CITOLOGIA E EMBRIOLOGIA DE ERIOTHECA PUBESCENS

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
4ª Semana do Servidor e 5ª Semana Acadêmica
2008 – UFU 30 anos
CITOLOGIA E EMBRIOLOGIA DE ERIOTHECA PUBESCENS (MART.
AND ZUCC.) SCHOTT ET ENDL. (MALVACEAE - BOMBACOIDEAE)
Luciana Nascimento Custódio1
Instituto de Biologia, Universidade Federal de Uberlândia. Av. Ceará s/n. Bairro Umuarama.
[email protected]
Renata Carmo de Oliveira2
[email protected]
Clesnan Mendes-Rodrigues2
[email protected]
Paulo Eugênio Alves Macedo Oliveira2
[email protected]
Resumo: Estudos recentes com Eriotheca pubescens (Mart. and Zucc.) Schott et Endl. mostraram a
presença de poliembrionia do tipo adventícia. No entanto, foram também encontrados indivíduos
ou populações monoembriônicas, o que pode ser um indicador de eventos de reprodução sexuada.
Estudos histológicos e morfológicos não permitiram diferenciar claramente estes embriões. Como
diferenças de ploidia ocorrem para espécies apomíticas recentemente estudadas no cerrado, dados
citológicos também podem ajudar a confirmar o caráter diferenciado e possivelmente sexuado de
indivíduos e populações monoembriônicas de Eriotheca pubescens encontrados na região. O
objetivo desse trabalho foi definir a natureza sexuada ou assexuada de embriões de populações
monoembriônicas de Eriotheca pubescens utilizando dados citológicos e embriológicos. Ovários em
diferentes fases de desenvolvimento foram coletados, fixados, incluídos e seccionados em
micrótomo para embriologia. Óvulos e sementes jovens de Eriotheca pubescens foram submetidos
ao protocolo de coloração Feulgen para análise citológica e teste da metodologia. Os resultados
confirmaram a o desenvolvimento de apenas um embrião sexuado por semente e indicaram que sua
embriologia é semelhante àquelas populações poliembriônicas estudadas anteriormente, apenas
com a ausência de embrionia adventícia. Os testes realizados com o protocolo de Feulgen
mostraram que são necessárias ainda algumas adaptações para um melhor resultado nos estudos
citológicos de óvulos inteiros de Eriotheca pubescens. Estas adequações se mostraram necessárias
mesmo quando foram utilizados óvulos menores, como aqueles de Miconia ferruginata e Tococa
formicaria, espécies também usadas para testar a metodologia.
Palavras chave: poliembrionia, Eriotheca pubescens, citologia.
1. INTRODUÇÃO
A apomixia, definida pelo processo de formação assexual de sementes viáveis (Koltunow,
1993 e Mogie, 1992), tem sido reportada em cerca de 330 gêneros de plantas (Richards, 2003).
Segundo Koltunow (1993) os processos de apomixia podem ter origem gametofítica ou
esporofítica. Nessa última, o embrião pode se desenvolver a partir de células do nucelo, sendo que,
nestes casos, comumente ocorre a formação de mais de um embrião por semente, ou poliembrionia
(Lakshmanan e Ambegaokar, 1984). Estes processos de apomixia podem ocorrer
1- Acadêmica do curso de Ciências Biológicas; 2- Orientadores.
concomitantemente com o evento de reprodução sexuada, constituindo alternativa reprodutiva para
espécies em determinadas situações fisiológicas ou ecológicas (Mogie, 1992).
A poliembrionia, no entanto, pode resultar tanto da embrionia adventícia associada à
apomixia, quanto da clivagem do zigoto ou do proembrião (Maheshawari, 1950), ou ainda da
fecundação independente de sacos embrionários múltiplos (Carmo-Oliveira, 1998 e Custódio et al.,
2006). Nestes últimos casos os embriões resultantes são sexuados.
Estudos recentes com Eriotheca pubescens (Mart. and Zucc.) Schott et Endl. mostraram a
presença de poliembrionia do tipo adventícia (Oliveira et al., 1992 e Mendes-Rodrigues et al.,
2005). No entanto, foram também encontrados indivíduos ou populações monoembriônicas, o que
pode ser um indicador de eventos de reprodução sexuada (Mendes-Rodrigues et al., 2005 e MendesRodrigues, 2005). Estudos histológicos e morfológicos não permitiram diferenciar claramente estes
embriões (Mendes-Rodrigues et al., 2005).
Como a apomixia parece estar associada a processos de hibridação e poliploidia (Carman,
1997 e Ramsey e Schemske, 1998) e diferenças de ploidia ocorrem para espécies apomíticas
recentemente estudadas no cerrado (Oliveira et al., 1992 e Costa et al., 2004), dados citológicos
também podem ajudar a confirmar o caráter diferenciado e possivelmente sexuado de indivíduos e
populações monoembriônicas de Eriotheca pubescens encontrados na região.
Estas diferenças citológicas podem ser observadas pela contagem direta de cromossomos ou
pelo uso de fluorescência diferencial. Presença ou ausência de calose, também evidenciada por
microscopia de fluorescência, tem sido utilizada para diferenciar sacos embrionários de origem
apomítica daqueles de origem sexuada (Kapil e Tiwari, 1978; Vishnyakova, 1991 e Peel et al.,
1997). Estes estudos citológicos requerem informações embriológicas prévias e utilizam
procedimentos histológicos comuns.
O objetivo desse trabalho foi definir a natureza sexuada ou assexuada de embriões de
populações monoembriônicas de Eriotheca pubescens utilizando dados citológicos e embriológicos.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Área de Estudo
O material botânico foi coletado em áreas de cerrado, em um transecto seguindo a rodovia
Uberlândia-Brasília (W 16º 37’, S 0.47º 44’), onde se encontram os indivíduos que produzem
sementes monoembriônicas. As coletas de quatro indivíduos foram realizadas nos meses de junho e
agosto de 2007.
2.2 Análises Embriológicas
Ovários de botões, flores em antese e frutos jovens foram coletados de diferentes indivíduos,
medidos e fixados. Os diferentes estágios foram fixados em FAA modificado (Lersten e Curtis,
1988) e solução de glutaraldeído 1% formaldeído 4% em tampão fosfato (pH 7,2 – 0,1M)
(Mcdowel e Trump, 1976), segundo o tempo necessário para cada fixador. Em seguida foram
tratados como referido para cada técnica e estocados em álcool etílico 70% (Jensen, 1962).
O material foi incluído em Paraplast (Sass, 1951) após desidratação em série butílica (Kraus
e Arduin, 1997), seccionado transversal e longitudinalmente em micrótomo rotativo.
As secções de 7 e 8µm foram submetidas a duplas colorações de Azul de Astra e Fucsina
Básica (Kraus e Arduin, 1997).
Os resultados foram registrados por meio de imagens obtidas em fotomicroscópio Zeiss
Axioplan e estereomicroscópio utilizando-se câmera de modelo DP70 e o programa DPController e
câmera digital Sony DSC-W30.
2.3 Análises Citológicas
2
O projeto inicial previa a realização de colorações com DAPI a partir de cortes dos
rudimentos seminais em desenvolvimento para a detecção de possíveis diferenças de ploidias em
células embrionárias. Porém, no decorrer do desenvolvimento do trabalho encontramos uma nova
metodologia de análises citológicas por fluorescência (Barrell e Grossniklaus, 2005).
Esta metodologia permitiria a análise de óvulos inteiros e estimativas relativas de ploidia
utilizando microscopia confocal e técnicas de coloração relativamente simples. Como a
Universidade Federal de Uberlândia havia adquirido um microscópio confocal alocado no Instituto
de Ciências Biomédicas (ICBIM) resolvemos utilizar esta nova metodologia em lugar da
metodologia mais trabalhosa envolvendo seções histológicas.
Para essas análises, óvulos e sementes jovens inteiras de Eriotheca pubescens foram
submetidos ao protocolo de coloração Feulgen descrito por Barrell e Grossniklaus (2005). Para
testar a metodologia também foram usadas sementes de Miconia ferruginata e Tococa formicaria.
As imagens foram geradas no microscópio Confocal Zeiss LSM 510 Meta. Essas imagens
correspondem a seções muito finas de 5, 1 e 0,25µm realizadas pela tecnologia confocal que varre
todo volume dos óvulos e sementes.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Análises Embriológicas:
O estudo anatômico das sementes Eriotheca pubescens (Figuras 1-4) em estágios iniciais de
desenvolvimento mostrou a ocorrência de apenas um saco embrionário por óvulo (Figura 6). Em
flores abertas, poucos dias após a antese foram observados rudimentos seminais ainda com células
que compõem o saco embrionário, como as sinérgides (Figura 6) e a oosfera (Figuras 7 e 8).
Figuras 1-4: Eriotheca pubescens. 1- Hábito. 2- Inflorescência. 3, 4- Detalhes da inflorescência com
botões, flores abertas e frutos jovens.
3
Em frutos jovens, com cerca de 10-15 mm de comprimento (10 a 15 dias após a antese,
Mendes-Rodrigues et al., (2004), as sementes apresentavam núcleos de endosperma (Figuras 8) e
zigoto quiescente (Figura 9). Nas figuras 10 e 11, tem-se uma semente de mesmo estágio, com um
único saco embrionário e um embrião no início de seu desenvolvimento na região micropilar.
o
end
Figuras 5-10: Seções histológicas de Eriotheca pubescens. 5- Vista geral transversal do ovário,
mostrando 5 lóculos. 6- Rudimento seminal de flor aberta, vê-se um único saco embrionário com as
antípodas na região micropilar. 7,8- Outra semente de mesma fase com oosfera (o) e núcleo de
endosperma (end). 9- Zigoto quiescente. 10- Embrião zigótico em suas primeiras divisões.
4
Outras sementes, de mesmo estágio, evidenciaram o desenvolvimento mais adiantado do
endosperma em relação ao crescimento do embrião, que permanece ainda com poucas células ou
apenas uma, enquanto são contados vários núcleos de endosperma (Figuras 11-14).
mic
emb
emb
mic
Figuras 11-16: 11- Seção longitudinal de uma semente com alguns dias após a antese da flor com embrião
em estágio inicial de desenvolvimento. 12,13,14 - Semente de fruto com comprimento em torno de 1015mm. 12- Embrião em início de desenvolvimento. 13,14-Núcleos do endosperma. 15- Observa-se o
embrião próximo à micrópila (fruto 60mm). 16- Vista de uma semente sob estereomicroscópio. Fruto com
cerca de 75mm.
5
Este padrão de crescimento do endosperma e zigoto é semelhante ao descrito para
indivíduos poliembriônicos da espécie (Mendes-Rodrigues et al. 2005), no qual o zigoto pode
permanecer quiescente enquanto há o crescimento do fruto e do endosperma por cerca de 20 dias
após a antese floral. Essa característica parece ser compartilhada por outras espécies da família
(Baker, 1960).
Em fruto com cerca de 60mm de comprimento (entre 55 e 60 dias após o início do
desenvolvimento, segundo Mendes-Rodrigues et al. (2004), já é possível observar um estágio mais
avançado no desenvolvimento do embrião multicelular, mas o material não permitiu boas
preparações, o que comprometeu a individualização das células (Figura 15). Sementes oriundas de
frutos ainda maiores (ca. 75mm) e próximos da maturação foram dissecadas e observadas sob
estereomicroscópio, confirmando o desenvolvimento sempre de apenas um embrião zigótico. Na
figura 16 observa-se o embrião em estágio de torpedo, localizado na região micropilar da semente.
Nesta fase, o endosperma tornou-se mais denso e esbranquiçado.
Em nenhum momento do desenvolvimento de 60 rudimentos seminais em diferentes fases
foram observados embriões adventícios em desenvolvimento ou qualquer evidência deste tipo de
desenvolvimento. Estes dados corroboram análises anteriores realizadas por Mendes-Rodrigues
(2005) indicando que estes indivíduos realmente produzem sementes estritamente
monoembriônicas, contrastando com outras populações observadas em Uberlândia e outras áreas de
cerrado onde a freqüência média de sementes poliembriônicas é de 75% (Mendes-Rodrigues et al.
2005).
3.2 Análises Citológicas
A metodologia utilizada produziu resultados animadores, mas não permitiu ainda a análise
da ploidia relativa prevista no projeto e descrita no trabalho de Barrell e Grossniklaus 2005. As
análises por fluorescência, devido à baixa definição e nitidez das imagens, não foi possível estimar
o número cromossômico das células do saco embrionário de Eriotheca pubescens (Figuras 17 e 18).
A baixa nitidez foi decorrente de problemas com a diafanização das sementes que são
relativamente grandes e possuem um tegumento com várias camadas celulares. Alguns reagentes
foram incluídos no protocolo de coloração, como Franklin (Kraus e Arduin, 1997) e Xilol para
auxiliar esse processo de diafanização. Contudo, ainda não é possível afirmar a real potencialidade
dessas substâncias na otimização da técnica.
Comparativamente, os resultados de Miconia ferruginata (Figura 19) foram melhores, uma
vez que pôde-se visualizar os núcleos bem corados e individualizar as células pela delimitação das
paredes celulares que também se coraram. No caso de M. ferruginata as sementes são muito
menores e o processo clarificação foi mais eficiente. Acreditamos que com a otimização da fixação
e da técnica de diafanização será possível realizar as análises citológicas para as espécies deste
grupo.
A metodologia também funcionou bem para Tococa formicaria, que tem óvulos ainda
menores que os de Miconia. Na figura 20 tem-se a vista de uma seção longitudinal do óvulo de
Tococa formicaria. Foi possível identificar o saco embrionário no centro do nucelo com o aparato
oosférico em baixa definição e os núcleos polares antes da sua fusão.
Análises tridimensionais possibilitadas pelo microscópio confocal permitiram, nesta espécie,
a individualização dos núcleos do saco embrionário (Figuras 21 e 22) e mostram que é possível
utilizar a fluorescência total de cada um destes núcleos para estimar a ploidia relativa quando
comparada às células do nucelo vizinhos. Em algumas espécies apomíticas de Miconia, o saco
embrionário parece se formar normalmente, mas ele é possivelmente não reduzido (2n), enquanto
nas espécies sexuadas do mesmo grupo (e.g. Tococa formicaria) espera-se que o saco embrionário
apresente núcleos haplóides (n) (Caetano, 2007).
4. CONCLUSÃO
6
o
s
s
ap
np
17-22: Imagens obtidas por meio de microscopia de fluorescência confocal. 17, 18- Eriotheca
pubescens: 17- Seção do rudimento seminal de flor aberta, detalhe das sinérgides (s) e a oosfera (o).
18- Detalhe dos núcleo s corados do tegumento (seta). 19- Miconia ferruginata. Núcleos das células
do nucelo e tegumentos bem corados. 20-22- Tococa formicaria. O saco embrionário é visível no
centro do óvulo. Vê-se os núcleos polares (np) e o aparato oosférico (ap).
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Os resultados do trabalho indicam que a população monoembriônica de Eriotheca
pubescens apresenta embriologia semelhante às populações poliembriônicas estudadas
anteriormente, apenas com a ausência de embrionia adventícia. Duração e sequência dos eventos
não diferem marcadamente e também não contribui para explicar a deflagração da embrionia
adventícia nas outras populações da espécie.
Os testes realizados com o protocolo descrito por Barrell e Grossniklaus (2005) mostraram
que são necessárias ainda algumas adaptações para um melhor resultado nos estudos citológicos de
Eriotheca pubescens, bem como Miconia ferruginata e Tococa formicaria. Entre as possibilidades
está o seccionamento prévio das sementes, incluídas em Paraplast ou Historresina, para a então a
coloração com o Reagente de Schiff, utilizado nesse protocolo.
5. AGRADECIMENTOS
Agradecemos ao órgão de fomento à pesquisa CNPq pela bolsa contemplada à aula de
Iniciação Científica.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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CYTOLOGIC AND EMBRYOLOGY OF ERIOTHECA PUBESCENS (MART.
AND ZUCC.) SCHOTT ET ENDL. (MALVACEAE - BOMBACOIDEAE)
Luciana Nascimento Custódio
Institute of Biology, Federal University of Uberlandia. Av. Ceara s / n. Neighborhood Umuarama.
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Renata Carmo de Oliveira
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Clesnan Mendes-Rodrigues
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Paulo Eugênio Alves Macedo Oliveira
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ABSTRACT: Recent studies with Eriotheca pubescens (Mart. and Zucc.) Schott and Endl. showed
the presence of the polyembryony and adventitious apomixis. However, there were also found
monoembryonic individuals and populations, which can be an indicator of events of sexual
reproduction. Histological and morphological studies did not differentiate clearly sexual from
apomictic embryos. Since differences in ploidy have been identified for species recently studied in
the cerrado, we thought cytological data would be useful to confirm the differential and possibly
sexual character of monoembryonic individuals and populations of Eriotheca pubescens found in
the region. The objective of this study was to define the nature of sexual or assexual of embryos
monoembryonic population of Eriotheca pubescens using embryological and cytological data.
Ovaries in different stages of development were collected, fixed, and embedded for microtome
9
sectioning and embryological studies. Ovules and young seeds of Eriotheca pubescens were
submitted to the Feulgen staining protocol for cytological analysis under confocal microscopy. The
results confirmed the development of a single sexual embryo per seed and indicated that seed
embryology is similar to the polyembryonic ones studied before, only with the absence of
adventitious embryony. Tests performed with the protocol of Feulgen showed that some adjustments
are still needed for better results in cytological studies of entire ovules of Eriotheca pubescens and
even in Miconia ferruginata and Tococa formicaria, species with smaller ovules also used to test the
methodology.
Key words: polyembryony, Eriotheca pubescens, cytologic.
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