β1, com consequente progressão da fibrose e evolução para cirrose. Estes dados explicam os achados de maiores níveis séricos de TGF-β1 nos infectados, assim como sua correlação com a GGT, a qual e considerada uma enzima de colestase, reveladora da fibrose hepática. Sabe-se que deve haver equilíbrio das respostas do tipo Th1 e Th2 para o perfeito funcionamento do sistema e eliminação viral, o que não ocorre nos que evoluem para cronicidade (Baumert et al., 2007; Vierling, 2007). As respostas para este fenômeno com os dados até então conhecidos sugerem a importância da interação dos três fatores ligados a epidemiologia da hepatite B: o vírus, o hospedeiro e o meio ambiente. Logo, a compreensão dos mesmos não deverá se fazer de maneira isolada, sob pena de se ter uma visão compartimentalizada, não conseguindo formar nexos entre os achados. Quanto mais próximo se chegar da realidade, melhores serão as ações de prevenção, monitoramento e intervenção terapêutica nos portadores de hepatite B, declinando cada vez mais as taxas de morbimortalidade, que ainda permanecem alarmantes não restam dúvidas que o advento da vacinação contribuiu de forma dramática para a diminuição da incidência dos casos. Porém, nem todos tem acesso aos serviços básicos de saúde, principalmente em regiões menos favorecidas e que coincidem com as de maior endemicidade; além do mais, há um contingente grande de portadores crônicos, responsável pelo reservatório da doença e pelos quadros de cirrose e leva ao óbito cerca de 500.000 pacientes ao ano. Avanços, em todas as áreas do conhecimento, inclusive o da imunologia e da genética humana e na nanotecnologia farmacêutica, com certeza contribuirão para minimização do problema se não distanciados do pensamento holístico do ser humano e de suas relações entre si e com o meio ambiente. Sem dúvida que estudos futuros com aumento de casuística e outras correlações serão necessários para ratificação dos resultados e contribuir para esclarecimentos de questões ainda não respondidas da imunopatogenia na infecção crônica do VHB. 8. PUBLICAÇÕES Ainda não foram originadas publicações do presente trabalho. 9. CONCLUSÕES Os níveis de expressão de INF-γ e TGF-β no tecido hepático parecem não estar relacionados com o tipo de hepatite apresentada pelo paciente (hepatite B, hepatite C ou hepatite não viral). Os níveis de expressão de INF-γ e TGF-β no tecido hepático não estão relacionados ao grau de fibrose ou atividade inflamatória em pacientes portadores de hepatite crônica. Dosagens normais ou elevadas de ALT, AST e GGT não estão associadas com a expressão de INF-γ e TGF-β no tecido hepático de pacientes portadores de hepatite crônica. 9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABBAS, A.K.; LICHTMAN, A.H.; PILLAI, S. Cytokines. In: Cellular and Molecular Immunology. ABBAS, A.K.; LICHTMAN, A.H.; PILLAI, S (eds). Saunders, 2007, p. 251-282. ALTER, M.J. Epidemiology and prevention of hepatitis B. Seminars in Liver Disease, 23(1): 39-46, 2003. ALTER H.J., CONRY‐CANTILENA C., MELPOLDER J., TAN D., VAN RADEN M., HERION D., LAU D., HOOFNAGLE J.H. Hepatitis C in asymptomatic blood donors. Hepatology 26(S3): 29S-33S, 1997. AYGÜN C., GÖZEL N., DEMIREL U. Kronik viral hepatit B tanisi olan hastalarda serum GGT düzeyi ile karaciğer fibrozu ilişkisi. Fırat Medical Journal 15: 74-78, 2010. AYRES, M., AYRES JR, M., AYRES, D.L., SANTOS, A.S. BioEstat 5.0: aplicações estatísticas nas áreas das Ciências biológicas e médicas. Belém, 2007. 364 p. ALTER, M.J. Epidemiology and prevention of hepatitis B. Seminars in Liver Disease, 23(1): 39-46, 2003. AYRES, M., AYRES JR, M., AYRES, D.L., SANTOS, A.S. BioEstat 5.0: aplicações estatísticas nas áreas das Ciências biológicas e médicas. Belém, 2007. 364 p. BAUMERT, T.F.; THIMME, R.; von WEIZSACKER, F. Pathogenesis of hepatitis B virus infection. World Journal of Gastroenterology, 13(1): 82-90, 2007. BEDOSSA, P., POYNARD, T. An Algorithm for the Grading of Activity in Chronic Hepatitis C. Hepatology, 24 (2): 289-293, 1996. BEDOSSA P. Intraobserver and Interobserver Variations in Liver Biopsy Interpretation in Patients with Chronic Hepatitis C. Hepatology 20(1): 15–20, 1994. BERTOLETTI A., FERRARI C. Kinetics of the immune response during HBV and HCV infection. Hepatology 38(1): 4–13, 2003 BERTOLETTI, A. & GEHRING, A.J., The immune response during hepatitis B virus infection. Journal of General Virology, 87: 1439–1449, 2006. BOYDE T.R.C., LATNER A.R. Starchgel electrophoresis of transaminase in human tissue extracts and sera. Biochemistry Journal 82: 51, 1961. CLARK J.M., BRANCATI F.L., DIEHL A.M. The prevalence and etiology of elevated aminotransferase levels in the United States. The American journal of gastroenterology 960-967, 2003. CLERMONT R.J., CHALMERS T.C. The transaminase test in liver disease. Medicine 46: 197-205, 1967. EMINLER A.T., IRAK K., AYYILDIZ T., KESKIN M., KIYICI M., GUREL S., GULTEN M., DOLAR E., NAK S. G.. The relation between liver histopathology and GGT levels in viral hepatitis: More important in hepatitis B. Turk Journal Gastroenterology 25: 4115, 2014. FERRAZ, M.L.G. Testes laboratoriais na investigação de doenças hepáticas. In: Tratado de Hepatologia. Mattos, A.A. & Dantas-Corrêa, E.B. (eds). Rio de Janeiro, 2010, p. 21-28. CHEN C.H., HUANG M.H., YANG J.C., NIEN C.K., YANG C.C., YEH Y.H., YUEH S.K. Prevalence and etiology of elevated serum alanine aminotransferase level in an adult population in Taiwan. Journal of gastroenterology and hepatology 22(9): 1482-1489, 2007 GANEM, D. & SCHNEIDER, R.J. Hepadnaviridae: the virus and their replication. In: FieldsVirology. KNIPE, D.M & HOWLEY, P.M. (eds). 4 th ed, vol. 2. Phildadelphia, Lippincott Williams, 2001:2923-2969. GAYOTTO, L.C.C. Visão histórica e consenso nacional sobre a classificação das hepatites crônicas. Gastroenterologia Endoscopia Digestiva, 19 (3): 137 – 140, 2000. GRANOT E., SHOUVAL D., ASHUR Y. Cell adhesion molecules and hyaluronic acid as markers of inflammation, fibrosis and response to antiviral therapy in chronic hepatitis C patients, Mediators Inflammation 10: 253–258, 2001. HUI, C. & LAU, G.K.K. Immune system and hepatitis B virus infection. Journal of Clinical Virology, 34 (supl.1): S44 – S48, 2005. IMBERT-BISMUT F, RATZIU V, PIERONI L, CHARLOTTE F, BENHAMOU Y, POYNARD T. Biochemical markers of liver fibrosis in patients with hepatitis C virus infection: a prospective study. Lancet 357: 1069-75, (2001). KANZLER, S.; LOHSE, A.; KEIL, A.; HENNIGER, J.; DIENES, H.P.; SCHIRMACHER, P.; ROSE-JOHN, S.; MEYER, K.H.; BLESSING, M. TGF-β in liver fibrosis: an inducible transgenic mouse model to study liver fibrogenesis. American Journal of Physiological Gastrointestinal and Liver Physiology, 275:1059-1068, 1999. KIM W., FLAMM S.L., DI BISCEGLIE A.M., Bodenheimer HC: Serum activity of alanine aminotransferase (ALT) as an indicator of health and disease. Hepatology 47(4): 1363-1370, 2008. LOCARNINI, S. Molecular virology of hepatitis B virus. Seminars in Liver Disease, 24 (supl 1): 3-10, 2004. MALHI, H. & GORES, G.J. Cellular and molecular mechanisms of liver injury. Gastroenterology, 134(6):1641-54, 2008. MASON, W.S., BURRELL, C.J.; CASEY, J.; GERLICH, W.H.; HOWARD, C.R.; KANN, M.; NEWBOLD, J.; SCHAEFER, S.; TAYLOR, J.M.; WILL. H. Hepadnaviridae. In: Virus Taxonomy. Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. FAUQUET,C.M.; MAYO, MANILOFF,J.; DESSELBERGER,U.; BALL, L.A. (eds). Amsterdan, 2005. M.A.; MIYAKE Y., IWASAKI Y., TERADA R., OKAMAOTO R., IKEDA H., MAKINO Y., KOBASHI H., TAKAGUCHI K., SAKAGUCHI K., SHIRATORI Y. Persistent elevation of serum alanine aminotransferase levels leads to poor survival and hepatocellular carcinoma development in type 1 autoimmune hepatitis. Alimentary pharmacology & therapeutics 24(8): 1197-1205, 2006. MOSSONG J, BILL S, HAWOTTE K. Predicting significant fibrosis in hepatitisC patients in Luxembourg using serological markers. Bull Soc Sci Med Grand Duche Luxemb 19-30, 2011 OHTA, A.; SEKIMOTO, M.; SATO, M.; KODA, T.; NISHIMURA, S.; IWAKURA, Y.; SEKIKAWA, K.; NISHIMURA, T. Indispensable role for TNF-alpha and IFNgamma at the effector phase of liver injury mediated by Th1 cells specific to hepatitis B virus surface antigen. Journal of Immunology, 15;165 (2): 956-961, 2000. PENDINO G.M., MARIANO A., SURACE P., CASERTA C.A., FIORILLO M.T., AMANTE A., BRUNO S., MANGANO C., POLITO I., AMATO F. Prevalence and etiology of altered liver tests: A population‐based survey in a Mediterranean town. Hepatology 41(5): 1151-1159, 2005. REHERMANN B., NASCIMBENI M. Immunology of hepatitis B virus and hepatitis C virus infection. Nature Reviews Immunology 5(3): 215-229, 2005. SCHAEFER, S. Hepatitis B virus taxonomy and hepatitis B virus genotypes. World Journal of Gastroenterology, 13 (1):14-21, 2007. VIERLING, J.M. The immunology of hepatitis B. Clinics in Liver Disease, 11(4):72759, 2007. VISVANATHAN, K. & LEWIN, S.R. Immunopathogenesis: role of innate and adaptive immune responses. Seminars in Liver Disease, 26(2):104-15, 2006. VORUGANTI V.S., COLE S.A., EBBESSON S.O., GORING H.H., HAACK K., LASTON S. A variação genética na APOJ, LPL, e TNFRSF10B afeta a distribuição de ácidos graxos no plasma esquimós do Alasca. American Journal Clin Nutrition 91: 1574-1583, 2010. WIELAND, S.; THIMME, R.; PUCELL, R.H.; CHISARI, F.V. Genomic analusis of the host response to hepatits B virus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, 101(17): 6669 – 6674, 2004. WHO. WORLD HEALTH ORGANIZATION. Progress towards global immunization goals – 2006. Summary presentation of key indicators. Genebra, September, 2007. YUEN, M.F.; WONG, D.K.H; ZHENG, B.J.; CHAN, J.C.H.; YUEN, J.C.H.; WONG, B.C.Y.; LAI, C.L. Difference in T helper responses during hepatitis flares in hepatitis B e antigen (HBeAg)-positive patients with genotypes B and C: implication for early HBeAg seroconversion. Journal of Viral Hepatitis, 14: 269275, 2007. ZECHINI B., PASQUAZZI C., ACETI A. Correlation of serum aminotransferases with HCV RNA levels and histological findings in patients with chronic hepatitis C: the role of serum aspartate transaminase in the evaluation of disease progression. European Journal Gastroenterology Hepatology 16: 891-896, 2004. 9. DIFICULDADES O atraso na obtenção dos reagentes para os testes de biologia molecular e do retorno do equipamento de PCR em tempo real que foi enviado para conserto técnico em São Paulo, foram os fatores negativos que interferiram na realização dos ensaios nesta fase de execução do projeto. 12. PARECER DO ORIENTADOR: O aluno demonstrou compromisso e bom desempenho nas atividades desenvolvidas no presente projeto. DATA: 10 /08/2015 Rosimar Neris Martins Feitosa ASSINATURA DO ORIENTADOR Michel dos Santos Costa ASSINATURA DO ALUNO FICHA DE AVALIAÇÃO DE RELATÓRIO DE BOLSA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA O AVALIADOR DEVE COMENTAR, DE FORMA RESUMIDA, OS SEGUINTES ASPECTOS DO RELATÓRIO: 1. O projeto vem se desenvolvendo segundo a proposta aprovada? Se ocorreram mudanças significativas, elas foram justificadas? 2. A metodologia está de acordo com o Plano de Trabalho? 3. Os resultados obtidos até o presente são relevantes e estão de acordo com os objetivos propostos? 4. O plano de atividades originou publicações com a participação do bolsista? Comentar sobre a qualidade e a quantidade da publicação. Caso não tenha sido gerada nenhuma, os resultados obtidos são recomendados para publicação? Em que tipo de veículo? 5. Comente outros aspectos que considera relevantes no relatório 6. Parecer Final: Aprovado ( ) Aprovado com restrições ( ) (especificar se são mandatórias ou recomendações) Reprovado ( ) 7. Qualidade do relatório apresentado: (nota 0 a 5) _____________ Atribuir conceito ao relatório do bolsista considerando a proposta de plano, o desenvolvimento das atividades, os resultados obtidos e a apresentação do relatório. Data : _____/____/_____. ________________________________________________ Assinatura do(a) Avaliador(a)