Avaliador(a) - pibic - Universidade Federal do Pará

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
DIRETORIA DE PESQUISA
PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC: CNPq, CNPq/AF,
UFPA, UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PARD, PIAD, PIBIT, PADRC E FAPESPA
RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO
Período: 08/2014 a 07/2015
( ) PARCIAL
(X) FINAL
IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO
Título do Projeto de Pesquisa: Estudo da Correlação de Marcadores
Imunológicos, Genéticos e de Estresse Oxidativo com a apresentação Clínica da
Hepatite B Crônica.
Nome do Orientador: Rosimar Neris Martins Feitosa
Titulação do Orientador: Doutor
Instituto/Núcleo: Instituto de Ciências Biológicas
Laboratório: Laboratório de Virologia
Título do Plano de Trabalho: Avaliação de marcadores imunológicos e genéticos
(IFN-gama e TGF-beta) em pacientes com infecção crônica pelo Vírus da hepatite B.
Nome do Bolsista: Michel dos Santos Costa
Tipo de Bolsa: (x) PIBIC/ FAPESPA
1. INTRODUÇÃO
O Vírus da hepatite B (VHB) pertence à família Hepadnaviridae, do gênero
Orthohepadnavirus, no qual se encontram outros membros que compartilham
características estruturais e funcionais (Ganem & Schneider, 2001; Mason et al.,
2005).
A hepatite B continua sendo um grande problema de saúde pública, haja
vista a existência de evidência sorológica de infecção passada em cerca de dois
bilhões de indivíduos no mundo, sendo que destes, 350 milhões permanecem
cronicamente infectados (WHO, 2007).
O VHB é classificado em genótipos, os quais diferem entre si através de
mudanças, de no mínimo 8%, nas sequências nucleotídicas (Locarnini, 2004;
Schaefer, 2007). Reconhece-se oito genótipos diferentes, denominados de A a H,
além de numerosos subgenótipos (Schaefer, 2007).
O genótipo A é dividido em cinco subgenótipos, A1(Aa), A2(Ae), A3, A4 e
A5, assim como os genótipos B, C e D. Os subgenótipos do F são F1 a F4, e ainda
não foram descritas subclassificações para os genótipos E, G e H (Schaefer, 2007).
O VHB é transmitido mediante a exposição percutânea e das membranas
mucosas ao sangue e fluidos corpóreos contaminados, entre eles o soro, sêmen e
saliva. A presença do HBeAg no soro se correlaciona com altas cargas virais,
facilitando a transmissibilidade do vírus. Reconhece-se como vias de transmissão a
percutânea/parenteral, a sexual, a vertical e a horizontal (Alter, 2013).
Durante a fase crônica, o VHB poderá ser responsável por quadros de
hipoplasia medular, e na doença hepática terminal, em razão da própria hipertensão
portal com hiperesplenismo, ocorre a pancitopenia (Ferraz, 2010).
Nas fases iniciais da infecção pelo VHB, há prejuízo da ação da imunidade
inata do hospedeiro.
Este fato
pode ser explicado
pela dificuldade do
reconhecimento das proteínas virais pelo sistema imunológico, pelo processo de
tradução do pgRNA se realizar no interior do nucleocapsídeo e pela não expressão
de genes regulatórios pela célula hospedeira quando infectada pelo VHB (Wieland et
al., 2004). Portanto, estes fatores funcionam como escapes do sistema imune que é
altamente sensível à produção de mRNA virais (Hui & Lau, 2005).
Mesmo assim, reconhece-se a participação da imunidade natural com a
produção de interferon (INF) tipo 1, α / β, pelas células infectadas e a ativação de
células natural killers (NK) e células T natural killers (NKT) pelo INF-γ. O INF-α / β
direciona o alvo da resposta para os produtos de replicação viral, enquanto que as
células NK são ativadas pelo reconhecimento de moléculas indutoras de stress
celular ou modulação do MHC classe I nas células infectadas (Bertoletti & Gerhing,
2006).
Yuen et al. (2007), pesquisando as diferentes respostas de LTh durante a
hepatite crônica, onde HBeAg é positivo em indivíduos asiáticos, observaram que os
infectados com o genótipo B possuíam maior secreção de INF-γ e maior chance de
soroconversão.
Na fase crônica, demonstra-se o importante papel do fator de transformação
do crescimento celular beta 1 (TGF-β1) na indução da fibrogênese hepática. Esta
citocina está envolvida na síntese e deposição dos componentes da matrix
extracelular, como a fibronectina, o colágeno tipo I, III e IV, a elastina, a
osteonectina, os bioglicanos, por meio das células estreladas ativadas. Tem sido
demonstrado que os níveis de RNAm para TGF-β1 e procolágeno I estão altamente
relacionados com o grau de fibrose encontrada nas biópsias hepáticas de modelos
animais portadores de hepatite crônica (Kanzler et al., 1999).
Em todas as fases da resposta imune, seja inata ou adaptativa, o papel das
citocinas é fundamental. Sua secreção surge em resposta a antígenos variados
estimulando o desenvolvimento da imunidade e da inflamação. Entre as suas
funções, destaca-se o estímulo para a diferenciação e crescimento de linfócitos,
ativação de diferentes células efetoras para eliminação de antígenos e estimulação
do crescimento das células hematopoiéticas (Abbas & Lichtmann, 2007). No
contexto da infecção pelo VHB, INF-γ e TGF-β1 exercem também um papel de
destaque.
2.
JUSTIFICATIVA
Tem sido sugerido que um aumento da apoptose de células T durante a
infecção pelo VHB é a causa de prejuízo na regulação da resposta imunitária
celular, ajudando a manter a infecção. Assim, o interesse em descobrir os prováveis
mecanismos pelos quais o VHB se perpetua no fígado, e para determinar as
condições que predispõem para a progressão da doença, faz a investigação da
expressão de genes de citocinas em tecido hepático de grande interesse.
São necessários estudos detalhados avaliando indicadores virais e do
hospedeiro para o risco de resistência e a identificação de fatores do hospedeiro
que prevêem para o risco de progressão da fibrose deve ser uma prioridade. Assim
como estudos de determinantes genéticos de risco do hospedeiro para a evolução
para quadros de carcinoma hepatocelular também são necessários.
3.
OBJETIVOS:
3.1 Objetivo geral:
Avaliar a expressão dos genes de IFN-gama e TGF-beta em pacientes
cronicamente infectados pelo Vírus da hepatite B, buscando identificar possíveis
marcadores imunogenéticos associados à infecção por este agente.
3.2 Objetivos específicos:

Correlacionar a quantificação da expressão dos genes de IFN-gama e TGFbeta com a apresentação clínica da infecção crônica pelo VHB e demais
causas;

Comparar a expressão dos genes de IFN-gama e TGF-beta no tecido
hepático de portadores de hepatite crônica pelo VHB com outras hepatites
crônicas de causas viral e ainda as não virais;

Buscar associação entre a quantificação da expressão dos genes de IFNgama e TGF-beta, com os níveis séricos das alaninas aminotransferases
(ALT/AST) e Gamma-glutamyl transferase (GGT).
4.
MATERIAL E MÉTODOS
4.1
Aspectos éticos
A pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa via Plataforma
Brasil, conforme os preceitos da Declaração de Helsinque e do Código de
Nuremberg e respeitadas as Normas de Pesquisa Envolvendo Seres Humanos
(Res. CNS 196/96 e complementares), do Conselho Nacional de Saúde.
Os pacientes selecionados para a pesquisa e que aceitaram participar foram
informados sobre os objetivos da pesquisa e assinaram um termo de consentimento
livre e esclarecido (TCLE).
4.2
4.2.1
População Investigada e Coleta das Amostras
Caracterização das amostras e População do estudo
Trata-se de um estudo do tipo transversal e analítico, realizado no
Laboratório de Análises Clínicas do Hospital Universitário João Barros Barreto, onde
foram selecionados casos consecutivos de pacientes portadores crônicos do VHB e
com outras doenças hepáticas crônicas, incluindo a doença hepática não-alcoólica
(DHGNA), hepatite autoimune, cirrose biliar primária, entre outras. Posteriormente
devido à retirada pelo Ministério da Saúde da obrigatoriedade de realização da
biópsia pelos portadores crônicos do VHB para início do tratamento, o que
ocasionou dificuldades para a obtenção de amostras deste grupo, optou-se por
coletar também amostras de pacientes portadores crônicos do VHC na tentativa de
aumentar o tamanho amostral.
Todos
os
pacientes
selecionados
foram
avaliados
clinicamente
e
submetidos à investigação complementar que constou de exames hematológicos,
bioquímicos, sorológicos, virológicos, ultrassonográficos e endoscópicos, além da
biópsia hepática, sendo estes dados transcritos dos prontuários para o protocolo de
pesquisa específico. Sendo estimada a coleta de amostra de 50 pacientes, os quais
foram divididos nos grupos a seguir:
a) Grupo 1 – portadores de hepatite B crônica, caracterizados por
alterações clínicas e dos testes hepáticos, HBsAg positivo, HBeAg
positivo ou negativo;
b) Grupo 2 - Portadores de hepatite C crônica, caracterizados por sorologia
anti-VHC positiva e detecção de RNA-viral;
c) Grupo 3 – portadores de doença hepática crônica não viral, incluindo a
doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA), a hepatite
autoimune, a cirrose biliar primária, entre outras, caracterizados por
alterações clínicas e dos testes hepáticos.
d) Grupo 4 – indivíduos submetidos à colecistectomia biliar convencional,
sem alterações hepáticas necro-inflamatórias, que servirão como
controles normais.
4.2.2 Critérios de inclusão e exclusão
Os pacientes investigados foram incluídos, atendendo a faixa etária igual ou
acima de 18 anos, de ambos os gêneros, com sorologia positiva para o anti-VHC e
detecção de RNA viral; portadores de HBsAg por mais de 6 meses, que possuíam
ou não persistência de alaninoaminotransferase elevada e que não estavam fazendo
terapia antiviral. Sendo excluídos da pesquisa indivíduos que não atendiam os
requisitos estipulados acima e aqueles pacientes co-infectados pelo VHD e/ou HIV e
pacientes que utilizaram ou estavam em uso de terapia antiviral específica contra
VHB.
4.3
Procedimentos laboratoriais
A análise da expressão dos genes estudados foi realizada no Laboratório
de Virologia do Instituto de Ciências Biológicas da UFPA.
4.3.1 Extração de DNA
Para a conservação do RNA, foram acrescentados 1.200 UL de RNAlater®
Tissue Collection ao fragmento de tecido hepático, de acordo com o protocolo do
fabricante (Applied Biosystems, USA). A extração de RNA foi realizada usando-se o
kit Norgen Biotek Corporation e, seguiu a seguintes etapas de acordo com o
protocolo recomendado pelo fabricante.
4.3.2 Transcrição Reversa (cDNA)
Após a extração, o RNA obtido foi quantificado através de leitura em
espectrofotômetro Qubit® 2.0 Fluorometer, utilizando-se o Qubit™ RNA Assay Kits
de acordo com o protocolo do fabricante. Para cada amostra foi feito o ajuste da
concentração e mantido a -80 ºC até o momento da transcrição. As amostras de
RNA foram transcritas em DNA complementar, utilizando-se o kit High-Capacity
cDNA Reverse Transcription kits (sem inibidor), de acordo com o protocolo
fornecido pelo fabricante (Applied Biosystems, USA).
4.3.3 Quantificação da expressão dos genes IFN-gama e TGF-beta por PCR em
Tempo Real
As reações para quantificação da expressão dos genes foram realizadas em
placas de 96 poços, utilizando os reagentes TaqManTM (Applied Biosystems, USA)
e o equipamento Step One Plus (Applied Biosystems, USA). As sondas referentes
aos genes-alvo e ao controle endógeno que foram utilizadas no experimento são:
para o IFN-gama: Hs00989291_m1 e para o TGF-beta: Hs00171257_m1.
A quantificação relativa dos genes alvos e o cálculo do intervalo de
confiança foram realizados utilizando o método CT Comparativo (ΔΔCT), método
utilizado para quantificação relativa da comparação do limiar da fase exponencial
(threshold), sem recurso a curvas padrão.
4.3.4
Quantificação do DNA do VHB e RNA do VHC
Os valores de Quantificação do DNA do VHB e RNA do VHC foram realizados
de modo qualitativo e quantitativo pelo Laboratório Central do Estado (LACEN-PA) e
obtidos a partir do prontuário dos pacientes.
4.3.5
Procedimentos histopatológicos
Espécimes de biópsia hepática foram obtidas de pacientes com indicação
médica para investigação de alterações de parênquima hepático, dentro do
protocolo de atendimento clínico. As biópsias hepáticas foram realizadas por
profissional médico do referidos hospital, com agulha de Trucut e dirigidas pela ultrasonografia. Cada amostra de biópsia hepática foi separada em duas partes, uma
delas foi enviada para estudo genético no Laboratório de Virologia/ICB/UFPA e a
outra examinada no Departamento de Anatomia Patológica da UFPA, obedecendo
às rotinas do serviço, submetida às colorações de hematoxilina-eosina (HE),
cromotrope azul de anilina (CAB), reticulina de Gomori e orceína de Shikata.
O diagnóstico histopatológico obedeceu a classificação da Sociedade
Brasileira de Hepatologia (Gayotto, 2000) e a francesa de METAVIR (Bedossa &
Poynard, 1996), pontuando a atividade do infiltrado inflamatório portal e peri-portal
de 0 a 3 e as alterações estruturais de 0 a 4.
Ressalta-se que todos os resultados dos exames feitos fora do Laboratório
de Virologia da UFPA foram obtidos do prontuário do paciente.
4.3.6 Análise Estatística
Para a análise estatística foram utilizados os programas EPIINFO 6.04 b e
Biostat 5.0 (Ayres et al., 2007). Os níveis de expressão dos genes foram
comparados, em relação às variáveis utilizadas no estudo, através do Teste t de
Student e Anova. Foi utilizada a Análise de Regressão Linear, a fim de avaliar a
associações independentes, entre cargas virais, graus de fibrose hepática e
expressões gênicas. Estabeleceu-se em 5 % o nível de significância (valor de p <
0,05).
4.3.7 Riscos e benefícios
Os possíveis riscos para o sujeito da pesquisa incluíram dor local e
sangramentos. Todos os pacientes permaneceram em observação por quatro horas
após a realização da biópsia, sendo utilizados todos os meios para evitar estes
riscos, uma vez que este procedimento foi realizado por profissional especializado e
experiente. Foram utilizados materiais descartáveis em todo o procedimento. Há
ainda o risco de divulgação indevida ou perda de informações constantes no
prontuário do sujeito da pesquisa, o que foi minimizado pelo compromisso ético do
pesquisador durante a manipulação dos prontuários, uma vez que o mesmo possuía
experiência em trabalhar com análise deste material.
Para o pesquisador houve o risco de não obtenção de todas as
informações necessárias a partir do prontuário dos pacientes, dificultando assim a
análise final dos resultados obtidos.
O grande benefício desta pesquisa para todos os que participaram será
possibilitar um melhor entendimento sobre a influência da resposta imunológica do
hospedeiro (pessoa infectada) através de suas citocinas e genes no tipo de evolução
da doença crônica do fígado pelos vírus das hepatites B e C. Há ainda a tentativa de
responder por que alguns que se infectam podem eliminar espontaneamente o vírus,
enquanto outros se tornam crônicos, podendo evoluir para cirrose ou tumor de
fígado.
6. RESULTADOS
Foram obtidas 21 amostras, sendo estes pertencentes aos grupos de
portadores do VHB (n=4), do VHC (n=4), hepatites não virais (HNV) (n=5) e grupo
controle (CT) (n=8).
Todos os grupos de pacientes, assim como para o grupo controle, tiveram
seus níveis séricos de ALT, AST, GGT e AFP avaliados, além do grau de fibrose e
de atividade inflamatória no tecido hepático quando este fosse identificado.
As medianas dos níveis de ALT em cada grupo foram: pacientes portadores
do VHB 25 UI/L, em portadores do VHC foi de 64 UI/L, em portadores de hepatite
não viral foi de 49 UI/L e no grupo controle foi de 27 UI/L. Para AST os valores
obtidos foram 30 UI/L, 39 UI/L, 6 UI/L e 24 UI/L, respectivamente.
Para GGT foram encontrados valores medianos de 20,5 UI/L em pacientes
portadores do VHB, de 42 UI/L em portadores do VHC, 9 UI/L em portadores de
hepatite não viral e 29 UI/L no grupo controle.
Em relação ao nível de fibrose, foram observados entre os portadores de
hepatite B 3 (75%) pacientes apresentando grau F1 e 1 (25%) o grau F0. Entre os
portadores de hepatite C 3 (75%) casos de pacientes apresentando grau F1 e 1
(25%) caso de grau F3. Entre os indivíduos portadores de hepatite não viral, 2 (40%)
casos apresentavam graus de fibrose F1, enquanto somente 1 (20%) apresentou
nível de fibrose F4. No grupo controle todos apresentaram o grau F0.
Quanto ao grau de resposta inflamatória verificou que 75% dos portadores
de hepatites B apresentavam o grau A1, enquanto que, para o VHC foi observado
50% e entre os indivíduos com infecção não viral 60%. Entre os pertencentes ao
grupo controle 100% apresentavam grau A0 (Tabela 1).
O processo de inflamação esteve ausente em 8,33% dos indivíduos com
escore de fibrose hepática F0 e em 57,14% do F1, em todos os demais escores foi
observada inflamação leve (A1) e moderada (A2), sendo que em F1 esteve a maior
frequência dos níveis de inflamação A1 (50,00%) (Tabela 2).
Tabela 1 – Dados clínicos, bioquímicos e histopatológicos segundo escores de
METAVIR da população do estudo.
VHB
VHC
HNV
CT
(n=4)
(n=4)
(n=5)
(n=8)
2/2
3/1
4/1
5/3
25
64
49
27
30
39
6
24
20,5
42
9
29
F0 (%)
1 (25)
-
-
8 (100,0)
F1 (%)
3 (75)
3 (75)
2 (20)
-
F2 (%)
-
-
-
-
F3 (%)
-
1 (25)
-
-
F4 (%)
-
-
1 (20)
-
A0 (%)
1 (25)
-
-
8 (100,0)
A1 (%)
3 (75)
2 (50)
4 (60)
-
2 (50)
-
-
Gênero (F/M)
ALT (UI/L) Mediana
AST (UI/L) Mediana
GGT (UI/L) Mediana
Estadiamento da fibrosea
Grau de inflamaçãob
A2 (%)
-
F: Feminino; M: Masculino. ALT: alanina aminotransferase (normal: 14 a 55 UI/L); AST:
aspartato aminotransferase (normal: 14 a 32 UI/L); GGT: gamaglutamiltransferase (normal:
< 50 UI/L); AFP: alfafetoproteína (normal: < 15 nm/mL); a Escores de Fibrose F0: ausência
de fibrose; F1: portal sem septos; F2: portal com alguns septos; F3: muitos septos sem
cirrose; F4: cirrose;
b
Atividade Inflamatória A0: ausente; A1: mínima; A2: moderada.
Tabela 2 – Frequência dos níveis de atividade inflamatória nos escores de fibrose
hepática dos pacientes com hepatite viral e não viral.
Escores de fibrose hepáticaa
Atividade
inflamatóriab
F0
F1
F2
F3
F4
A0
0
8,33%
0
0
0
A1
8,33%
50,00%
0
8,33%
A2
0
0
0
8,33%
8,33%
0
a
Escores de Fibrose F0: ausência de fibrose; F1: portal sem septos;F2: portal com alguns
septos; F3: muitos septos sem cirrose; F4: cirrose; bAtividade Inflamatória A0: ausente; A1:
mínima; A2: moderada.
No presente estudo não houve diferenças estatisticamente significativas
entre a expressão de INF-γ e TGF-β entre os pacientes portadores de hepatite não
viral (HNV), VHB e VHC (Figura 1).
Figura 1- Gráfico em dot-plot apresentando a média dos valores de expressão
de INF-y e TGF-B entre pacientes portadores do VHB, VHC e Hepatite Não
Viral (HNV).
Nos pacientes portadores de hepatite crônica não foram encontradas
diferenças significativas entre INF-γ e TGF-β e os graus de fibrose (Figura 2-A) e
inflamação (Figura 2-B); dosagens normais ou elevadas de ALT, AST e GGT (Figura
3).
Figura 2 - Gráfico em dot-plot apresentando a média da expressão de INF-y e
TGF-B de acordo com o grau de fibrose (A) e inflamação (B) entre os portadores
de hepatite crônica.
Figura 3 - Gráfico em dot-plot apresentando a média da expressão de IFN-y e TGF-B
de acordo com dosagens normais ou elevadas de ALT, AST e GGT entre pacientes
portadores de hepatite crônica.
As análises de correlação linear entre a expressão de INF-γ, TGF-β e as
dosagens de ALT, AST e GGT nos pacientes portadores de hepatite crônica não
foram significativas (Figura 4).
Figura 4 - Correlação linear entre as expressões de INF-y e TGF-B e as dosagens
de ALT, AST e GGT.
7.
DISCUSSÃO
Os mecanismos moleculares envolvidos na progressão da lesão hepática
crônica até à cirrose, e em última análise, para o carcinoma hepatocelular,
decorrente das infecções pelo VHB e pelo VHC, continuam a serem discutidos. A
persistência da infecção por esses vírus e consequente inflamação crônica do fígado
é caracterizada por uma deficiência da resposta imunitária mediada por linfócitos T
citotóxicos ativados (Bertoletti & Ferrari, 2003), que têm papel essencial na
destruição do VHB e de células infectadas com o VHC, através de diversas vias,
incluindo a produção e síntese de citocinas com ação antiviral, perforina, granzima B
entre outros. Existem outros estímulos que podem causar lesão hepática, como a
ingestão de álcool, a colestase, a esteatose, o abuso de drogas e a autoimunidade,
assim a variabilidade genética viral está sempre interagindo com os fatores
ambientais, fazendo com que os danos no fígado tenham um gradiente de
severidade (Voruganti et al., 2010).
A avaliação histopatológica do tecido hepático através da biópsia é
considerada a forma mais especifica de avaliar os danos resultantes da infecção
crônica pelos vírus das hepatites B e C, bem como de outras doenças crônicas,
possibilitando a graduação da atividade necroinflamatória, o estadiamento da fibrose
e a detecção de eventuais doenças associadas (Bedossa et al., 1994).
Sabe-se que a hepatite viral é a causa principal ou secundária da elevação
das enzimas ALT e AST (Clark et al., 2003; Pendino et al., 2005; Chen et al., 2007) e
que a atividade das transaminases é um indicador de lesão hepática tanto nas
formas agudas como nas crônicas (Rehermann & Nascimbeni, 2005).
A GGT é uma enzima microssomal que pode ser isolada a partir do
hepatócitos e do epitélio da vesícula biliar, e seu aumento pode ocorrer em várias
doenças do fígado, da vesícula biliar, do pâncreas, na síndrome metabólica e no
diabetes mellitus tipo 2 (Aygün et al., 2010)
No presente estudo foi observado que apesar das variações nos níveis
séricos das enzimas hepáticas ALT e AST as maiores medianas foram verificadas
em pacientes com VHC, seguidos de VHB e HNV respectivamente, sendo que para
GGT foi observado a seguinte ordem VHC, seguido pelo VHB e por fim HNV.
Os resultados do presente estudo corroboram com outros achados da
literatura mostrando que dentre as hepatites não virais a esteatose hepática tem sido
fortemente associada à atividade da ALT (Clark et al., 2003; Pendino et al., 2005;
Chen et al., 2007), assim como na hepatite autoimune estudos mostram um nível de
ALT persistentemente baixo associado à melhora do prognóstico (Miyake et al.,
2005), além de uma associação entre a elevação persistente da ALT com a baixa
sobrevida desses pacientes (Miyake et al., 2006).
Semelhante aos nossos resultados Alter et al., (1997) mostraram que
pacientes assintomáticos com níveis detectáveis de RNA do VHC têm elevações de
ALT, o mesmo observado naqueles indivíduos positivos para anticorpos contra o
VHC.
Importante enfatizar que todos os pacientes com VHB deste estudo eram
HBeAg soro convertidos e tiveram as menores medianas nos valores de ALT, esses
achados corroboram os de Yuen et al., (2006) que observaram, na soro conversão
de pacientes HBeAg positivo, uma redução dos níveis da atividade da ALT,
sugerindo que na hepatite B a ALT é útil não só para determinar a presença da
doença do fígado e a necessidade de tratamento, mas também para medir o curso
da história natural da infecção e predizer a soroconversão do antígeno HBeAg.
Em todos os grupos estudados a mediana da ALT foi superior à média da
AST, perfil típico da infecção e doença hepática crônica em fases iniciais e
intermediárias (Kim et al., 2008), o que corresponde ao estadiamento da maioria dos
pacientes deste estudo.
Quando analisada a associação das enzimas hepáticas nos pacientes com
fígado normal ou com fibrose ou cirrose, independente da doença hepática, foi
observado maior valor de ALT em fibrose enquanto resultado indicativo de que a
extensão da fibrose pode ter influência na medida dessa enzima, concordando com
outros relatos na literatura em que os valores séricos da ALT são mais altos do que
os da AST nas fases iniciais das hepatites, sugerindo que em pacientes com
hepatite crônica, os valores da AST superiores aos da ALT indicam liberação
adicional de AST das mitocôndrias nos hepatócitos, em consequência de dano
hepatocelular mais grave ou prolongado (Clermont & Chalmers, 1967; Zechini, et al.,
2004).
Semelhante aos resultados do presente estudo, Granot et al., (2001)
correlacionaram a atividade da ALT ao escore de fibrose.
Uma associação de altas concentrações de ALT e AST com os maiores
níveis de atividade inflamatória hepática observada neste estudo sugere que os
valores elevados das transaminases pode se correlacionar com parâmetros
histológicos de gravidade da doença, corroborando os resultados de Zechini, et al.,
(2004).
Diferente dos resultados do presente estudo, Roshan & Guzman (2014)
concluíram que a ALT não é um indicador confiável na associação da inflamação
hepática ou fibrose em pacientes com VHC visto que há uma variação significativa
nos níveis da ALT no curso da infecção.
No presente estudo, verificou-se uma possível associação positiva entre o
grau de fibrose e os níveis de atividade inflamatória com os valores elevados de
GGT, porém a avaliação por doença hepática não foi possível em virtude do
tamanho amostral dos pacientes com VHB. Em estudo recente foi proposto que em
pacientes com hepatite viral crônica, a GGT pode ser utilizada para prever avançada
lesão histológica hepática, especialmente em pacientes com hepatite B (Eminler et
al., 2014).
Algumas pesquisas consideraram a GGT um dos marcadores indiretos para
fibrose hepática, tendo sido incluída no FIBROINDEX desenvolvido por ImbertBismut et al., (2001) e validado por Poynard et al., (2002). A elevação de GGT é
atribuída à presença de lesões em ductos biliares nos portadores de VHC (Giannini
et al., 2001) Mossong et al., (2011) correlacionaram positivamente a AST e a GGT
com a pontuação METAVIR, seguida por contagem de plaquetas e alfa2macroglobulina, em pacientes com VHC.
Apesar da correlação negativa entre níveis séricos de INF-γ com atividade
inflamatória e com cirrose encontrada nesta pesquisa, isso não quer dizer que
citocina não se mantenha ativada por células Th1 antígeno-específicas quanto maior
for o dano hepático. Tanto que em modelo animal, demonstrou-se que o INF-γ
assume um importante papel na patogênese da infecção pelo VHB, ao serem
induzidos por estimulação de LTh1 HBsAg-específicos, que, por sua vez, ativam
células citotóxicas efetoras (Ohta et al., 2000).
Neste sentido, Tang et al. (2006) estudaram 43 pacientes portadores
crônicos de VHB e 19 controles, encontrando concentrações maiores de INF-γ no
grupo com cirrose hepática ativa e houve correlação positiva com os níveis de
transaminases, o que não ocorreu em nossa pesquisa devido ao baixo número
amostral. A injúria tecidual estimularia as células estreladas na produção de
citocinas com função reparadora do dano, como a TGF-β1, que ao mesmo tempo
que antagoniza os efeitos inflamatórios tenta reparar a lesão tecidual por meio da
síntese de colágeno.
Até certo ponto, este efeito e benéfico, porém a estimulação crônica levaria a
substituição de grande parte do tecido hepático normal por tecido fibrótico,
desarranjando a arquitetura hepática com impacto na circulação portal e na função
do órgão. Admite-se também, que em pacientes portadores crônicos do VHB, há
predomínio da resposta do Th2 em relação a Th1, resultando no aumento da
produção de citocinas anti-inflamatórias (Vierling, 2007).
A citocina TGF-β1 tem um efeito imunossupressão, resultando em um
aumento da replicação do VHB, acarretando maior grau de fibrose hepática. Ela
ativa as células estreladas com posterior estimulação de proteínas da matrix
extracelular, como o colágeno e a fibronectina, induzindo a fibrose (Visvanathan &
Lewin, 2006; Malhi & Gores, 2008). Portanto, os pacientes cronicamente infectados
pelo VHB possuem estimulação continua de fatores que levam a síntese de TGF-β1,
com consequente progressão da fibrose e evolução para cirrose. Estes dados
explicam os achados de maiores níveis séricos de TGF-β1 nos infectados, assim
como sua correlação com a GGT, a qual e considerada uma enzima de colestase,
reveladora da fibrose hepática.
Sabe-se que deve haver equilíbrio das respostas do tipo Th1 e Th2 para o
perfeito funcionamento do sistema e eliminação viral, o que não ocorre nos que
evoluem para cronicidade (Baumert et al., 2007; Vierling, 2007). As respostas para
este fenômeno com os dados até então conhecidos sugerem a importância da
interação dos três fatores ligados a epidemiologia da hepatite B: o vírus, o
hospedeiro e o meio ambiente. Logo, a compreensão dos mesmos não deverá se
fazer de maneira isolada, sob pena de se ter uma visão compartimentalizada, não
conseguindo formar nexos entre os achados.
Quanto mais próximo se chegar da realidade, melhores serão as ações de
prevenção, monitoramento e intervenção terapêutica nos portadores de hepatite B,
declinando cada vez mais as taxas de morbimortalidade, que ainda permanecem
alarmantes não restam dúvidas que o advento da vacinação contribuiu de forma
dramática para a diminuição da incidência dos casos. Porém, nem todos tem acesso
aos serviços básicos de saúde, principalmente em regiões menos favorecidas e que
coincidem com as de maior endemicidade; além do mais, há um contingente grande
de portadores crônicos, responsável pelo reservatório da doença e pelos quadros de
cirrose e leva ao óbito cerca de 500.000 pacientes ao ano.
Avanços, em todas as áreas do conhecimento, inclusive o da imunologia e
da genética humana e na nanotecnologia farmacêutica, com certeza contribuirão
para minimização do problema se não distanciados do pensamento holístico do ser
humano e de suas relações entre si e com o meio ambiente. Sem dúvida que
estudos futuros com aumento de casuística e outras correlações serão necessários
para ratificação dos resultados e contribuir para esclarecimentos de questões ainda
não respondidas da imunopatogenia na infecção crônica do VHB.
8.
PUBLICAÇÕES
Ainda não foram originadas publicações do presente trabalho.
9.
CONCLUSÕES
Os níveis de expressão de INF-γ e TGF-β no tecido hepático parecem não
estar relacionados com o tipo de hepatite apresentada pelo paciente (hepatite B,
hepatite C ou hepatite não viral).
Os níveis de expressão de INF-γ e TGF-β no tecido hepático não estão
relacionados ao grau de fibrose ou atividade inflamatória em pacientes portadores
de hepatite crônica.
Dosagens normais ou elevadas de ALT, AST e GGT não estão associadas
com a expressão de INF-γ e TGF-β no tecido hepático de pacientes portadores de
hepatite crônica.
9.
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9.
DIFICULDADES
O atraso na obtenção dos reagentes para os testes de biologia molecular e
do retorno do equipamento de PCR em tempo real que foi enviado para conserto
técnico em São Paulo, foram os fatores negativos que interferiram na realização dos
ensaios nesta fase de execução do projeto.
12. PARECER DO ORIENTADOR:
O aluno demonstrou compromisso e bom desempenho nas atividades
desenvolvidas no presente projeto.
DATA: 10 /08/2015
Rosimar Neris Martins Feitosa
ASSINATURA DO ORIENTADOR
Michel dos Santos Costa
ASSINATURA DO ALUNO
FICHA DE AVALIAÇÃO DE RELATÓRIO DE BOLSA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA
O AVALIADOR DEVE COMENTAR, DE FORMA RESUMIDA, OS SEGUINTES
ASPECTOS DO RELATÓRIO:
1. O projeto vem se desenvolvendo segundo a proposta aprovada? Se ocorreram
mudanças significativas, elas foram justificadas?
2. A metodologia está de acordo com o Plano de Trabalho?
3. Os resultados obtidos até o presente são relevantes e estão de acordo com os
objetivos propostos?
4. O plano de atividades originou publicações com a participação do bolsista?
Comentar sobre a qualidade e a quantidade da publicação. Caso não tenha sido
gerada nenhuma, os resultados obtidos são recomendados para publicação? Em
que tipo de veículo?
5. Comente outros aspectos que considera relevantes no relatório
6. Parecer Final:
Aprovado (
)
Aprovado com restrições (
) (especificar se são mandatórias ou
recomendações)
Reprovado (
)
7. Qualidade do relatório apresentado: (nota 0 a 5) _____________
Atribuir conceito ao relatório do bolsista considerando a proposta de plano, o
desenvolvimento das atividades, os resultados obtidos e a apresentação do relatório.
Data : _____/____/_____.
________________________________________________
Assinatura do(a) Avaliador(a)