isolamento e caracterização de bactérias endofíticas e da rizosfera
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CONVÊNIOS CNPq/UFU & FAPEMIG/UFU Universidade Federal de Uberlândia Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação DIRETORIA DE PESQUISA COMISSÃO INSTITUCIONAL DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA 2008 – UFU 30 anos ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS E DA RIZOSFERA EM RAÍZES DE ALGODOEIRO E TESTE DE INDUÇÃO DE CRESCIMENTO IN VITRO Juliana Rainho Teixeira1; Universidade Federal de Uberlândia – Av. Amazonas, s/n, Umuarama, Uberlândia. CEP: 38400-902 [email protected] Ana Paula de Oliveira Ribeiro2; Rafael Rogerio Pereira da Silva3; Maria Amelia dos Santos4; Adão de Siqueira Ferreira5 Resumo: O presente trabalho teve como objetivo, fazer um isolamento de bactérias fixadoras de nitrogênio presentes em raízes de algodoeiro cultivado em solos do Cerrado da região de Uberlândia (MG) e testar a ação destas bactérias na mesma espécie vegetal cultivada in vitro para verificar se são capazes de promover crescimento. As plantas coletadas foram lavadas em água corrente e, em seguida, foram desinfetadas (endosfera) ou não (rizosfera) superficialmente. As amostras foram trituradas em liquidificador e diluídas em série para obtenção de suspensões. Alíquotas de 100 µL das suspensões do homogenato foram inoculadas em triplicata em tubos Falcon contendo meios semi-sólidos seletivos: LGI, LGI NOVO e LGI-P. Os tubos foram incubados a 30 °C por 7 dias. Utilizou-se a tabela de McCrady para o cálculo do número mais provável (NMP) de bactérias para estimar a população. Foram obtidos 67 isolados que foram caracterizados morfologicamente nos meios EMB, MacConkey, 523, LB e Batata-P e submetidos aos testes bioquímicos Citrato-Simmons, SIM e fermentação da glicose. A maioria foi caracterizada como bactérias Gram negativas e com forma bastante variada. Foram selecionados oito isolados que foram testados para a capacidade de promover crescimento in vitro de plântulas de algodão. Para tal, sementes foram desinfestadas e colocadas em meio LGI para germinação no escuro durante uma semana, posteriormente, foram transferidas para ambiente iluminado por 12 horas diárias. Após duas semanas, as plântulas de algodão foram cortadas aproximadamente 2 cm abaixo do hipocótilo e transferidas para frascos com meio MS, imersas em solução contendo isolados a 400 Abs e mantidas por aproximadamente 20 dias. Observou-se que a contaminação foi relativamente pequena e os melhores resultados foram obtidos nas plântulas acondicionadas em meio MS com BAP, mas não podemos deixar de citar que alguns isolados estão apresentando resultado comparável. Palavras-chave: bactérias fixadoras de nitrogênio, Gossypium hirsutum, cultura de tecidos vegetais e biotecnologia. 1. INTRODUÇÃO O reconhecimento da importância da microbiologia do solo e a busca de alternativas para diminuir o consumo de fertilizantes nitrogenados levaram à intensificação de pesquisas na área de fixação biológica de nitrogênio. No Brasil, o fertilizante nitrogenado representa o maior custo entre os fertilizantes, já que sua compra não é subsidiada e a quantidade requerida pela planta é uma das maiores em relação aos outros macronutrientes, a exemplo do fósforo e potássio. Além disso, o uso excessivo de fertilizantes nitrogenados representa risco de contaminação ambiental. A fixação biológica do nitrogênio é, após a fotossíntese, o processo mais importante no planeta. Na natureza, somente alguns microrganismos procariotos conhecidos como diazotróficos (1) Acadêmica do curso de Ciências Biológicas; (2) Pós - Doutoranda em Agronomia UFU/FAPEMIG; (3) Acadêmico do curso de Agronomia; (4) Docente do Instituto de Ciências Agrárias; (5) Orientador e docente do Instituto de Ciências Agrárias. ou fixadores de nitrogênio, são capazes de reduzir nitrogênio atmosférico à amônia. Esse processo é chamado de fixação biológica do nitrogênio (FBN), sendo a transformação de N2 a NH3 realizado pela enzima nitrogenase (Eady e Postgate, 1974). Em alguns casos, a FBN pode suprir quase toda a demanda de nitrogênio ao desenvolvimento da planta, para os padrões de produção da plantas cultivadas (Canuto et al., 2003). Um exemplo do sucesso de FBN é o que ocorre em plantas de leguminosas em associação com com bactérias diazotróficas. Os relatos de literatura também tem mostrado a fixação de nitrogênio em plantas não-leguminosas (Raven et al., 2001; Moreira e Siqueira, 2002). A população de bactérias diazotróficas é subdividida em vida livre e associativa. Esta última subdivisão tem sido denominada endófita, pois as bactérias colonizam os tecidos de plantas, ocupando os espaços intercelulares ou intracelular de certas plantas. A simbiose é estabelecida quando planta e microrganismos estabelecem uma interação positiva, na qual a planta fornece nutrientes para o crescimento das bactérias e estas por sua vez fornecem nitrogênio à planta. A simbiose pode ser detectada pela colonização das bactérias, na epiderme e córtex da raiz, ou sistêmica, pela colonização de toda planta (Moreira e Siqueira, 2002). Bactérias não-simbióticas dos gêneros Azotobacter, Azotococcus, Beijerinckia e Clostridium são capazes de fixar nitrogênio. Os três primeiros gêneros são formados por bactérias aeróbicas, enquanto Clostridium é uma bactéria anaeróbica. Todos os quatro gêneros são de bactérias saprófitas comumente encontradas no solo, onde realizam a oxidação da matéria orgânica para obtenção de energia empregada no processo de fixação. Estima-se que elas provavelmente adicionam cerca de 7 kg de N.ha-1 de solo a cada ano (Raven et al., 2001). Esses microrganismos associados às leguminosas e gramíneas, e atualmente estudados em novas famílias botânicas, contribuem para a produção de alimentos sem degradação do meio ambiente, representando importante fonte genética a ser mantida para uso futuro. Na Coleção de Culturas de microorganismos da EMBRAPA-Agrobiologia estão registradas bactérias diazotróficas sendo que 71% são estirpes de Rhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Azorhizobium e Sinorhizobium isoladas de diversas espécies de leguminosas de grãos, forrageiras e espécies arbóreas, especialmente da Mata Atlântica e Amazônia; 25% são estirpes de Azospirillum, Herbaspirillum e Burkholderia, isoladas de trigo, arroz, sorgo, dendê, abacaxizeiro e bananeira e de Acetobacter, isoladas de cana-de-açúcar e batata-doce. Também, mantêm culturas de Azotobacter, Azoarcus, Beijerinkia e outras obtidas por intercâmbio com coleções de diversos países; e 4% são culturas modificadas geneticamente para estudos com diferentes finalidades (Pitard, 2002). Microrganismos endofíticos têm apresentado a capacidade de estimular o crescimento das plantas por mecanismos diretos (fixação de nitrogênio e/ou produção de fitohormônios) e por mecanismos indiretos (antagonismo contra patógenos ou resistência a drogas). É possível que bactérias epifíticas ou endofíticas possam promover o aumento de produtividade da planta por sintetizar substâncias que atuam na regulação do crescimento e/ou por fixar nitrogênio atmosférico (Neto et al., 2008). No Brasil, estudos têm sido conduzidos com linhagens de Azospirillum lipoferum, A. brasilense e Gluconoacetobacter diazotrophicus capazes de produzir ácido indol acético (AIA) e compostos relacionados. Estas bactérias também são capazes de fixar N2, aumentado o seu potencial para a promoção de crescimento. Outras bactérias como Burkholderia cepacia, Methylobacterium spp. e Pantoea agglomerans têm sido avaliadas quanto à promoção de crescimento de abacaxi, citros e eucaliptos, respectivamente (Neto et al., 2008). O mecanismo de promoção de crescimento vegetal por microrganismos endofíticos ainda necessita de mais estudos para um melhor entendimento dos fatores envolvidos. Além da interação entre o genótipo da planta e a comunidade endofítica promotora de crescimento, outros fatores interagem neste processo, como as comunidades microbianas epifíticas e da rizosfera (Neto et al., 2008). Pode-se utilizar para testes de promoção de crescimento em plântulas, o cultivo in vitro. A cultura de tecidos vegetais pode ser definida como um conjunto de métodos para o crescimento de plântulas em um ambiente controlado e estéril. O grande impacto causado pela cultura de tecidos, em 2001, foi a micropropagação ou propagação clonal, na qual produz 2 indivíduos idênticos (Raven et al., 2001). As técnicas a que a micropropagação recorre baseiam-se em métodos modernos de cultura de tecidos vegetais in vitro. Deste modo, a micropropagação é utilizada para multiplicar plantas jovens, produzidas pelos métodos convencionais de produção de plantas, e mesmo plantas geneticamente modificadas (Micropropagação, 2007). O presente trabalho tem como objetivos, fazer um isolamento e caracterização de bactérias fixadoras de nitrgênio e testar as mesmas em plantas de algodoeiro cultivadas in vitro para verificar se são capazer de promover crescimento vegetal. 2. MATERIAIS E MÉTODOS Plantas de algodoeiro novo, intermediário e velho, classificados aqui como estádio 1, 2 e 3, respectivamente e com sistemas radiculares intactos foram coletados e levados ao laboratório para posterior isolamento e quantificação de bactérias endofíticas. 2.1. Isolamento e Caracterização de Bactérias Endofíticas Para o isolamento das bactérias, as raízes de algodoeiro foram lavadas em água corrente. Após, este procedimento foram cortadas e desinfestadas superficialmente com etanol 70% por 1’, seguida de exposição em solução de hipoclorito de sódio 2,5% durante 5’ e três lavagens com água destilada estéril. Sob condições assépticas, fragmentos de cerca de 2 cm foram triturados em um copo de liquidificador por 2’ na maior velocidade, juntamente com solução salina. Da suspensão obtida, considerada como a diluição 10-1, foi realizada uma série de diluições até 10-6 em solução salina contida em tubos de ensaio estéril, utilizando-se pipetador automático. Posteriormente, iniciou-se a inoculação das bactérias da maior diluição seguindo para as menores, para tal, retirou-se 0,1 mL e depositou no interior de cada um dos meios semi-sólidos LGI (5 g sacarose, 0,6 g KH2PO4, 0,2 g K2HPO4, 0,2 g MgSO4.7H2O, 0,02 g CaCl2, 0,02 g Na2MoO4.2H2O, 0,5 % azul de Bromotimol, 1 mL vitaminas, 4 mL FeEDTA, 1000 mL de H2O, pH 6,0 - 6,2), LGI NOVO (1 g ácido cítrico, 1 g ácido succínico, 1 g malato, 0,8 g KH2PO4, 0,3 g K2HPO4, 0,2 g MGSO4.2H2O, 0,05 g CaCl2.2H2O, 0,02 g Na2MoO4.2H2O, 5 mL Bromotimol, 0,5 mL vitaminas, 4 mL FeEDTA, 1000 mL de H2O, pH 6,5) e LGI-P (100 g sacarose, 0,6 g KH2PO4, 0,2 g K2HPO4, 0,2 g MgSO4.2H2O, 0,02 g CaCl2, 0,002 g Na2MoO4.2H2O, 0,5 % azul de Bromocresol, 0,01 g FeCl3.H2O, 1000 mL de H2O, pH 5,5) em tubos Falcon (15 mL) contendo 5 mL de meio. O crescimento de bactérias foi observado pela mudança de cor dos meios de culturas e a presença de uma película típica logo abaixo da superfície dos meios após o período de incubação de 7 dias à 30 oC. Pela indicação de crescimento nas diluições, quantificou-se a população de bactérias por meio da técnica do número mais provável (MPN), usando a tabela de McCrady para três repetições em diluição (Döbereiner et al., 1995). Os frascos que apresentaram crescimento foram utilizados no isolamento de bactérias em meios sólidos dos respectivos meios de cultivo. As colônias isoladas nestes meios foram transferidas para meios semi-sólidos adicionados de 100 mg.L-1 de extrato de levedura. Os isolados estão sendo mantidos em glicerol à -4 oC, no Laboratório de Microbiologia Agrícola e Ambiental. A caracterização morfológica das colônias dos isolados foi realizada em meios de culturas sólidos LGI-P, LGI, LGI NOVO, 523, EMB, MacConkey, Batata-P e LB incubado em BOD à 30 oC. Os isolados foram caracterizados quanto à forma, coloração, textura, tamanho das colônias, arranjos das células (Coradas com Fucsina), reação à coloração de Gram e testes bioquímicos (Citrato-Simmons – 1000 mL de água destilada; 2 g de citrato de sódio; 0,2 g de MgSO4.7H2O; 1 g de NH4H2PO4; 1 g de K2HPO4; 5 g de NaCl, 20 g de ágar e 15 ml de azul de bromotimol; SIM – 1000 mL de água destilada; 30 g peptona; 3 g de extrato de carne; 0,10 g de FeSO4.7H2O e 3 g de agar - presença de Indol, H2S e motilidade; e fermentação de glicose – 1000 mL de água destilada; 1 g de glicose; 2 g de peptona; 5 g de NaCl, 0,3 g de KH2PO4, 3 g de ágar e 3 mL de vermelho de metila - produção de ácido e gás). 3 2.2. Cultivo in vitro de Plântulas de Algodão Em paralelo, plântulas de algodoeiro estão sendo mantidas in vitro. Para tal, sementes de algodão foram imersas overnigth em solução de Benomyl (1 mg mL-1) sob agitação constante. Posteriormente, foram lavadas com água estéril e devidamente desinfetadas com etanol 70 % durante 1’ e hipoclorito de sódio (2,5 %) por 10’. Cada semente foi estabelecida em um tubo Falcon (50 mL) contendo meio LGI. Anterior à transferência das sementes para os tubos, foi realizado um pequeno corte na extremidade próxima ao embrião, para facilitar a emergência da raiz. Os tubos contendo as sementes foram mantidos em BOD à 25 ºC no escuro durante 1 semana, transferidas para BOD com luz controlada (fotoperíodo de 12 h) à 25 ºC por mais uma semana. Estas plântulas foram utilizadas para o teste de indução de crescimento com as bactérias selecionadas. Desde modo, as plântulas de algodão foram cortadas aproximadamente 2 cm abaixo do hipocótilo e transferidas para frascos com meio MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962). Foram realizados dois experimentos utilizando isolados diferentes, cada um com 6 tratamentos, sendo dois controles (negativo, sem BAP e isolados; e positivo apenas com BAP) e quatro tratamentos com isolados diferentes, selecionados de acordo com suas características bioquímicas e morfológicas. Para inoculação dos mesmos, foi feita medição em espectrofotômetro e padronização das quantidades a serem inoculadas (400 Abs). As plântulas cortadas foram imersas nas soluções com os isolados, e em seguida transferidas para meio MS. Os mesmos foram mantidos em BOD sob fotoperíodo de 12horas, irradiância de 35 mmol m-2 s-1 por aproximadamente 20 dias, sendo que foram avaliadas de 7 em 7 dias, características como: tamanho da plântula, tamanho das folhas emergentes, presença de raiz e contaminação. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1. Isolamento e Caracterização de Bactérias Endofíticas Foram observadas pelo método NMP (Número Mais Provável), nas populações obtidas da endosfera das raízes, populações de 9,5x103, 4x103 e 2x102 para bactérias crescidas em meio LGI, estádios 1, 2 e 3, respectivamente. Populações de 4,5x102, 3x104 e 14x102 para bactérias crescidas em meio LGI-P, estádios 1, 2 e 3, respectivamente. Para rizosfera, observou-se populações de 9,5x104 e 1,1x102 para bactérias crescidas em meio LGI, estádios 2 e 3, respectivamente. Populações de 2,5x103 e 3x104 para bactérias crescidas em meio LGI-P, estádios 2 e 3, respectivamente. E para o meio LGI NOVO houve crescimento bacteriano, mas o mesmo não foi significativo em nenhum dos estádios (Tabela 1). Foram obtidos 67 isolados que se encontram estocados em glicerol 10% em eppendorfs e mantidos à 4ºC. enquanto que, Barretti et al. (2008) obtiveram 150 isolados de bactérias endofíticas sendo os mesmos de folhas, caules e raízes de tomateiros e destes, 53 destacam-se quanto à habilidade em promover crescimento de plantas. Já Stroschein (2007), trabalhando com três espécies de tremoço, isolou 204 indivíduos e selecionou 38 após a purificação. Foi realizada caracterização morfológica nos meios LB, 523, Batata-P, EMB e MacConkey (Figura 1 e Tabela 2). Durante a caracterização em meio LB e 523 foi observada colônias com coloração: branca e amarela; textura: lisa e rugosa; formato: redonda, arredondada e disforme; e tamanho: pequena, média e grande (Figura 1A e 1B). Enquanto que no meio Batata-P, foi observado todas as colônias brancas, com texturas variando entre lisa, rugosa e gosmenta. Algumas colônias crescidas em meio Batata-P apresentaram característica muito peculiar, que foi a formação de uma película cobrindo-as (Figura 1C). Nos meios EMB (Figura 1D) e MacConkey (Figura 1E) foi encontrado colorações: rosa, marrom e preta. A maioria dos isolados apresentaram coloração GRAM negativa e foram observadas as seguintes formas: cocos, bacilos, cocobacilos, diplococos, bastonete e diplobacilo. Enquanto que, Sakiyama (2001) encontrou em cafeeiro uma maior predominância destas bactérias na forma de bastonetes e GRAM negativas, o que diverge em parte com os nossos resultados. Já isolados de tremoço do trabalho de Stroschein (2007) foram caracterizados também como GRAM negativos. 4 Tabela 1: Valores do número mais provável (NMP) das bactérias endofíticas diazotróficas isoladas. Meio NMP* LGI 0,95 Estádio 1 Endosfera LGI-P 4,5 Novo 0,0 LGI 0,095 Estádio 2 Rizosfera LGI-P 0,25 Novo 0,0 LGI 0,4 Endosfera LGI-P 0,03 Novo 0,0 LGI 1,1 Estádio 3 Rizosfera LGI-P 1,4 Novo 0,0 LGI 2,0 Endosfera LGI-P 14 Novo 0,0 * NMP (bactérias g-1) = (ND x FD x 10)/(AL x MFA), sendo que: NMP – número mais provável; ND – número de diazotróficas de acordo com a Tabela de McCrady; FD – fator de diluição (intermediário); Al - alíquota; MFA – peso de massa da amostras. A C B E D Figura 1: Isolados 9, 10, 11 e 12 do meio LGI submetidos à caracterização da colônia em meio: A - LB; B - 523; C - Batata-P; D - EMB; e E - Isolados 1, 2, 4 e 5 em meio MacConkey. O meio Batata-P, em particular, é capaz de purificar Acetobacter diazotrophicus e apresenta colônias inicialmente claras e úmidas, tornando-se de coloração chocolate após sete a dez dias de incubação à 30ºC (Döbereiner, Baldani, Baldani, 1995). Porém a coloração descrita encontrada não foi observada, indicando que as bactérias isoladas não são da espécie citada. Tabela 2: Caracterização dos isolados selecionados de algodão nos meios LB, 523, Batata-P, MacConkey e BEM e coloração de GRAM. LGI-P meio tamanho coloração textura forma GRAM 9 LB média branca lisa redonda - 3R 10-2 523 média branca lisa redonda Diplococos Batata-P média branca lisa redonda MacC. média rosa lisa redonda EMB média preta rugosa redonda 5 continuação Tabela 2 13 LB média amarela lisa arredondada - 3R 10-2 523 grande amarela lisa arredondada Diplococos Batata-P grande branca gosmenta arredondada MacC. - - - - EMB - - - - NOVO tamanho coloração textura forma GRAM 2 LB média branca lisa arredondada - 3R 10-4 523 grande branca lisa disforme Diplococos Batata-P grande branca lisa disforme MacC. grande rosa lisa redonda EMB Placa com bactérias móveis 5 LB média branca lisa arredondada - 3R 10-4 523 grande branca lisa disforme Cocobacilos Batata-P grande branca lisa disforme MacC. grande rosa lisa redonda EMB média rosa lisa redonda 24 LB média amarela rugosa arredondada - 3E 10-5 523 média amarela rugosa arredondada Cocobacilos Batata-P grande branca rugosa disforme MacC. média rosa rugosa arredondada EMB média rosa rugosa arredondada LGI tamanho coloração textura forma GRAM 1 LB média amarela rugosa arredondada - 3E 10-3 523 média branca rugosa arredondada Bastonete Batata-P grande branca rugosa redonda MacC. média marron rugosa arredondada EMB média preta rugosa arredondada 10 LB média branca lisa arredondada - 2R 10-2 523 grande branca lisa redonda Cocos Batata-P grande branca lisa redonda MacC. - - - - EMB média preta lisa redonda 20 LB média branca lisa arredondada - 3E 10-1 523 média branca lisa redonda Cocobacilos Batata-P média amarela lisa redonda MacC. média rosa lisa redonda EMB média preta rugosa redonda 6 Quanto aos testes bioquímicos (Tabela 3), a maioria são Citrato positivas (Figura 2), não produzem indol e produzem H2S. A partir destes testes, conseguimos selecionar os isolados que apresentaram características conjuntas divergentes, para posteriores etapas. Figura 2: Isolados do meio LGI submetidos a teste bioquímico Citrato-Simmons. Tabela 3: Resultados dos testes bioquímicos SIM, Citrato/Simmons e Fermentação nos isolados de bactérias endofíticas diazotróficas selecionados. Meio de cultura Isolado LGI 1 10 20 2 5 24 9 13 MEIO NOVO LGI-P (*) + - positivo e; Utilização de citrate + + + + + + + Produção de H 2S + + + + + + – + – Produção de Indol Mobilidade – – – – – – – – – + + + + – – + – - negativo. 3.2. Cultivo in vitro de Plântulas de Algodão As sementes de algodão germinadas em condições de escuro em BOD e posteriormente transferidas para câmara de crescimento (Figura 3) estão apresentando bons resultados. Os tubos são verificados diariamente e os que apresentarem contaminação são descartados. A B Figura 3: Sementes de algodão submetidas ao cultivo in vitro, no meio LGI em sala de crescimento. A – Detalhe do Tubo Falcon contendo uma plântula; B – Visão do material nas prateleiras na sala de crescimento. Os isolados já testados apresentaram resultados divergentes. Alguns conseguiram resultados superiores aos do controle e outros não (Tabela 4 e 5). Sakiyama (2001) testou isolados de bactérias endofíticas em cafeeiro e comprovou a promoção de crescimento da planta por alguns. Diferentemente do nosso experimento, utilizou-se do reisolamento de isolados para a verificação de que os mesmos haviam promovido o crescimento. 7 Tabela 4: Resultado referente à avaliação das plântulas de algodão germinadas in vitro após uma semana da montagem do experimento 1 . Isolado Caracterização da 1ª folha emitida nº1 nº2 nº3 nº4 nº5 Controle NCF* Pequena* Média NCF* Pequena* Controle + Pequena Grande NCF Pequena Média NOVO 05 Média NCF NCF Grande Pequena LGI 10 Grande Pequena NCF Média NCF LGI 20 Pequena NCF NCF Pequena Pequena LGI-P 09 NCF NCF NCF NCF NCF Tamanhos: pequena (até 1cm), média (de 1 a 1,5 cm), grande (de 1,5 a 2 cm) e enorme (de 2 a 3 cm); NCF = não houve crescimento foliar; *presença de contaminação. Tabela 5: Resultado referente à avaliação das plântulas de algodão germinadas in vitro após uma semana da montagem do experimento 2. Isolado Caracterização da 1ª folha emitida nº1 nº2 nº3 nº4 nº5 Controle Média* Pequena* NCF* Pequena* Pequena* Controle + Pequena* NCF* Média* NCF* Pequena* NOVO 02 Pequena NCF Pequena NCF Pequena* NOVO 24 Pequena Pequena NCF Pequena Pequena LGI 01 Pequena Pequena NCF Pequena Pequena LGI-P 13 Pequena NCF Pequena Pequena Pequena* Tamanhos: pequena (até 1cm), média (de 1 a 1,5 cm), grande (de 1,5 a 2 cm) e enorme (de 2 a 3 cm); NCF = não houve crescimento foliar; *presença de contaminação. Podemos perceber que, comparando um experimento com outro, o Experimento 2 apresentou maior grau de contaminação, sendo que a mesma inclui-se de fungos e bactérias, ao contrário do Experimento 1, onde foram detectadas apenas bactérias. Quanto às bactérias, acreditamos que as mesmas sejam endógenas, porém são necessários outros testes para a posterior comprovação. No experimento 1, os melhores resultados foram observados no Controle Positivo, pois as primeiras folhas cresceram mais e não houve contaminação. Observou-se que, o tratamento com isolado LGI-P 09 não apresentou crescimento foliar. No Experimento 2, os melhores resultados foram obtidos com o Controle Negativo. Porém, como citado anteriormente, muitos foram contaminados por fungos. Contudo, os tratamentos com os diferentes isolados não apresentaram contaminação neste experimento. Demais bactérias irão ser testadas, visto que possuímos um grande número de isolados em nosso banco de germoplasma bacteriano. 4. AGRADECIMENTOS Agradeçemos à FAPEMIG pelo apoio financeiro à pesquisa. À AgroTeste, que nos forneceram as sementes e raízes de algodoeiro utilizados no trabalho. À Professora Maria Rita da Universidade Federal de Goiás (UFG) pela ajuda na padronização do cultivo in vitro de plântulas de algodão. Aos professores Jonas Jäger Fernandes, José Magno Q. Luz e Marcus Vinícius Sampaio e membros dos Laboratórios de Biotecnologia Vegetal, Nematologia, Entomologia-Controle Biológico e Fitopatologia e Virologia Vegetal da UFU, que gentilmente cederam instalações e equipamentos para realização de parte do experimento. A todos aqueles que diretamente ou indiretamente ajudaram na realização deste trabalho. 5. REFERÊNCIAS 8 Barretti, P. B.; Souza, R. M.; Pozza, E. A., 2008, “Bactérias endofíticas como agentes promotores do crescimento de plantas de tomateiro e de inibição in vitro de Ralstonia solanacearum”, Ciênc. Agrotec., Lavras, Vol. 32, n.3, pp 731-739. Canuto, E.L.; Salles, J.F.; Oliveira, A.L.M.; Perin, L.; Reis, V.M. and Baldani, J.I., 2003, “Respostas de plantas micropropagadas de cana-de-açúcar à inoculação de bactérias diazotróficas endofíticas”, Agronomia, Vol. 37, n.2, pp 67-72. Döbereiner, J.; Baldani, V. L. and Baldani, J. I., 1995, “Como isolar e identificar bactérias diazotróficas de plantas não-leguminosas”. 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Raven, P.H.; Evert, R.F. and Eichhorn, S.E., 2001, “Biologia Vegetal”, 6. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 906p. Sakiyama, C. C. H., 2001, “Colonização de Coffea arábica L. por bactérias endofíticas promotoras de crescimento”, Tese de doutorado, Viçosa, UFV, 80p. Stroscheim, M. R. D., 2007, “Caracterização de bactérias fixadoras de nitrogênio em Lupinus albescens”, Tese de mestrado, Santa Maria, 83p. 9 ISOLATION AND CARACTERIZATION OF BACTERIA ENDOPHYTIC AND RIZOSPHYTIC PRESENT IN ROOTS OF COTTON AND TEST TO PROMOTE GROWTH IN VITRO Juliana Rainho Teixeira1; Federal University of Uberlândia – Av. Amazonas, s/n, Umuarama, Uberlândia. CEP: 38400-902 [email protected] Ana Paula de Oliveira Ribeiro2; Rafael Rogerio Pereira da Silva3; Maria Amelia dos Santos4; Adão de Siqueira Ferreira5 Abstract: This study aimed to make an isolation of bacteria present in roots of cotton plant cultivated in soils of the Cerrado of the region of Uberlândia (MG) and to test the same ones in plants of cotton plant cultivated in vitro to verify if they are to able to promote growth of the vegetable. The collected plants had been washed in current water and after that they had been disinfected (endosphera) or not (rizosphera) superficially. The samples had been triturated in liquidizer and diluted in series for obtain of the suspensions. Aliquot of 100µL of the suspensions they had been inoculated in third copy in tube falcon contend selective semisolids medium: LGI, LGI NOVO and LGI-P. The tube were incubated at 30°C for 7 days. It was used McCrady table for the calculation of the most likely number (NMP) of bacteria estimate the population. Had been gotten 67 isolated ones that they had been characterized morphologically in medium EMB, MacConkey, 523, LB and Batata-P and submitted to the biochemists tests Citrate-Simmons, SIM and fermentation of the glucose. The majority was characterized as negative Gram bacteria and with form sufficiently varied. Isolated ones had been selected eight had been tested for the capacity to promote growth in vitro of buds of cotton. For such, seeds had been disinfested and placed in half LGI for germination in the dark one during one week, after that they had been transferred to environment illuminated for 12 daily hours. After two weeks, buds of cotton had been cut approximately 2 cm below of hypocotyl and transferred to bottles with MS medium, being immersed in solution contend isolated 400Abs approximately and kept for 20 days. It was observed that the contamination was relatively small e the best ones resulted had been gotten in buds conditioned in medium MS with BAP, but we cannot leave to cite that some isolated ones are presenting resulted comparable. Key words: fixing nitrogen bacteria, Gossypium hirsutum, plant tissue culture, biotechnology. 10
