Expressão e purificação de lipases recombinantes Ana Carolina Maisonnave Arisi Departamento Ciência e Tecnologia de Alimentos, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal de Santa Catarina, [email protected] Enzimas recombinantes Uma proteína recombinante é o produto da expressão de um DNA recombinante. DNA recombinante é uma molécula de DNA composta de fragmentos de DNA ligados covalentemente in vitro, os quais podem ser originários de diferentes organismos. A expressão heteróloga, ou seja em outro organismo, de uma enzima recombinante sob o controle de um promotor forte possibilita a produção de grande quantidade desta enzima no organismo hospedeiro em condições simples de cultivo. A purificação de uma enzima é uma etapa fundamental para o seu estudo. Quando se trata de uma enzima recombinante, para facilitar a sua purificação, a sequência codificante para uma cauda N-terminal ou C-terminal pode ser inserida no vetor de expressão a fim de produzir uma proteína-fusão, a qual pode ser purificada em uma coluna de afinidade. A obtenção de uma proteína recombinante purificada a partir da seqüência de DNA pode ser dividida em cinco etapas: 1) A clonagem do DNA complementar em um vetor de expressão. 2) A expressão da proteína-fusão contendo cauda de afinidade. 3) Obtenção da proteína-fusão em forma solúvel. 4) A purificação da proteína-fusão em colunas de afinidade (ligação a coluna, lavagem e eluição). 5) A verificação do grau de pureza da proteína obtida. As caudas mais usadas para purificação de proteína-fusão são Polihistidina ou Glutationa-S-transferase. A purificação usando cauda polihistidina se baseia na afinidade dos resíduos histidina a níquel que está imobilizado em uma coluna, no caso da cauda com Glutationa-S-transferase, a matriz imobilizada contém glutationa. Lipases A lipase (triacilglicerol acilhidrolase) emergiu como enzima chave em biotecnologia, devido ao seu grande potencial catalítico em meios aquoso e não aquoso, tornando-a enzima preferencial para uma vasta variedade de aplicações industriais, como tecnologia de alimentos, detergentes, indústria química e ciências biomédicas. As lipases mais usadas comercialmente são de origem microbiana, produzidas em cultivo submerso ou em outras condições. As condições ótimas de cultivo foram estabelecidas para obtenção de um bom rendimento de enzima produzida por diversos microrganismos produtores de lipase, como Bacillus subtilis e Candida rugosa. A maioria das aplicações comerciais das lipases não requer enzimas com alto grau de pureza. Por outro lado, é necessário obter quantidade razoável de uma lipase em alto grau de pureza para realizar sua caracterização bioquímica (elucidação do seu mecanismo de ação e cinética) e estrutural (resolução da estrutura tridimensional). A maioria das lipases microbianas pertence a superfamíla estrutural de alfa/beta hidrolases cuja atividade enzimática resulta da tríade catalítica Serina- Histidina-Aspartato de seu sítio ativo. Apesar da alta homologia do sítio de ligação ao substrato, as lipases de diferentes microrganismos apresentam grandes variações de especificidade por substrato e condições ótimas de reação. O sítio catalítico é coberto por uma estrutura móvel (uma tampa) que está envolvida na modulação da atividade e seletividade da lipase. Embora a atividade lipase seja definida como a habilidade de hidrolisar triglicerídeos, em certas condições experimentais as lipases podem catalisar esterificação ou transesterificação. Em contraste com as esterases, lipases são ativadas somente quando adsorvidas na interface água-óleo, quando o lid se move e deixa o sítio catalítico exposto. A interação lipase-lipídio na interface tem sido intensamente investigada. Muitas lipases foram purificadas a homogeneidade para caracterização bioquímica, de sua atividade e sua estabilidade em diferentes condições de reação. Diversas lipases foram cristalizadas para caracterização estrutural. A purificação geralmente necessitou diversas etapas, como precipitação, cromatografia de troca iônica, interação hidrofóbica, gel filtração. Lipases recombinantes Um grande número de genes de lipases de diferentes organismos já foram isolados, clonados e sequenciados. Por técnicas de DNA recombinante, a expressão heteróloga de lipases de diversos microrganismos foi realizada com sucesso tanto em hospedeiros bacterianos (Escherichia coli, Lactococcus lactis, etc) como em leveduras (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastori), alguns exemplos estão listados abaixo. 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